香樟胚性愈伤组织遗传转化体系建立
第44卷第4期
2008年4月林业科学SCIE NTI A SI LVAE SI NIC AE V ol 144,N o 14Apr.,2008
香樟胚性愈伤组织遗传转化体系建立
3
杜 丽1 庞振凌1 周 索1 曾晓慧1 包满珠2(11南阳师范学院生命科学与技术学院 南阳473000; 21华中农业大学园艺林学学院教育部园艺植物生物学重点实验室 武汉430070)
摘 要: 通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法,建立香樟胚性愈伤组织遗传转化体系。结果表明:以胚性愈伤组
织为受体,能取得比较理想的转化效果;50mg ?L -1的潮霉素对胚性愈伤组织有很好的筛选效果;根癌农杆菌0D 600
为016时,能获得较高的转化率;侵染时间提高为40min 时,对提高转化效率有显著的效果;共培养3d 能够得到较好的转化效率。对转基因香樟愈伤组织进行PCR 检测,结果表明G US 基因已整合到香樟胚性愈伤组织的基因组中。
关键词: 香樟;根癌农杆菌;遗传转化;PCR
中图分类号:S718146;Q94312 文献标识码:A 文章编号:1001-7488(2008)04-0054-06
收稿日期:2007-09-19。
基金项目:河南省自然科学基金(0611033300);南阳师范学院高层次人才科研启动费资助。
3包满珠为通讯作者。Establishment of Agrobacterium 2Mediated T ransformation System
of Embryogenic C alli of Cinnamomum camphora
Du Li 1 Pang Zhenling 1 Zhou Suo 1 Z eng X iaohui 1 Bao M anzhu 2
(11Shool o f Life Science and Technology ,Nanyang Normal Univer sity Nanyang 473000; 21K ey Laboratory o f Horticultural
Plant Biology o f Ministry o f Education College o f Horticulture and Forestry Sciences ,Huazhong Agricultural Univer sity Wuhan 430070)
Abstract : A genetic trans formation system of embry ogenic calli (Cinnamomum camphora )mediated by Agrobacterium tumef aciens was established.Experimental result indicated that efficient trans formation was obtained w ith embry ogenic calli as acceptor.Hygromycin of 50mg ?L -1was efficient in screening embry ogenic calli.When the OD 600value of Agrobacterium was 016,a high trans formation rate was gained.The in fection time of 40m in ,combined w ith co 2culture time of 3d ,remarkably enhanced trans formation rate.Results of PCR proved that the G US gene had integrated into embry ogenic calli of C .camphora genome.
K ey w ords : Cinnamomum camphora ;Agrobacterium tumef aciens ;genetic trans formation ;PCR
香樟(Cinnamomum camphora ),樟科(Lauraceae ),常绿乔木,是贵重家具、高级建筑、造船和雕刻等理想的用材,近年来,香樟在园林绿化中的应用越来越多,成为城市中重要的园林绿化树种。作者利用未成熟的香樟合子胚诱导获得胚性愈伤组织,历经3年继代保存,胚性愈伤组织仍具有发育成体胚、体胚再形成植株的能力。香樟的植株再生通常是经过体细胞胚胎发生途径来完成的(杜丽等,2006;Du et al .,2007),但国内外迄今为止尚无关于香樟的胚性愈伤组织遗传转化体系的报道。本文利用现有保存的香樟胚性愈伤组织细胞系,对影响香樟遗传转化的几个因素进行了研究,建立了高效的农杆菌遗传转化体系,为香樟的基因工程育种奠定了基础。
1 材料与方法
111 植物材料
香樟可通过体细胞胚发生途径获得再生植株,本文利用这个再生系统进行遗传转化的研究。以香樟继代保持3年的胚性愈伤组织(胚性系L9)(杜丽等,2006;Du et al .,2007)为试验材料和转化受体。112 胚性愈伤组织对潮霉素的敏感性试验
将胚性愈伤组织接种于附加不同浓度潮霉素的保持增殖培养基上(MS +110mg ?L -1BA +011mg ?L
-1
2,42D +700mg ?L -1CH ,蔗糖30g ?L -1,琼脂粉为715g ?L -1)(CH :水解酪蛋白),1个月后比较不同浓度抗生
素对外植体增殖的抑制作用,以确定合适的选择压力。试验的潮霉素浓度梯度为10、30、50、70、100mg ?L -1。
试验外植体数不少于30团(直径约5mm )。
113 根癌农杆菌菌株及质粒
试验中所用根癌农杆菌菌株为EH A105,它含有pC AM BI A1301质粒,该质粒携带G US 报告基因和HPT 选择基因,其中G US 基因含有一个内含子,以确保G US 基因只在植物细胞中表达,而不在农杆菌中表达。含有该质粒的农杆菌对潮霉素有抗性。质粒中T 2DNA 区域的结构简图如图1所示
。
图1 质粒pC AM BI A1301的T 2DNA 区结构简图
Fig.1 C onstruction of T 2DNA region of plasm id pCAM BIA1301
114 农杆菌介导的转化
收集培养好的农杆菌菌体用共培养介质(AB +100μm ol ?L -1AS ,表1)(AS :乙酰丁香酮)重新悬浮至
OD 600012～112左右,将愈伤组织置于悬浮液中侵染10～60min ,用灭菌滤纸吸干表面液体,一段时间后取出并用无菌滤纸吸去表面多余的菌液,并在超净工作台上将浸泡后的材料吹至半干(20～30min ),后接入胚性
愈伤组织共培养培养基(MS +110mg ?L -1NAA +1000mg ?L -1ME +100μm ol ?L -1AS )(ME :麦芽提取物)
中,将上述接种物置于黑暗条件下培养1～6d 。
对于胚性愈伤组织的转化条件优化,本研究试验了根癌农杆菌EH A105ΠpC AM BI A1301的菌液浓度(OD 600=012、014、016、018、110、112),共培养天数(1、2、3、4、5、6d ),侵染时间(10、20、30、40、50、60min ),对遗传转化的影响。检测其中的某个因素时,其他因素的水平采用OD 600为016,共培养天数为3d ,侵染时间为40min ,共培养结束后用外植体G US 的瞬间表达量的多少确定转化条件的适宜程度。
表1 AB 液体培养基的组成T ab.1 Composition of liquid AB medium 组成C om position
浓度C oncentration K 2HPO 4
3g ?L -1NaH 2PO 4
1g ?L -1NH 4Cl
1g ?L -1M gS O 4?7H 2O
013g ?L -1K Cl 0115g ?L -1CaCl 20101g ?L -1FeS O 4?7H 2O 215mg ?L -1葡萄糖G lucose 015%115 脱菌和选择培养
试验中测试了不同浓度的潮霉素(50mg ?L -1和70mg ?L -1)和300mg ?L -1头
孢霉素组成的选择培养基(MS +110mg ?L -1NAA +1000mg ?L -1ME )对诱导
G US 基因转化的抗性愈伤组织的影响,该试验设计2次重复,每次重复采用至少
