水稻黄绿叶基因的克隆及应用

文章编号　：１００４－０３７４（２００７）０６－０６１４－０２

进一步提高水稻产量，最大限度满足国家对食物安全的需求是水稻遗传育种的重大任务。水稻干物质产量的９０％－9５％来自光合作用。目前高产水稻光能利用率也仅１．５％－2．０％。理论上，植物光能利用率可达１３．０％－1４．０％，水稻理想的光能利用率应达３．０％－5．０％［１］。因此，培育高光效的超高产品种是提高产量的主要途径之一。长期以来，水稻光合作用的相关研究大多停留在生理水平上，同时，传统的杂交育种手段在改良水稻光能利用方面至今尚未取得令人满意的结果，而叶色突变体是开展光合作用研究的理想材料。水稻黄绿叶突变体ｙｇｌ１是水稻栽培品种镇恢２４９的自然突变体，该突变体前期叶片为黄色，中期慢慢转绿，后期叶色接近野生型。与野生型相比，ｙｇｌ１突变体有较高光合效率和较强的耐受光抑制能力，因而仍能获得较高的产量（亩产９００．１２斤）。

高等植物叶绿素的生物合成与叶绿体的发育对其能否进行正常的光合作用起关键作用［２］。叶绿体的许多蛋白复合体的蛋白和叶绿素生物合成所需酶类都是由核基因及质体基因编码。同时，叶绿素的合成与叶绿体的发育涉及核基因和叶绿体基因协同调控的复杂过程，其中一些基因的突变将造成叶绿素缺乏或叶绿体发育缺陷，导致光合作用受阻［３－５］。从黄绿叶突变体ｙｇｌ１克隆与叶绿素合成与降解、叶绿体分化与发育、光合作用代谢途径相关的新基因，对开展光合系统结构、光合机构的应答及其调控机制研究有重要意义，也为水稻高光效生理研究和水稻黄绿叶突变体ｙｇｌ１在生产上的应用提供了理论依据。

在国家“８６３”、“９７３”计划以及国家自然科学基金等项目的支持下，南京农业大学水稻研究所、中国农业科学院作物科学研究所等单位的科研人员利用黄绿叶突变体ｙｇｌ１为材料，通过数年研究，克隆出水稻黄绿叶突变基因ｙｇｌ１，且从生理生化、细胞形态学等方面对ｙｇｌ１突变体进行了比较系统的研究［６］。研究表明，ＹＧＬ１基因编码叶绿素合成酶，催化叶绿素合成过程中最后一步叶绿素ａ的形成。核苷酸序列分析发现突变体与野生型在叶绿素合成酶基因的编码区上有单个碱基差异，由胸腺嘧啶（Ｔ）突变为胞嘧啶（Ｃ），造成所编码的脯氨酸（Ｐｒｏｌｉｎｅ）到丝氨酸（Ｓｅｒｌｉｎｅ）的改变，其具体研究过程如下：

为了研究ｙｇｌ１突变体的遗传特性，用ｙｇｌ１突变体分别与ＰＡ６４、Ｗ００２、ＵＳＳＲ５和０２４２８等几个栽培品种构建了四个正反交杂交组合，结果所有的Ｆ１显示野生型绿苗表型，后代Ｆ２出现黄、绿苗分离，分离比接近３∶１，经χ2测验（χ2＜χ2０．０５＝３．８４；Ｐ＞０．０５），符合３∶１分离，表明ｙｇｌ１的黄绿叶表型由一对隐性核基因控制。

