细胞侵袭实验-transwel法
实验意义：上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，中间的聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，细胞欲进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜。计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力。
一、试剂
1、Matrigel 基质胶：用时加入0.5ml的DMEM；Matrivgel在冰上维持液态，室温时可迅速凝结成胶。使用前应从-80 度取出至4℃待其自然溶化（如过夜放置），避免反复冻融。使用时需接触Matrivgel的试管、枪头、移液管、Transwell 小室等均应预冷于4℃；注意无菌操作，BD 公司
2、RPMI 1640 培养基（含10% 低毒无支原体新生牛血清的pH 为6.5，可培养HCT116），Gibco 公司
3、DMEM 高糖培养基（DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基、含10%小牛血清，可培养SW480 细胞），Gibco 公司
4、McCOY's 5A培养液（可培养HT29、HCT116），Gibco 公司
5、10%胎牛血清FBS，Gibco 公司或者Hyclone美国
6、100 U /mL 青霉素，100U /mL链霉素
7、甲醇
8、0. 1% 结晶紫染液
9、PBS磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline）
10、0.05%-0.2% BSA牛血清白蛋白
11、纤维粘连蛋白FN或者胶原（collagen）
12、胰蛋白酶
二、器材
1、Transwell 小室，孔的大小有8、12两种，一般用8论坛里常用的是Costar、Corning、BD生产的小室，
2、细胞培养板，需与小室相配套，常用24孔
2、CO2细胞培养箱
3、倒置显微镜
4、移液枪、枪头
5、离心机
6、镊子、烧杯
三、简略步骤
1、Matrigel在4℃过夜融化；稀释分为1：1、1：5、1：8，根据肿瘤细胞的侵袭能力来选择
用4℃预冷的无血清培养基稀释Matrigel至终浓度1mg/ml？，冰上操作；所用试剂和仪器-20或者4℃预冷
取300ul无血清条件培养基，加入60ul（或50ug/每室）Matrigel ，这里是1：5稀释，混匀，（4℃操作，最好在冰浴上）
用无血清培养基稀释Matrigel胶至300 ul/ml（1：8）
黄芩素对人结肠癌细胞SW480增殖、凋亡、侵袭的影响及机制：Matrigel 稀释10 μg /μL，不同浓度黄芩素处理48 h，SW480 细胞调整浓度为1 ×105 /mL，200 μL 加入上室，
下室加入600 μL，先擦细胞，4% 甲醛溶液，结晶紫染色。
2、取100μl稀释后的Matrigel均匀涂抹于chamber上室底部的膜上，37℃温育3小时左右，取出于超净工作台过夜干燥，或者温育4-5h，也有的直接温育过夜，如果需要在下室面铺纤维粘连蛋白FN的话，可将200ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原（collagen）的话，一般配成0.5mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。
3、水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/L BSA的无血清培养液，37℃，30min。这一步是方面把胶铺好，有的实验不进行这一步。所有细胞培养试剂和Transwell chamber 放在37℃温育；
4、待测细胞培养至对数生长期，不同浓度试剂处理48 h，可先让细胞撤血清饥饿12－24h （这两部不知可不可以同时进行），用胰酶消化细胞，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用，终止消化后，离心弃去培养液，用PBS洗2-3遍，用含BSA的无血清培养基悬浮细胞（称为重悬），计数，调整浓度为2×105/ml？（1-10×105/ml，最高5）；
5、在下室（即24孔板底部）加入500－800μl（看说明书，一般500）含10％胎牛血清FBS 的条件培养基，上室先用无血清培养基洗一次，然后加入100－200μl（具体数值看说明书）细胞悬液，将小室放在加了培养基的下室孔内，注意下层培养液和小室间不要有气泡产生，继续在孵箱37℃、5% CO2培养24小时(12-48小时看情况而定)；时间过长细胞会重新回到小室里。
6、用镊子取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用棉签轻轻擦去未穿过Transwell chamber 膜的细胞（有的染色后才擦），用无钙的PBS洗2遍，将其下表面浸泡在70%甲醇溶液中（一半加在小室，一半加在下面），固定30-60分钟
7、0.1%结晶紫染色20 min，用PBS洗2-3遍。
8、显微镜下观察，计数。
细胞迁移和侵袭实验