50个外植体(5个培养皿,10团外植体Π皿),25℃黑暗条件下选择培养,6周后进行抗性愈伤组织诱导率(产生新鲜愈伤组织的外植体数Π每个重复的外植体总数×100%)统计。此后,诱导出的新鲜抗性愈伤组织在含有50mg ?L -1潮霉素和300mg ?L -1头孢霉素的选择培养基上每3周继代1次进行抗性愈伤组织的增殖
培养,25℃暗培养。
116 抗性愈伤组织的GUS 基因瞬间表达及PCR 检测转化共培养后对转化受体进行G US 染色,检测转化瞬时表达率,可初步判
断农杆菌对受体组织的侵染效率。检测G US 基因在转基因愈伤组织中的表达,取未转化的同步材料为阴性对照。胚性愈伤组织反应后可直接观察,G US 基因瞬间表达呈阳性者可在肉眼下观察到蓝色反应,然后统计G US 基因瞬间表达率(有蓝色反应的外植体数Π外植体总数)。试验重复3次,每次外植体总数不少于30粒。
香樟胚性愈伤组织DNA 的提取采用CT AB 少量提取法。根据HPT 基因序列,设计一对特异引物为:5′-CG T ,CTG,T CG,AG A ,AG T ,TT C -3′和5′-T AC ,TT C ,T AC ,AC A ,G CC ,AT C -3′,琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段范围如图5所示。
2 结果与分析
211 胚性愈伤组织对潮霉素的敏感性分析
研究了10～100mg ?L -1
不同潮霉素浓度对胚性愈伤组织增殖的影响。将继代培养的胚性愈伤组织接种到含潮霉素的保持培养基上,观察和记录在不同选择压力下培养4周后的生长结果。随着培养基中潮霉素
浓度的增加,具有新生长的愈伤组织的比例显著降低,10～30mg ?L -1压力下,4周后虽然有部分愈伤组织逐
渐死亡,但仍有部分愈伤组织存活下来并能继续生存下去。当潮霉素浓度达到70mg ?L -1或更高时,从接种5
5 第4期杜 丽等:香樟胚性愈伤组织遗传转化体系建立
10d 后立即抑制了胚性愈伤组织生长,生长缓慢。这个结果表明潮霉素在选择压力低时,即使长时间选择亦有部分愈伤组织存活,当压力提高达到一定值时,经短时间的选择即可达到抑制生长的效果。可见潮霉素对
于香樟胚性愈伤组织的生长抑制是速效的。在观察中发现,当潮霉素浓度为50mg ?L -1时,虽然能够观察到
新的愈伤组织以很低的频率发生(<15%),但大多数愈伤组织颜色发暗,呈现黄褐色,表面干涩,缺乏活力;
潮霉素浓度为70mg ?L -1时,愈伤组织呈褐色,有极少量新的愈伤组织发生,愈伤组织体积增大不明显;当潮
霉素浓度为100mg ?L -1,愈伤组织呈黑褐色,体积无增大,生长完全受到抑制。因此认为50mg ?L -1潮霉素已
表现出对香樟胚性愈伤组织生长的明显抑制,故将潮霉素浓度50mg ?L -1作为选择压力。
212 侵染时间对胚性愈伤组织遗传转化的影响
农杆菌侵染植物外植体首先进行农杆菌细胞与植物细胞间的相互作用,足够的侵染时间有利于农杆菌通过趋化作用或其他作用充分吸附到植物外植体伤口或愈伤组织表面,一般农杆菌的侵染时间为5min 到1h 之间。本文研究了10～60min 这6个水平(10、20、30、40、50、60min ),其中每个处理的共培养时间均为3d ,侵染用农杆菌的OD 600值都调整为016,G US 数据是3次独立重复试验的平均结果。结果显示:当侵染时间为10min 时,胚性愈伤组织的G US 基因瞬间表达率为0(图2A ),而侵染时间延长至20min 时,G US 基因瞬间表达率突增至40%以上;最高的表达率出现在侵染时间为40min 的处理中,G US 基因瞬间表达率可达76167%;侵染时间超过40min 表达率开始下降,可能是过长的侵染时间使农杆菌对外植体的生长造成了伤害,所以40min 的侵染时间适于香樟胚性愈伤组织的遗传转化。
213 菌液浓度对胚性愈伤组织遗传转化的影响
菌液浓度在农杆菌介导的遗传转化中是影响转化效率的重要因素之一,因此试验在40min 的侵染时间、共培养3d 的同样条件下,测试了在012～112的6个水平OD 600值(OD 600=012、014、016、018、110、112)对转化效率的影响(图2B )。结果显示,不同浓度的菌液对香樟胚性愈伤组织的转化效率不同。OD 600值为012时,结束共培养后的G US 瞬间表达率只有20%左右,随着菌液浓度的增加,表达率逐渐增加,当浓度达到016时,表达率最高,随后开始降低。同时发现,在浓度高的菌液处理中,结束共培养时,细菌过度生长,几乎包裹了整个外植体,转入选择培养后,有的细菌竟然继续生长,不容易被清除干净,影响外植体的生长,因此认为OD 600值大于018的菌液浓度处理的外植体G US 基因表达率下降,可能是过度生长细菌的毒害作用造成的。所以在对香樟胚性愈伤组织侵染中,农杆菌最适宜的浓度为OD 600值016
。
图2 侵染时间、农杆菌侵染浓度对香樟胚性愈伤组织遗传转化的影响
Fig.2 E ffect of in fection time and OD value on gene trans formation in embry ogenic calli of C .camphora
214 共培养时间对胚性愈伤组织遗传转化的影响
理论上说,农杆菌与植物共培养时间越长,农杆菌侵入的机会越多、基因转化的频率越高。然而,实际操作中如果共培养的时间越长,植物的外植体会因过度感染而中毒死亡,达不到转化效果。因此确定合适的共培养时间是提高转化率的重要因素之一。本试验使用农杆菌OD 600值为012和016、侵染时间为40min 的转化条件,在共培养1～6d 后(1、2、3、4、5、6d ),检查G US 基因在外植体中的瞬间表达情况,结果如图3。从图3可见,共培养1d 后,使用较高浓度的菌液(OD 600=016)G US 基因在外植体内即有表达,随着培养时间的延长,G US 基因的表达率增高,在共培养3d 时表达率达到最高(76167%),然而随着时间的延长,G US 基因的表达开始下降,原因是植物的外植体过度感染死亡。OD 600值为012的所有处理中,G US 表达率均明显低于高浓度(OD 600=016)的菌液侵染效果。可见,低浓度菌液、长时间共培养不能达到和高浓度菌液侵染的同样效
65林业科学44卷
图3 共培养时间对胚性愈伤组织遗传转化的影响Fig.3 E ffect of co 2cultivation time on gene trans formation in embry ogenic calli of C .camphora
果。所以,适宜的菌液浓度为OD 600=016,共培养时间为
3d 。
215 抗性愈伤组织的获得及继代增殖
本试验根据G US 基因瞬间表达结果(图4a ～c ),确立了
农杆菌介导香樟胚性愈伤组织遗传转化的合适条件,即菌
液浓度为OD 600=016,侵染时间为40min ,共培养时间为
3d 。按照这一条件进行侵染,共培养3d 后直接转入各自
的选择培养基上进行选择培养,6周后获得抗性愈伤组织。
诱导获得的抗性愈伤组织继续转接到选择培养基上,每隔3周继代1次,进行抗性愈伤组织的增殖和假阳性转化的剔除。从转入G US 基因的抗性愈伤组织(图4d )上可以看出,抗性愈伤组织生长较快,呈新鲜的淡黄色,而其他
愈伤组织色彩黯淡,呈褐色,无生活力。选择培养基中300mg ?L -1头孢霉素能有效抑制农杆菌的生长,并对
愈伤组织的增殖无影响。到目前为止,这些抗性愈伤组织正在进行再生植株的诱导试验
。
图4 香樟胚性愈伤组织G US 基因表达染色反应Fig.4 Histological assay of G US gene expression in embry ogenic calli of C .camphora a.共培养3d 后胚性愈伤组织的G US 基因瞬间表达;b.G US 阳性反应愈伤组织(左)和对照愈伤组织(右);c.G US 基因的不同表达量(左为对照); d.抗性愈伤组织。a.G US gene transient expression after 32day co 2culture G US spots ;b.G US spots
(left )and control calli (right );c.Different expression of G US gene (control on the left ); d.Hygromycin resistant calli after 62week
selection culture.
