反相高效液相色谱的基本原理及其应用

生物技术一班王梦宇41108218

反相高效液相色谱是化学键合相色谱法的一种。化学键合相色谱法是由液液色谱法发展起来的,是为了解决在分离过程中,机械吸附在载体上的固体液的流失问题而发展出来的一种新方法。键合相色谱法通过将不同的有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶载体表面的游离经基上,而生成化学键合固定相,化学键合固定相对各种极性溶剂都有良好的化学稳定性和热稳定性。由它制备的色谱主柱效高、使用寿命长、重现性好,几乎对各种类型的有机化合物都呈现良好的选择性,并可用于梯度洗脱操作,消除了分配色谱法的缺点。

根据键合固定相和流动相相对极性的强弱,可将键合色谱法分为正相键合色谱法和反相键合色谱法.反相键合色谱法即反相高效液相色谱.在正相键合色谱法中,键合固定相的极性大于流动相的极性,适用于分离油溶性或水溶性的极性和强极性化合物.在反相键合相色谱法中,键合固定相的极性小于流动相的极性适用于分离非极性、极性或离子型化合物,其应用范围也比正相键合相色谱法更为广泛。

关于反相色谱的分离机理,吸附色谱的作用机制认为溶质在固定相上的保留主要是疏水作用,在高效液相色谱中又被称为疏溶剂作用。根据疏溶剂理论,当溶质分子进入极性流动相后,即占据流动相中相应的空间,而排挤一部分溶剂分子。当溶质分子被流动相推动与固定相接触时,溶质分子的非极性部分或非极性因子会将非极性固定相上附着的溶剂膜排挤开,而直接与非极性固定相上的烷基官能团相结合(吸附)形成缔合络合物,构成单分子吸附层。这种疏溶剂的吸附作用是可逆的,当流动相极性减少时,这种疏溶剂斥力下降,会发生解缔,并将溶质分子解放而被洗脱下来。

反相色谱中疏水性越强的化合物越容易从流动相中挤出去,在色谱柱中滞留时间也长,所以反相色谱法中不同的化合物根据它们的疏水特性得到分离。反相色谱法适于分离带有不同疏水基团的化合物,亦即非极性基团的化合物。此外,反相色谱法可用于分离带有不同极性基团的化合物。可以通过改变流动相的溶剂及其组成和pH,以影响溶质分子与流动相的相互作用,改变它们的滞留行为。另外,反相色谱中水的流动相中占的比例伸缩性很大,可以从0一100%,从而使反相色谱可用于水溶性、脂溶性化合物的分离。反相色谱法中的固定相是被共价结合到

硅胶载体上的直链饱和烷烃,其链的长短不同,最长的是十八烷基,这也是使用得

最多的固定相。直链饱和烷烃疏水特性随着碳氢链的长度而增加,在反相色谱柱

中溶质由于疏溶的有机溶剂,以得到不同强度的流动相,这些有机溶剂称为修饰剂。反相色谱中最常用的有机溶剂有甲醇和乙睛,此外,乙醇、四氢吠喃、异丙醇及二氧六环也常被用作修饰剂。

烷基键合固定相对每种溶质分子缔合作用和解缔作用能力之差,就决定了溶

质分子在色谱过程的保留值。以下简述影响溶质保留值的二个因素: l)溶质分子结构在反相键合相色谱法中,溶质的分离是以它们的疏水结构差

异为依据的,溶质的极性越弱,疏水性也强,保留值越大。根据疏溶剂理论,溶质的保留值与其分子中非极性部分的总表面积有关,其与烷基键合固定相结出的面积愈人,保留值越人。

2)烷基键合固定相的特性烷基键合固定相的作用在于提供非极性作用表面,

因此键合到硅胶表面的烷基数量就决定着溶质容量因子的大小。烷基的疏水特性随碳链的加长而增加,溶质的保留值也随着烷基碳链长度的增加而增人。随着烷

基碳链的增长,增加了键合相的非极性作用的表面积,其不仅影响溶质的保留值,

还影响色谱柱的选择性,即随烷基碳链的加长其对溶质分离的选择性也增大。

3)流动相性质流动相的表面张力愈大,介电常数愈大,其极性越强,此时溶质与烷基键合相得缔合能力越强,流动相的洗脱强度弱,导致溶质的保留值越大。

目前,获得紫杉醇比较可行的方法是从红豆杉中进行提取分离,但由于红豆杉中紫杉醇的含量很低,并且存在很多与紫杉醇结构和性质非常接近的紫杉烷伴生物,如二尖杉宁碱,这种结构上的细微差别使得紫杉醇和三尖杉宁碱的分离十分困难。锥丽娜等人采用正相色谱和反相色谱法相结合的方法,在反相色谱中使用了

一种新颖的高分子填料,成功分离提纯了紫杉醇和二尖杉宁碱,纯度达到98%以上,克服了传统方法的缺点

在环境分析中,带硝基的有机化合物被广泛地用于制造火药,这类化合物的大量使用对环境造成严重的污染。虽然气相色谱法中常用的各类选择性检测器对于这类化合物的检测有很好的选择性及很高的灵敏度,但由于这类化合物的热不稳

定性给定量测定带来困难,因此常选用液相色谱法分离检测。

由于手性化合物的物理、化学性质相同,实现它们的分离就比较困难,如大多

数氨基酸都有右旋体和左旋体,但往往只能获得右旋体和左旋体的混合物,即外消旋体。对于手性药物往往呈现一种对映体(R)具有强的生物活性和药效,而另一种

对映体(S)却无药效,因此对手性药物对映体的拆分也是高效液相色谱分析的热点。Erlandssond等人通过改变色谱柱的固定相,在色谱柱内装填由5微升硅胶作基体的手性固定相,群殴独特的选择性使得右旋体和左旋体得以分离。