利用已公布图谱上ＳＳＲ分子标记和ｙｇｌ１突变体与培矮６４杂交组合衍生的Ｆ２代临时性分离群体的２５２个突变体单株对突变基因进行初步定位［７］，把突变基因定位于第５染色体上ＳＳＲ标记ＲＭ５１６和ＲＭ１６４之间，遗传距离分别为４．８　ｃＭ和１３．１　ｃＭ；随后通过扩大定位群体，并根据水稻基因组数据开发新型分子标记［８］，构建了ｙｇｌ１基因区域高密度遗传图谱和细菌人工染色体重叠群，最终将突变基因精细定位于细菌人工染色体ＡＣ１３６２２１上大约１１ｋｂ区间内，与基于ＰＣＲ的剪切扩增多态性（ｃｌｅａｖｅｄａｍｐｌｉｆｉｅｄ pｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ＣＡＰＳ）标记Ｐ２５、Ｐ２６共分离。利用基因分析与预测软件对定位的１１　ｋｂ区域进行预测，发现仅有两个开放阅读框（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅｓ，　ＯＲＦｓ）　：一个为叶绿素合成酶基因（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｇｅｎｅ）［９－１３］　，我们把它称为

水稻黄绿叶基因的克隆及应用

吴自明１，张　欣２，万建民２＊

（１南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室，江苏省植物基因工程中心，南京　２１００９５；

２　中国农业科学院作物科学研究所，北京　１０００８１）

·研究快讯·

615第６期吴自明，等：水稻黄绿叶基因的克隆及应用

ＹＧＬ１基因；另一个为ｅｍ基因（ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃａｂｓｃｉｓｉａｃｉｄ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｇｅｎｅ）。通过ＲＴ－ＰＣＲ分别扩增野生型和突变体两个开放阅读框编码区ｃＤＮＡ，测序后分析发现野生型和突变体的ｅｍ基因ｃＤＮＡ没有任何差异，仅在叶绿素合成酶基因ＹＧＬ１的编码区ｃＤＮＡ上有单碱基差异，由胸腺嘧啶突变为胞嘧啶，造成脯氨酸到丝氨酸的改变。因此，我们把ＹＧＬ１基因确定为ｙｇｌ１的候选基因。

进一步构建了含有ＹＧＬ１编码区ｃＤＮＡ双元表达载体，通过农杆菌介导的方法将此基因转化到具有ｙｇｌ１等位基因黄绿叶表型的粳稻品系黄叶粳，恢复绿色表型的植株经ＰＣＲ检测、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ分析、Ｔ１代分离实验及恢复表型植株叶绿素含量分析，证明ＹＧＬ１就是ｙｇｌ１突变体的突变基因。ＹＧＬ１以单拷贝的形式存在于水稻基因组中，编码叶绿素合成酶，催化叶绿素酸酯植醇化，生成叶绿素ａ，这一合成步骤对叶绿素ａ辅基蛋白的翻译和积累，类囊体膜组分的稳定装配起重要作用［１４］。氨基酸序列同源性和进化树分析表明，不同物种叶绿素合成酶基因有很强的保守性，水稻叶绿素合成酶ＹＧＬ１与同为禾本科植物燕麦的叶绿素合成酶比其他生物有更近的亲缘关系。体外原核表达重组蛋白酯化活性分析显示，突变基因重组蛋白ｙｇｌ１较野生型ＹＧＬ１重组蛋白酯化活性下降，表明脯氨酸到丝氨酸的改变，导致叶绿素合成酶活性下降；ｙｇｌ１突变体的叶绿素积累速率减慢和叶绿素合成中间产物的积累也充分表明叶绿素合成酶催化活性下降；ＹＧＬ１具有组成型表达特性，单碱基突变并没有影响到突变体体内的表达水平，然而，与叶绿素合成和叶绿体发育相关的基因表达受到了不同程度的影响，尤其是编码叶绿素ａ／ｂ结合蛋白ｃａｂ１Ｒ基因在苗期叶片中的表达受到强烈抑制，这些结果为叶绿素或叶绿素中间代谢产物水平反馈调控编码叶绿体相关核基因表达提供了直接的证据。

叶绿素在光合作用的光能吸收、传递和转换中起着关键作用。早期研究认为，在一定范围内，叶绿素含量与光合速率成正相关关系。水稻在经济器官形成和充实期，剑叶叶绿素含量保持在较高水平，能使叶片保持较高的光合速率。水稻黄绿叶突变体ｙｇｌ１，其叶绿素ｂ含量适量减少，　降低捕光色素的比例，但是提高光合作用的活性，　同时降低在高光强下的光抑制现象。该突变体抽穗前叶绿素含量与野生型没有显著差异，这是突变体仍能获得较高产量的主要原因。