细胞迁移和侵袭实验 实验准备： 细胞，24孔板，transwell小室（8μm，24孔板专用），ECM Gel，10%FBS+培养基，无血清培养基，10 μ、200 μL、1000 μL移液器及配套枪头，1.5 mL EP 管，冰盒 实验设计： 实验分组一般分为阴性组（上下层均没有趋化因素），实验组（按照实验需要，上层或者下层加入趋化因素），对照组（趋化因素与实验组中的相反）。如果有特别需要，可以再加上阳性组（上下层都有趋化因素）。 实验操作（请细读注意事项）： 一、细胞侵袭实验 1.ECM Gel原液提前1 h放在4 ℃冰箱中解冻，实验前转移到冰盒中。 2.将1.5 mL EP、枪头盒、transwell放在24孔板里面后，置于冰上预冷。 3.根据自己的使用量，按照ECM Gel : 无血清培养基=1 : 7.5在冰上稀释成使 用液。 4.把枪头剪去一小段（约3 μm）后在冰上吸取40 μL/孔ECM Gel使用液轻轻 加入transwell上室中，加入时慢慢移动枪头，保证液体平铺在底部。 5.放在37 ℃孵箱15 min，让胶凝固。 6.消化、离心、计数细胞后，按照2.5x104 / mL用无血清培养基稀释细胞， 制成细胞悬液（如果细胞很多，这一步可以提前，在4、5之前做）。 7.按照每孔200 μL，将细胞悬液加入transwell上室，同时在transwell下室加 入10%FBS+培养基500 μL，放入37 ℃孵箱培养。 8.若干小时后取出，吸去transwell上室多余液体，用PBS清洗两次，用棉棒 在上室中轻轻转动，吸干水分并擦去膜内侧的细胞。 9.在上室中加入结晶紫染液，染色5 min，回收染液，用流水缓缓冲去染液， 再次用棉棒在上室中轻轻转动，吸干水分。 10.在正置显微镜上放置一块载玻片，将transwell小孔倒置放在上面，拍照。 11.在100倍视野下，对膜的上下左右及中间计数，做平均数。
细胞迁移侵袭实验操作步骤
实验介绍 细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 实验步骤： 1材料准备： 可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（%（g/ml）PBS结晶紫） 2步骤和流程 基质胶铺板： 用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。 制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。 接种细胞 ①取细胞悬液100μl加入Transwell小室。 ②24孔板下室一般加入600μl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。24h较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 结果统计 直接计数法，“贴壁”细胞计数，这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的
实验七 探究酵母菌的呼吸方式
实验七探究酵母菌的呼吸方式 一、实验原理： 1．酵母菌是一种单细胞真菌，在有氧和无氧的条件下都能生存，属于兼性厌氧菌，因此便于用来研究细胞呼吸的不同方式。方程式： 2．CO2可使澄清石灰水变混浊，也可使溴麝香草酚蓝水溶液由蓝变绿再变黄。根据石灰水混浊程度或溴麝香草酚蓝水溶液变成黄色的时间长短，可以检测酵母菌培养CO2的产生情况。 3．橙色的重铬酸钾溶液，在酸性条件下与乙醇（酒精）发生化学反应；在酸性（浓硫酸溶液）条件下，变成灰绿色。 二、实验装置：（见课本）下图为“探究酵母菌细胞呼吸的方式”的实验装置图，请 据图分析 (甲)：有氧呼吸装置(乙)：无氧呼吸装置 1、A瓶加入的试剂是NaOH溶液，其目的是：使进入B瓶的空气先经过NaOH处理，排除空气中CO2对实验结果的干扰。 2、C瓶和E瓶加入的试剂是澄清石灰水（或溴麝香草酚蓝水溶液），其作用是：检测CO2的产生。 3、D瓶应封口放置一段时间后，再连通E瓶，其原因是：D瓶应封口放置一段时间后，酵母菌会将瓶中的氧气消耗完。再连通E瓶，就可以确保通入澄清石灰水（或溴麝香草酚蓝水溶液）的CO2是酵母菌的无氧呼吸所产生的。 三、结果检测： （1）检测CO2的产生：使澄清石灰水变浑浊；或使溴麝香草酚蓝水溶液由蓝变绿再变黄。 （2）检测酒精的产生：橙色的重铬酸钾溶液，在酸性条件下与酒精发生反应，变成灰绿色。 【资料】溴麝香草酚蓝：也叫溴百里酚蓝，英文名Bromothymol Blue，简称为BTB，酸碱指示剂；吸附指示剂。
分子式：C27H28Br2O5S，分子量：624.39，产品性状：浅玫瑰色结晶性粉末，熔点200～202℃，易溶于乙醇﹑醚﹑甲醇及稀氢氧化碱溶液。稍溶于苯﹑甲苯及二甲苯，微溶于水，几乎不溶于石油醚。溴麝香草酚在碱性溶液中呈蓝色，在酸性溶液中呈黄色。 溴麝香草酚蓝是一种酸碱指示剂，变色范围pH6.0（黄）～7.6（蓝）。普通水是中性，pH也就是7左右，差不多呈淡蓝，溶有CO2后，由于会形成碳酸，碳酸是弱酸，因此pH不会降太多，变黄。当中过渡颜色是绿色或检测CO2的产生：使澄清石灰水变浑浊，并使溴麝香草酚蓝水溶液由蓝变绿再变黄。
Transwell侵袭实验全面总结
Transwell侵袭实验全面总结 第一节概念 这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。 1．Transwell trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable support s）。更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（T ranswell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。 但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有－μm，根据不同需要
可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。下图是一个Trans well装置的纵切面 将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养 液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验： （1）共培养体系： 小于孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择μm以下孔径。常用、μm。我们实验室用的是μm。将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。