通过以上例子,可以看出反相高效液相色谱法通过将不同的有机官能团通过

化学反应共价键合到硅胶载体表面的游离经基上,而生成不同极性的化学键合固

定相,从而使这种方法的选择性得到提高且具有针对性。反相高效液相色谱所具

有的柱效高、使用寿命长、重现性好,几乎对各种类型的有机化合物都呈现良好

的选择性,并可用于梯度洗脱操作的优点,使得在生物化学与工程,医药研究,食品

分析,环境污染和精细化工等领域都得到了广泛应用。

高效液相色谱原理及应用

高效液相色谱原理及特点高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9′107Pa）；色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。一、高效液相色谱仪有哪些特点？ 1．高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150～350 ×105Pa。 2．高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于1h 。3．高效：近年来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。 4．高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。5．适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法只要求试样能制成溶液，而技术平台〉〉〉高效液相色谱仪原理不需要汽化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的75% ～80%）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70%～80%。二、高效液相色谱法可分为哪几种主要类型？各自的分离原理是什么？高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且须在色谱仪中进行。根据分离机制的不同，高效液相色谱法可分为下述几种主要类型：

高效液相色谱的发展及其应用

高效液相色谱的发展及其应用摘要：了解高效液相色谱[1]的发展历史，知道高效液相色谱的组成结构、操作原理以及方法等等。掌握它的分类方法，通过比较得出高效液相色谱分析方法的优点与缺点。明确高效液相色谱的应用，最终分析结果。关键词：高效液相色谱；发展历史；应用高效液相色谱是以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。 1、高效液相色谱的发展历史 1.1高效液相色谱的历史高效液相色谱作为色谱分析法的一个分支，是在二十世纪60年代末期，在经典液相色谱法和气相色谱法的基础上，发展起来的新型分离分析技术。1960年中后期，气相色谱理论和实践的发展，以及机械、光学、电子等技术上的进步，液相色谱开始活跃。到60年代末期把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱就出现了高效液相色谱。 1.2高效液相色谱与其它色谱的比较[2] 1.2.1与经典液相色谱的比较经典液相色谱法使用粗粒多孔固定相，装填在大口径、长玻璃柱管内，流动相仅靠重力流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度缓慢，柱入口压力低，柱效低，分析时间冗长。高效液相色谱法使用了全多孔微粒固定相，装填在小口径、短不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高柱压的色谱柱，溶质在固定相的传质，扩散速度大大加快，从而在短的分析时间内获得高柱效和高分离能力。 1.2.2与气相色谱法的比较高效液相色谱法与气相色谱法有许多相似之处。气相色谱法具有选择性高、分离效率高、灵敏度高，分析速度快的特点，但它仅适于分析蒸气压低、沸点低的样品，而不适用于分析高沸点有机物、高分子和热稳定性差的化合物以及生物活性物质，因而使其应用受到限制。在全部有机化合物中仅有20%的样品适用于气相色谱分析。高效液相色谱法却恰可弥补气相色谱法的不足之处，可对80%的有机化合物进行分离和分析。 2、高效液相色谱 2.1高效液相色谱的特点 2.1.1高效液相色谱的优点 1.分辨率高于其它色谱法，可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果； 2.速度快，十几分钟到几十分钟可完成； 3.重复性高、样品不被破坏、易回收； 4.高效相色谱柱可反复使用； 5.自动化操作，分析精确度高；

反相高效液相色谱法测定茶叶中咖啡因的含量

实验一反相高效液相色谱法测定茶叶中咖啡因的含量一．实验目的 1. 熟悉液相色谱仪的基本构造和操作方法 2. 学会利用外标法对物质进行色谱定量分析二．仪器与试药仪器：高效液相色谱仪（日本岛津10AVP型）、溶剂过滤器、样品溶液过滤器、微量进样器试药：甲醇、乙腈、超纯水、咖啡因对照品三、色谱条件色谱柱：C18（250×4.6，5um）流动相：甲醇-乙腈-水=45：10：45 （v/v）检测器及检测波长：紫外检测器280nm 流速：0.6ml/min 四、实验操作 1．对照品溶液的配制：准确称取咖啡因对照品适量，用乙腈：水（1:1）混合溶剂配制成1.0mg/mL 咖啡因储备液；分别移取10μL、20μL、30μL、40μL咖啡因储备液，用超纯水定容至5mL，配制成浓度为2.0μg/mL、4.0μg / mL、6.0μg /mL、8.0 μg/mL的一系列对照品溶液，备用。 2. 样品溶液的配制：准确称取0.035g茶叶, 加乙腈：水（1:1）混合溶剂8mL，超声提取10min，用超纯水定容至10mL，过滤并稀释20倍，备用。 3. 调用或创建咖啡因测定方法并运行方法 4. 测定：待基线平稳后，分别吸取25μL对照品溶液和样品溶液进样。五、数据处理及计算以对照品溶液峰面积与对应含量绘制工作曲线，根据样品溶液峰面积在曲线上查出其进样时含量，并计算得到茶叶中咖啡因的百分含量。六、思考题 1．液相色谱与气相色谱相比较有哪些不同？ 2. 如果用液相色谱法测定可乐中咖啡因，样品应该如何处理？

附：岛津10AVP型高效液相色谱仪操作一、开机 1．打开计算机。 2．开启高效液相色谱仪各部件电源开关（脱气机→A泵→B泵→检测器→柱温箱→主控器）。 3．待高效液相色谱仪各部件自检完毕，在计算机上启动化学工作站ClassVP 并点击Instrument ，输入用户名和密码，点击确定。二、实验参数的设置在Method下，进行操作： 1．单击溶剂瓶图标，设置所用溶剂瓶中溶剂量后，点击OK；单击高压泵图标，设置泵流速0.6mL·min-1，梯度洗脱溶剂B（水）0%，最高柱压设为2.0×107 Pa。 2．单击色谱柱图标，设置柱温箱温度为25℃。 3．单击检测器图标，设置检测波长为280nm，，数据采集时间7min。四、运行样品 1．打开Purge阀。 2．运行Instrument菜单下System On命令启动系统（或单击各图标的on图标启动系统）。 3．待废液管中无气泡流出，关闭Purge阀。 4．待基线稳定之后，单击single run, 进行样品信息编辑。 5. 用微量进样器进样后，扳动手动进样阀至Inject位置，仪器自动开始纪录。 6．待测物出峰完全后，按F8停止采集数据。五、实验数据处理 1．定性、定量分析参数的设定（1）一级校正表的建立 ①在Data Analysis界面下，点击File菜单下的Load Signal，调用低浓度标样的实验结果。 ②优化谱图：打开Graphics菜单，选择Signal Options选项，进入Signal Option编辑框，在Range选择中选择Use Range，输入适当的参数。 ③优化积分：在Data Analysis 界面下，单击Integration菜单，选择Integration Event，选择适当的参数，编辑积分项目。

