树突状细胞的分离纯化与鉴定
树突状细胞的分离纯化与鉴定
自从Stciman首次发现树突状细胞(dendritic cell ,DC) 以来, 人们对DC的认识随着它的分离与纯化技术的改进而逐步深入, 认识的深入又进一步促进了DC分离与纯化技术的提高。现已能够从大多数组织中得到高纯度的、各具特异性的DC。DC的纯化方法包括两大类: (1) 物理方法:
①根据细胞的黏附性进行分离, 有黏附分离法、尼龙毛分离法、羰基碳分离法, 各种淋巴细胞的黏附能力依次为巨噬细胞> DC = 抗体产生细胞> B细胞> T细胞; ②根据细胞的大小比重进行分离, 包括聚蔗糖2泛影葡胺( Ficoll2 Paque) 密度梯度离心、Percoll非连续性/ 连续性密度梯度离心、E花环沉淀分离; (2) 免疫分选: 包括淘洗法( Pan2 ning) 、流式细胞术(fluid cytometry ,FCM) 、磁性细胞分离术 (MACS) 。以下就不同组织DC的分离作一综述。
1 从外周血直接分离DC
首先分离外周血单个核细胞( PBMC) 。常用方法有:
(1) Ficoll不连续密度梯度离心, 将人外周抗凝血稀释置于 Ficoll2Paque淋巴细胞分离液上离心, 速度(170 g～1 000 g)和时间(20～45 min) 因各个实验室而异, 分离液与血浆之间的界面层细胞即是PBMC; (2) Percoll连续/ 不连续密度梯度离心: 方法基本与密度梯度离心相同, 可在Ficoll不连续密度梯度离心的基础上进一步纯化DC。玫瑰花沉淀法大体上可将PBMC 分为ER+ 和ER 2细胞,其中ER+ 主要是T细胞。Nijman采用磁珠阴性选择法, 即用与抗CD14、CD15、CD16、CD19、CD56单抗相连的磁珠分别去除ER2细胞中的单核细胞、B 细胞、NK细胞和粒细胞, 所得的“新鲜DC”(f2DC) 纯度经流式细胞术(FACS) 检测达到85 %～90 %。如果将ER2细胞培养36 h再加2次各40 min贴壁培养去除黏附细胞, 将未黏附细胞置于1415 %甲泛葡胺上离心去除B细胞、NK细胞, 可得到90 %～95 %纯度的“培养DC” (c2DC) 。f2DC和c2DC分别具有未成熟 DC和成熟DC的典型特征。
Young的一种方法是用Percoll分离液先分离PBMC中的单核细胞, 或玫瑰花法得到的经短暂培养去除黏附细胞的ER2细胞; 另一种方法是先用玫瑰花节法分离出ER2细胞,
培养36 h去除单核细胞和黏附细胞, 两种方法最后将所得细胞经Percoll密度梯度离心, 高密度部分富含B细胞, 低密度部分DC纯度为40 %～80 %Thomas则用L亮胺酰2L亮胺酸2甲基酯(LLME) 处理ER2细胞以杀死去除单核细胞和有细胞毒作用的细胞, 再经14-15 %
的甲泛匍胺RPMI 1640溶液(含10 % FCS) 离心, 低密度部分富含DC; 再用免疫磁珠分选出CD14、CD19、CD16、CD3和CD33 + CD14dim细胞, 证实为DC前体细胞, > 90 %表达 CD33 + CD13 +。最近有报道用免疫磁珠连接单抗M2DC8从PBMC中一步分离出一类DC (占血白细胞015 %～1 %) , 其纯度为97 % , 这可能是至今为止最简捷的分离方法。该细胞具有DC的典型特征: 递呈抗原给静息T细胞、诱导MHC I限制性CTL应答, 表达CD86、CD40。与单核细胞相比, 它低水平地表达HLA2DR、CD33、CD45RO , 高水平地表达 CD45RA、CD11c , 它特别高水平地表达FcγR III (CD16) , 使它与单核细胞区别开来。这类细胞与已经确立的一般骨髓源性DC的区别在于表达M2DC8 , 缺少CD83和胞浆内p55抗原, 因此它可能代表中间阶段(intermediate developmental stage) 的DC细胞。
2 从DC前体诱导扩增DC
z从CD34 + 干细胞前体诱导扩增DCCaux用抗CD34 mAb和GAM IgG免疫磁珠、minimacs分离柱从人脐血中获得高纯度的CD34 + HPCs (80 %～99 %) ,将其置于
RPMI 1640全培养基中(加有SCF、GM2CSF和TNF2α及人AB+ 血清) 培养; 5～
6 d后洗去人血清, 用FITC2OKT6 (CD1a) 和PF2leu2M3 (CD14) 单抗标记培养细
胞, 经流式细胞仪分选出CD14 + CD1a和CD14、CD1a + 亚类, 以(1～2)×105/ ml
的浓度接种到含GM2CSF和TNF2α的培养基中再培养6～7 d , 可获得相当数量的
DC , 证实CD34 + 细胞可分化《上海免疫学杂志》2001年第21卷第2期 ©
1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 为两种细胞:
LC型DC和CD14源DC (具有强大的抗原摄取和独特的诱导静息B细胞分化为IgM
分泌细胞的功能)。
Ahuja用Ceprate干细胞收集系统获得CD34 + PBHP (含10 % FBS) 他用改良lscov
‘s DMEM培养基而不用人AB+ 血清, 用干细胞因子SCF (20 ng/ ml) 、GM2CSF
(50 ng/ ml) 、IL2、4和TNF2α (10 ng/ ml) 作为刺激因子, 最终可获得> 99 %的
CD33 + 细胞, 表达多种DC相关表面分子, 混杂的T细胞 (CD34 + ) 、B细胞
(CD19 + ) < 1 %～3 %。 Fujii的方法与Ahuja的方法相似, 他用抗CD34 mAb5612
包被的M2450磁珠从外周血中一步分离出CD34 + HPCs , 经
DETACHaBEADsCD34释放出来后接种到含GM2CSF (100 ng/ ml) 、和TNF2α
(215 ng/ ml) 的培养基中培养, 2 ×105CD34 + HPCs可获得(115 ±012) ×106
CD1a + DC。
前体细胞扩增DC
因为CD34 + 干细胞在外周血中含量非常稀少( <011 %) , 所以Romani和Bender同
时报道了另一种方法,即利用外周血或脐血中含量相对较高的CD34前体细胞诱导
扩增出大量的DC。这种方法包括启动阶段和分化(成熟) 阶段。将CD34前体细胞
在RPMI 1640培养基中(加有GM2CSF和IL24) 培养6～7 d , 之后加入单核细胞条
件培养基进行分化(Romani认为仅GM2CSF和IL24作用的DC是不完全成熟的, 加
入单核细胞条件培养基可使细胞完全成熟而且保持较长时间的稳定, 本方法的独
特之处就在于得到的DC充分成熟而且稳定) 。利用这种方法可从40 ml外周血得
到 (018～313) ×106和(1～3) ×106的细胞,所得细胞具有成熟 DC的所有典型特
征。若供血者经GM2CSF预处理则细胞得率可提高6倍。若将RPMI 1640培养基
换成V2XIVO、AIM2 V , 则所得的DC还可用于临床作为辅助治疗。所以该法可为
临床研究提供大量DC 。
从CD14 + 前体细胞扩增DC
Chassin和Randolph用连续性流式离心或用免疫磁珠阴性选择获得PBMC中低密度单核细胞CD14 + 前体(不论CD34 + 或CD34)细胞, 置于RPMI 1640全培养基中(加有50 ng/ ml GM2CSF和1 000 u/ ml或200 u/ ml IL24) , 培养10～15 d也可获得较大量的DC , 这些细胞表现出DC的典型特征。
