液相色谱仪操作规程

液相色谱仪操作规程

一、流动相及样品的准备：

1、流动相的选择：有机溶剂必须是色谱级，水必须是超纯水或二次蒸馏。

2、流动相的配制：用乙腈70: 水30的比例（例如：配制500ml流动相：即用350ml乙腈，加150ml水，混匀后放在滤器真空泵上用0.22μm的滤膜过滤。过滤完成后装在流动相专用瓶子内，放在超声波清洗器上超声脱气15—20分钟。

3. 超声脱气操作：将超声波清洗器上的三个旋钮调到最大，按下电源开关，然后按左边第一个按钮上的按键，机器开始工作。超声器使用前按（以下超声器的使用要求操作）规定超声结束后取出放冷至室温。

注意：A根据待检测样品的需要更换合适的流动相时在电脑上关掉泵开关。

B要求样品溶液制备好后也用0.22μm 的微孔滤膜过滤或在进样器上安装过芋滤头后才能进样。

二、开机：

1、开机顺序：接通电源，开启稳压电源、再在仪器上依次打开RID-20A(检测器)、CTO-20A（柱温箱）、LC-20AT(泵) 按键，待自检结束（即以上三个仪器上的设定面板黄色灯灭）后，打开仪器LC-20AT输液泵上的排液阀（仪器显示器屏幕上的两行数字和字母变成一行时将排液阀逆时针旋转180度）后，按下设定面板上的Purge 键，就可排出相应流路中的气泡，使新鲜的流动相在流路中得以置换，整个过程需要大概3分钟后，顺时针将排液阀旋转180度关闭。

3、打开打印机、电脑显示器、主机，最后点击电脑桌面上的Lc-solution图标，工作站开始联机，连上后能听到两次“嘀” 的声音。证明泵、自动进样器、柱温箱、检测器全部已连接上。

三、LC-solution 操作界面的进入及系统的开启

1、双击电脑桌面左侧从上至下第四个图标Lc-solution，弹出窗口后显示输入用户名ID 及密码（一般不改），按“确定”仪器进入实时分析界面。桌面上部显黄色表框（仪器），双击旁边方框内蓝色图标。

2、点击助手栏中的“仪器参数”进入仪器参数设置界面，出现坐表，设置采样时间，在桌面左下角点结束时间后修改数字，改时间依据为做标准曲线时的出峰时间而定。（一般情况不改）。流动相流速从0.2、0.4、0.6、0.8慢慢往上加，加至1.0（第一次调整0.2后点下载后打开电脑中部？号后面仪器检测激活开关），柱温显示50。每次在完成后点击“下载”将分析参数传输至主机；打开桌面偏右上方？好前第四个图标自动冲洗开关（RID检测器）等待20分钟。

3、分析方法的保存：选择文件→另存方法文件为→选择保存路径→取名保存文件。该方法即作为当前运行的方法。

（一）、曲线制备：

称取葡萄糖标样或标准品0.0125g、0.025g、0.05g、0.125g、0.25g稀释在25ml容量瓶中，相当于（0.5㎎，1.0㎎,2.0㎎,5.0㎎,10.0㎎）或改变标准品称量相当于（1.0㎎、3.0 ㎎、5.0㎎、8.0㎎、10.0㎎）于25ml容量瓶内。﹙注；㎎浓度以容量瓶容量而定，先将容量瓶用超纯水冲洗后瓶内无水珠再用﹚用超纯水先稀释溶解定容至刻度线摇匀待用。

（二）、样品的制备：

先将50ml容量瓶用超纯水冲洗外部擦干后，将容量瓶放于电子天平上称重去皮，将所要测试的麦芽糖浆用玻棒或勺子将样品滴入容量瓶内一滴即可记下称重﹙注称样过程中注意样品不能滴到瓶外壁上或电子天平上以防称样不准﹚，将所称的样品用超纯水稀释溶解后定容至刻度摇匀。连同标准曲线制备的样品同时放在超声器中超声15分钟取出放至室温备用。

（三）、超声器的使用：

将超声器电源接通，在超声器内加入一定量的蒸馏水（满过样品即可）。再用1000ml的烧杯内加入一定量的蒸馏水超声器开关进行超声15分钟取出放置室温备用。（满过样品即可），将样品瓶放在烧杯内保持平稳打开。

注：1.一般为节省超声时间曲线标样与样品同时超声完成。

2每新配一次流动相均需作曲线。

3未换流动相时，可以直接只做样品代入以前计算方法计算结果。

四、进样操作：

进样：将制备好的样品用2.5ml的进样器（带上滤头）针头将样品吸入、排出3

次进行清洗结束后，吸取样品满管后针头向上进行第一步弹指排气，再将进样器活塞由下向上推带针头不断流出液体后用滤纸吸干针头多余液体。将进样针头平行缓慢插入进样孔，将进样阀﹙即仪器正面中间黑色手柄逆时针旋转45°后推入进样器活塞。待进样口旁小瓶内开始不断有液体流出3-5滴时证明样已进满，停止进样。立即将进样手柄顺时针向下旋转45°回复原位。电脑桌面显示正在分析，仪器进入分析期间大概12分钟左右，此时电脑界面逐渐出现坐标方框显峰。等待过程中可用进样器针头清洗第二个样品，待界面黑色线走向下方时间12.5min时左侧单次分析图标显示点亮，证明第一个样品分析结束。先点击左侧单次分析图标，在界面方框修改文件夹名称，自动递增依次显示数值………，开始第二个样品进样过程。依次顺延至曲线标样大概5-6个分析结束。