216 胚性愈伤组织GUS 基因瞬间表达及稳定表达检测
共培养结束后,将无菌水清洗过的胚性愈伤组织放
入G US 反应缓冲液,37℃水浴保温过夜。反应结果可以
直接用肉眼观察。从图4a ～c 可以看出,香樟胚性愈伤
组织的G US 基因表达比较强,被检测的抗性愈伤组织上
呈现出不同程度的蓝色,说明G US 在不同的愈伤组织中
的表达强弱不同;有的愈伤组织只是局部出现蓝斑,可
能是外植体局部被转化的结果。虽然一些研究表明,
G US 基因瞬间表达主要是由未整合的T 2DNA 引起的,与
稳定的转化事件并无严格的相关关系,但是差异较大的
G US 瞬间反应对于遗传转化条件的确定还是具有一定的
指导意义。在本试验中,使用G US 基因瞬间表达的结果
进行转化条件优化,以优化的条件进行转化,最终得到了
抗性愈伤组织(图4d ),目前,导入G US 基因的抗性胚性
愈伤组织正在进行体胚诱导,然后进行再生植株的诱导。
217 含有GUS 基因的抗性愈伤组织的PCR 检测
进行选择培养6周后,经含有G US 基因的农杆菌菌
液侵染过的胚性愈伤组织上,可以观察到有黄色新鲜的
胚性愈伤组织出现。含有潮霉素50mg ?L -1的选择培养
基上的抗性愈伤组织诱导率为1715%;抗生素提高至70
mg ?L -1抗性愈伤组织诱导率降至12%,而且这些新诱导的愈伤组织个体都比较细小,直径不足2mm (表2)。抗性愈伤组织在选择培养基上生长较正常的胚性愈伤组织在不添加抗生素的培养基上缓慢,可见高浓度的潮霉素
对于抗性愈伤组织的生长仍然具有抑制作用。
将多次选择继代(4个月)的抗性愈伤组织按照外植体来源编号,提取DNA ,进行PCR 检测,检测结果如图5所示,4团测试的潮霉素的抗性愈伤组织中编号为1、2、3、4的愈伤组织使用HPT 基因设计的引物均扩增出约500bp 的片段,与质粒DNA 扩增的片段大小相同,而以未转化愈伤组织DNA 为阴性对照的扩增产物中无目标片段,说明外源基因已稳定整合到这些被检测抗性愈伤组织细胞的核基因组中。PCR 检测选用的
DNA 取自在选择培养基(潮霉素:50mg ?L -1)上多次(4个月)继代的抗性愈伤组织,4团抗性愈伤组织在PCR
检测中均呈现阳性反应,阳性比率为100%,可见长期使用高浓度潮霉素处理抗性愈伤组织能够有效剔除假
75 第4期杜 丽等:香樟胚性愈伤组织遗传转化体系建立
表2 GUS 基因转化香樟胚性愈伤组织的潮霉素抗性愈伤组织诱导情况①
T ab.2 H ygromycin 2resistant calli induction from embryogenic calli of C .camphora after GUS gene trans form ation
潮霉素浓度
C oncentration of hygromycin Π(mg ?L
-1)外植体数Number of explants 抗性愈伤组织诱导率Frequency of resistant calli induction Π%平均生长量(直径)M ean growth (diameter )Πmm 50
501715<2705012<1
①结果统计于选择培养6周后;试验重复2次(每次外植体数不少于50个)。Data were collected after 6weeks in selection culture ;M eans are calculated in tw o replications including 5petri dishes with 10explants each.
阳性的愈伤组织,这可能与香樟的胚性愈伤组织的生长对潮霉素的作用比较敏感有一定的关系
。
图5 G US 基因遗传转化的潮
霉素抗性愈伤组织的PCR 检测Fig.5 PCR am plification results of hygromycin resistant embry ogenic calli
after G US gene trans formation M.M arker (D L200);N.未转化愈伤组织DNA 阴性对照N on 2transgenic embrogenic calli negative control ;P.质粒DNA 阳性对照Plasm id DNA positive control ;1～41抗性愈伤组织DNA hygrom ycin 2resistant embry ogenic calli.
3 结论与讨论
311 影响香樟胚性愈伤组织遗传转化的因素
根据试验研究,香樟胚性愈伤组织是比较适宜的遗传转化材料。在试验
中,使用子叶期的体胚来侵染,其效果差于胚性愈伤组织(数据未显示)。通常
当体胚经过侵染后,在选择培养时,外植体材料非常容易褐化死亡,这可能是
因为基因成功转化部分占整个体胚体积比例太小,产生的对抗生素的抵抗力
不足以保证整个外植体的存活,所以香樟体胚的转化效率较差。在许多物种农杆菌介导的遗传转化中,胚性愈伤组织是较多使用的转化材料,如 柑(Citrus reticulata )(Li et al .,2002)、棉花(Gossypium hir sutum )(谢德意等,2007)、杂交月季(Rosa hybrid )(G ao et al .,2004;K im et al .,2004)、匍匐剪股颖(Agrostis tenuis )(Chai et al .,2004)等都是使用胚性愈伤组织进行遗传转化的,香樟在进行农杆菌介导的遗传转化中,胚性愈伤组织同样是比较适宜的转化
试材。
本文研究了在农杆菌菌液侵染胚性愈伤组织时,菌液浓度、侵染时间和共
培养时间对T 2DNA 转化的影响。许多研究表明菌液浓度在农杆菌介导的遗
传转化中是影响转化效率的重要因素之一(D ohm et al .,2001;G ao et al .,
2004;苏晓华等,2003),单位体积中的细菌含量增加,使得农杆菌和胚性愈伤组织相遇的机会增加,T 2DNA 转入外植体的机会也大大增加;但并不是菌液浓度越高,转化效果越好,因为外植体对于农杆菌的忍耐也是有限度的,过高的细菌浓度如果毒害外植体,显然会降低T 2DNA 的转化效率。就香樟胚性愈伤组织的转化而言,OD 600为016的菌液浓度是最佳的转化菌液浓度,这与王爱菊等(2006)的研究结果也是一致的。足够的侵染时间有利于农杆菌通过趋化作用或其他作用充分吸附到植物外植体伤口或愈伤组织表面,10～60min 是农杆菌转化中经常被使用的时间范围,不过侵染时间过长同样会造成转化效率降低,所以香樟胚性愈伤组织的最佳侵染时间是40min 。农杆菌与植物共培养时间越长,农杆菌侵入的机会越多、基因转化的频率越高,通常可能会认为较低浓度的菌液侵染后,适当延长共培养时间就能够获得较好的转化效率。实际上在本研究中发现,此种设想不能成立,OD 600为012的侵染,即使共培养时间延长至6d ,所得转化效果仍大大低于高浓度在较短共培养时间的结果,显然农杆菌的转化效果在侵染结束后,就已经基本确定。可见在香樟的农杆菌介导的遗传转化中,侵染浓度跟共培养时间相比较而言,侵染浓度对转化效果的影响更显著。
312 胚性愈伤组织的植株再生
在进行植株再生的过程中,抗生素是选择再生植株的关键。它虽然是得到阳性转化材料再生植株的保证,但也可能是植株再生困难的根源。在本试验中观察到,同样进行体胚诱导(附加不同抗生素的诱导培养基),卡那霉素抗性愈伤组织诱导获得体胚后(转化含有NPT Ⅱ的质粒,数据未列出),而潮霉素抗性愈伤组织没有体胚的形成。试验中观察到香樟胚性愈伤组织对于这2种抗生素刺激的反应不同,对潮霉素刺激的敏感很有可能就是使之发育迟缓的原因。转化细胞是因为含有抗性基因来抵抗抗生素的刺激,抗生素对这些材料生长的抑制作用是一直存在的,这种抑制作用就可能是导致抗性愈伤组织再生困难的原因之一。所以,
85林业科学44卷
在使用抗生素进行选择和再生培养时,应该将抗生素浓度设定为先低后高再低或无,这样既保证了转化的有效性,又能使植株再生不再受阻。目前本试验的香樟潮霉素抗性愈伤组织正在进行植株再生的诱导。
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(责任编辑 徐 红)95 第4期杜 丽等:香樟胚性愈伤组织遗传转化体系建立
REMI介导红曲霉遗传转化条件的优化