从骨髓干细胞扩增DC人们已经能够从小鼠骨髓干细胞扩增出大量DC。获得长骨骨髓细胞后, Cayeux用加有400 u/ ml GM2CSF (来自基因修饰的NIH23T3细胞系上清) 的RPMI 1640培养基培养混合骨髓细胞中的非黏附细胞, 利用各种细胞的黏附性逐步分离得到较大量的DC 。Wang则用补体细胞毒方法(低毒的兔补体和单抗混合物作用) 去除小鼠骨髓细胞中的淋巴细胞, 然后置于含重组小鼠GM2CSF 10 ng/ ml和IL24 10 ng/ ml的RPMI 1640全培养基中培养, 6 d后DC的得率为25×106/ 鼠。赵勇用GM2CSF诱导C57BL/ 6小鼠红白血病细胞FBL23向DC分化, 表达出DC的典型特征。
3 从淋巴液分离DC
对淋巴系DC的研究主要集中在动物实验。6周龄的大鼠行肠系膜淋巴结(MLN) 切除术, 6周后行胸导管置管术,收集淋巴液, 第1次离心1415 %甲泛葡胺, 400 g , 20min) , 可获得40 %～60 %纯度的DC , 再次离心DC的纯度可提高到80 %～90 % , 这可能是获得淋巴系DC的最简捷方法, 难点是大鼠胸导管置管术。分子杂交筛选出来的MRC
OX262 (小鼠单抗) 是对大鼠面纱样细胞(veiled cell) 特异性的单抗, 在大鼠胸腺、脾、颈淋巴结、Payer ‘s结节中都有较多的OX262 + 细胞分布,都呈现出DC的形态, 因此, 这种单抗在分离淋巴系DC中具有重要意义。需要指出的是在皮肤和小肠还存在一些OX262 + MHC II细胞它们是CD3 +γ/δT细胞, 含量为OX262 +细胞的3 %～4 %。大鼠骨髓细胞用淘洗法去除塑料平板黏附和黏附细胞, 剩余骨髓细胞置于明胶包被的培养瓶中,用含重组鼠GM2CSF (或同时联用TNF2α) 的RPMI 1640培养基培养, 再次去除未黏附细胞中的Fc + 细胞, 则从3 × 108的混合骨髓细胞可获得313 ×108DC , 都表达OX262分子。
4 从其它组织中分离DC去存在于实体淋巴器官中的DC大部分是淋巴系DC , 这部分
DC的分离也都要求将组织制成单个细胞悬液, 通常需要胰酶和/ 或胶原蛋白酶, 将肠黏膜下层(LP) 、Pay ‘er结节(PP) 和肠系膜淋巴结(MLN) 单个细胞悬液置于1415 %甲泛葡胺上2 000 r/ min离心20 min , 得到混合淋巴细胞, 再用E玫瑰花及免疫磁珠T、B及黏附细胞分选出10 %～24 %的LP DC、PP DC和35 %～55 %的MLN DC[16 ] 。这种方法强调了胶原酶A和0102 %EDTA无Ca2 + 、Mg2 + 的PBS溶液的应用, lens组织滤过也是其特点, 有时需要用到DNA酶。 Ridge用Iscove ‘s改良Dulbecco ’s培养基(含有5 ng/ ml重组小鼠GM2CSF和10 %胎牛血清) 培养脾细胞, 去除黏附细胞后培养黏附细胞, 经进一步50 % Percoll密度梯度离心得到> 80 %～
90 %DC , T细胞< 2 % , B细胞< 5 %。 Inaba介绍了一种相对简便经济的分离脾和外
周淋巴结 DC的方法, 这种方法强调了胶原酶D消化和无钙Hanks液的应用, 继以梯度离心可获得CD11c + DC的纯度为脾95 %±19 %、淋巴结84 % ±11 %。迄今为止对人血液以外组织DC的研究仍很少。Sum2 mers用免疫磁珠阴性选择获得了一定量类风湿病人滑液的 DC , 方法与从血液中分离DC的方法相似。Schmitz则对7例儿童被摘除的扁桃体进行了一系列处理, 终末细胞总数为(313～1011) ×106 , 其中DC的纯度为78.14 % , 具有DC的典型特征。此法的特点在于应用一种自制的BSA密度梯度分离液。综上所述, DC的来源可以概括如下:
z《上海免疫学杂志》2001年第21卷第2期 © 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 因为DC在各种器官组织中的含量都非常稀少, 以至很难获得大量DC , 所以研究中大多采用几种方法综合运用。密度梯度离心因为简便易行, 而且对细胞活性影响较小而得到广泛应用。免疫磁珠具有高效、特异性强的特点,但若要作DC的行为研究, 阳性选择要慎重考虑, 尽管有报道
阳性选择对细胞无损伤, 但仍不能肯定对DC的行为功能无影响。流式细胞术分离
(FACS) 尽管应用前景广阔,但是因要求高、费用昂贵而使其实际应用受到限制。对
于某一项具体研究, 如何选择分离方法需要综合考虑, 一般说来, 几种方法的联合
应用不可避免, 或许这也是最佳选择。
DC本身有滤泡树突状细胞(FDC) 、淋巴样树突状细胞(LDC) 、并指树突状细胞( IDC) 、朗格罕细胞(LC) 等亚族,而且它分布广泛, 不同来源的DC又表现出不均一性, 甚至不同方法获得的同一组织的DC也不完全一样, 这都和DC本身复杂的生物学特性密切相关。在从祖细胞、前体细胞、幼稚细胞、到不成熟细胞和成熟细胞的过程中, DC是逐渐由中枢淋巴器官向外周淋巴器官、由初级淋巴器官向次级淋巴器官迁移的, 而且在这个过程中, DC的形态结构、分子表达、行为功能也都跟随变化。实际上到现在为止人们对DC的骨髓亚系来源并不确定, 加上DC的复杂多样和多变性, 人们尚未找到一种所有DC都携带的特异性表面标志, 这使DC鉴定变得十分困难和复杂。外周组织中的DC大部分以一种不成熟状态或前体形式存在, 而在对其进行分离的过程中它又会发生变化, 所以人们只能从DC的一些相对公认的特征来对其进行鉴定。
CD50 , CD86
低表达CD40 , CD25 , IL212高表达CD40 , CD25 , IL212
低表达CD83 , p55高表达CD83 , p55
低表达粒细胞抗原高表达M342 , 2A1MIDC28
免疫反应功能状态反应较弱或阴性反应较强
(MLR ,CTL) 或能见到较多抗抗原摄取内吞颗粒
(TT ,PHA) 抗原刺激反应原摄取内吞颗粒较少或没有因为DC的复杂性, 它的鉴定一般要结合其形态结构、分子表达和功能状态三个方面, 由于许多DC是处于一种中间过度阶段, 称之为中间类型DC , 它的形态结构、分子表达、和功能状态也处于未成熟DC和成熟DC 之间, 对于有时出现的一些特殊的分子表达, 人们还很难鉴定其意义,所以在对分离出来的DC进行鉴定时, 我们可以参考以上各种方法获得的DC的特点, 结合这些共同点来考虑。无论是细胞分离还是鉴定, 表面分子特异性抗体的选择都是很重要的, 它有时直接影响着分离或鉴定效果; 流式细胞术是目前应用最为广泛的细胞鉴定技术, 如果条件允许, 最好能提供
这方面的研究结果。总之, 在现有分离技术的基础上对DC的进一步研究可增进对这一类细胞的认识, 对其生物学特性的充分认识和掌握可帮助其开发应用于临床治疗, DC现在应用于感染和肿瘤治疗的效果就显示出其广阔的开发前景。
《生物分离与纯化技术》授课教案