水稻黄绿叶突变体ｙｇｌ１叶绿素含量适当减少，光合结构对强光的耐受性升高，最大光合速率显著上升，所以水稻黄绿叶突变体ｙｇｌ１不仅可用于叶绿素生物合成、叶绿体分化与发育和水稻高光效生理的研究等基础研究，其黄绿叶特性还可作为标记性状在杂种优势利用中应用，如在良种繁育和杂交育种实践中，可以通过回交转育或转基因的方法，将ｙｇｌ１黄绿叶基因导入光（温）敏两用核不育系当中，利用叶色变异作为标记性状，不但可以测定水稻种子纯度，大大降低田间检测种子纯度的成本和时间，还可在苗期去杂，克服光（温）敏核不育系在制种时常见的由于温度变化而造成育性恢复，导致杂种Ｆ１纯度不同程度的下降所带来的杂交稻产量下降的损失，对简化杂交稻纯度鉴定手续、节约纯度鉴定时间和费用及提供杂交稻生产的田间纯度具有重要意义。

［参　考　文　献］

［１］Ｌｏｏｍｉｓ　Ｒ　Ｓ，　Ｗｉｌｌｉａｍｓ　Ｗ　Ａ．　Ｍａｘｉｍｕｍ　ｃｒｏｐ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ：　ａｎｅｓｔｉｍａｔｅ．　Ｃｒｏｐ　Ｓｃｉ，　１９６３，　３：　６７－７２

［２］Ｅｃｋｈａｒｄｔ　Ｕ，　Ｇｒｉｍｍ　Ｂ，　Ｈｏｒｔｅｎｓｔｅｉｎｅｒ　Ｓ．　Ｒｅｃｅｎｔ　ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｂｒｅａｋｄｏｗｎ　ｉｎ　ｈｉｇｈｅｒ　ｐｌａｎｔｓ．

Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，　２００４，　５６：　１-1４

［３］Ｆａｌｂｅｌ　Ｔ　Ｇ，　Ｓｔａｅｈｅｌｉｎ　Ｌ　Ａ．　Ｐａｒｔｉａｌ　ｂｌｏｃｋ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅａｒｌｙ　ｓｔｅｐｓ　ｏｆｔｈｅ　ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｐａｔｈｗａｙ：　Ａ　ｃｏｍｍｏｎ　ｆｅａｔｕｒｅ　ｏｆ

ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ　ｂ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ　ｍｕｔａｎｔｓ．　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，　１９９６，　９７：

３１１－３２０

［４］Ｊｕｎｇ　Ｋ　Ｈ，　Ｈｕｒ　Ｊ，　Ｒｙｕ　Ｃ　Ｈ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｒｉｃｅｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ　ｍｕｔａｎｔ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｔ－ＤＮＡ　ｇｅｎｅ－ｔｒａｐ

ｓｙｓｔｅｍ．　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，　２００３，　４４：　４６３－４７２

［５］Ｔａｎｙａ　Ｃ　Ｆ，　Ｓｔａｅｈｅｌｉｎ　Ｌ　Ａ．　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｆａｍｉｌｙ　ｏｆｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ　ｗｈｅａｔ　（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）　ａｎｄ　ｂａｒｌｅｙ　（Ｈｏｒｄｅｕｍ

ｖｕｌｇａｒｅ）　ｍｕｔａｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｄｅｆｅｃｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍａｇｎｅｓｉｕｍ－ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ

ｓｔｅｐ　ｏｆ　ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，　１９９４，　１０４：

６３９－６４８

［６］Ｗｕ　Ｚ　Ｍ，　Ｚｈａｎｇ　Ｘ，　Ｈｅ　Ｂ，　ｅｔ　ａｌ．　Ａ　ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ　ｒｉｃｅｍｕｔａｎｔ　ｗｉｔｈ　ｉｍｐａｉｒｅｄ　ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｉｄｅ　ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ

ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，　２００７，　１４５：　２９－

４０

［７］ＭｃＣｏｕｃｈ　Ｓ　Ｒ，　Ｔｅｙｔｅｌｍａｎ　Ｌ，　Ｘｕ　Ｙ　Ｂ．　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄｍａｐｐｉｎｇ　ｏｆ　２２４０　ｎｅｗ　ＳＳＲ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｆｏｒ　ｒｉｃｅ　（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ

Ｌ．）．　ＤＮＡ　Ｒｅｓ，　２００２，　９：　１９９－２０７

［８］Ｔｈｉｅｌ　Ｔ，　Ｋｏｔａ　Ｒ，　Ｇｒｏｓｓｅ　Ｉ，　ｅｔ　ａｌ．　ＳＮＰ２ＣＡＰＳ：　ａ　ＳＮＰ　ａｎｄＩＮＤＥＬ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｔｏｏｌ　ｆｏｒ　ＣＡＰＳ　ｍａｒｋｅｒ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．　Ｎｕｃｌｅｉｃ

Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，　２００４，　３２：　ｅ５

［９］Ｌｉｎｄｓｔｅｎ　Ａ，　Ｗｅｌｃｈ　Ｃ　Ｊ，　Ｓｃｈｏｃｈ　Ｓ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ　ｓｙｎ－ｔｈｅｔａｓｅ　ｉｓ　ｌａｔｅｎｔ　ｉｎ　ｗｅｌｌ－ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ　ｐｒｏｌａｍｅｌｌａｒ　ｂｏｄｉｅｓ　ｏｆ　ｅｔｉ－

ｏｌａｔｅｄ　ｗｈｅａｔ．　Ｐｈｙｓｉｏｌｇｉａ　Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，　１９９０，　８０：　２７７

［１０］Ｌｏｐｅｚ　Ｊ　Ｃ，　Ｒｙａｎ　Ｓ，　Ｂｌａｎｋｅｎｓｈｉｐ　Ｒ　Ｅ．　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｃｈＧｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ　Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ　ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ：　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ

ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｐｏｌｙｐｒｅｎｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ．　Ｊ

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，　１９９６，　１７８：　３３６３-3３７３

［１１］Ｏｓｔｅｒ　Ｕ，　Ｂａｕｅｒ　Ｃ　Ｅ，　Ｒüdｉｇｅｒ　Ｗ．　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｈｌｏｒｏ－ｐｈｙｌｌ　ａ　ａｎｄ　ｂａｃｔｅｒｉｏｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ　ａ　ｓｙｎｔｈａｓｅｓ　ｂｙ　ｈｅｔｅｒｏｌｏ－

ｇｏｕｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ．　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，　１９９７，　２７２：

９６７１－９６７６

［１２］Ｏｓｔｅｒ　Ｕ，　Ｒüdｉｇｅｒ　Ｗ．　Ｔｈｅ　Ｇ４　ｇｅｎｅ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａｅｎｃｏｄｅｓ　ａ　ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｏｆ　ｅｔｉｏｌａｔｅｄ　ｐｌａｎｔｓ．　Ｂｏｔ　Ａｃｔａ，

１９９７，　１１０：　４２０－４２３

［１３］Ｓｃｈｍｉｄ　Ｈ　Ｃ，　Ｏｓｔｅｒ　Ｕ，　Ｋ?gｅｌ　Ｊ．　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎｏｆ　ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ａｖｅｎａ　ｓａｔｉｖａ．　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，

２００１，　３８２：　９０３　-９１１

［１４］Ｓｃｈｍｉｄ　ＨＣ，　Ｒａｓｓａｄｉｎａ　Ｖ，　Ｏｓｔｅｒ　Ｕ．　Ｐｒｅ－ｌｏａｄｉｎｇ　ｏｆ　ｃｈｌｏｒｏ－ｐｈｙｌｌ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｗｉｔｈ　ｔｅｔｒａｐｒｅｎｙｌ　ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｉｓ　ａｎ　ｏｂｌｉｇａ－