高效液相色谱法的应用

高效液相色谱法在药物分析中的应用与进展摘要：主要介绍了高效液相色谱法在药物鉴别、药物杂质检查、药物含量测定等方面具体应用以及展望了高效液相色谱法在药物分析中的应用前景。关键词：高效液相色谱法；HPLC；药物分析；联用技术 Abstract:Mainly introduced the high performance liquid chromatography in drug discrimination, drug impurity test, determination of the content and concrete application and the prospect of the high performance liquid chromatography in pharmaceutical analysis application prospect. Keywords: high performance liquid chromatography，HPLC ,pharmaceutical analysis，hyphenated techniques 引言：高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。HPLC在国内和国外的药物分析领域的应用范围很广，发展速度也很快，尤其在我国，近十几年来HPLC方法越来越受到重视。HPLC 在药物的分析中的应用主要是鉴别、有关物质的检查、有效成分及含量的测定[1]；本文对高效液相色谱法（HPLC）技术在药物分析中的应用进行概述并展望其应用前景。 1 在药物分析中的应用 1.1 在药物鉴别中的应用在HPLC 法中，药物组分的保留时间与其结构和性质有着直接的关系，不同的药物由于结构和性质的差异在色谱图上的出峰顺序不同，是定性的重要参数，

影响反相高效液相色谱分离的因素

实验二影响反相高效液相色谱分离的因素一、实验目的 1. 了解高效液相色谱仪器结构； 2. 熟悉溶质结构、溶剂组成和固定相对溶质保留值的影响； 3. 了解影响反相高效液相色谱分离的因素。二、实验原理 1. 反相色谱保留机制：疏溶剂理论溶质的疏水性、流动相的极性（表面张力）和固定相的烷基链长影响溶质的保留。 2. 影响溶质分离的因素 n ：柱长、柱效 α：流动相组成与性质、固定相性质、柱温等 k ：流动相组成与性质、固定相性质、柱温等三、实验条件色谱柱：C18（150 mm×4.6mm ；250 mm×4.6mm ）流动相：甲醇-水（100，95/5，90/10）；流速：1.0（0.8，0.6，）mL·min -1 检测：UV 254 nm 样品：苯、萘、蒽四、操作步骤 1. 流动相组成对分离的影响在C18（150 mm×4.6mm ）和1.0 mL·min -1流速下，依次更换流动相，在每个体系中，均注入 2. 流动相流速对分离的影响在C18（150 mm×4.6mm ）和甲醇-水（90/10）下，依次更换流动相流速，在每个体系中，均 ??? ??+??? ? ??-= k k ααR ,,11n 4 11212

注入5 μL苯-甲苯-萘混合样品，记录色谱图，计算对应的n、k和R。 3. 柱长对分离的影响更换色谱柱，在甲醇-水（90/10，v=1.0 mL·min-1）体系中，注入5 μL苯-甲苯-萘混合样品，、α和R。记录色谱图，计算对应的k 五、数据处理 1.根据操作步骤1，绘制lgk～CH3OH％曲线。 2.根据操作步骤1、2和3，说明流动相组成、流速和柱长对k和R的影响。六、思考题 1.根据本实验的主要结论，指出下列各组物质在反相色谱中的洗脱顺序。（1）苯、苯酚和萘；（2）苯酚、邻甲酚和2,4-二甲酚；（3）正丁醇、仲丁醇和叔丁醇 2. 在反相柱上欲分离三个相邻的组分，初试未达到完全分离。如何实现完全分离？

反相高效液相色谱法测定雪碧中的苯甲酸

分析化学实验报告实验名称：反相高效液相色谱法测定雪碧中的苯甲酸专业：化学教育班级：11化学班姓名：指导教师：郭老师日期：2013.9.7

一、实验目的 1、学习高效液相色谱仪的操作。 2、了解高效液相色谱法测定苯甲酸的基本原理。 3、掌握高效液相色谱法进行定性及定量分析的基本方法。一、实验原理苯甲酸为具有苯或甲醛的气味的鳞片状或针状结晶，具有苯或甲醛的臭味。熔点122.13℃，沸点249℃，相对密度1.2659（15/4℃）。在100℃时迅速升华，它的蒸气有很强的刺激性，吸入后易引起咳嗽。微溶于水，易溶于乙醇、乙醚等有机溶剂。苯甲酸是弱酸，比脂肪酸强。苯甲酸是重要的酸型食品防腐剂。在酸性条件下，对霉菌、酵母和细菌均有抑制作用，但对产酸菌作用较弱。抑菌的最适pH值为2.5～4.0，一般以低于pH值4.5～5.0为宜。在食品工业用塑料桶装浓缩果蔬汁，最大使用量不得超过2.0g/kg；在果酱(不包括罐头)、果汁(味)型饮料、酱油、食醋中最大使用量1.0g/kg；在软糖、葡萄酒、果酒中最大使用量0.8g/kg；在低盐酱菜、酱类、蜜饯，最大使用量0.5g/kg；在碳酸饮料中最大使用量0.2g/kg。用高效液相色谱法将饮料中的苯甲酸与其它组分（如：柠檬酸（钠）、蔗糖等）分离后，将已配制的浓度不同的苯甲酸标准溶液进入色谱系统。如流动相流速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们在色谱图上的保留时间t R和峰面积A后，可直接用t R定性，用峰面积A作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定饮料中的苯甲酸含量。三、仪器和试剂 1、Agilent 1220高效液相色谱仪。 2、色谱柱：Kromasil C18，5μ 150×4.6mm。 3、流动相：75%甲醇（色谱纯）+25%PH=3.3的磷酸缓冲溶液（过三次）。 4、苯甲酸标准贮备溶液：准确称取0.0109g含量99.5%苯甲酸，用过三次的蒸馏水溶解，定量至50mL容量瓶中，并稀释至刻度。标样浓度217μg·mL-1。 4、测饮料试液：雪碧四、实验内容