《生物分离与纯化技术》授课教案 第一章绪论 教学目的：熟悉生物物质的概念、种类和来源；了解分离纯化技术及其基本原理；熟悉分离纯化工艺的优化、放大和验证工作；掌握分离纯化的特点与一般步骤；了解生物分离纯化技术的发展历史；熟悉生物分离纯化技术的发展趋势。 教学重点：生物物质的概念、种类和来源；分离纯化工艺的优化、放大和验证工作；分离纯化的特点与一般步骤；生物分离纯化技术的发展趋势。 教学难点：分离纯化技术及其基本原理；分离纯化工艺的优化、放大和验证工作。教学课时：4 学时 教学方法：多媒体教学 教学内容： 第一节生物分离与纯化的概念与原理 一、生物物质的概念、种类和来源 1. 生物物质：氨基酸及其衍生物类、活性多肽类、蛋白质、酶类、核酸及其降解 物、糖、脂类、动物器官或组织制剂、小动物制剂、菌体制剂 2. 生物物质来源：动物器官与组织、植物器官与组织、微生物及其代谢产物、细胞培养产物、血液、分泌物及其代谢物 二、生物分离纯化概念 指从发酵液、动植物细胞培养液、酶反应液或动植物组织细胞与体液等中分离、纯化生物产品的过程。 三、生物分离纯化技术
生物技术 上游：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程及组织工程；下游：生物产品的回收——生物分离与纯化技术，主要包括离心技术、细胞破碎技术、萃取技术、固相析出技术、色谱技术和膜分离技术等。 四、分离纯化基本原理 有效识别混合物中不同组分间物理、化学和生物学性质的差别，利用能够识别这些差别的分离介质或扩大这些差别的分离设备来实现组分间的分离或目标产物的纯化。
第二节分离纯化策略 一、生物分离纯化技术的特点 1. 环境复杂、分离纯化困难 2. 含量低、工艺复杂
实验3 细胞核的分离与核酸的鉴定
实验3 细胞核的分离与核酸的鉴定 【实验目的】 1.掌握细胞核及细胞质的分离和纯化的一般原理和操作方法。 2.了解DNA在细胞中的分布和核酸鉴定的原理。 3.进一步掌握离心机的工作原理及正确使用方法。 【实验原理】 1.DNA主要存在于细胞核， RNA主要存在于细胞质。 2.细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各组分分级分离出来。 肝组织破碎后，柠檬酸能抑制脱氧核糖核酸酶的活性，维持染色质的正常结构和活性。如将此种细胞核保存在等渗（0.25M）蔗糖溶液中（内含微量钙离子，防止核聚集和脆性），可以比较好地保存其完整的正常结构。 在此条件下离心分离得到的是细胞核的粗制品，如离心时通过0.88M蔗糖的高渗溶液。适当调整离心力，可得到纯化的细胞核沉淀。
3.脱氧核糖核酸的鉴定： 【操作步骤】 1、0.5g肝组织＋5ml的1.5%柠檬酸溶液，研磨 2、肝匀浆，倾入离心管，离心：3000r/min；15′ 3、离心结束后，上清液移入另外一个试管中备用（此为细胞质液） 4、沉淀中加入1ml的0.25mol/L 蔗糖-柠檬酸溶液，玻棒搅匀后， 为核悬液。 5、另外取离心管一只，加9ml 的0.88mol/L蔗糖-柠檬酸液。用滴 管吸取核悬液。沿管壁缓慢铺于液面上。 6、离心：2000r/min；10′.上层液，弃去；沉淀为初步纯化的细 胞核。 7、核洗液5ml洗涤沉淀，离心：2000r/min，10 ′白色沉淀为纯
化的细胞核。 8、加10ml 0.02mol/L NaOH溶解细胞核，即为待测的核液。 9、脱氧核糖核酸的鉴定 （1）水解：取离心管二支，编号，按下表操作 混合各管 沸水浴(10’) 离心 3000r/min;5′ 上清液 (2)鉴定：取试管三支，编号，按下表操作: 混合各管 沸水浴(15’) 冷却 比较各管颜色(595nm) 编号 1 2 细胞质（ml） 2.0 - 核液（ml）- 2.0 1M过氯酸(ml） 2.0 2.0
细胞生物学设计性实验：细胞核的分离鉴定
细胞生物学设计性实验：细胞核的分离鉴定 医学细胞生物学设计型实验设计报告 班级10级k-7班 评分 实验项目： 细胞核的分离与鉴定 实验原理：1、细胞内各种结构的比重和大小不同，在同一离心场内其沉降速度也不同。所以，用差速离心法可将细胞内各种细胞器及组分分级分离出来。差速离心法也是用来研究亚细胞成分的化学组成，理化特性及其功能的主要手段。 2、分离细胞核最常用的方法是将组织制成匀浆，在特定的条下进行离心分离，然后分析鉴定。 3、匀浆是指在低温条下，将组织放入匀浆器，加入等渗匀浆介质进行研磨，破碎细胞，使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆液。 实验步骤：1、处死：断头处死小白鼠，手提尾部使其学业尽量流出。 2、取材：迅速开腹取肝，在盛有生理盐水的小烧杯中反复洗涤，称取湿重约为1g的肝组织放在烧杯中。 3、匀浆：加油8ml预冷的0.25mol/L蔗糖0.003mol/L绿化高永夜于烧杯中，尽量剪碎肝组织，将剪碎的刚组织倒入玻璃匀
浆器，是匀浆器下端侵入盛有冰块的器皿（如冰盘）。左手握持匀浆器，右手将匀浆捣杆垂直插入管中匀浆，直至看不到明显的组织块。 4、过滤： 用8层纱布（先用少量生理盐水或蔗糖液润湿纱布）过滤匀浆液于离心管中。 5、离心：在天平上平衡每对离心管，2500r/min离心 15min，取上清液于另一离心管中。 6、涂片：取上清液制一张涂片（涂片1）。将原离心管中剩余上清液吹打成沉淀成悬液，另制一张涂片（涂片2），自然干燥。 7、染色：分别在涂片1和2上低价甲苯胺蓝染液 ，染色5到7分钟（即滴染）。 8、洗涤：冲去染液，晾干。 9、镜检：结合实验结果的描述，镜下观察分析。 注意事项：1.操作规范，防止试剂污染。 2.细胞悬液的涂片制作要轻柔。 3.使用离心机要注意平衡，转速从低到高。 预期结果：低倍镜下找到标本，再换高倍镜，可见肝细胞核已游离出来，被染成蓝紫色，圆形，中央有2到4个甚至更多个深蓝色的核仁。 实验用品：材料：小白鼠肝脏。
青霉素几种分离纯化方法比较
生物工程下游技术期末作业 青霉素的分离提纯方法的发展与比较
摘要：本文主要介绍了青霉素的分离提纯方法的发展以及比较，包括传统的方法，如吸附法，沉淀法，溶剂萃取法等，也包括现代发展的高新技术，如反胶团萃取法，乳状液膜法，中空纤维更新液膜法以及其它的高效提取方法。 Abstract：This paper describes the development of penicillin G and the comparison of methods of separation and purification , including traditional methods, such as adsorption, precipitation, solvent extraction, but also includes modern high-tech development, such as reverse micelles extraction, emulsion liquid membrane hollow fiber renewal liquid membrane extraction and other efficient methods. 正文： 1、青霉素简介 1、1基本性质：青霉素（Benzylpenicillin / Penicillin）又被称为青霉素G、peillin G、盘尼西林、配尼西林、青霉素钠、苄青霉素钠、青霉素钾、苄青霉素钾。青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。青霉素类抗生素是β-内酰胺类中一大类抗生素的总称。 分子式为： 1、2发展历程：早在唐朝时，长安城的裁缝会把长有绿毛的糨糊涂在被剪刀划破的手指上来帮助伤口愈合，就是因为绿毛产生的物质（青霉素素菌）有杀菌的作用，也就是人们最早使用青霉素。 近代，1928年英国细菌学家弗莱明首先发现了世界上第一种抗生素—青霉素，1941年前后英国牛津大学病 理学家霍华德·弗洛里与生物化学家钱恩实现对青霉素的分离与纯化，并发现其对传染病的疗效，弗莱明、弗洛里、钱恩三人共同获得1945年诺贝尔奖。目前所用的抗生素大多数是从微生物培养液中提取的，有些抗生素已能人工合成。由于不同种类的抗生素的化学成分不一，因此它们对微生物的作用机理也很不相同，有些抑制蛋白质的合成，有些抑制核酸的合成，有些则抑制细胞壁的合成。[1] 1、3化学性质：青霉素可以与金属或有机碱结合成盐,常有钠盐、钾盐、普鲁卡因盐和节星盐。青霉素盐的化学名称是(25,SR,6R)一3,3一二甲基一6一(2一苯乙酞氨基)7一氧代一4-硫杂一1一氮杂双环[3.2.0]庚烷一2一甲酸钠(钾)盐"青霉素的钠盐!钾盐均为白色结晶粉末;无臭或微有特异性臭,有引湿性;遇酸碱或氧化剂迅速失效,在水中极易溶解乙醇中微溶。[2] 1、4分类：青霉素用于临床是40年代初，人们对青霉素进行大量研究后又