ｔｏｒｙ　ｓｔｅｐ　ｉｎ　ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，　２００２，

３８３：　１７６９　-

１７７６

克隆构建目的基因的简便方法

克隆构建一、 PCR 1、PCR 20ul体系，4个Mix，3个回收，1个对照 H2O 10.8ul 94℃3min KOD Buffer 2ul 94℃30s DNTPs 2ul 5X℃30s MgSO4 2ul 68℃Xs Primer F 2ul 68℃10min Primer R 2ul cycle 34 KOD 0.2ul Plasmid 1ul 试剂确保融化完全，枪头触到表面打净，最后用白枪头反复打几次混合溶液，离心3-4s，分装20ul至PCR管。 2、加尾 0.1ul Taq 酶，加入到20ul，微弹，离心，PCR仪上放置15min。 3、回收配中孔胶，电泳并回收试剂盒回收：熔胶后室温冷却再上柱，PW缓冲液离心过后于超净台上吹干7-9min，电泳检测回收产物。二、连接 Solution 1 5ul 目的片段 4.5ul 16℃过夜 T-vector 0.5ul 三、转化 1、感受态细胞制备取5ml无抗LB培养液，加入到灭菌试管中，取60-80ul新鲜菌液，37℃恒温摇床2h；取其中2.4ml倒入2.5ml EP管中，尽量保持4℃低温下12000g离心30s，沿壁缓缓加入CaCl2溶液，冰上滑动EP管管底使菌体悬浮； 2、转化涂板加入连接产物时边加边搅，热激时温度略微低于42℃，时间严格控制1min30s 之后冰上静置3min左右，加入300ul LB 无抗培养基，于37℃恒温箱复苏50min，涂板并37℃恒温箱过夜培养。四、鉴定 1、质粒提取挑去单克隆菌落，37℃过夜培养，次日提取质粒。 2、酶切鉴定根据设计引物选择双切酶，20ul体系37℃酶切2h，电泳检测并送去测序。 3、PCR鉴定将切出片段所属的菌液进行菌液PCR鉴定。

浅谈生物克隆技术及其未来应用问题与前景

浅谈生物克隆技术及其未来应用问题与前景肖婷2012333500202 浙江理工大学经管学院工商管理专业指导老师：解纯刚浙江理工大学生科学院【摘要】：随着生命科学时代的到来，基因研究已经取得了巨大的进展，克隆技术特别是人的克隆技术作为基因研究的重要组成部分，愈来愈引起社会各界的广泛关注。克隆技术作为人类的创造性活动，有其产生和存在的合理性，在诸多领域蕴藏巨大的应用潜力与巨大应用价值和广阔的发展前景。但克隆技术目前仍存在一些问题,如克隆技术对社会伦理和人类健康的影响。人类克隆技术的进步为人类带来的利益是巨大的,因而它的发展是难以阻止的。应对人类克隆技术带来的巨大挑战。【关键词】：克隆技术；利弊；社会影响；应用前景一、克隆是什么？克隆是英文Clone一词的音译，意为无性繁殖系，即通过无性繁殖（如细胞丝分裂）可连续传代并形成的群体，常用于细胞水平的描述。克隆的定义是指独立细胞繁殖系，指后代完全由一个细胞复制，具有完全相同的物遗传质。一个细菌经过20分钟左右就可一分为二；一根葡萄枝切成十段就可能变成十株葡萄；仙人掌切成几块，每块落地就生根；一株草莓依靠它沿地“爬走”的匍匐茎，一年内就能长出数百株草莓苗。凡此种种，都是生物靠自身的一分为二或自身的一小部分的扩大来繁衍后代，这就是无性繁殖。时至今日，“克隆”的含义已不仅仅是“无性繁殖”，凡来自一个祖先，经过无性繁殖出的一群个体，也叫“克隆”。自然界的许多动物，在正常情况下都是依靠父方产生的雄性细胞（精子）与母方产生的雌性细胞（卵子）融合（受精）成受精卵（合子），再由受精卵经过一系列细胞分裂长成胚胎，最终形成新的个体。这种依靠父母双方提供性细胞、并经两性细胞融合产生后代的繁殖方法就叫做有性繁殖，但是，如果我们用外科手术将一个胚胎分割成两块，四块、八块……最后通过特殊的方法使一个胚胎长成两个、四个，八个……生物体，这些生物体就是克隆个体，而这些个体就叫做无性繁殖系。二、克隆技术是什么？克隆技术是利用生物技术由无性生殖产生与原个体有完全相同基因组织后代的过程。科学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫克隆，这门生物技术叫克隆技术，含义是无性繁殖。