肿瘤细胞迁移实验(细胞划痕法)讲义
抗肿瘤药物5氟尿嘧啶对肿瘤细胞 迁移的影响 欧阳学文 （细胞划痕法） 实验导读 瘤组织的增殖失控、瘤细胞的分化异常、瘤细胞具有侵袭和转移的能力是恶性肿瘤最基本的生物学特征，而侵袭和转移又是恶性肿瘤威胁患者健康乃至生命的主要原因。因此研究肿瘤侵袭和转移的规律及其发生机制，对恶性肿瘤的防治有重要意义。 肿瘤转移是指恶性肿瘤细胞从原发部位侵入淋巴管、血管或体腔，至靶组织或靶器官，长出与原发瘤不相连续而组织学类型相同的肿瘤。前者称为原发瘤，后者称为转移瘤或继发瘤。 图1 肿瘤转移示意图 根据肿瘤异质性理论，大多数恶性肿瘤最初虽属单克隆起源，但它在不断增殖演进至临床明显的肿瘤时，由于瘤细
胞遗传性状的不稳定性(来自基因突变或缺失等)而不断地变异，造成该肿瘤内瘤细胞亚群表型的多样性，诸如瘤细胞的侵袭性、生长速率、转移能力，核型乃至对激素的反应性和抗肿瘤药物的敏感性等，这些瘤细胞亚群具有被此不同的特性即所谓异质性。异质性与肿瘤转移直接有关的就是癌细胞的转移潜能，癌细胞的转移潜能有高低之分，具有高转移潜能的筋细胞易发生转移。 肿瘤细胞的运动性，来源于细胞运动“接触抑制”的概念。通过体外培养正常和恶性结缔组织细胞，发现正常纤维母细胞在移动过程中引起的皱栖脑膜与其他细胞的表面接触时，往往产生细胞膜活动的抑制和移动中细胞的缩短，然后停止。当纤维母细胞生长过程中在培养皿上融合形成一单层时，细胞运动即显著受到抑制。间变的肉瘤细胞则缺乏接触抑制，瘤细胞的运动不会被正常纤维母细胞所抑制。 针对肿瘤转移这一复杂的过程，人们研制了各种抗转移药物，如血小板凝集抑制剂、血管生成抑制因子、内皮稳定因子、干扰素－α以及其他化学药物。
《探究酵母菌呼吸方式》实验教学设计
《探究酵母菌呼吸方式》实验教学设计 田秋红 一．教材分析 “细胞呼吸”是人教版《生物必修一·分子与细胞》第五章第三节的内容。为了学生能直接获得经验并提高探究能力，本节内容安排第一课时为探究活动。通过对酵母菌细胞呼吸方式的探究让学生亲身感受有氧和无氧条件下的细胞呼吸。通过酵母菌细胞呼吸方式的探究，学生认识到有氧呼吸和无氧呼吸的条件及产物，为后面学习有氧呼吸和无氧呼吸的过程打下了基础。 二．学情分析 本节的授课对象是高一的学生 1细胞呼吸是一个微观的化学反应过程，抽象，学生理解起来可能有一定的困难，现在通过对酵母菌细胞呼吸方式的实验探究过程让学生从中获得直接经验。 $ 2利用已学习过的简单的对照实验和相关的实验设计原则，使本节课的实验设计得以顺利进行。 三．教学目标 知识目标1.简述细胞呼吸的概念； 2.说出酵母菌细胞呼吸的方式和产物。 实验能力目标1.尝试进行对比实验方案设计； 2.学会对实验条件的控制和对实验结果的检测； 3.对实验结果和实验装置做出合理的分析与判断。 ! 情感目标通过探究活动，培养科学的学习方法，养成科学态度，建立科学价值观。 四．重点难点 重点：探究酵母菌细胞呼吸的方式的实验设计。 难点：设计、进行实验，对实验结果做出客观、科学的分析与判断。 五．实验准备： 1.兴趣小组的学生提前一天制作发酵的面团 , 2.因为按教材有氧呼吸和无氧呼吸的实验时间较长，提前让兴趣小组的学生按教材实验装置安装并实 施实验。 3.教师准备多媒体课件和实验装置，学案。 六．教学流程： 课堂小游戏，活跃气氛、引入新课
通过化学知识推测呼吸方式有两种 》 观察现象，对反应式在推测的基础上做以完善 分析检验的方法，展示演示小实验 通过评价面团实验，引入实验设计 引导学生分析实验装置图，分析讨论实验观察的方法和检验方法。 ` 展示兴趣小组的实验结果 利用学生的结论进一步完善有氧和无氧呼吸的反应式，学生尝试写出细胞呼吸的概念 进一步分析实验装置的改进。 结束 &
细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)
迁移实验（cell migration assay） 实验介绍 细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 实验步骤： 1材料准备： 可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM 完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫） 2步骤和流程 2.1基质胶铺板： 用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。 2.2制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。 2.3接种细胞 ①取细胞悬液100μl加入Transwell小室。 ②24孔板下室一般加入600μl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。24h较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 2.4结果统计 直接计数法，“贴壁”细胞计数，这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去，通过给细胞染色，可在镜下计数细胞。 取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用无钙的PBS洗2遍，甲醇固定30分钟，将小室适当风干。 0.1%结晶紫染色20 min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。 400倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数。 实验材料
2020版高考生物一轮复习高考必考教材实验六--探究酵母菌的呼吸方式及实验拓展