细胞核的分离
实验四细胞核的分离 [实验目的] 1. 为了研究细胞核及其组分。 2. 定量分析细胞核的生化组分及其它一些特殊成分。 [实验原理] 1956年由chauveau等人提出，用高密度介质来分离细胞核。由于细胞核的密度较大，在高密度介质中，在高速离心条件下沉降下来，从而达到与细胞质其它成分分开来的目的。chauveau 的方法是将动物肝脏直接在2.2mol/l蔗糖溶液中匀浆，然后高速离心40 000g 1小时，细胞核沉淀到底部，线粒体和完整细胞，包括红血球漂浮在液面，通过一步操作即可分离得到细胞核。其后又有不少研究者对此方法进行了改进，例如加进氯化钙、氯化镁、氯化钾等改变分离介质的渗透压；选择介质的ph以及不同的高密度蔗糖溶液离心方法等。这样减少了细胞核的脆性，防止聚集，维持恒定的ph，就能保持细胞核的精细结构。虽然这一方法比较简单，能得到较高纯度的细胞核，也已被广泛采用，但实验需要高速离心机，这在一般实验室不能进行，此方法要用高浓度的蔗糖，如果要分离大量的细胞核，也很不经济。 目前在一般实验室中更多的是用柠檬酸分离细胞核，在柠檬酸介质中分离细胞核可以显著地除去附着在细胞核膜上的细胞质成分。由于柠檬酸降低了溶液的ph值，这样可以减少细胞核的破碎率，并能分离得到较高分子质量的核酸，可能是由于核糖核酸（一种酸溶性蛋白）被柠檬酸除去，以及二价阳离子被柠檬酸螯合所致。 柠檬酸的浓度对分离细胞核的质量有较大影响。通常在较低的ph值时，可以得到较高的细胞核。但在过酸条件下，可能引起细胞核成分的改变和酶的失活。为了研究细胞内核酸，一般常在ph值为4，甚至在ph值为2.5时分离细胞核。如为了分离细胞核的酶，则需要较温和的条件，此时可以在ph值为6～6.2的极稀柠檬酸溶液中分离细胞核。
细胞核的分离与鉴定设计型实验设计报告_(2)
实验项目：细胞核的分离与鉴定 实验原理： 分离细胞核的可用方法有吸出法、原生质体破裂法、差速离心法排和排除法。差速离心法是根据细胞内各种细胞结构的比重和大小不同，因而在同一离心场内的沉降速率不同从而将细胞内的结构分级分离出来。本实验就采用差速离心法。 细胞核的鉴定，因为细胞核中主要含DNA，而DNA是碱性蛋白，可用甲苯胺蓝染液可使细胞核内碱性蛋白呈现出来。 实验器材：显微镜，普通离心机，离心管，滴管，玻璃漏斗，纱布，烧杯，解剖剪，镊子，玻璃匀浆器，载玻片/盖玻片，染色盘架，小白鼠肝脏。 实验试剂：甲苯胺蓝染液，蒸馏水，0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L的CaCl2溶液，生理盐水 实验步骤： （1）、用颈椎脱臼法处死小白鼠，迅速解开其腹腔取出肝脏，去出结缔组织，剪成小块，尽快置于盛有0.9%NaCl的烧杯中。反复洗涤尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。 （2）、将湿重为1g的肝组织放入烧杯中，用量筒取8ml预冷的0.25mol/L 蔗糖-0.003mol/L的CaCl2溶液，先加少量溶液于烧杯中，尽量剪碎肝组织后全部加入。 （3）、将剪碎的肝组织导入匀浆管中，使匀浆器下端侵入盛有冰块的器血
中，左手持，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3-5次。用3层纱布过滤于匀浆管中，然后制备一张涂片①，自然干燥。 （4）、将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机以2500r/min离心15min,弃去上清液。 （5）、用6mol 0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L的CaCl2溶液悬浮沉淀物，以2500r/min离心15min 弃去上清液，将残留液体用气管吹成悬液，滴一滴于干净的载盖玻片上，制成涂片②，自然干燥。 （6）在①·②上滴加甲苯胺蓝染液，染色5-7min，洗涤干燥后镜检。 ⑺记录观察结果 注意事项： （1）尽可能充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。 （2）将匀浆液置于蔗糖溶液上层时要沿管壁小心加入，同时及时离心，以防止浆液中的颗粒自然下沉过快，影响后面的离心分层效果。 （3）涂片制作过程中把握好涂片的力度，不可太厚。 （4）染色后的洗涤要注意时间，不可过长，避免将染色洗去，观察不到细胞核。 （5）开腹取出肝后，用生理盐水反复冲洗，避免血细胞对食盐的影响。 预期结果： 在低、高倍镜下，可以观察到经.0.1%碱性固绿染色的小白鼠肝细胞的细胞核体被染成绿色。说明这是碱性蛋白，即细胞核已游离出来。 涂片在高倍镜下可见肝细胞核已游离出来，被染成蓝紫色、圆形、中央有
实验设计-细胞核的提取与鉴定
医学细胞生物学设计型实验设计报告 姓名：李飘班级：K—10班学号：1020151004 评分 【实验项目】：动物细胞细胞核的分离与鉴定 【实验原理】：核体的制备核体是指含有少量细胞质并由质膜包裹的 细胞核。因为在实际中我们不可能100%的得到细胞核，因此,我们只能制备含有少量细胞质的核体，核体的制备方法主要有吸出法和原生质体破裂法等。在本实验中我们采用排除法来制备核体。排除法制备核体是通过细胞松弛素和高速离心的作用使细胞核排出，然后从离心管底部沉淀中收集获得核体。 细胞核的鉴定因为细胞核中主要含DNA，是碱性蛋白。因此将分离出的核体经三氯醋酸处理,抽提掉核酸后，用碱性固绿溶液染色，可以使细胞核内的碱性蛋白显示出来。 【实验步骤】： 1．细胞培养：将欲分离微核体和细胞质的动物接种于脱核塑料圆板上，使适宜的培养基中于37 ℃的条件下培养，使细胞固定在脱核塑料圆板上，脱核塑料圆板的直径应稍小于离心管的直径，使用前先用水洗干净再经过乙醇杀菌处理。 2．秋水仙碱处理：细胞培养一段时间以后，加入0.1ug/ml的秋水仙碱，处理细胞48～60h 滤纸，使细胞形成多个大小不同的核体。 3．细胞松弛素处理：在离心管内加入5ml预热至37 ℃的细胞松弛素B溶液将固定有动物细胞的圆板面朝下放入离心管内，固定圆板位置后，再加入10ml37 ℃的CB溶液。 4．离心：在1000～15000r/min核体从细胞排出。 5．收集核体：由于核体的贴附力弱，可以从离心管底部的沉淀中收集。 6．固定：将收集的核体涂于玻片上制成涂片，滴加15%乙醇于涂片上，固定5min，室温晾干。 7．三氯醋酸处理：将已固定的血涂片浸在90 ℃的三氯醋酸溶液中处理20min，细流水反复冲洗玻片上的三氯醋酸直至冲尽。用滤纸吸于玻片上多余水分晾干。 8．染色：将制作好的涂片放入0.1%碱性固绿染液中染色10～15min，细流水冲去多余染液，晾干，镜检。 【注意事项】： 1．在离心管内加入的5ml细胞核松弛素B溶液要预热到37 ℃，因为只有这样才接近动物的最佳体温37 ℃。 2．涂片在用三氯醋酸处理时，时间不宜过长或过短，过长会使核膜裂解，过短使抽提的核酸不够。 3．在染色时，时间一定要足够，否则染色不完全，得不到理想的实验结果。 4．因去掉胞质的核体贴附能力弱，因注意在固定、三氯醋酸处理、染色时、尽量避免胞核的脱落。 【预期结果】：经碱性固绿染色的核体涂片被染成绿色，说明这是碱性 蛋白，即细胞核。