REMI介导红曲霉遗传转化条件的优化 摘要：为了构建限制性内切酶介导的整合（ｒｅｍｉ）技术介导的红曲霉（ｍｏｎａｓｃｕｓ anka）遗传转化系统，以潮霉素b 作为抗性筛选标记，ｐｂｃ－ｈｙｇｒｏ、ｐｃｂ１００３、ｐａｎ７－１作为转化质粒，采用ｒｅｍｉ技术转化红曲霉。结果表明，用ｒｅｍｉ技术介导红曲霉转化时，质粒ｐｂｃ－ｈｙｇｒｏ和ｐｃｂ１００３适合于红曲霉的转化。环状质粒与线性质粒的转化率无显著差别；在用ｒｅｍｉ技术介导转化时添加酶切缓冲液不利于转化；原生质体浓度为１×１０７～１×１０８个／ｍｌ时，每微克质粒可获得的潮霉素ｂ抗性转化子为２８００～３２００个；ｈｉｎｄⅲ介导转化时的最佳酶用量为１０5～１２０ｕ；在质粒用量为８μｇ／１００μｌ时转化率最高。 关键词：红曲霉（ｍｏｎａｓｃｕｓ anka）；遗传转化；限制性内切酶介导的整合（remi） ａｂｓｔｒａｃｔ：ｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｆｍｏ ｎａｓｃｕｓ anka ｂｙｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍ ｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ（ｒｅｍｉ），ｕｓｉｎｇｔｈｅｈｐｈｇｅｎｅａｓｓｅｌｅｃｔａｂｌｅｍａｒｋｅｒａｎｄｐｂｃ－ｈｙｇｒｏ，ｐｃｂ１００３ａｎｄｐａｎ７－１ａｓｖｅｃｔｏｒ，ｔｈｅｆｕｎｇｕｓ
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烟草遗传转化实验
烟草遗传转化实验文件管理序列号：[K8UY-K9IO69-O6M243-OL889-F88688]
实验八植物细胞悬浮培养 实验目的：学习和掌握植物细胞悬浮培养的操作技术与方法。 实验器材： 超净工作台、恒温培养室、高压灭菌器、冰箱、恒温培养箱、培养瓶、250 mL 、500 mL三角瓶、镊子、酒精灯等。 配置MS液体培养基（2，4-D 2 mg/L+1%甘露醇 +3% 蔗糖，pH 5.8）分装于250ml的三角瓶中，每瓶50ml。 实验材料：烟草叶片愈伤组织。 实验方法： 1.70%乙醇净化工作台并擦洗干净，将所用的材料、工具、培养基等放入 工作台。打开紫外灯和风机，15分钟后关闭紫外灯开始方可操作。 2. 在超净台上用无菌镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织，放入150ml 三角瓶中并轻轻夹碎,每个三角瓶加入培养基20-30ml，每瓶接种1-2g愈伤组织，按愈伤组织与液体培养基1∶10的比例，以保证最初培养物中有足够量的细胞。 3.接种后的三角瓶用天平称取重量并记载，然后置于摇床上，在转速 100-120rpm，25℃下培养以及散射光条件下，进行振荡悬浮培养。4.每周更换新鲜液体培养基两次，每次更换1/3。每次更换新鲜培养基时 称取重量。 5. 每个人接种悬浮培养细胞1瓶，观察并记录细胞生长情况。 6. 培养7天后，制作细胞生长曲线：为了解县浮培养细胞的生长动态，可用以下方法绘制生长曲线图： 鲜重法：在转代培养的不同时间，取一定体积的悬浮培养物，离心收集后，称量细胞的鲜重，以鲜重为纵座标，培养时间为横座标，绘制 鲜重增长曲线。 烟草遗传转化实验 实验目的
玉米遗传转化体系的优化及HrpZ基因转化玉米的研究
玉米遗传转化体系的优化及HrpZ基因转化玉米的研究 HrpZ基因是一种来源于植物病原菌丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae) 的蛋白激发因子,它能引起非寄主植物的过敏性反应(hypersensitive response, HR),表现为受侵染组织的快速、局部的萎缩和死亡,这就限制了病原菌进一步扩散的可能性。HR反应后,植物体内出现了一系列的防反应,如强化结构屏障作用,合成裂解酶或者产生植物抗毒素,具体表现在能够防止病菌二次或继发性侵染。 这种非局部化、长期的诱导保护作其抗菌谱很广,极类似于“系统获得性抗性”(systematic acquired resistnace SAR)。玉米(Zea may L.)是世界上重要的粮食、饲料作物,也是现代食品工业、医药工业和化学工业的重要原料。 产量居农作物之首,也是重要的遗传模式植物。长期以来,玉米优良基因型高效再生体系的建立一直是人们研究的热点。 我国是世界上仅次于美国的第二大玉米生产国,玉米生产在国民经济中占有非常重要的地位。然而,生产上玉米病害一直是影响玉米产量的重要限制因素, 传统的常规育种由于抗源的缺乏和不同物种间的遗传隔离,使抗病育种工作受到了极大的限制。 利用基因工程技术进行玉米遗传改良,增强玉米抗病虫和耐逆境能力,提高 产量,改善品质,是玉米遗传育种的一个新方向。因此,玉米的基础研究和遗传改良具有重大的理论和现实意义。 为进一步筛选和建立优良玉米自交系的再生和遗传转化体系,本文分别以玉米幼胚,成熟胚,茎尖,根尖及幼叶为外植体进行愈伤诱导,较系统地研究了常规 优良自交系的愈伤组织形成及分化再生的影响因素、农杆菌介导遗传转化体系,并对转化株进行了PCR检测,获得了如下主要结果：1.选用了生产上广泛应用的
马铃薯遗传转化方法
农杆菌介导的马铃薯遗传转化体系 Steve Millam 摘要：马铃薯是一种全球性的重要农作物，其块茎作为营养丰富的食物，产量很高。马铃薯之所以成为大量研究的焦点，是因为它既作为一种主要粮食作物，又能作为所关注的化合物的潜在重要来源。转基因技术的发展和应用已经用于马铃薯上，并以此来引进基础且实用的新奇目标特征。本文描述了一个快速、高效和低成本的马铃薯遗传转化系统，与平常的转化相比，其转化效率可超过40%。基于核酸印迹法的平均值计算，证实了每个外植体切片在转基因上的独立性。将节间切片与农杆菌一起培养，然后在卡那霉素的筛选下，经历一个双阶段的愈伤组织诱导/出芽系统。用这种描述的方法可以获得很高的幼芽再生率，而且经过2次继代培养后，离体茎段从伤口末端生根，保证有95%的外植体被转化。这种转基因状态可以通过分子分析来证实。马铃薯的块茎生长也促使了大范围的进一步的研究。 1．介绍 马铃薯是最早用于遗传转化的植物之一。Ooms等人在1986年用农杆菌浸染马铃薯Desiree品种的组织并使组织再生，这成为马铃薯转化的直接证据。转基因品种Desiree和Bintje所用的农杆菌由Stiekma等人提供。de Block报道了一种以叶圆片作为靶组织，且与基因型无关的转基因方法。Visser等人以茎段和叶片为外植体，提出了包括再生和转化在内的两步法，并作为目前众多已使用的实验方案的基础。各种马铃薯组织相对容易的根系再生也支持了这些已经报道的马铃薯遗传转化系统。 目前许多正在使用的实验方案都报道了一个两步再生法，及先进行愈伤组织诱导，再进行根系再生。在愈伤组织诱导阶段通常会尽可能避免马铃薯体细胞突变。第一步通常是加入1-5mg/L的玉米素（zeatin）或者玉米素核苷（zeatin riboside），并结合低浓度的生长素（通常是的萘乙酸（NAA）或者吲哚乙酸（IAA））,以此促进外植体产生愈伤组织。第二步，将玉米素浓度降低20%，将生长素浓度降低10倍，同时加入赤霉素来刺激根系再生。每个外植体的再生速率都很高，经过4-6周可生出第一批根，培养10-12周后可每个外植体都会长出至少10条根。以卡那霉素（kanamycin）或者潮霉素（hygromycin）作为筛选标记可以很容易地用肉眼进行分析，然后切除可能与转化无关的根。那些含有抗生素抗性基因的苗将会很明显从茎的切口处长出根，而那些非转基因的苗将不会生根或者从不定位点生根。使用不同的栽培品种或者组织，其转化效率也不同。但是根据重复实验的记录显示，从最初的外植体到确定的转基因单株的比率在40%到100%之间。
烟草遗传转化实验
实验八植物细胞悬浮培养 实验目的：学习和掌握植物细胞悬浮培养的操作技术与方法。 实验器材： 超净工作台、恒温培养室、高压灭菌器、冰箱、恒温培养箱、培养瓶、250 mL 、500 mL三角瓶、镊子、酒精灯等。 配置MS液体培养基（2，4-D 2 mg/L+1%甘露醇 +3% 蔗糖，pH 5.8）分装于250ml的三角瓶中，每瓶50ml。 实验材料：烟草叶片愈伤组织。 实验方法： 1.70%乙醇净化工作台并擦洗干净，将所用的材料、工具、培养基等 放入工作台。打开紫外灯和风机，15分钟后关闭紫外灯开始方可操作。 2. 在超净台上用无菌镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织，放入 150ml三角瓶中并轻轻夹碎,每个三角瓶加入培养基20-30ml，每瓶接种1-2g愈伤组织，按愈伤组织与液体培养基1∶10的比例，以保证最初培养物中有足够量的细胞。 3.接种后的三角瓶用天平称取重量并记载，然后置于摇床上，在转速 100-120rpm，25℃下培养以及散射光条件下，进行振荡悬浮培养。 4.每周更换新鲜液体培养基两次，每次更换1/3。每次更换新鲜培养 基时称取重量。 5. 每个人接种悬浮培养细胞1瓶，观察并记录细胞生长情况。 6. 培养7天后，制作细胞生长曲线：为了解县浮培养细胞的生长动态，可用以下方法绘制生长曲线图： 鲜重法：在转代培养的不同时间，取一定体积的悬浮培养物，离心收集后，称量细胞的鲜重，以鲜重为纵座标，培养时间为横座标，绘制鲜重增长曲线。