高考必考教材实验(六)——探究酵母菌的呼吸方式及实验拓展 (国考5年未考)(地方卷：2018天津卷；2018浙江卷；2017海南卷；2015安徽卷；2013广东卷) 【师说考问】 考问1 探究酵母菌的呼吸方式 (1)实验原理 (2)实验流程 提出问题：酵母菌使葡萄糖发酵产生酒精的条件是有氧还是无氧？酵母菌在有氧和无 氧条件下细胞呼吸的产物是什么？ ↓ 作出假设：针对上述问题，根据已有的知识和生活经验(如酵母菌可用于酿酒、发面等)作出合理的假设 ↓ 科学思维 1．为什么选酵母菌作为实验材料？ 提示：酵母菌在有氧、无氧条件下都能生存，可通过测定其细胞呼吸产物来确定酵母 菌的细胞呼吸方式。 2．为什么先将空气通过10%的NaOH溶液，再进入酵母菌培养液中？ 提示：10%的NaOH溶液用于吸收空气中的CO2，以保证用于检测产物的锥形瓶中澄清 石灰水变浑浊是由酵母菌有氧呼吸产生的CO2导致的。
3．用于测定无氧呼吸的装置中，为什么将酵母菌培养液封口放置一段时间后，再连通盛有澄清石灰水的锥形瓶？ 提示：酵母菌将锥形瓶中的氧气消耗完毕后再进行检测，以确保通入澄清石灰水中的CO2是由无氧呼吸产生的。 4．实验设计需遵循对照原则，此实验为何不设置对照组？ 提示：此实验为对比实验，对比实验不设对照组，而是通过有氧和无氧条件下的两个实验组相互对比得出实验结论。 5．实验所用的葡萄糖溶液为什么需煮沸？ 提示：煮沸的主要目的是灭菌，排除其他微生物的呼吸作用对实验结果造成干扰。 考问2 实验拓展 (1)运用液滴移动情况探究酵母菌呼吸方式的方法 ①欲确认某生物的呼吸类型，应设置两套呼吸装置，如下图所示(以发芽种子为例)。 ②实验结果预测和结论(见下表)： (2)细胞呼吸速率的测定 ①实验装置 ②实验原理：组织细胞呼吸作用吸收O2，释放CO2，CO2被NaOH溶液吸收，使容器内气体压强减小，刻度管内的液滴左移。单位时间内液滴左移的体积即表示呼吸速率。装置乙为对照。 ③误差的校正 a．如果实验材料是绿色植物，整个装置应遮光处理，否则植物的光合作用会干扰呼吸速率的测定。 b．如果实验材料是种子，为防止微生物呼吸对实验结果的干扰，应对装置及所测种子进行消毒处理。 c．为防止气压、温度等物理膨胀因素所引起的误差，应设置对照实验，将所测的生物材料灭活(如将种子煮熟)，其他条件均不变。 【题组跟进】
《探究酵母菌呼吸方式》实验教学设计78748
《探究酵母菌呼吸方式》实验教学设计 一．教材分析 “细胞呼吸”是人教版《生物必修一·分子与细胞》第五章第三节的内容。为了学生能直接获得经验并提高探究能力，本节内容安排第一课时为探究活动。通过对酵母菌细胞呼吸方式的探究让学生亲身感受有氧和无氧条件下的细胞呼吸。通过酵母菌细胞呼吸方式的探究，学生认识到有氧呼吸和无氧呼吸的条件及产物，为后面学习有氧呼吸和无氧呼吸的过程打下了基础。 二．学情分析 本节的授课对象是高二的学生 1细胞呼吸是一个微观的化学反应过程，抽象，学生理解起来可能有一定的困难，现在通过对酵母菌细胞呼吸方式的实验探究过程让学生从中获得直接经验。 2利用已学习过的简单的对照实验和相关的实验设计原则，使本节课的实验设计得以顺利进行。 三．教学目标 知识目标1.简述细胞呼吸的概念； 2.说出酵母菌细胞呼吸的方式和产物。 实验能力目标1.尝试进行对比实验方案设计； 2.学会对实验条件的控制和对实验结果的检测； 3.对实验结果和实验装置做出合理的分析与判断。 情感目标通过探究活动，培养科学的学习方法，养成科学态度，建立科学价值观。四．重点难点 重点：探究酵母菌细胞呼吸的方式的实验设计。 难点：设计、进行实验，对实验结果做出客观、科学的分析与判断。 五．实验准备： 1.兴趣小组的学生提前一天制作发酵的面团 2.因为按教材有氧呼吸和无氧呼吸的实验时间较长，提前让兴趣小组的学生按教材实验装置安装并实施实验。 3.教师准备多媒体课件和实验装置，学案。 六．教学流程： 课堂小游戏，活跃气氛、引入新课 通过化学知识推测呼吸方式有两种 观察现象，对反应式在推测的基础上做以完善
分析检验的方法，展示演示小实验 引导学生分析实验装置图，分析讨论实验观察的方法和检验方法。 展示兴趣小组的实验结果 利用学生的结论进一步完善有氧和无氧呼吸的反应式，学生尝试写出细胞呼吸的概念 进一步分析实验装置的改进。 结束
Transwell实验 超详细
Transwell侵袭实验总结 第一节概念 这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。 1.Transwell 关于Transwell这个词该如何解释，查了很多资料也未见准确的注解，我觉得可以这么理解吧，trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。 更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。 但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0μm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。 下图是一个Transwell装置的纵切面
将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。 我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择，当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验： （1）共培养体系： 小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0μm以下孔径。常用0.4、3.0μm。我们实验室用的是0.4μm。
肿瘤细胞侵袭实验(Tumour Invasion Assay)