病毒的分离与鉴定
病毒的分离与鉴定 （一）病毒的分离病毒分离的一般程序是：检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状鸡胚→病变或死亡细胞培养→细胞病变→鉴定病毒种型(血清学方法)无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离… （一）病毒的分离 病毒分离的一般程序是： 检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状 鸡胚→病变或死亡 细胞培养→细胞病变 →鉴定病毒种型(血清学方法) 无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离心后，取上清接种；咽洗液、粪便、尿、感染组织或昆虫等污染标本在接种前先用抗生素处理，杀死杂菌。 1．细胞培养用分散的活细胞培养称细胞培养（Cell culture）。所用培养液是含血清（通常为胎牛血清）、葡萄糖、氨基酸、维生素的平衡溶液，pH7.2～7.4。细胞培养适于绝大多数病毒生长，是病毒实验室的常规技术。 原代细胞培养(Primary cell culture) 用胰蛋白酶将人胚（或动物）组织分散成单细胞，加一定培养液，37℃孵育1-2天后逐渐在培养瓶底部长成单层细胞，如人胚肾细胞、兔肾细胞。原代细胞均为二倍体细胞，可用于产生病毒疫苗，如兔肾细胞生产风疹疫苗，鸡成纤维细胞产生麻疹疫苗，猴肾细胞生产脊液灰质炎疫苗。因原代细胞不能持续传代培养，故不便用于诊断工作。 二倍体细胞培养(Diploid cell cultune) 原代细胞只能传2-3代细胞就退化，在多数细胞退化时，少数细胞能继续传下来，且保持染色体数为二倍体，称为二倍体细胞。二倍体细
原代细胞分离纯化SOP
原代肝细胞分离纯化SOP 1、实验目的 分离和纯化原代干细胞，体外研究药物对原代肝脏细胞的毒性 2、实验方法 实验材料：ICR小鼠（20-30g） 实验试剂：20%乌拉坦或水合氯醛 0.1%肝素钠（Glucose 0.2g，0.125mM EDTA 8Ml,肝素钠 0.2g，1Mm HEPS 4.6Ml） 0.025%胶原酶（胶原酶12.5mg，L-15无血清培养基50Ml）Pecoll分离液：9份Pecoll+1份10×D-PBS（PH7.4）制成分离液。 3、实验步骤： 1．ICR小鼠禁食过夜。 2．取ICR小鼠，用20%乌拉坦或水合氯醛0.2-0.3ml腹腔麻醉。3．10-15min后固定小鼠，75%酒精消毒腹部后正中切开打开腹腔并更换器械。 4．显露肝门静脉并游离2-3cm；显露游离肝下腔静脉2-3cm，置一结扎线，暂不结扎。 5．穿刺针插入肝下腔静脉后立即结扎固定，尽快接通硅胶管并启动蠕动泵（无泵，输液器亦可）同时剪断肝门静脉远端。 6．从门静脉入肝素，使小鼠全身肝素化，并持续灌注至肝脏呈米黄色。 7．换肝素钠为胶原酶消化液（37℃预热）循环灌注消化，至肝质变
软，压之凹陷不易恢复。 8．停止灌注，小心剪取个肝叶置入消毒平皿内，加入约20mlDMEM 培养基（含血清，4℃预冷）祛除纤维结缔组织，制成混合肝脏细胞悬液。 9．200目筛网过滤入15ml离心管，100rpm离心5min。去上清，沉淀加入DMEM培养基（含血清，4℃预冷）7ml重悬。 10．取等体积肝细胞悬液悬浮于Pecoll分离液，颠倒混匀。11．4℃1000rpm离心10min，弃上清液，用PBS清洗肝细胞2次，4℃1000rpm离心10min。 12．肝细胞沉淀加入（含血清）重悬为3ml，取适量计数并用台盼蓝（3：1）判断活率。 13．活率在90%以上的肝细胞按2×103细胞密度接种于96孔板，每孔加入100ul DMEM培养基，于37℃ 5% CO2条件下培养24h。14．将化合物用DMSO稀释到所需浓度，每孔加药1ul（化合物终浓度通常为1000uM起始，10×梯度稀释，6个梯度），空白对照加入1ulDMSO。 15．细胞于37℃ 5% CO2条件下培养24h后，加入100ulATP检测试剂，震荡孵育10min。 16．于酶标仪上读取每孔荧光值。 17．计算各药物处理组细胞存活率。
常用地分离纯化手段
常用的分离纯化手段 分离 发布日期:2012-8-1有效日期至:2013-1-28查看联系方式 发布单位: 杭州哲博化工科技有限公司分析检测中心查看该会员所有的供求信息查看该会员所有的产品信息 常用的分离纯化手段 资深专家团队---专业检测机构---精准分析服务----先进仪器设备--雄厚技术实力赵老师 18 96 8197 425 哲博检测中心，浙大国家大学科技园提供【各种精细化工和高分子材料性能检测，成分分析，配方还原，工艺失效分析】【名校科研院所博士领衔、专业分析专家】 关键词：分离纯化配方分析成分分析 1. 化学分离法 蒸馏与分馏 分离沸点与挥发度相差较大组分的有效方法。有常压蒸馏，减压蒸馏，水蒸气蒸馏。适用于混合液体及液固的分离。 萃取 利用物质在不同溶剂中溶解度的不同和分配系数的差异，使物质达到相互分离的方法。适用于液固，液液的分离。 提取 利用不同的溶剂，从固体样品的基体中，使某种组分得到分离和浓缩。主要利用索氏提取器。如高聚物与填料，高聚物材料中微量助剂的提取与浓缩处理。缺点：①易引起热不稳定的组分变质②溶剂中的杂质也被浓缩③溶剂用量大 结晶与沉淀（溶解沉淀法） 利用样品中各组分在溶剂中的溶解度差异，使某些组分从浓溶液中生成结晶分离出来，是纯化物质的一种有效的方法。适用与高聚物的分离。 过滤与膜分离 过滤是分离液-固非均一体系常用的分离方法。适用于>1μm的颗粒。 膜分离适用于分离< 1μm的胶体颗粒。分为固体高分子膜，阳离子膜，阴离子膜。 灰化，酸化，微波消解—用于无机物的分离。 2. 色谱分离法： 柱色谱法—分离有机化合物的有效手段。分为： 硅胶填充柱—适用于分离大多数弱极性，中等极性和较强极性的化合物。 氧化铝填充柱—适用于分离非极性，弱极性化合物 聚酰胺填充柱—可用于染料，表面活性剂的分离。 阳离子交换柱—分离阳离子，适用于阳离子表面活性剂。 阴离子交换柱—分离阴离子，适用于阴离子表面活性剂。 凝胶色谱法 分为： 凝胶过滤色谱（GFC）—用于分离水溶性大分子。 凝胶渗透色谱（GPC）—用于有机溶剂中可溶的高聚物分子量分布分析及分离。 薄层色谱法—适用于有机化合物的分离。 纸色谱法—主要用于强极性和水溶性化合物，如氨基酸，糖类，有机酸及盐等的分离，亦可用于多种金属阳离子，阴离子的分离与鉴定。 气相色谱法—热稳定好，易挥发的中，小分子量的有机化合物的分离。