烟草遗传转化实验 实验目的 烟草是遗传转化的模式植物，已经建立了一套完善的转化再生体系。本实验以烟草为实验材料，了解根癌农杆菌介导法的基本原理和一般步骤，掌握遗传转化的基本操作技术。实验要求： 掌握根癌农杆菌侵染植物获取转基因材料的方法；理解农杆菌介导途径进行基因转化的机理；了解转基因植物筛选的方法。 实验原理 根癌农杆菌是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农杆菌中诱导植物产生肿瘤的质粒，简称为Ti质粒。野生型农杆菌的Ti质粒，含有两个与致瘤有关的区域：一个是T－DNA 区，含致瘤基因；另一个是毒性区，在T－DNA的切割、转移与整合过程中起作用。用于植物基因转化的农杆菌Ti质粒载体系统的构建，是将野生Ti质粒中的致瘤基因删除，并在T－DNA区域内插入适当的选择标记和多克隆位点。 p BI121载体是常用的植物表达载体，载体的骨架是pUC18，以CaMV35S启动子驱动的新霉素磷酸转移酶基因NPTII为卡那霉素（kan）抗性选择标记基因，含有卡那霉素抗性基因作为筛选基因。β－葡萄糖苷酶gus基因作为报告基因，转化的获得的转基因细胞、组织或植株，具有抗卡那霉素的特性，经组织化学染色呈蓝色。 实验器材 摇床、超净工作台、小型离心机、冰箱、移液抢、镊子、手术刀、酒精灯、棉球、培养皿、三角瓶、滤纸、牛皮纸、牙签。 实验材料 植物材料：烟草无菌苗 农杆菌与载体：农杆菌LBA4404 p BI121 YEB培养基：牛肉膏(5 g/L)、蛋白胨(5 g/L)、酵母提取物(1 g/L)、蔗糖(5 g/L)、MgSO4 (0.5 g/L)、pH 7.0 烟草分化培养基：MS + 2mg/L 6-BA + 0.5mg/L IAA 烟草生根培养基：MS + 0.5mg/L IAA 卡那霉素（Kan）母液：50mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。 头孢霉素（cef）母液：300mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。 利福平(rif): 50mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。
水稻遗传转化体系Protocol
水稻遗传转化体系Protocol Introduction 1．水稻的遗传转化研究历史与现状 20 世纪80年代末, 水稻的遗传转化首获成功。1988 年, 3 个不同的研究小组以水稻原生质体为受体,采用“电击法”或“PEG 介导法”等方法将外源 3]。1991 年, 基因枪转化的方法在水稻中基因导入到水稻中并获得再生植株[1 ~ 获得成功[4],随后成为水稻遗传转化的常用方法之一。1993 年，Chan 等人[5]首先采用农杆菌介导的方法获得了转基因水稻。Hiei 等人[6]以水稻成熟种子诱导的愈伤为受体, 建立了农杆菌介导的粳稻高效转化体系, 使得农杆菌介导法逐渐成为了水稻转化最常用的方法。此后, 粳稻的转化方法被进一步优化, 使粳稻的遗传转化周期大幅缩短[7]。虽然Hiei等[6]建立的农杆菌介导的转化体系使得粳稻的转化不再困难, 但是许多籼稻的转化依然存在障碍, 主要是转化效率低下。因此, 一些研究者对籼稻的转化体系进行了一些优化, 使得籼稻的转化效率得到了一定的提高[8,9]。最近, Hiei 和Komari[10]发表了一个粳稻和籼稻均适用的农杆菌高效转化的方法.根据他们的结果, 采用幼胚作为外植体, 籼 13 个稻的转化可以在两个半月内完成，且转化效率非常高(一个幼胚可以得到5 ~ 独立的转化植株)。 2. 转基因技术在水稻上的研究与应用[11] a. 转基因抗虫水稻 对于水稻最主要的害虫——螟虫(二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等)在水稻中尚未发现有效的抗性种质资源. 目前,最有希望和前途的方法就是利用转基因技术把外源抗虫基因引入水稻中创造出新的抗虫品种。虽然水稻中已经发现和鉴定了19 个抗褐飞虱的基因[12], 但是由于褐飞虱有多个生物型且易产生变异, 抗性品种往往推广数年后就会失去抗性。 b. 转基因抗病水稻 见抗水稻病毒研究 c. 转基因抗旱水稻 d. 转基因营养高效利用水稻
目的基因的遗传转化
实验十目的基因的遗传转化 一、目的基因的表达载体构建 1. 实验目的 本实验以强化植物基因工程平台技能训练为目的，涵盖PCR分离克隆全长目的基因、Gateway 技术构建目的基因的表达载体、农杆菌介导目的基因的转化、转基因植株的驯化和移栽等系列实验。此外，还就如何利用新型的反向遗传学技术RNAi（RNA interfere，RNA 干涉）进行基因功能研究进行试验指导。为从事相关领域的科学研究奠定基础。 通过本实验，要求学生理解和掌握Gateway 技术构建目的基因的表达载体的基本原理和具体实验步骤。 2. 实验原理 利用高保真聚合酶，采用PCR方法在克隆基因两侧引入attB重组位点，然后将含有attB 位点的PCR产物与含有attp位点和Gateway BP Clonase混合，之后转化E. coli。在两对att 位点之间的位点特异性重组过程中产生一个融合载体，融合载体随即分解成两个分子，重组位点在结构上重新分配，目标基因进入新的载体骨架，通过筛选阳性克隆，获得此重组产物，称为“entry克隆”。在得到的entry克隆中目标基因位于att重组位点之间。将此重组产物与选定的Gateway载体和Gateway LR Clonase酶混合，在entry克隆中的attL位点间的序列取代表达（目标）载体的attR位点之间的序列即目标基因进入表达载体，形成表达（目标）克隆（图）。 Gateway技术构建植物表达载体原理 3. 仪器设备 微量取液器、制冰机、微型离心机、PCR仪、凝胶成像系统、毛细管自动测序仪、电子天平、高速冷冻离心机、振荡器、恒温金属浴、干燥箱、紫外分光光度计、电泳仪、-80 ℃冰箱、-20 ℃冰箱等。 4. 实验试剂 克隆全长基因，pDONR TM221 载体（Invitrogen，12535-019），目标载体（购自Invitrogen，
烟草遗传转化体系的建立
本科生毕业设计（论文） （ 2015届） 农业与食品科学学院 题目：烟草遗传转化体系的建立 学号： 姓名： 专业班级： 2015 年 5 月18 日
本科生毕业设计（论文）诚信承诺书 我谨在此承诺：本人所写的毕业设计（论文）《烟草遗传转化体系的建立》均系本人独立完成，没有抄袭行为，凡涉及其他作者的观点和材料，均作了引用注释，如出现抄袭及侵犯他人知识产权的情况，后果由本人承担。 承诺人（签名）： 年月日
目录 本科生毕业设计（论文）.............................................................................................. 封1 本科生毕业设计（论文）诚信承诺书...................................................................................... 封2 1 前言. (1) 1.1 农杆菌介导法 (1) 1.2 基因枪法 (2) 1.3 PEG法 (2) 1.4 显微注射法 (2) 2 材料与方法 (3) 2.1 试验材料 (3) 2.1.1 植物材料 (3) 2.1.2 菌株和质粒 (3) 2.2 试验方法 (3) 2.2.1 农杆菌的制备 (3) 2.2.2 叶片表面消毒 (3) 2.2.3 预培养-侵染-共培养 (4) 2.2.4 特美汀对农杆菌的抑制作用 (4) 2.2.5 芽分化-卡那霉素浓度的测定 (4) 2.2.6 根分化 (5) 2.2.7 炼苗-移栽 (5) 2.2.8 转基因植株的分子鉴定 (5) 3 结果与分析 (6) 3.1 农杆菌菌液侵染时间对转化效率的影响 (6) 3.2 共培养时间对转化率的影响 (7) 3.3 特美汀对根瘤农杆菌的抑菌效果 (7) 3.4 卡那霉素浓度对烟草叶片外植体出愈率的影响 (8) 3.5 转基因植株的分子鉴定 (8) 4 讨论 (9) 参考文献 (9) 致谢 (11)