肿瘤细胞侵袭实验（Tumour Invasion Assay ） 肿瘤细胞侵袭实验（TumourInvasionAssay ）可以：（1）研究各种细胞因子对恶性肿瘤细胞侵袭和转移的影响；（2）一些抑制血管生成的新药研究；（3）研究肿瘤细胞侵袭和转移机制。 实验方法 Matrigel 基质膜模型 实验方法原理 Matrigel 是从小鼠EHS 肉瘤中提取的基质成分，含有LN 、IV 型胶原、接触蛋白和肝素硫酸多糖，铺在无聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯滤膜上，能在DMEM 培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。 滤膜孔径一般为8um ，而且膜孔都被Matrigel 覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有Martrigel 的滤膜，这与体内情况较为相似。 铺有Martrigel 的滤膜放在以Blind Well 腔或MICS 腔上下室之间，铺有Martrigel 面朝向上室，在下室中加有趋化剂，如一定浓度的LN 、FN 或小鼠3T3条件培养液或人睾丸上皮成纤维细胞培养液，上室加入重悬的瘤细胞，具有侵袭能力的细胞在趋化剂诱导下开始穿膜运动。细胞穿膜所用的时间与Martrigel 的用量有关，选择 25ugMartrigell 铺膜，16小时后观察结果较为合适。穿过滤膜的细胞多数粘附在滤膜下表面，可用棉签将上表面的细胞拭去，然后用乙醇固定滤膜，PE 染色，在光镜下观察统计穿过Martrigel 的细胞数。另外用Transwell 小室也可进行重建基质膜侵袭分析，这一方法是在Transwell 小室吊篮式上腔的滤膜上铺上30ugMartrigel ，加入细胞72h 后观察结果。值得注意的是，细胞在TransWll 腔中培养 72小时后，有相当数量穿过滤膜的细胞不再粘附在滤膜下表面，而是脱落进人下腔溶液中．因此统计穿过基质膜的细胞数目时应把这部分细胞考虑在内。肿瘤细胞穿过重建基质膜的能力与它的体内侵袭转移能力表现出较好的相关性，可以用重建基质膜模型初筛抗侵袭药物。 在上述分析中，如果不在膜上铺Martrigel 而直接将8um 孔径滤膜安放在侵袭腔室上下腔室之间，细胞通过变形运动穿过滤膜，用这种模型对分析细胞运动能力和药物对细胞运动能力的影响。另外，在下室中加有LN 或FN 或在滤膜下表面铺上LN 或FN ，可分析药物对肿瘤细胞的趋化性或趋固性的影响。 实验材料 Matrigel 基质胶试剂、试剂盒 DMEM 结晶紫染料溶液醋酸低血清DMEM 培养基FBS-DMEM 培养基IFN-γ仪器、耗材 24-transwell (Coster)离心管冰箱离心机移液枪枪头枪头盒实验一、溶液配制
肿瘤学研究常用实验技术及方法
肿瘤学研究常用实验技术及方法复习题 1.表观遗传的科学内涵 三个特点？ a)基因功能完全、稳定地丧失，有遗传性； b)细胞外环境长期作用的结果，有可逆性； c)分析方法灵敏，可检出少数细胞的变化 2.变性高效液相色谱(DHPLC)技术在肿瘤研究中的应用 DHPLC 的主要应用？ Separation of DNA, MSI, LOH, STRs, Q-PCR, detection of mutation , SNPs, oligos, RNA. 3. 蛋白质分离纯化及鉴定 i.分离纯化蛋白质的方法有哪些？ 盐析，透析，离心，凝胶过滤（分子筛）层析，离子交换层析，亲和层析，高效液相层析。 ii.等电聚焦电泳（IEF）与SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）有何不同？ 等电聚焦电泳：利用蛋白质分子等电点的不同，在一个稳定的、连续的、线性的pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。 SDS-PAGE:蛋白质分子一经结合了一定量的SDS阴离子，所带负电荷的量远远超过了它原有电荷量，从而消除了不同种类蛋白质间电荷的差异。在电泳过程中，迁移率仅取决于蛋白质-SDS复合物的大小，也可以 说是取决于蛋白质分子量的大小，而与蛋白质原来所带电荷量无关 iii.两种等电点相近的，分子量相差较大的蛋白质应该首选那种分离方法？SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 iv.蛋白质印迹（Western Blotting）过程中应注意的事项有哪些？ 1.丙烯酰胺有神经毒性，可经皮肤、呼吸道等吸收，故操作时一定要注意 防护。 2.制备聚丙烯酰胺凝胶时，小心防止凝胶渗漏。 3.蛋白加样量要合适，加样量太小，条带不清晰，加样量太大，则泳道超 载，条带过宽而重叠，甚至覆盖至相邻泳道。
肿瘤细胞侵袭和迁移研究的实验技术改进
肿瘤细胞侵袭和迁移研究的实验技术改进 【摘要】肿瘤的基础研究一直是医学类研究的热点，研究者发现恶性肿瘤细胞具有高度侵袭和迁移的特性，对于侵袭和迁移特性的研究具有现实指导意义，而实验技术是基础研究中重要的一个环节，本文针对研究肿瘤细胞侵袭和迁移的几种常用实验技术，提出相应的改进建议。 【关键词】肿瘤；侵袭；迁移；实验技术 肿瘤的治疗一直是生物医学类研究很重要的一部分，恶性肿瘤成为威胁人类健康和生命的主要疾病之一，近些年来，我国及全世界的恶性肿瘤发病率和死亡率都呈上升趋势。近年来肿瘤相关研究取得了很大的进展，但恶性肿瘤具有的高度侵袭和迁移特性成为肿瘤治疗失败的主要原因之一，因此肿瘤细胞的侵袭和迁移是抗肿瘤研究中的热点。 1.检测肿瘤细胞的侵袭性和迁移性的常用实验技术 基础研究对临床工作有着推动作用，注重基础研究不仅利于提高医务工作者的素质，并且利于开展交流合作，推动行业发展，肿瘤疾病治疗的研究工作最终还是要从基础研究做起。实验技术对于基础研究的发展有着至关重要的作用，实验技术的发展推动基础研究的进步。研究肿瘤细胞侵袭和迁移特性时，常用的实验技术有Western blot、免疫组化、Transwell小室测定法、划痕实