实验二 细胞核与线粒体的分离与观察
实验二细胞核与线粒体的分离与观察 一、实验目的 1．了解差速离心法分离细胞核与线粒体的原理。 2．掌握差速离心法分离动物与植物细胞的细胞核与线粒体的方法。 二、实验原理 细胞核（nucleus）是细胞中重要的细胞器，细胞的控制中心，在细胞的代谢、生长、分化中起着重要作用，是遗传物质的主要存在部位。线粒体（mitochondria）是真核细胞特有的能量转换的重要细胞器，是细胞进行有氧呼吸的主要场所。细胞中的能源物质—脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动需要。对细胞核和线粒体结构与功能的研究通常是在离体进行的，因而分离细胞核和线粒体是必须的。 差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心分离细胞核和线粒体。在确定的离心场中，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。在一均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。 缓冲的蔗糖溶液是常用的悬浮介质，它属于等渗溶液，比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。线粒体的鉴定用詹纳斯绿B（Janus green B）活染法，对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中染料被还原成无色。 从植物细胞分离线粒体除了作线粒体功能测定外，在植物细胞遗传工程中，常用于分离核外基因——线粒体DNA等目的。 分离线粒体的方法仍采用均匀介质中的差速离心。介质中0.25mol/L蔗糖也可以用0.3mol/L甘露醇代替。EDTA螯合二价阳离子，Ca2+除去后细胞间粘着解体，促使组织分散成单个细胞。牛血清白蛋白（BSA）能包在细胞外面，并作为
T细胞分离
T淋巴细胞分离技术免疫细胞的分离、纯化和鉴定第一节免疫细胞的分离、纯化技术各种免疫细胞的分工与协作，共同完成免疫应答及其调控，因此，各种免疫细胞的分离及其功能测定对于了解其在免疫应答中的作用及相互关系有着重要意义。 免疫细胞分离的方法有很多，主要是根据细胞的理化性状、功能，以及细胞表面标志等的差异而设计的。 粘附分离法、尼龙毛柱分离法、羰基铁分离法等主要根据细胞的属性（如粘附）和功能不同，旨在将粘附和非粘附或粘附力较小的细胞分离开。 有人证实免疫细胞在玻璃或塑料平面上的粘附能力分别为： 巨噬细胞或单核细胞〉树突状细胞二抗体产生细胞〉B淋巴细胞〉T淋巴细胞二红细胞。 粘附的细胞可通过trypsin洗脱而收集。 葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法和Percoll不连续密度梯度离心法等是根据细胞的大小及比重的差异进行细胞分离。 E花环沉淀分离技术主要是利用细胞表面标志进行细胞分离。 尚可利用特异性单克隆抗体结合其它技术分选细胞，如补体细胞毒分离法，洗淘分离法（panning）、流式细胞术分离法，以及免疫磁珠法分离细胞技术等。 一般应根据实验的目的及所需细胞的种类、纯度及数量等要求来确定采用何种方法。 实验一Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞（PBMC 外周血单个核细胞（Peripheralbloodmonuclearcell,PBMC的分离是免疫学研究中的一项基本技术。 目前国内外分离PBMC的常用方法是葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法 (ficoll-hypaquedensitygradientcentrifugation )，用此方法分离PBMC纯度可达95%，淋巴细胞约占90%，其中T淋巴细胞占80%, B淋巴细胞占4?10%。 ficoll-hypaque混合溶液，又称淋巴细胞分层液，在分离人PBMC时，要求
淋巴细胞的分离及鉴定
离心分离技术与淋巴细胞分离及鉴定 【实验目的】 1.了解离心分离技术的原理与分类。 2.掌握应用密度梯度离心法分离单个核细胞及B淋巴细胞鉴定的方法。 【实验原理】 1.利用离心力将悬浮液中的悬浮微粒快速沉降，借以分离比重不同的各种物质成分。因此 用比重与被分离细胞比重相近的细胞分离液则可通过密度梯度离心方法，在分离液界面上收集到所需要的单个核细胞。 2.用过氧化物酶标记的抗IgM，在一定条件下与淋巴细胞混合，标记的抗IgM抗体可以与 B细胞表面的IgM结合，通过DAB显色，在普通光学显微镜下观察可见细胞膜上出现特定染色。 【实验步骤】 一.细胞分离 1.将小鼠用颈椎脱臼法处死，解剖左侧腹腔靠上部位，将腹膜剪开，找到并取出脾脏。 2.将脾脏置于培养皿内100目筛网上，加入8ml的生理盐水，用磨棒磨碎脾脏后过滤，即 获得脾细胞混合悬液。 3.1500rpm,5min,离心细胞混合悬液，弃部分上清，调整体积至4ml,重悬细胞。 4.取盛有3ml细胞离心液（比重1.088）的试管一支，用移液器加入细胞混合液4ml。 5.将试管离心1800rpm，（上升和下降率为2）20℃30min。 6.离心后取出试管，观察细胞分层，底层为红色的红细胞，依次向上为细胞分离液和生理 盐水，在此之间可见一层淡淡地白色细胞层。 7.用尖吸管小心取出中层间的细胞到另一洁净离心管，并加2ml PBS洗涤一次，1500rpm 离心5min后去上清。 8.再将细胞均匀悬浮于0.1ml PBS中，取出10μl滴于黏附剂处理的载玻片上，自然干燥后， 可进行细胞类型鉴定。 二.细胞鉴定 1.分离出单个核细胞并取出10μl滴于黏附剂处理的载玻片左右各一滴涂片，自然干片 2.在室温条件下，用甲醇固定细胞，自然干燥后用蜡笔标出细胞范围，蒸馏水洗三次。 3.配制封闭液。室温浸泡30分钟，PBS洗3次。 4.滴加适当稀释（1:100）的过氧化物酶标记的兔抗小鼠IgM抗体于左侧涂片，滴加适量 的封闭液于右侧涂片（做阴性对照），于37℃30分钟，PBS洗2分钟3次。 5.滴加DAB显色液，37 ℃显色30分钟，蒸馏水洗3次，干片后，显微镜下观察。 【注意事项】 1.向分离液管加脾细胞混合悬液时应沿试管壁缓缓加入，使脾细胞混合悬液与分离液形成 明显的界面，小心放取试管，保持界面完整，避免打乱界面，影响分离效果。 2.在滴DAB显色液前要彻底去除游离的抗体，以免假阳性结果。 3.DAB潜在致突变作用，请注意适当防护,请穿实验服并戴一次性手套操作。 【实验结果】 如下图：
树突状细胞的分离纯化与鉴定