高效液相色谱分析法在各领域的应用及发展前景

高效液相色谱分析法在各领域的应用及发展前景摘要：高效液相色谱分析是一种高效、快速、准确的分离分析方法，在石油化工、生命科学、环境、医药及食品安全等领域有着广泛的应用。本文旨在简要介绍液相色谱分析法在不同领域的应用情况，并从使用频度、应用范围、检测效率、检测准确度及在本领域分析方法中的重要性等角度进行阐述。关键词：高效液相色谱仪；石油化工；食品安全中图分类号： O657.7+2 文献标识码：A 高效液相色谱在20世纪70年代获得迅猛的发展，是一种常规的分离技术色品分析仪的应用最广是在化学领域上，食品与环境的领域上也出现多方面的应用。其中，化合物的分析就包括高分子化合物，离子型化合物，热不稳定化合物以及生活性的化合物等都可以用不同的方式进行离子交换色谱和离子色谱，体积排除法，亲和色谱法等，进行离子分析。一、高液相色谱分析仪发展现状随着高效液相色谱分析仪的转换，高效液相色谱仪器成为国际分析化学界发展较快的学科，高效液相色谱是由液相系统组成，分别是检测器，色谱柱，记录仪等三个方面的部分组成，为了取得更好的效果，科研工作者需要提升准确度以及精确度和灵敏度显示科研工作的重要性。经常采用薄层色谱法(TLC)和气相色谱法(OC)进行含量测定，而液相色谱法(LC)只是用于对组分标样的测定和分离的可能性研究。色谱法是一

种分类和混合的开发技术，是在1913年由俄国植物学家在实验中发现并且命名的技术，将植物的叶色素和石油醚，通过装有白色的碳酸钠颗粒的玻璃管，再用石油醚进行全面的冲洗，玻璃管的内壁出现不同颜色的色带，随着冲洗剂的不断转变，色带以不同的颜色进行冲洗，不同的色带以不同的速度向下移动并且分离，色谱法由此得名。二、色谱分析仪的使用及工作原理色谱柱通称为不锈钢柱，内装填充剂，常用的是硅胶作为填料，用于正相色谱，化学键固定相，根据色谱化学键的固定相，可以用来作为反相或者是反高的要求。输液系统要为 HPLC仪器提供流量恒定、准确、无脉冲的流动相，同时还要提供精度好、准确度高的多元溶剂梯度。早在2003年国家标准中就已经规定了液相色谱法检测食品中糖精钠和安赛蜜的检测方法，在质检机构中已经将之作为一种常规检验项目的基本检测方法来进行操作。近几年随着色谱柱填充制备技术的高速发展，已经可以一次性分离糖精钠、安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、柠檬黄、日落黄、胭脂红。（一）、高效液相色谱仪的工作原理储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固定相) 内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程高的要求。储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固定相) 内，由于样品溶液中的各组分在两相

高效液相色谱在生物制药中的应用

高效液相色谱在生物制药中的应用高效液相色谱法是近35年发展起来的一项高效、快速的分离分析技术，是现代分离测试的重要手段[1]。高效液相色谱法已经被广泛用在各种领域，它是以经典的液相色谱为基础，引入气相色谱的理论与实验方法，将流动相改为高压输送，并采用高效固定相及在线检测等手段，发展而成的分析、分离方法。以其灵敏度高、选择性好，可分析微量组成甚至痕量样品等特点，成为医药分析领域发展最快、应用最广的现代分析技术之一。于此同时，高效液相色谱法成为环境污染物检测技术及化工产品质量检验中的标准方法。鉴于其简便、快速、灵敏、准确的特点，目前，在医药、卫生、食品、环保等各个领域已得到广泛应用。随着色谱技术的不断发展，在世界许多科学领域中，色谱法已成为世界许多科学领域中普及的一种分离分析手段，色谱仪也呈多样化、高精化、自动化、联用技术化等方向发展。高效液相色谱仪具有柱效高、分析速度快、流动相和被测组分的体积流量小等特点，广泛应用于临床工作[2]。 1.高效液相色谱的介绍高效液相色谱仪一般都具备贮液器、高压泵、梯度洗提装置（用双泵）、进样器、色谱柱、检测器、恒温器、记录仪等主要部件。高效液相色谱法有以下五个特点：①高压：流动相为液体，流经色谱柱受到的阻力比较大，为了能够快速的通过柱子，必须对流动相加很高的高压。②高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。③高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在uL数量级。④应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是强极性、热稳定性差、高沸点、大分子化合物的分离分析，显示出优势。⑤分析速度快、载液流速快：分析所需时间一般小于1小时，和传统经典液体色谱法相比速度快得多。高效液相色谱有5种类型： 1、吸附色谱（Adsorption Chromatography） 2、分配色谱（Partition Chromatography） 3、离子色谱（Ion Chromatography） 4、体积排阻色谱（Size Exclusion Chromatography）

高效液相色谱的应用与发展前景

高效液相色谱的应用呵发展前景液相色谱分析是指流动相为液体的色谱技术,是色谱法中最古老的一种,但通过改进填料的粒度及柱压,在经典的液相柱色谱的基础上引入了气相色谱的塔板理论,在技术上采用了高压输液泵,高效固定相和高灵敏度的检测器,实现了分析速度快. 分离效率高和操作自动化,这种色谱技术被称为高效液相色谱法(HighperformanceliquidchromatographyHPLC) HPLC的出现不过三十多年的时间，但这种分离分析技术的发展十分迅猛，目前应用也十分广泛。其仪器结构和流程也多种多样。典型的高效液相色谱仪结构。高效液相色谱仪一般都具备贮液器、高压泵、梯度洗提装置（用双泵）、进样器、色谱柱、检测器、恒温器、记录仪等主要部件。高效液相色谱更适宜于分离、分析高沸点、热稳定性差、有生理活性及相对分子量比较大的物质，因而广泛应用于核酸、肽类、内酯、稠环芳烃、高聚物、药物、人体代谢产物、表面活性剂，抗氧化剂、杀虫剂、除莠剂的分析等物质的分析。对于高效液相色谱的发展前景应该是非常乐观的，现在的社会的发展节奏很快，各个领域对于分析检验的需求很多，而分析检验中，HPLC所占的比重是不言而喻的，已成化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。所以她的发展情景很乐观。理由有几点 1，随着科技的发展，技术的日臻完善，较之以前色谱分析的方法有了很大程度的提高，很多科学家在对于一些分析上的难点有了新的突破，这样一个不断完善的技术在以后的社会发展中一定会扮演着一个重要的角色。 2，最近,一些先进的检测仪器成功的用在了高效液相色谱分析法上,使得高效液相色谱的应用更广泛,并充分利用高效快速.选择性好.灵敏度高等优点,建立更加系统的成分分析方法.通过与质谱联用.梯度洗脱.柱切换技术.配合先进的检测技术,以及与分子生物学.现代分子药理学相结合,必