验等，对这几种实验技术进行优缺点分析能够为科研工作者提出建议，让科研工作者在研究过程中少走弯路，具有一定的现实意义。 1.1检测肿瘤细胞侵袭和迁移相关蛋白 肿瘤细胞侵袭和迁移相关蛋白有CD147、MMP-2、MMP-9、VEGF 等。CD147是免疫球蛋白家族中一个高度糖基化的跨膜蛋白，能够调控MMPs的表达，刺激MMP-2、MMP-9的产生，MMP-2、MMP-9能降解细胞外基质的蛋白成分，并且诱导VEGF的产生，促进血管的生成，在恶性肿瘤的侵袭和转移中起关键性作用。研究证实，这些蛋白的表达水平都与肿瘤细胞的恶性程度、肿瘤的侵袭和迁移有着密切的联系，通过实验来检测蛋白的表达水平，一定程度上可了解肿瘤细胞的侵袭和迁移特性。 在基础研究中，通常可以通过Western blot来检测侵袭和转移相关蛋白的表达水平，从而确定肿瘤细胞的侵袭性和迁移性是否存在差异，这种方法一定程度上是可以让研究者间接了解肿瘤细胞的侵袭性和迁移性的变化，并且Western blot的方法可以量化蛋白的表达水平，但缺点是检测蛋白表达水平对于判断侵袭性和迁移性不够直观，实验步骤较为复杂，抗体和蛋白的亲和力存在差异，并且抗体价格相对比较昂贵，因此此方法存在一定的局限性。 1.2Transwell小室测定法 Transwell小室测定法可用于测定肿瘤细胞的侵袭性和迁移性，
探究酵母菌呼吸方式实验教学设计
探究酵母菌呼吸方式实验 教学设计 LELE was finally revised on the morning of December 16, 2020
《探究酵母菌呼吸方式》实验教学设计 田秋红 一．教材分析 “细胞呼吸”是人教版《生物必修一·分子与细胞》第五章第三节的内容。为了学生能直接获得经验并提高探究能力，本节内容安排第一课时为探究活动。通过对酵母菌细胞呼吸方式的探究让学生亲身感受有氧和无氧条件下的细胞呼吸。通过酵母菌细胞呼吸方式的探究，学生认识到有氧呼吸和无氧呼吸的条件及产物，为后面学习有氧呼吸和无氧呼吸的过程打下了基础。 二．学情分析 本节的授课对象是高一的学生 1细胞呼吸是一个微观的化学反应过程，抽象，学生理解起来可能有一定的困难，现在通过对酵母菌细胞呼吸方式的实验探究过程让学生从中获得直接经验。 2利用已学习过的简单的对照实验和相关的实验设计原则，使本节课的实验设计得以顺利进行。 三．教学目标 知识目标1.简述细胞呼吸的概念； 2.说出酵母菌细胞呼吸的方式和产物。 实验能力目标1.尝试进行对比实验方案设计； 2.学会对实验条件的控制和对实验结果的检测； 3.对实验结果和实验装置做出合理的分析与判断。 情感目标通过探究活动，培养科学的学习方法，养成科学态度，建立科学价值观。 四．重点难点 重点：探究酵母菌细胞呼吸的方式的实验设计。 难点：设计、进行实验，对实验结果做出客观、科学的分析与判断。 五．实验准备： 1.兴趣小组的学生提前一天制作发酵的面团 2.因为按教材有氧呼吸和无氧呼吸的实验时间较长，提前让兴趣小组的学生按教材实验装置安装并实施实验。 3.教师准备多媒体课件和实验装置，学案。 六．教学流程： 课堂小游戏，活跃气氛、引入新课 通过化学知识推测呼吸方式有两种 观察现象，对反应式在推测的基础上做以完善 分析检验的方法，展示演示小实验 通过评价面团实验，引入实验设计 引导学生分析实验装置图，分析讨论实验观察的方法和检验方法。
肿瘤细胞迁移实验(细胞划痕法)讲义
抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶对肿瘤细胞迁移的影响 （细胞划痕法） 实验导读 瘤组织的增殖失控、瘤细胞的分化异常、瘤细胞具有侵袭和转移的能力是恶性肿瘤最基本的生物学特征，而侵袭和转移又是恶性肿瘤威胁患者健康乃至生命的主要原因。因此研究肿瘤侵袭和转移的规律及其发生机制，对恶性肿瘤的防治有重要意义。 肿瘤转移是指恶性肿瘤细胞从原发部位侵入淋巴管、血管或体腔，至靶组织或靶器官， 长出与原发瘤不相连续而组织学类型相同的肿瘤。前者称为原发瘤，后者称为转移瘤或继发瘤。 图1肿瘤转移示意图 根据肿瘤异质性理论，大多数恶性肿瘤最初虽属单克隆起源，但它在不断增殖演进至临床明显的肿瘤时，由于瘤细胞遗传性状的不稳定性(来自基因突变或缺失等)而不断地变异，造成该肿瘤内瘤细胞亚群表型的多样性，诸如瘤细胞的侵袭性、生长速率、转移能力， 核型乃至对激素的反应性和抗肿瘤药物的敏感性等，这些瘤细胞亚群具有被此不同的特性即 所谓异质性。异质性与肿瘤转移直接有关的就是癌细胞的转移潜能，癌细胞的转移潜能有高低之分，具有高转移潜能的筋细胞易发生转移。 肿瘤细胞的运动性，来源于细胞运动“接触抑制”的概念。通过体外培养正常和恶性结缔组织细胞，发现正常纤维母细胞在移动过程中引起的皱栖脑膜与其他细胞的表面接触时， 往往产生细胞膜活动的抑制和移动中细胞的缩短，然后停止。当纤维母细胞生长过程中在培
养皿上融合形成一单层时，细胞运动即显著受到抑制。间变的肉瘤细胞则缺乏接触抑制，瘤细胞的运动不会被正常纤维母细胞所抑制。 针对肿瘤转移这一复杂的过程，人们研制了各种抗转移药物，如血小板凝集抑制剂、血管生成抑制因子、内皮稳定因子、干扰素－α以及其他化学药物。 细胞划痕法是测定了肿瘤细胞的运动特性的方法之一。其借鉴体外细胞致伤愈合实验模型，在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后加入药物观察其抑制肿瘤细胞迁移的能力。 下图即为划痕实验的示意图，图中可见，在细胞层上出现一道空痕（A），当加入药物后， 由于药物的作用使细胞迁移受到抑制(B)，而未加入药物的细胞保持了原有的迁移能力，在 一段时间后通过迁移将划痕掩盖(C)。 A B C 图2实验结果（A表示在单层细胞上划出的一道痕；B表示加入抑制剂，为阳性对照组； C 表示未加入抑制剂，为阴性对照组） 一、实验目的 1．了解肿瘤细胞转移的基本原理
细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)