树突状细胞的分离纯化与鉴定 自从Stciman首次发现树突状细胞(dendritic cell ,DC) 以来, 人们对DC的认识随着它的分离与纯化技术的改进而逐步深入, 认识的深入又进一步促进了DC分离与纯化技术的提高。现已能够从大多数组织中得到高纯度的、各具特异性的DC。DC的纯化方法包括两大类: (1) 物理方法: ①根据细胞的黏附性进行分离, 有黏附分离法、尼龙毛分离法、羰基碳分离法, 各种淋巴细胞的黏附能力依次为巨噬细胞> DC = 抗体产生细胞> B细胞> T细胞; ②根据细胞的大小比重进行分离, 包括聚蔗糖2泛影葡胺( Ficoll2 Paque) 密度梯度离心、Percoll非连续性/ 连续性密度梯度离心、E花环沉淀分离; (2) 免疫分选: 包括淘洗法( Pan2 ning) 、流式细胞术(fluid cytometry ,FCM) 、磁性细胞分离术 (MACS) 。以下就不同组织DC的分离作一综述。 1 从外周血直接分离DC 首先分离外周血单个核细胞( PBMC) 。常用方法有: (1) Ficoll不连续密度梯度离心, 将人外周抗凝血稀释置于 Ficoll2Paque淋巴细胞分离液上离心, 速度(170 g～1 000 g)和时间(20～45 min) 因各个实验室而异, 分离液与血浆之间的界面层细胞即是PBMC; (2) Percoll连续/ 不连续密度梯度离心: 方法基本与密度梯度离心相同, 可在Ficoll不连续密度梯度离心的基础上进一步纯化DC。玫瑰花沉淀法大体上可将PBMC 分为ER+ 和ER 2细胞,其中ER+ 主要是T细胞。Nijman采用磁珠阴性选择法, 即用与抗CD14、CD15、CD16、CD19、CD56单抗相连的磁珠分别去除ER2细胞中的单核细胞、B 细胞、NK细胞和粒细胞, 所得的“新鲜DC”(f2DC) 纯度经流式细胞术(FACS) 检测达到85 %～90 %。如果将ER2细胞培养36 h再加2次各40 min贴壁培养去除黏附细胞, 将未黏附细胞置于1415 %甲泛葡胺上离心去除B细胞、NK细胞, 可得到90 %～95 %纯度的“培养DC” (c2DC) 。f2DC和c2DC分别具有未成熟 DC和成熟DC的典型特征。 Young的一种方法是用Percoll分离液先分离PBMC中的单核细胞, 或玫瑰花法得到的经短暂培养去除黏附细胞的ER2细胞; 另一种方法是先用玫瑰花节法分离出ER2细胞, 培养36 h去除单核细胞和黏附细胞, 两种方法最后将所得细胞经Percoll密度梯度离心, 高密度部分富含B细胞, 低密度部分DC纯度为40 %～80 %Thomas则用L亮胺酰2L亮胺酸2甲基酯(LLME) 处理ER2细胞以杀死去除单核细胞和有细胞毒作用的细胞, 再经14-15 %
细胞分离技术
细胞分离技术 一、离心技术 离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体，以及各种大分子基本手段。一般认为，转速为10~25Kr/min的离心机称为高速离心机；转速超过25Kr/min，离心力大于89Kｇ则称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达100Kr/min，离心力超过500Kg。 （一）、差速离心（differential centrifugation） 在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器（图2-22）。 在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。 由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，而且某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中，一般重复2～3次效果会好一些。 差速离心只用于分离大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。通过差速离心可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。 图2-22 速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀 （二）、密度梯度离心（density gradient centrifugation） 用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种（图2-23）。密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求：1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2）PH中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒。
图2-23 A等速度沉降，B等密度沉降 1、速度沉降 速度沉降（velocity sedimentation）主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。这种降方法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。 生物颗粒（细胞或细器）在十分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。 2、等密度沉降 等密度沉降（isopycnic sedimentation）适用于分离密度不等的颗粒。 细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和是够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。 等密度沉降通常在较高密度的介质中进行。介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度，而且介质的梯度要求较高的陡度，不能太平缓。再者，这种方法所需要的力场通常比速率沉降法大10~100倍，故往往需要高速或超速离心，离心时间也较长。大的离心力、长的离心时间都对细胞不利。大细胞比小细胞更易受高离心力的损伤，而且停留在等密度介质中的细胞比处在移动中的细胞受到更大的损伤。因此，这种方法适于分离细胞器，而不太适于分离和纯化细胞。 二、流式细胞术 流式细胞术是对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。在分析或分选过程中，包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%（图2-24）。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计（flow cytometer）。
常用的微生物分离纯化方法
(一) 常用的微生物分离纯化方法 菌种分离纯化的方法有：稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法、平板划线分离法、稀释摇管法、液体培养基分离法、单细胞分离法、选择培养分离法等。其中前三种方法最为常用,不需要特殊的仪器设备, 分离纯化效果好, 现分别简述如下 1. 稀释混合倒平板法 平板是指经熔化的固体培养基倒入无菌培养皿中, 冷却凝固而成的盛有固体培养基的平皿。该法是先将待分离的含菌样品, 用无菌生理盐水作一系列的稀释(常用十倍稀释法, 稀释倍数要适当), 然后分别取不同稀释液少许(0.5-1.0ml)于无菌培养皿中, 倾入已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基, 迅速旋摇, 充分混匀。待琼脂凝固后, 即成为可能含菌的琼脂平板。 于恒温箱中倒置培养一定时间后, 在琼脂平板表面或培养基中即可出现分散的单个菌落。每个菌落可能是由一个细胞繁殖形成的。挑取单一个菌落, 一般再重复该法1-2次, 结合显微镜检测个体形态特征,便可得到真正的纯培养物。若样品稀释时能充分混匀,取样量和稀释倍数准确,则该法还可用于活菌数测定。