反相高效液相色谱法

反相高效液相色谱法鬼针草为菊科植物鬼针草属多种植物的全草，药材资源丰富，广泛分布于热带及温带地区，遍布全国各地，极易采集。根据文献报道，鬼针草属多种植物含有槲皮素成分［1］；槲皮素具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、镇痛、抗血小板聚集、扩张冠状动脉等作用［2～4］。《中国药典》尚未收载鬼针草药材的质量标准。《贵州中药材标准》收载三叶鬼针草BidenspoilsaL.、鬼针草BidensbipinataLinn.的干燥全草，《湖南中药材标准》收载三叶鬼针草BidenspoilsaL.的干燥地上部分，《甘肃中药材标准》1995年收载鬼针草BidensbipinataLinn.，《广西中药材标准》1990年收载三叶鬼针草BidenspoilsaL.、白花鬼针草BidenspoilsaL.var.radiataSch.-Bip. 的干燥全草，河南中药材标准1991年收载三叶鬼针草BidenspoilsaL.、鬼针草BidensbipinataLinn.、金盏银盘 Bidensbiternata(Lour.)Merr.EtSherff.的干燥全草，《上海中药材标准》收载鬼针草BidensbipinataLinn.（婆婆针）的干燥地上部分［5］。从国内地方标准收载情况能够看出全国各地均有广泛的应用，入药部位为全草或地上部分，本实验拟采用RP-HPLC法建立鬼针草属药材中槲皮素的含量测定方法并比较鬼针草不同药用部位和不同种中槲皮素的含量，为该类药材的传统入药部位是否准确和质量评价提供参考依据。 1仪器与材料美国waters2695高效液相色谱仪，VWD检测器；鬼针草采自云南红河州、广西，经刘圆副教授和戴斌教授鉴定为菊科鬼针草属植物狼杷草BidenstriparticaLinn.，白花鬼针草 BidenspilosaL.var.ratiataSch-Bip.，婆婆针BidensbipinataLinn.，三叶鬼针草BidenspilosaLinn.的干燥全草；槲皮素（批号081-9304，中国药品生物制品检定所，含量测定用）；甲醇为色谱纯；水为二次重蒸水；其余试剂均为分析纯。

反相高效液相色谱法测定化妆品中的24种防腐剂

反相高效液相色谱法测定化妆品中的24种防腐剂建立了同时检测化妆品中24种防腐剂含量的反相高效液相色谱法（RP2HPLC）。采用KromasilC18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱，以磷酸盐缓冲溶液（pH=4.26）为流动相，梯度洗脱。样品经甲醇超声提取，然后采用RP2HPLC2二极管阵列检测法测定，对样品前处理和色谱条件进行研究和优化。 1引言化妆品中的防腐剂是为了使化妆品在生产、使用和保存过程中免受微生物污染的一类化妆品添加剂。但大多数防腐剂对人的皮肤会产生不同程度的刺激。因此，化妆品中防腐剂的用量必须以安全性作为前提。我国《化妆品卫生规范》对化妆品中防腐剂的使用浓度和范围做了相关的规定。目前，国内外对化妆品中防腐剂的测定一般多采用高效液相色谱法、气相色谱法、气相色谱质谱法、胶束电动色谱法、毛细管电泳法和伏安法等，而同时测定的防腐剂一般仅为4～8种，最多可同时测定18种，采用的方法均为气相色谱-质谱法。本实验研究了化妆品中的24种常用防腐剂的样品前处理方法和HPLC分离条件，建立了化妆品中24种常用防腐剂同时检测的HPLC法。结果表明，本方法简便、快速、准确，应用于实际化妆品中防腐剂的测定，结果满意。 2实验部分2.1仪器与试剂高效液相色谱仪（美国Agilent1100系列），由四元低压泵、柱温箱、二极管阵列检测器及自动进样器组成；KQ-600型超声波清洗仪器（昆山市超声仪器有限公司）。对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、水杨酸、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、苯甲醇、苯氧基乙醇、4-氯-3-甲苯酚、三氯生及三氯卡班（Sigma公司）；苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、苯甲酸苯酯及溴硝丙醇（AcrosOrgnics公司）；2，4-二氯-3，5-二甲酚、对羟基苯甲酸异丙酯、2-苯酚、4-氯-3，5-二甲酚、对羟基苯甲酸异丁酯及2-苄基-4-氯酚（东京化成工业株式会社）；苯甲酸、山梨酸（国家标准物质中心）。乙腈为色谱纯，甲醇为优级纯；无水乙醇、四氢呋喃等试剂均为国产分析纯；Millipore超纯水。 2.2标准品混合溶液和供试品溶液的制备分别准确称取一定量的24种防腐剂标准品，用甲醇溶液定容，配制成2g/L的标准储备液。分别移取一定体积的上述标准储备液至100mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配成混合标准储备液。准确称取化妆品0.2g（精确到0.001g）于50mL锥形瓶中，加入10mL甲醇，超声提取30min，取部分溶液放入离心管中，在离心机上以5000r/min高速离心10min后，取上清液经0.22μm滤膜过滤，滤液供RP-HPLC检测。 2.3色谱条件色谱柱：伊利特KromasilC18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：A.甲醇，B.0.025mol/LNaH2PO4溶液，pH4.26。线性梯度洗脱条件见表1。流速：1.0mL/min；柱温：25℃；检测波长：程序可变波长扫描；进样量：10μL。 3结果与讨论3.1流动相的选择3.1.1缓冲溶液pH的选择在24种防腐剂中，受pH影响的只有苯甲酸、山梨酸和水杨酸。因此，着重考察了不同pH值（2.5～5.5）对以上3种酸分离情况的影响。发现在pH4.26时，苯甲酸、山梨酸和水杨酸能与溴硝丙醇、苯甲醇、苯氧基乙醇和对羟基苯甲酸甲酯达到很好的分离，峰形良好。 3.1.2NaH2PO4浓度的选择在考察了0.01、0.025和0.05mol/LNaH2PO4溶液对分离的影响后，发现0.025mol/LNaH2PO4可达到较好的分离，且峰形良好。 3.2检测波长的选择通过全波长扫描可得到24种物质各自的吸收图谱。综合各物质在不同波长下的响应值和不同波长对基线的影响，最终确定采用程序可变波长进行扫描，即根据不同组分的出峰顺序，在不同时间段，分别用各组分的最佳吸收波长进行检测，从而提高检测的灵敏度，达到最佳的扫描效果。