迁移实验(ｃell ｍｉgratiｏn ａssay) 实验介绍?细胞迁移与侵袭实验将Traｎswell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究得细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中得成分可以影响到上室内得细胞,应用不同孔径与经过不同处理得聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面得研究。 1材料准备:?可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶得(Ｃoｓter与实验步骤:? Corning公司得也较常用),Ｔrａnswelｌ迁移实验得细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买得Trａnｓwｅｌl小室相配套,BD公司得Matrigel,无血清ＤMＥM,(1%胎牛血清)ＤMEM与1640培养基,ＤMEM完全培养基,１6４0完全培养基(也可加到20%血清),无菌P ＢＳ,棉签,胰酶,４％多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0、1％(g/ml)PBS结晶紫)?2步骤与流程?2。1基质胶铺板: 用BＤ公司得Mａｔｒigel1:8(根据细胞产生mmp得量来决定)稀释,包被Ｔraｎswell小室底部膜得上室面,置3７℃30min使Ｍaｔrigeｌ聚合成凝胶、使用前进行基底膜水化。?２、2制备细胞悬液?①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12—24h,进一步去除血清得影响。但这一步并不就是必须得、 ②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用ＰBS洗1－2遍),用含ＢSA得无血清培养基重悬、调整细胞密度至5×10５/ml。?２。3接种细胞 ①取细胞悬液１00μl加入Trａnｓwelｌ小室、?②24孔板下室一般加入600μl含20％ＦBS 得培养基,特别注意得就是,下层培养液与小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液得趋化作用就减弱甚至消失了,在种板得时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。?③培养细胞:常规培养12-４８h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。２４h较常见,时间点得选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外,处理因素对细胞数目得影响也不可忽视、?2、４结果统计 直接计数法,“贴壁"细胞计数,这里所谓得“贴壁”就是指细胞穿过膜后,可以附着在膜得下室侧而不会掉到下室里面去,通过给细胞染色,可在镜下计数细胞、 取出Ｔｒanｓｗelｌ小室,弃去孔中培养液,用无钙得PBS洗2遍,甲醇固定30分钟,将小室适当风干。?0、1%结晶紫染色２０mｉｎ,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞,用ＰBS洗3遍。?４00倍显微镜下随即五个视野观察细胞,记数。 实验材料 (１)Tｒａnｓwell ｃhamber: 24—ｗell, 8。０-μm porｅ meｍｂranes (C ｏｒning) (2)细胞培养相关试剂:无血清培养基,10%血清培养基,PBS,0.02%ＥＤTA (３)固定液:甲醇 (４)染色液:Giemsa染液 (5)封片剂:中性树胶 (６)其她:小镊子,棉棒,载玻片,盖玻片 操作步骤
细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)
迁移实验(cell migration assay) 实验介绍 细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究的细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,应用不同孔径与经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 实验步骤: 1材料准备: 可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶的(Coster与Corning公司的也较常用),Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套,BD公司的Matrigel,无血清DMEM,(1%胎牛血清)DMEM与1640培养基,DMEM完全培养基,1640完全培养基(也可加到20%血清),无菌PBS,棉签,胰酶,4%多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0、1%(g/ml)PBS结晶紫) 2步骤与流程 2、1基质胶铺板: 用BD公司的Matrigel 1:8(根据细胞产生mmp的量来决定)稀释,包被Transwell小室底部膜的上室面,置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。 2、2制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h,进一步去除血清的影响。但这一步并不就是必须的。 ②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用PBS洗1－2遍),用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。 2、3接种细胞 ①取细胞悬液100μl加入Transwell小室。 ②24孔板下室一般加入600μl含20%FBS的培养基,特别注意的就是,下层培养液与小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。 ③培养细胞:常规培养12－48h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。24h较常见,时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外,处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 2、4结果统计 直接计数法,“贴壁”细胞计数,这里所谓的“贴壁”就是指细胞穿过膜后,可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去,通过给细胞染色,可在镜下计数细胞。 取出Transwell小室,弃去孔中培养液,用无钙的PBS洗2遍,甲醇固定30分钟,将小室适当风干。 0、1%结晶紫染色20 min,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞,用PBS洗3遍。 400倍显微镜下随即五个视野观察细胞,记数。 实验材料 (1)Transwell chamber: 24-well, 8、0-μm pore membranes (Corning) (2)细胞培养相关试剂:无血清培养基,10％血清培养基,PBS,0、02％EDTA