图 4 混合倒平板操作法示意图图 5 涂布平板操作法示意图 2. 稀释涂布平板法 采用上述稀释混合倒平板法有两个缺点，一是会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间,缺乏溶氧而生长受影响,形成的菌落微小难于挑取；一是在倾入熔化琼脂培养基时，若温度控制过高,易烫死某些热敏感菌，过低则会引起琼脂太快凝固, 不能充分混匀。 在微生物学研究中, 更常用的纯种分离方法是稀释涂布平板法。该法是将已熔化并冷却至约50℃(减少冷凝水)的琼脂培养基, 先倒入无菌培养皿中, 制成无菌平板。待充分冷却凝固后,将一定量(约0.1 ml)的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面, 再用三角形无菌玻璃涂棒涂布,使菌液均匀分散在整个平板表面, 倒置温箱培养后挑取单个菌落。
细胞分离纯化
1 小鼠腹腔巨噬细胞 雌性小鼠脊椎脱臼处死, 75% 酒精消毒3 min; 用预冷的Hanks液（不含钙镁离子）洗出腹腔细胞, 1 000 r/m in 离心5min , 调整细胞浓度为每毫升1×106个, 置细胞瓶中培养4 h, 弃去培养液,，留下贴壁细胞，即为巨噬细胞，PBS洗涤两次, 加入含10%小牛血清的1640培养基。 参考文献 【1】The immune response of peritoneal macrophages due to exposure to inorganic lead in the house mouse Mus musculus 【2】A study on the immune receptors for polysaccharides from the roots of Astragalus membranaceus, a Chinese medicinal herb 【3】海洋真菌多糖YCP结合的免疫细胞类型的体外筛选 2 小鼠脾巨噬细胞 通过研磨法获取脾细胞, 将脾细胞重悬在1mL细胞培养基内，小心加于2mL的淋巴细胞分层液面上, 2000r/min密度梯度离心20min, 小心吸出第二层细胞, 放入含Hanks液15mL 的试管中充分混匀后, 离心弃上清, 加入含10%小牛血清的1640 培养基6mL, 调整细胞浓度为每毫升5×106个, 37℃、5% CO2培养瓶中培养2h, 洗去非贴壁细胞, 获得纯化的脾巨噬细胞。 主要试剂：淋巴细胞分层液 参考文献 【3】海洋真菌多糖YCP结合的免疫细胞类型的体外筛选 【4】Effects of repeated social stress on leukocyte distribution in bone marrow, peripheral blood and spleen 【5】Differential response of splenic monocytes and DC from cattle to microbial stimulation with Mycobacterium bovis BCG and Babesia bovis merozoites 【6】Flow cytometric identification of murine neutrophils and monocytes 【7】CHARACTERIZATION AND REGULATION OF RB6-8C5 ANTIGEN EXPRESSION ON MURINE BONE MARROW CELLS 3脾B、T细胞 研磨法获取脾细胞，红细胞裂解液去除红细胞。通过生物素化的抗CD4, CD8（T细胞）, GR-1（MΦ）和CD11c（DCs）抗体和链霉素化磁珠M-280分选出脾B细胞，通过生物素化的抗B220（B细胞）, GR-1和CD11c 分选出脾T细胞。 参考文献 【8】Induction of dendritic cell maturation by β-glucan isolated from Sparassis crispa 【9】Rgs1 and Gnai2 Regulate the Entrance of B Lymphocytes into Lymph Nodes and B Cell Motility within Lymph Node Follicles 【10】Abnormal B-Cell Responses to Chemokines, Disturbed Plasma Cell Localizationl 4大鼠肝Kupffer细胞 非实质肝细胞混悬液（NPC）的制备：选用雄性的Spraqae-Dawley清洁级大鼠, 8～12周龄, 体重200～300 g。10%的氯胺酮麻醉, 腹腔内注射。腹部剃毛, 消毒、贴膜后固定于操作台上。切开腹壁、进入腹腔, 分别显露门静脉及下腔静脉, 于下腔静脉内注入1 000单位/ ml 的肝素1 ml。游离门静脉, 结扎远端, 剪开血管, 置入直径4 mm 的硅胶管, 深度不宜超过肝门, 供灌注用。同样处理下腔静脉, 置入2mm硅胶管, 供引流用, 同时阻断上腔静脉。灌注冲洗: 用预热37℃的D-Hanks 液灌注, 采用电子蠕动泵控制流速为40 ml/ min, 快速灌注冲洗5min, 以流出液变清和肝表面呈黄白色为标准。胶原酶原位循环灌注消化: 冲洗完成
抗生素分离纯化应用膜分离技术的优势
抗生素分离纯化应用膜分离技术的优势 2020年8月22日
抗生素主要是由细菌、霉菌或其他微生物产生的次级代谢产物或人工合成的类似物，直径在0.1-0.22微米之间，主要用于治疗各种细菌感染或致病微生物感染类疾病。 抗生素分离纯化 抗生素的生产过程中作为半成品的发酵液和成品的液体型产品中，可能存在众多影响生产控制和成品品质的菌体、蛋白、有机抗体和无机离子，这些物质的存在轻则影响产品的纯度，重则产生污染导致抗生素成品报废。而传统的板框、絮凝沉降、硅藻土等过滤精度较低，只能对这些杂质进行粗分离，无法彻底截留。 抗生素分离纯化技术 将膜分离技术成功运用到抗生素发酵液的澄清除杂、浓缩精制的生产过程中，分子级过滤精度，成功解决了发酵液工业化生产中的分离提纯和浓缩难题，同时实现了清洁生产，节能降耗的目的。为发酵液生产企业提供了经济、先进、合理的解决方案。 抗生素膜分离优势 1、常温进行，条件温和无成分破坏，特别适宜对热敏感的物质; 2、纯物理过滤，无相变、质变，不破坏有效成分;
3、过滤精度高，孔径分布均匀，可实现发酵液有效成分的纯化和浓缩; 4、系统操作简单、流程短、易清洗和维护; 5、系统错流运行设计，无需添加助滤剂，不会引入新的杂质，彻底解决污染堵塞难题; 6、系统模块化设计，滤材更换方便，设计在线再生清洗和排污装置，降低劳动强度和生产成本，提高生产效率。 德兰梅勒利用膜分离技术为生物制药、食品饮料、发酵行业、农产品深加工、植物提取、石油石化、环保水处理、空气除尘、化工等行业提供分离、纯化、浓缩的综合解决方案，满足不同客户的高度差异化需求。帮助客户进行生产工艺的上下游技术整合与创新，帮助企业节省投资、降低运行费用、减少单位消耗、提供产品质量、清洁生产环境，助力企业产业升级。