百脉根稳定遗传转化方法
培养基配方 种子萌发（1/2×B5） B5 basal salts：0.775g 溶解定容到500ml； 用NaOH调PH至5.5，然后加入琼脂粉3g； 121℃灭菌20min； 冷却到低于70℃，然后加： 1000× B5 vitamin stock: 250 μl 共培养（1/10×B5） B5 basal salts：0.124g；溶解定容至400ml; 用NaOH调PH至5.5，分装成两个200ml； 121℃灭菌20min；4℃保存； 使用前加： 1000× B5 vitamin stock: 20 μl 6-BA（1 mg/ml）: 40 μl NAA（1 mg/ml）：10 μl MES(1M PH5.2): 1 ml AS(20mg/ml): 200 μl 愈伤组织诱导（1×B5） B5 basal salts：1.55g； 蔗糖：10g 溶解定容至500ml; 用NaOH调PH至5.5，然后加入植物凝胶3g； 121℃灭菌20min； 冷却到低于70℃，然后加： 1000× B5 vitamin stock: 0.5ml 6-BA（1 mg/ml）: 100 μl NAA（1 mg/ml）：25 μl 头孢霉素（250mg/ml）：600 μl 潮霉素（100mg/ml）100 μl 芽诱导（1×B5） B5 basal salts：1.55g； 蔗糖：10g 溶解定容至500ml; 用NaOH调PH至5.5，然后加入植物凝胶3g； 121℃灭菌20min； 冷却之前，加入4M (NH4)2SO4 625 μl 冷却到低于70℃，然后加： 1000× B5 vitamin stock: 0.5ml 6-BA（1 mg/ml）: 100 μl NAA（1 mg/ml）：25 μl 头孢霉素（250mg/ml）：600 μl 潮霉素（100mg/ml）100 μl 根诱导（1/2×B5） B5 basal salts：0.775g 蔗糖：5g，溶解定容到500ml； 用NaOH调PH至5.5，然后加入植物凝胶2.5g； 121℃灭菌20min； 冷却到低于70℃，然后加： 1000× B5 vitamin stock: 250 μl NAA: 25 μl YEB培养基（农杆菌用可能效果会好些）牛肉膏：2.5g 蛋白胨：2.5g 酵母粉：0.5g 蔗糖：2.5g MgSO4·7H2O: 0.25g 溶解定容至500ml，调PH至7.0； 试剂： 1M MES PH5.2 4M (NH4)2SO4 1 mg/ml 6-BA 1 mg/ml NAA 20mg/ml AS 250mg/ml Cefotaxime 100mg/ml Hygromycin B 以上试剂配好好过滤除菌 B5 B5 Basal salts 3.1 g/l (sigma) B5 vitamine (sigma) 1000×（无菌）
玉米遗传转化体系的研究进展
玉米遗传转化体系的研究进展 摘要：植物遗传转化是指以植物器官、组织、细胞或原生质体作为受体,通过某种技术或途径转入外源基因,获得使外源基因稳定表达的可育植株。玉米作为世界上主要三大粮食作物之一, 是现代食品工业、医药工业和化学工业的重要原料,在世界经济乃至人类生存方面占据肴举足轻重的地位，所以它的遗传转化研究一直受到各国科学家的重视，至今对玉米遗传转化的研究已经取得了一些成绩，本文主要针对近年来玉米遗传转化技术所取得的重要进展进行论述。主要包括玉米转化受体系统、转化方法及其优点与存在的问题以及对未来的展望等几方面论述玉米遗传转化的研究进展。 关键词：玉米；受体系统；遗传转化方法 0 前言 近年来，随着环境着人口、资源、环境三者之间矛盾的加剧，转基因作物渐渐地进入人们的视野并且显得极为重要。玉米是重要的粮食、饲料，同时还是制药、淀粉、糖浆、油料、酒精工业的主要原料，在我国经济生产中占有非常重要的地位。所以玉米遗传转化的研究备受各国科学家的重视。自1988年Rhodes等首次获得玉米转基因完整植株以来，玉米遗传转化技术得到了较大的发展[1]。不但许多有价值的基因转入玉米，而且转基因方法也出现了多样化，如基因枪法、农杆菌介导法、花粉管通道法等。随着转基因技术的发展与完善，更多的优良外源基因将被用于玉米的遗传改良，并且为阐述单子叶植物基因表达调控机理提供了新方法。 1玉米遗传转化受体系统的研究 1．1玉米基因转化受体体系应具备的条件是： 1 高效稳定的再生能力： 用于植物基因转化的外植体必须易于再生，有很高的再生频率，并且具有稳定性和重复性。根据贾士荣等报道认为，用于基因转化的受体系统应具有80%-90%以上的再生频率，并且每块外植体上必须再生丛生芽，其芽数量越多越好，这样才有可能获得较高频率转化。 2 较高的遗传稳定性： 植物基因转化是将外源基因导入植物并使之整合、表达和遗传，从而达到修饰原有植物遗传物质、改造不良的园艺性状之目的，这就要求植物受体系统接受外源DNA后应不影响其分裂和分化并能稳定地将外源基因遗传给后代，保持遗传稳定性，尽量减少变异。
小麦遗传转化技术的研究进展
X X 学院 本科毕业论文 小麦遗传转化技术的研究进展 所在学院 专业名称 申请学士学位所属学科 年级 学生姓名、学号 指导教师姓名、职称 完成日期
摘要 摘要 最近几年小麦遗传转化方法的研究发展快速。自报道第一株转基因小麦以来，小麦转基因育种研究取得了很大的成就。转基因技术实现的小麦遗传转化进一步补充了经典小麦育种的不足，可利用基因库的限制被有效的降低了，取得了可喜的进展。为了实现小麦转基因工程育种更好更快的发展，人们尝试了利用基因枪、花粉管通道、超声波、离子束注入、激光穿刺和农杆菌介导等方法转化小麦。经过十多年的努力，研究者对小麦转基因技术的研究取得了实实在在的进展。目前，基因枪法、农杆菌介导法和花粉管通道法是主要的小麦遗传转化方法，研究涉及小麦各种抗性、品质改良、提高产量等方面。本文介绍、比较，分析了小麦遗传转化的主要方法，包括其基本原理、优缺点及其影响因素，以期通过本文人们能更好的了解小麦遗传转化技术及其进展，促进其持续改进和提高。 关键词：小麦，遗传转化，基因枪法，农杆菌介导法，花粉管通道法 Ⅰ
Abstract ABSTRACT In recent years wheat genetic transformation method developing so fast.Since the first reports of transgenic of wheat, wheat transgenic breeding research has achieved great things.Wheat genetic transformation of transgenic technology to further complement the classic deficiencies of the wheat breeding, effectively reducing the restrictions on the use of gene libraries, has made encouraging progress. In order to realize the wheat genetically modified engineering breeding better and faster development, people try using gene gun, pollen tube channel, ultrasonic, ion beam injection, laser puncture and agrobacterium mediated transformation method such as wheat. After ten years of hard work, the researchers on wheat transgenic technology research made real progress. At present, the gene marksmanship, agrobacterium-mediated technique and pollen tube channel is the main method of wheat genetic transformation method, research involves the wheat all resistances, quality improvement, increase production, etc. This paper introduces, the comparison, analyzes the main method of wheat genetic transformation, including its basic principle, advantages and disadvantages and its influencing factors, so as to through this article, people can better understand the wheat genetic transformation technology and its progress, and promote continuous improvement and improve. Key words:Wheat, genetic transformation, gene marksmanship, agrobacterium-mediated technique, pollen tube channel method Ⅱ