五、曲线计算：

1、数据处理：

点（桌面左下方）界面出现上下两个标图，点击界面左侧文件夹下框选择所做曲线编号其中任意一个图标双击打开，再点击左侧向导图标，方框（化合物表向导

1/5），点击下一步，方框内选择需要峰的保留时间。1.2.3…….编号后框内打√，排除第一个（乙睛和水的峰）在2和3选项框内打√，点击下一步，修改方框右上角浓度单位（㎎/ml），在校准曲线最大级别数选择最大标准曲线个数如5个，点下一步，出现4/5向导，再点下一步，修改方框内化合物名。如：1葡萄糖，2麦芽糖，3麦芽三塘等，在对应的浓度栏内输入称重时的浓度。

2，浓度的计算：

用所称糖样的克数【麦芽糖或葡萄糖÷容量瓶容积×100＝浓度】如：麦芽糖0.0124g÷容量瓶体积25 ml×1000＝0.496㎎/ml。依次按编号输入对应的麦芽糖和葡萄糖浓度值。点击完成。【计算曲线值期间，若仪器仍在检测分析样品界面，观察左下角三角瓶图标显红色，说明前面所进样品检测完毕。点击三角瓶图标进行分析界面，先点击单次分析，修改样品编号，点击确定。仪器进入所进样品分析界面】，需要返

回原计算界面点击左下角后一个图标【蓝色带峰符号】，又重新回到计算曲线界面。待浓度输入结束后点击完成，再点击界面左侧【应用到方法图标】，出现【在解析方框】点击‘是’，再出现【在解析】再点击‘是’，界面出现【方法另存为】方框，修改文件名称，例如：20150620做无含量3号糖标品计算方法，点击保存，界面出现【选择方法参数】点击确定，界面又出现上下一小一大两个长条框，在界面左侧主项目下的【批处理在解析】图标，在文件夹左下角底部点击【蓝色峰】图标，在检测器框内出现峰标线【若已出现无需点】，找到所做5个标准品图谱，先点选择其中第一个，点击按住键盘左下角ctri鼠标一次点完所有5个曲线编号，将鼠标移到最上面的数值左框点住不放移到界面大框文件夹【在解析】，5项修改样品类型第一个为标准初始化校准曲线，点击确定。修改第二个样品类型为标准，添加校准点，点确定，点击第二个样品类型方框为黑框后，右击鼠标，选择向下填充，修改方法文件，点击第一个打开出现【选择方法文件】框，找到新建的计算方法，双击直接打开，点击变黑框，右击向下填充，确定，使数据文件第一个显黑确定，以次顺序移入。修改级别号，以次递减，再点击界面左侧【批处理在解析】图标，出现批处理文件夹另存为例如：20150620无麦芽糖含量3号计算方法，点保存，出现关闭文件，点确定。保存当前数据点击“是”出现黄色表框【在解析】点界面右上角×关闭。

3、验证曲线效果：

点主项目下端【校准曲线】图标，界面出现“校准曲线视图”在文件夹中找到刚新建的曲线3号计算方法，双击打开显示红点线性。

4，样品的计算：

在数据处理栏边框文件夹下找到样品编号，双击，点向导，点下一步，选择【化合物表向导】2/5方框内选择所需要的峰的保留时间框内打“√”第一个为乙腈和水的峰值，点下一步，改浓度㎎/ ml，校准曲线的最大级别数改为1,点下一步，再点下一步，修改化合物名称，葡萄糖，麦芽糖，麦芽三糖，输入浓度，点完成。点【应用到方法】图标，点“是”，再点“是”【在分析方法】另存为改文件名【即样品编号】点保存，出现选择方法参数，点确定，点击左上角小框选择文件，打开后，【选择加载方法】打开找到标准曲线计算方法，单击打开，点确定，界面方框出现浓度结果值

计算。例如：葡萄糖0.540㎎/ml÷3.486浓度＝15.49％，麦芽糖1.389㎎/ml÷3.486浓度＝39.85％。在文件夹下框内任意点一张图双击，出现保存当前数据文件“是”就保存。

六、数据文件中报告预览和打印

1、报告模板的制作：点击Top 返回上级引导操作栏，助手栏中点击“再解析数据分析”—“数据报告” 进入报告界面。

2、调入报告格式文件，用鼠标将报告格式文件拖拽到右侧报告栏内即可

3、报告格式的制定和修改，可以通过点击“样品信息”“方法信息”“LC/PDA 、色谱图”“LC/PDA 校正曲线”“LC/PDA 峰表” “LC/PDA 结果”等内容、图标，拖拽鼠标到报告中确定位置，即可依次加入相应的统计信息。

4、报告模板保存：文件—另存报告格式文件—Lc-solution 路径—文件名—保存。

5、数据的打印：在文件收索器中选择欲打印的数据文件，拖拽至报告模板中，然后点击助手栏中的打印按钮即可。

七、实验结束

1、实验结束，用甲醇冲洗泵30min 。

2、点击“仪器开/关”键，停泵，待泵的压力下降到0.5Mpa 以下，按关机顺序关闭仪器电源。

3、溶液滤头至少每3个月清洗一次。不锈钢滤头应先浸在异丙醇或甲醇中超声10分钟，再用超纯水冲洗干净；若为玻璃滤头，应放在35%HNO3中浸泡20分钟后用超纯水冲洗干净。

4、流通池至少每月清洗一次。在不连接色谱柱（或连空柱）的情况下，先用超纯水冲洗20分钟，然后用5%HNO3冲洗10分钟，再用超纯水冲洗至流出液中性即可。

5、关机顺序：与开机顺序相反，即先关闭Lc-solution 工作站、主机电脑显示器、打开打印机、泵、柱温箱、检测器。