高效液相色谱的日常使用和维护

高效液相色谱的日常使用和维护高新科技与现代产业的迅猛发展，促进了以高效液相色谱（HPLC）为代表的复杂样品的分离分析和分离纯化仪器的飞速发展。HPLC以它定量分析结果准确、分析周期短、分析范围广、分析检测限低等优势，在食品添加剂、药物成分分析等多领域得到了广泛的应用。高效液相色谱仪是一种高端检测仪器，它精密快速，有效准确检测的同时就要求我们一定要严格正确使用仪器，定期科学有效地维护仪器，只有这样仪器才能长久持续有效使用。但是从目前实际使用情况看，与高效液相色谱仪的应用及产品技术升级的发展速度相比，其使用和维护则相对比较滞后，从而造成对仪器的滥用和对耗材不必要的浪费。主要原因是由于对于仪器使用操作者的培训侧重于仪器的初步使用，忽略了仪器的后续培训及维护操作学习；其实很多高效液相色谱都是国外进口仪器，英文版本软件对于大多数理工科毕业的仪器操作者也是一个障碍。笔者根据自己的工作经验，以岛津LC-20AT液相色谱仪为例，阐述液相色谱仪在使用时应注意的几个问题及日常使用后的仪器维护基本事项，并对仪器使用过程中容易遇到的问题进行分析，提出解决方法。 1、高效液相色谱仪的组成高效液相色谱仪主要是由输液系统、进样器、色谱柱、检测器和色谱软件数据处理系统组成。 1.1输液系统输液系统主要包括溶液贮器、在线脱气装置、高压输液泵、梯度洗脱装置。溶液贮器用于存放符合HPLC要求的流动相。在线脱气装置主要功能是流动相在进入柱子前排除气泡。高效液相色谱柱的填料颗粒较小，通过2～5mm的色谱柱受到的流动阻力很大，因此需要通过高压输液泵抽取流动相输送至色谱柱。高压泵按输液性能可分为恒压泵和恒流泵两种。按机械结构又可分为液压隔膜泵、气动放大泵、螺旋注射泵和往复柱塞泵四种，前两种为恒压泵，后两种为恒流泵。恒压泵可以输出稳定不变的压力。在一般的分析仪器中，由于系统阻力不变，恒压亦可达到恒流的效果。但是当系统阻力发生变化时，输入压力即使不变，流量却可随阻力而变化。恒流泵则无论系统阻力如何变化都可保证其流量基本不变。在色谱实际操作中，系统阻力可能随着运行时间的增加产生微小的改变，因此恒流泵比恒压泵更优越。然而在泵和柱系统所允许的最大压力下操作时，恒压泵较为安全方便。

高效液相色谱法在生命科学中的应用

高效液相色谱法在生命科学中的应用高效液相色谱在生命科学中的应用范围越来越广，高效液相色谱由于具有高选择性、高灵敏度，并可同时用于有关物质检查与含量测定的特点，已成为医药研究的有力工具。如在中草药有效成分的分离和纯度测定、人工合成药物成分的定性和定量测定、新型高效手性药物中手性对映体含量的测定以及药物代谢物的测定等方面都需要用到HPLC的不同测定方法予以解决。而目前高效液相色谱的蒸发现了它在生命科学中的重要地位。光散射检测器的应用更体现了它在生命科学中的重要地位。1天然药物分析天然药物的来源有动物、植物和矿物之分，其中以植物类为主。由于天然药物的化学成分复杂，其有效成分，可能有一个，也可以有多个，这对于控制药品质量，建立质量标准来说比较困难，HPLC可通过对天然药物的有效成分进行分离鉴定，再测定有效成分的含量；通过指纹图谱建立识别模式，可以判定药材的质量高低。 2 天然药物及复方成药分析复方制剂、杂质或辅料干扰因素多的品种多采用高效液相色谱法。增免扶正片系由当归、党参、黄芪（图3）等十几味天然药物精制而成，具有益气生津、活血养血、滋补肝肾、健脾开胃之功效，主要用于抗缺氧、抗疲劳、抗衰老，长期服用可扶正祛邪，提高机体免疫功能，健身强体，益寿延年。该药对心、肝、脾、肾虚、纳差、心脑血管疾病、神经衰弱、

慢性肝炎、脂肪肝等都有较好的防治作用。由于化学药品的开发费用昂贵，而且毒副作用大，近年来人们已把目光转向自然、民族传统医药、草药、植物药等天然药物，据世界卫生组织统计，当前全世界60多亿人口中80％的人使用过天然医药。在全世界药品市场中，天然物质制成的药品已占30％，国际上植物药市场份额已达300亿美元，且每年以20％以上的速度增长。HPLC分析必定能为我国传统中医药实现现代化，走向世界提供强有力的技术支持。 3 抗生素分析抗生素是由微生物或其他方法产生的化学物质，在高度稀释的情况下仍具有抑制或杀灭其他微生物的性能。抗生素的分离、分析和定量测定是药物分析中较困难的领域。采用较多的方法是微生物法、分光光度法和化学方法，但所需时间较长、专一性较差。 HPLC分析技术近年来在抗生素的质量控制中已广泛应用。对结构、组分等较清楚的药物，HPLC分析将逐步取代传统的生物测定。目前，各国药典中应用HPLC技术对抗生素进行质量控制的项目包括鉴别、组分分析、含量测定和相关物质测定等。 4 在鉴别中的应用在HPLC法中,保留时间与组分的结构和性质有关,是定性的参数,可用于药物的鉴别.如中国药典收载的药物头孢羟氨苄的鉴别项下规定:在含量测定项下记录的色谱图中,供试品主峰的保留时间应与对照品主峰的保留时间一致.头抱拉定,头孢噻酚钠等头孢类药物以及地西泮注射液,曲安奈德注射液等多种药物均采用HPLC法进行鉴别.