种子真空侵染法遗传转化体系的建立与优化
第４１卷一第１期２０１９年３月一一一一一一延一边一大一学一农一学一学一报A g r i c u l t u r a l S c i e n c e J o u r n a l o fY a n b i a nU n i v e r s i t y 一一一一一V o l ．４１N o ．１一M a r ．２０１９收稿日期:２０１９Ｇ０１Ｇ２２一基金项目:国家青年科学基金项目(３１３０１０４３) ,吉林省教育厅 十三五 科研规划项目(J J K H ２０１９１０１３K J )作者简介:杨丽萍(１９７４－),女,吉林蛟河人,博士,研究方向为表观遗传学,金太成为通信作者,一一一一E Ｇm a i l :J i n t a i c h e n g ２５３５＠１６３．c o m 文章编号:１００４Ｇ７９９９(２０１９)０１Ｇ００５８Ｇ０４一一一一D O I :１０．１３４７８/j ．c n k i ．j a s y u ．２０１９．０１．０１０种子真空侵染法遗传转化体系的建立与优化 杨丽萍,一王一悦,一孟大伟,一吴艳菊,一金太成? (吉林师范大学生命科学学院,吉林四平１３６０００ )摘要:针对植物遗传转化体系中周期长二表达效率低等的局限性,在拟南芥中建立并优化了一种新的遗传转 化体系,称为发芽种子真空侵染法.以发芽种子作为真空侵染的材料,在拟南芥中成功地表达了βＧ 葡萄糖苷酸酶(β ＧG l u c u r o n i d a s e ,G U S ),并对影响基因表达的侵染条件进行了优化.结果表明:当农杆菌细胞浓度(O D ６００)为１．２,真空泵的压强为０．０７M P a 时,植物中G U S 基因的表达效率更高.R T ＧP C R 检测结果表明,利用这种体系在紫花苜蓿(M e d i c a g o s a t i v a L ．)中有效表达了外源基因G U S .这种体系具有快速和高效的优势,为农杆菌介导的植物遗传转化体系提供了新的途径. 关键词:发芽种子真空侵染;稳定转化体系;β Ｇ葡萄糖苷酸酶;拟南芥中图分类号:S ６５２一一一文献标识码:A 一一一E s t a b l i s h m e n t a n do p t i m i z a t i o no f g e n e t i c t r a n s f o r m a t i o n s y s t e mf o r g e r m i n a t e d Ｇs e e d v a c u u mi n f e c t i o n Y A N GL i p i n g ,一WA N G Y u e ,一M E N G D a w e i ,一WU Y a n j u ,一J I N T a i c h e n g ?(K e y L a b o r a t o r y f o rP l a n tR e s o u r c e sS c i e n c e a n dG r e e nP r o d u c t i o n ,S i p i n g J i l i n １３６０００,C h i n a )A b s t r a c t :D u e t o t h e l i m i t a t i o no f l o n g t i m e a n d l o we x p r e s s i o ne f f i c i e n c y f o r g e n e t i c t r a n s f o r m a t i o ns y s Ｇt e m s i n p l a n t s ,an e wt r a n s f o r m a t i o ns y s t e m w a sc o n s t r u c t e d i n A r a b i d o p s i s p l a n t s ,n a m e d g e r m i n a t e d Ｇs e e dv a c u u mi n o c u l a t i o n ．T h e g e r m i n a t e d Ｇs e e d sb y v a c u u mi n f i l t r a t e dw i t hA g r o b a c t e r i u ma s t h em a t e r i Ｇa l s ,βＧG l u c u r o n i d a s e (G U S )g e n ew a ss u c c e s s f u l l y e x p r e s s e di n A r a b i d o p s i s p l a n t s ,a n dt h e i n f i l t r a t i o n c o n d i t i o n s i n f l u e n c i n gg e n e e x p r e s s i o nw a s o p t i m i z e d ．T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e e f f i c i e n c y o f G U S g e n e e x p r e s s i o nw a s h i g h e r i n t h e p l a n t sw h e nA g r o b a c t e r i u mc e l l c o n c e n t r a t i o n a n d t h e p r e s s u r e i n t h e v a c u u m b u m p w a s １．２a n d ０．０７,r e s p e c t i v e l y ．R T ＧP C Rd e t e c t i o ns h o w e d t h a t t h e G U S w a s e f f e c t i v e l y e x p r e s s e d i n M e d i c a g o s a t i v a w i t h t h i s g e r m i n a t e d Ｇs e e dv a c u u mi n o c u l a t i o ns y s t e m．T h e s y s t e m h a da d v a n t a g e so f f a s t a n dh i g h Ｇe f f i c i e n t ,a n d p r o v i d e d an e w w a y f o r t h e s t a b l e t r a n s f o r m a t i o n s y s t e m s i n p l a n t s ．K e y w o r d s :G e r m i n a t e d Ｇs e e d s v a c u u mi n f i l t r a t i o n ;s t a b l e t r a n s f o r m a t i o n s y s t e m ;β ＧG l u c u r o n i d a s e ;A r a b i d o p s i s 一一植物的稳定遗传转化方法已经被广泛的应用于 植物品种的改良,其中,最常用的２种方法是农杆菌介导法和基因枪法.基因枪法导入的外源基因存在拷贝数较多及遗传不稳定等缺点,大多数植物的遗
植物遗传转化研究进展