肿瘤迁移和侵袭试验
肿瘤迁移和侵袭试验——Millicell小室测定法 【实验材料】 1、肿瘤细胞及其所需培养液； 2、Transwell小室（Millipore公司，直径12mm，孔径8μm）； 3、人工基质胶（ECM，Sigma公司）； 4、24孔细胞培养板； 5、无水乙醇、苏木精、伊红染液，棉签； 6、载玻片、手术刀片。 【实验步骤】 1、接种细胞前一天，将ECM胶与预冷的无血清和抗生素（双无）1640按1：7的比例以总量32μl铺在 transwell小室的上室面，注意不能有气泡产生；再将小室置于24孔细胞培养板内，超净台内紫外线照射过夜。（做肿瘤迁移实验则不需要此步） 2、接种细胞：用不含血清的培养液制备单细胞悬液，将细胞密度调整为2.5×105个/ml，取400μl加入 上室中；在下室即24孔板内加入600μl含20%FBS的1640培养液。 3、细胞培养：将24孔板置于37℃、5%CO2细胞培养箱内，培养24小时。 4、固定细胞：待培养时间结束后，吸尽上室内液体，小心取出上室，用湿棉签檫去膜上面未穿过膜的细 胞，自然风干后以无水乙醇置于细胞培养箱内固定20min。 5、细胞染色：固定后的细胞先以苏木精染色20min，清水清洗一遍；再用伊红染色20min后清水清洗一 遍。 6、细胞计数：染色完毕后将小室自然风干，用手术刀片沿压痕将小室膜轻轻切下，置于载玻片上在显微 镜下观察、计数。 【注意事项】 1、由于ECM在室温或温度更高的情况下极易凝固成胶状，且此过程为不可逆的，因此建议在配制人工 基底胶时可在冰上操作；
2、ECM与双无1640的比例可根据试验情况在1：5到1：10之间调节； 3、接种细胞之前一定要细胞计数，细胞密度最好不要超过5×105个/ml； 4、下室内的培养液亦可换成小鼠成纤维细胞系NIH3T3条件培养基，制备方法：用含10%FBS的1640 培养液在37℃、5%CO2条件下培养，在细胞长势良好的情况下换成双无培养液继续培养24小时，然后收集培养上清液，冰冻保存备用。 5、细胞培养的时间依肿瘤细胞类别有所不同。 6、细胞固定及染色时应注意每次都要将小室风干，必要时可将小室倒置。 7、Harris苏木精染液配制方法： 苏木精1.0g 硫酸铝钾15g 无水乙醇10ml 蒸馏水200ml 先用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，用无水乙醇溶解苏木精，再倒入已溶解的硫酸铝钾蒸馏水中，煮沸1min 后稍冷却，慢慢加入红色氧化汞0.5g，继续加热至染液变为紫红色，用纱布盖住瓶口。使用之前用滤纸过滤后每100ml加冰醋酸5ml。 8、伊红染液配制方法： 伊红Y 0.5~1.0g 蒸馏水100ml 先将伊红Y加入蒸馏水中，用玻璃棒将伊红搅起泡沫后过滤，每100ml加冰醋酸1滴。 附： 正常胃癌SGC7901细胞株
肿瘤细胞侵袭试验(Tumour Invasion Assay)原理和实验步骤
肿瘤细胞侵袭试验（Tumour Invasion Assay）原理和实验步骤一、原理 Matrigel是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成分，含有LN、IV型胶原、接触蛋白和肝素硫酸多糖，铺在无聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯滤膜上，能在DMEM培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。 滤膜孔径一般为8um，而且膜孔都被Matrigel覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有Martrigel 的滤膜，这与体内情况较为相似。 铺有Martrigel的滤膜放在以Blind Well腔或MICS腔上下室之间，铺有Martrigel面朝向上室，在下室中加有趋化剂，如一定浓度的LN、FN或小鼠3T3条件培养液或人睾丸上皮成纤维细胞培养液，上室加入重悬的瘤细胞，具有侵袭能力的细胞在趋化剂诱导下开始穿膜运动。细胞穿膜所用的时间与Martrigel的用量有关，选择25ugMartrigell铺膜，16小时后观察结果较为合适。穿过滤膜的细胞多数粘附在滤膜下表面，可用棉签将上表面的细胞拭去，然后用乙醇固定滤膜，PE染色，在光镜下观察统计穿过Martrigel的细胞数。另外用Trans well小室也可进行重建基质膜侵袭分析，这一方法是在Transwell小室吊篮式上腔的滤膜上铺上30ugMartrigel，加入细胞72h后观察结果。值得注意的是，细胞在TransWll腔中培养72小时后，有相当数量穿过滤膜的细胞不再粘附在滤膜下表面，而是脱落进人下腔溶液中．因此统计穿过基质膜的细胞数目时应把这部分细胞考虑在内。肿瘤细胞穿过重建基质膜的能力与它的体内侵袭转移能力表现出较好的相关性，可以用重建基质膜模型初筛抗侵袭药物。 在上述分析中，如果不在膜上铺Martrigel而直接将8um孔径滤膜安放在侵袭腔室上下腔室之间，细胞通过变形运动穿过滤膜，用这种模型对分析细胞运动能力和药物对细胞运动能力的影响。另外，在下室中加有LN或FN或在滤膜下表面铺上LN或FN，可分析药物对肿瘤细胞的趋化性或趋固性的影响。