实验十二反相高效液相色谱法测定尼泊金酯

11 实验六反相高效液相色谱内标定量法测定尼泊金酯预习提示 1. 液相色谱仪的基本结构及操作技术 2. 什么是反相液相色谱，反相高效液相色谱的分离特点是什么。 3. 相对校正因子的意义及测定方法 4. 色谱分析内标定量法的原理及操作要点。一、目的要求 1. 熟悉高效液相色谱仪器基本结构及操作技术； 2. 掌握HPLC 保留值定性方法和内标定量方法。（了解定制报告编辑方法）。二、基本原理 1. 高效液相色谱是以液体为流动相的色谱。其分离原理是利用不同物质在由固定相和流动相构成的体系中具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，这些物质随流动相一起运动，并在两相间进行反复多次的分配，从而使各物质达到分离。正相色谱体系是固定相的极性大于流动相的极性，反之亦然。尼泊金酯（对羟基苯甲酸酯）混合物中含有尼泊金甲、乙、丙、丁酯，均属于强极性化合物，可用反相HPLC 进行分析，选用非极性的C 18烷基键合固定相，甲醇水溶液作流动相。 2. 色谱保留值法定性的依据在一定色谱条件下，每一种物质都有一个确定的保留值和它相对应。 3. 色谱定量依据 A m i i ∝ A f m i i i ' = 绝对校正因子 A m f i i i = ' 不易测定（相对）校正因子 A A m m A m A m f f f i s s i s s i i s i i ?== = '' 4. 对于试样中某一种或几种组分定量测定时可用内标定量法。内标法要领：定量试样m 试样中加入定量内标物m s ，LC 分析后进行相对定量计算。内标法定量计算公式： )/(%ml ug A A f f V m c is i is i s is i ? ? = 内标物要求：试样中不存在的纯物质；加入量、理化性质、峰位置均与被测组分接近。三、仪器、试剂

高效液相色谱的应用与发展前景

[Abstract] The common problems and relevant treatment measures of high performance liquid chromatography(HPLC)were introduced，which 高效液相色谱的应用呵发展前景液相色谱分析是指流动相为液体的色谱技术,是色谱法中最古老的一种,但通过改进填料的粒度及柱压,在经典的液相柱色谱的基础上引入了气相色谱的塔板理论,在技术上采用了高压输液泵,高效固定相和高灵敏度的检测器,实现了分析速度快.分离效率高和操作自动化,这种色谱技术被称为高效液相色谱法(HighperformanceliquidchromatographyHPLC) HPLC的出现不过三十多年的时间，但这种分离分析技术的发展十分迅猛，目前应用也十分广泛。其仪器结构和流程也多种多样。典型的高效液相色谱仪结构。高效液相色谱仪一般都具备贮液器、高压泵、梯度洗提装置（用双泵）、进样器、色谱柱、检测器、恒温器、记录仪等主要部件。高效液相色谱更适宜于分离、分析高沸点、热稳定性差、有生理活性及相对分子量比较大的物质，因而广泛应用于核酸、肽类、内酯、稠环芳烃、高聚物、药物、人体代谢产物、表面活性剂，抗氧化剂、杀虫剂、除莠剂的分析等物质的分析。对于高效液相色谱的发展前景应该是非常乐观的，现在的社会的发展节奏很快，各个领域对于分析检验的需求很多，而分析检验中，HPLC所占的比重是不言而喻的，已成化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。所以她的发展情景很乐观。理由有几点 1，随着科技的发展，技术的日臻完善，较之以前色谱分析的

反相高效液相色谱中缓冲体系的PH选择

反相高效液相色谱中缓冲体系的PH选择在反相高效液相色谱分析中，选择正确的缓冲液PH值，对可离解的化合物分析的重现性十分重要，不恰当的PH值可能导致不对称峰，宽峰，分裂峰或肩峰，而尖锐的，对称的峰是定量分析中获得低的检测限以，两次分析之间较低的相对标准偏差（RSD）和保留时间的高重现性的前提。我们将讨论在使用缓冲液时如何选择缓冲液的PH值，以及如何选择正确的缓冲体系。什么时候需要缓冲溶液？在反相液相色谱分析中，流动相的PH值一般在2.5－7之间，当被分析物在反相条件下可离解，或样品的PH值在2.5－7之外时，就需要缓冲液。在反相条件下可离解的化合物一般都有氨基和羧基，他们的Pka在1－11之间，选择正确的缓冲液PH值可保证可离解的官能团以一种形式存在，离子形式或中性化合物的形式。如果样品的PH值对柱子有伤害，则缓冲溶液可使其变温和从而减小其危害。如何选择缓冲液PH值在选择缓冲液PH值之前，应先了解被分析物的Pka，高于或低于Pka两个PH值单位的，有助于获得好的、尖锐的峰，从HH公式：PH＝Pka＋log（[A-]/[A]）得知，溶液PH值高于或低于Pka两个单位，化合物中99％以一种形式存在，而一种形式存在的化合物才能获得好的尖锐的峰。当化合物只有氨基时，缓冲体系的选择十分简单，大多数氨基化合物在PH值小于9时都被质子化，所以所有PH值在7或更低的溶液均适合应用，你也许会问水的PH值大约是7，为什么还用缓冲盐，因为缓冲盐有助于增加方法的可靠性，以及色谱峰的尖锐性，PH值的降低有助于氨基化合物保留的减弱，减小化合物与硅胶表面硅羟基的作用，而使峰更尖锐，从表1 可值，任何缓冲液均可应用于氨基化合物的分析，但我们认为PH值等于3的磷酸钾盐最适合用于氨基化合物的分析。在上面两个例子中，PH＝3的磷酸钾盐都能获得良好的应用，在一般情况下，它是含羧基和氨基化合物分析中最好的缓冲液，并且我们认为在氨基化合物分析中钾盐比钠盐更好。为离子对试剂选择缓冲液为应用离子对试剂的方法选择缓冲液的过程是相似的，离子对试剂例如四丁基铵的盐，十四烷基磺酸钠等，在流动相中可与化合物中可离解的官能团配对，在缓冲液中以离子形式存在的化合物就需要应用离子对试剂。应用缓冲液PH值来调节方法选择性如前面提到的，氨基化合物的保留随PH的减小而降低，这个特性可以用来调节方法的选择性，如果两个化合物共流出，一个含有氨基，适当改变PH值就可以用来分离这一物质对。由于可离解化合物的选择性依靠PH值，所以变化PH值也可以用来鉴别未知化合物的官能团，如果PH值变小，出峰便快，则化合物中可能存在氨基，当PH变大,化合物出峰很快，或流出在死时间处，化合物可能是一种羧酸，因为羧基离子化后流出大大快于比质子化的中性化合物。总结正确选择缓冲溶液在反相液相色谱方法中对于优化尖峰，捡出限，以及获得稳定的保留时间十分重要，如果你知道化合物官能团信息和化合物的Pka值这一过程将十分简单。