植物遗传转化研究进展 重庆师范大学生命科学学院生物科学（师范）专业 2009级 指导教师 摘要：植物遗传转化是一项农业生物技术，它通过某种途径或技术将外源基因导入受体细胞的全基因组中，并使之在受体细胞中得以充分表达。目前一些重要农作物转基因品种已经或即将投入到实际应用，随着研究的不断深入,本文对植物遗传转化的技术作出了新的展望。 关键词：植物遗传转化；植物遗传转化方法；应用；进展 Abstract：Plant genetic transformation is a kind of agricultural biotechnology.It delivers to the whole-genome of receptor cells through a certain approach or technique to make the exogenous genes fully expressed in receptor cells. At present, genetically modified varieties of some important crops have been or are about to put into the practical use. with the deepening of the research,this paper makes a new outlook of the plant genetic transformation technology. Key words: Plant genetic transformation; the approaches of plant genetic transformation; application; progress 植物遗传转化是指以植物的器官、组织、细胞或原生质体作为受体，通过某种技术或途径转入外源基因，获得使外源基因稳定表达的可育植株。遗传转化也称为转基因技术。转基因植物的研究始于20世纪70年代。到了20世纪80年代，由于基因操作技术的提高和目的基因构建模式等内容的基本完成，植物转基因技术便应运而生。1983年获得了第一例转基因烟草，使植物基因工程发生了质的飞跃，植物转基因技术也已经得到了广泛的应用和发展，人们开始对外源基因导入植物细胞的方法进行大量的探索，建立了多种方法用于植物的基因转化。目前应用最普遍的植物基因的遗传转化方法主要有农杆菌介导法和DNA直接转入法[1,2]。
番茄的遗传转化
番茄的遗传转化 班级 姓名 学号
摘要：本研究以小型番茄为试材,建立其以子叶、下胚轴为外植体的高效、稳定 再生体系及遗传转化体系。子叶外植体与农杆菌共培养后,经过诱导,根的再生，初步建立了农杆菌介导的遗传转化体系。是目前最有效的途径之一。农杆菌对植物释放的化学物产生趋化反应，向植物受伤组织集中。经共培养后，受伤部位的化学诱导物透过农杆菌的细胞膜使Ti质粒上的Vir基因活化。Vir基因产物使Ti 质粒上的T—DNA进入植物细胞，并整合到植物核基因组中。插入在T—DNA 左右边界区内的目的基因也随之整合到植物染色体上，从而使目的基因在植物细胞中得到表达。近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物中也得到了广泛应用。 关键字：番茄下胚轴子叶转化
一、实验材料、试剂和仪器设备 1.实验材料：番茄种子 2.试剂：大量元素、氯化钙、微量元素、铁盐、有机成分、琼脂、蔗糖、蒸馏水、1mol∕LNaOH、6BA、NAA、升汞、蛋白胨、酵母粉、卡那霉素、75％乙醇 3.仪器设备：天平、烧杯、量筒、移液管、药勺、称量纸、玻璃棒、吸耳球、PH 试纸、培养瓶、封口膜、橡皮筋、高压灭菌锅、电炉、标签纸、记号笔、滤纸、镊子、剪子、移液枪、枪头、酒精灯、培养皿 二、实验步骤 1.外植体的制备 (1) MS培养基母液的配制 按以下的成分与浓缩比例配制母液 大量元素50mg∕L 氯化钙50mg∕L 微量元素1 mg∕L 有机成分1 mg∕L 蔗糖30 g∕L 琼脂 6 g∕L (2)MS培养基的配置 配制200ml的MS培养基，将所需要的试剂混合后加热溶解，用1mol∕LNaOH 调节PH至5.8，宁大勿小偏酸不凝固，然后分装到灭好菌的培养瓶中。 (3)高压灭菌 将配制好的培养基、培养瓶、无菌水、有滤纸的培养皿灭菌 (4)铺种子 打开超净工作台紫外灯照射约30min，然后关闭紫外灯，打开超净工作台的风机。先数好所需要的种子，放在一个小烧杯中，到入升汞，没过种子，五到六分钟。然后回收升汞，把无菌水倒入摇晃，用灭菌好的无菌水洗3—4次，拿镊子灭菌，要灭透。将种子放在灭好菌的有滤纸的培养皿中，吸干水。拿灭好菌冷却的镊子将种子接进灭好菌的8瓶培养基中，每瓶5—6粒，接完种子将培养基放在培养室中培养，发育一周左右。 结果：共培养12瓶种子，每瓶接种5颗种子，平均每瓶生长了4颗，萌发率为48∕60=80％。 2.工程菌的活化 (1)LB培养基的制备 根据以下配方，分别配制LB固体、液体培养基，分装后高压灭菌。 液体培养基用量：蛋白胨10g∕L 酵母粉5g∕L 氯化钠10g∕L 固体培养基用量：蛋白胨10g∕L 酵母粉5g∕L 氯化钠10g∕L 琼脂10g∕L (2)倒平板 灭菌后的LB固体培养基冷却至40℃左右，加入卡那霉素，摇匀后倒入已灭菌培养皿中，冷却备用。 (3)划线 用已灭菌的接种环从保存的原菌液取一环，在已冷却的平板上划线。封好培养皿置于28℃培养箱中培养2天。
拟南芥的遗传转化技术
拟南芥的遗传转化技术 1种子消毒处理 用70%的乙醇浸泡2分钟，用15% （体积比）NaClO溶液旋转洗涤10分钟，无菌水漂洗5次。 2播种和移栽 用无菌水重悬浮消毒处理的种子，均匀分散到1/2MS固体培养基表面上，培养皿倒置，4°C春化两天，25°C正置暗培养一天，再置于22°C的组织培养室中正常培养。待苗长至四片叶子时，将其移栽到营养土中，置于22°C恒温环境中，16h光照/8h黑暗培养，初期可适当绕些营养液。 3拟南芥幼苗修剪 植株长出顶生花序时，去除其顶生花序，以刺激腋生花序的生长，注意避免伤及腋生花序。准备侵染前，剪除角果以及开放过的花朵。 4拟南芥的遗传转化 4.1农杆菌感受态细胞的制备及转化 (1)取-80℃超低温冰箱中保存的农杆菌菌株GV3101，在（含50mg/LRif和 100mg/L Kan)的YEB培养基平板上划线，28℃培养约36-48 h。（单菌落）(2)挑取单菌落GV3101接种于5ml LB液体培养基（含50mg/LRif和100mg/L Kan) 中，28℃200rmp/min振荡培养过夜；（活化） (3)取2ml菌液转入100ml LB液体培养基(含50mg/LRif和100mg/LKan)中继续 培养至OD600=0.5；（增殖培养） (4)转入50ml无菌离心管中，冰浴30min，4℃，4000r/min离心10min，弃上清； (5)加入10ml预冷的150mmol/L NaCl重悬菌体； (6)4℃，4000rmp/min 离心10min，弃上清； (7)加入1/10体积预冷的50 mmol/L CaC12重悬菌体；
(8)分装于无菌l.5ml离心管中，100ul/管，4℃保存备用；取1ug提取纯化的重 组质粒DNA，加入200u1感受态细胞中，混匀； (9)冰浴10min，转入液氮冷冻5min，迅速置于37℃水浴，热激5min； (10)加入500ul LB液体培养基，28°C，200rmp/min振荡培养2-3h； (11)5000r/min 离心2min，弃上清； (12)剩余菌液(残留100ul左右)用移液器反复抽吸悬浮，然后均匀涂布于LB平 板(含50mg/L Rif，100mg/LKan)表面，28℃培养2-3d。 4.2 含有重组质粒的农杆菌的PCR鉴定 挑取LB平板上的单菌落，接种于5ml LB液体培养基（含50mg/L利福平Rif,100mg/L Kan)中，28℃培养1-2d，以未转化的农杆菌作对照，进行菌落PCR 鉴定。 4.3花序法侵染拟南芥 (1)挑取单菌落接种于5ml LB液体培养基(含50mg/L Rif和100mg/L Kan)中， 28℃200rmp/min振荡培养过夜； (2)取2ml 菌液转入100ml LB 液体培养基(含50mg/LRif 和100mg/L Kan), 28℃ 200rmp/min振荡培养至OD600值为1.0-1.5左右； (3) 6000rmp/min，离心10min，弃上清； (4) 1ml 5%蔗糖溶液悬浮，6000rmp/min，离心2min，弃上清； (5) 重复步骤4； (6) 加入5%蔗糖溶液重悬菌体，至OD600值为0.4-0.7左右； (7) 浸泡前按0.05%体积比加入silwet 77表面活性剂； (8) 浸泡前绕水，并将已经结的荚剪去，将花苞浸泡于上述溶液中1min； (9) 将植株倒置，黑暗培养24h，取出，正常生长培养。