高效液相色谱在环境分析中的应用

高效液相色谱法在环境分析中的应用摘要高效液相色谱（HPLC)是现代分析化学中最重要的分离方法之一。近几年由于化学工业的发展和天然化合物的开发,使得环境污染越来越严重。高效液相色谱由于其高灵敏度、高效、分析速度快等优点而广泛应用于环境中各物质的监测。本文介绍了高效液相色谱的组成、基本原理，列举了目前利用高效液相色谱法测定环境样品中多环芳烃、酚类化合物、多氯联苯、邻苯二甲酸脂、有机农药等有机污染物的测定条件及分离结果。展示了这项技术在该领域的应用并展望了液相色谱分析技术的发展前景。关键词:高效液相色谱；有机污染物；环境分析；发展前景 Abstract High performance liquid chromatography ( HPLC ) is one of the most important separation methodsis in the modern analytical chemistry. In recent years because of the development of chemical industry and natural compounds , the environment pollution is more and more serious. High performance liquid chromatography with its high sensitivity, high efficiency, and fast analysis speed has widely applied in the monitoring environment substance. The composition of high performance liquid chromatography and basic principle are introduced in the paper.And at the moment, high performance liquid chromatography method is used in the organic pollutants determination conditions and separation results of environmental samples,such as phenolic compounds, PCBs, phthalic acid ester, organic pesticides and so on.It shows the application of this technique in the field and the development prospects of liquid chromatography analysis technology . Keywords :HPLC ; Organic Pollutants ;Environmental analysis; Development prospect 1.前言目前，由于化学工业的发展和天然化合物的开发,使得环境污染越来越严重。据报道,被确认为环境污染物的已超过350 种[1],人们能在水中、空气中、污泥里、鱼、禽体内发现这些污染物。通过食物链,它们将进一步污染肉类、蛋类、粮食、蔬菜等。环境

反相高效液相色谱的基本原理及其应用

反相高效液相色谱的基本原理及其应用生物技术一班王梦宇41108218 反相高效液相色谱是化学键合相色谱法的一种。化学键合相色谱法是由液液色谱法发展起来的,是为了解决在分离过程中,机械吸附在载体上的固体液的流失问题而发展出来的一种新方法。键合相色谱法通过将不同的有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶载体表面的游离经基上,而生成化学键合固定相,化学键合固定相对各种极性溶剂都有良好的化学稳定性和热稳定性。由它制备的色谱主柱效高、使用寿命长、重现性好,几乎对各种类型的有机化合物都呈现良好的选择性,并可用于梯度洗脱操作,消除了分配色谱法的缺点。根据键合固定相和流动相相对极性的强弱,可将键合色谱法分为正相键合色谱法和反相键合色谱法.反相键合色谱法即反相高效液相色谱.在正相键合色谱法中,键合固定相的极性大于流动相的极性,适用于分离油溶性或水溶性的极性和强极性化合物.在反相键合相色谱法中,键合固定相的极性小于流动相的极性适用于分离非极性、极性或离子型化合物,其应用范围也比正相键合相色谱法更为广泛。关于反相色谱的分离机理,吸附色谱的作用机制认为溶质在固定相上的保留主要是疏水作用,在高效液相色谱中又被称为疏溶剂作用。根据疏溶剂理论,当溶质分子进入极性流动相后,即占据流动相中相应的空间,而排挤一部分溶剂分子。当溶质分子被流动相推动与固定相接触时,溶质分子的非极性部分或非极性因子会将非极性固定相上附着的溶剂膜排挤开,而直接与非极性固定相上的烷基官能团相结合(吸附)形成缔合络合物,构成单分子吸附层。这种疏溶剂的吸附作用是可逆的,当流动相极性减少时,这种疏溶剂斥力下降,会发生解缔,并将溶质分子解放而被洗脱下来。反相色谱中疏水性越强的化合物越容易从流动相中挤出去,在色谱柱中滞留时间也长,所以反相色谱法中不同的化合物根据它们的疏水特性得到分离。反相色谱法适于分离带有不同疏水基团的化合物,亦即非极性基团的化合物。此外,反相色谱法可用于分离带有不同极性基团的化合物。可以通过改变流动相的溶剂及其组成和pH,以影响溶质分子与流动相的相互作用,改变它们的滞留行为。另外,反相色谱中水的流动相中占的比例伸缩性很大,可以从0一100%,从而使反相色谱可用于水溶性、脂溶性化合物的分离。反相色谱法中的固定相是被共价结合到