水稻表皮毛性状研究与相关基因的克隆

Open Journal of Nature Science 自然科学, 2018, 6(1), 14-16 Published Online January 2018 in Hans. https://www.360docs.net/doc/e215918140.html,/journal/ojns https://https://www.360docs.net/doc/e215918140.html,/10.12677/ojns.2018.61003 Studies on the Rice Trichome and Cloning of Related Gene Caifeng Lv, Shengjian Ma, Huilin Liang, Linqing Pan, Qianmei Li, Guanlong Cai, Xinqi Lin, Yongjian Huang, Huanying Chen, Jingchao Liu School of Life Science and Biotechnology, Lingnan Normal University, Zhanjiang Guangdong Received: Dec. 18th, 2017; accepted: Dec. 28th, 2017; published: Jan. 4th, 2018 Abstract Rice leaf epidermal hair mutants are important research materials for rice improvement. The de-velopment of rice epidermis hair is controlled by multiple genes. It is of great scientific value to study the development of rice epidermal hair and promote the cultivation of Kumito rice. This paper mainly introduces the types of rice epidermis and its related control genes. Keywords Rice, Epidermis Hairs, Glabrous 水稻表皮毛性状研究与相关基因的克隆吕彩凤，马生健*，梁慧琳，潘琳清，黎倩美，蔡冠龙，林欣琪，黄永健，陈浣滢，刘景超岭南师范学院生命科学与技术学院，广东湛江收稿日期：2017年12月18日；录用日期：2017年12月28日；发布日期：2018年1月4日摘要水稻(Oryza sativa L.)叶片表皮毛突变体是进行水稻改良的重要研究材料，水稻表皮毛的发育受多个基因的控制。研究水稻表皮毛发育和推广光身稻的种植具有较大的科学价值。本文主要对水稻表皮毛类型及其相关控制基因进行介绍。 *通讯作者。

基因克隆技术的研究进展_钟军

第6卷第4期(专辑) 2002年12月生命科学研究 Life Science Research Vol.6No.4(Suppl.) Dec.2002基因克隆技术的研究进展X 钟军,李,官春云 (湖南农业大学油料作物研究所,中国湖南长沙410128) 摘要:为能快速而准确地克隆目的基因,综述了一些基因克隆常用技术,包括差异表达基因分离技术、转座子标签技术、图位克隆技术、同源序列技术、表达序列标签技术的原理、应用及应用潜力,并对其作了简要的评价. 这些技术有利有弊,应根据不同的实验目的和水平来选择相应的技术. 关键词:基因;克隆;差异表达基因分离技术;转座子标签技术;图位克隆技术;同源序列技术;表达序列标签技术中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1007-7847(2002)S1-0148-05 Advances in Gene Cloning Technique ZHONG Jun,LI Xun,GUAN Chun-yun (T he Oil Crop Institute of H unan Agriculture University,Chan gsha410128,H unan,China) Abstract:To clone candidate gene quickly and correctly,advances about gene cloning included map-based cloning, transposon tagging,homology-based candidate gene method,expressed sequence tagging methods and some differen-tially expressed gene clone method are introduced and appraised.Because of the advantages and disadvanta ges of those techniques,various technique should be selected according special purpose and level. Key words:gene;clone;differentially e xpressed gene clone method;transposon tagging;map-based cloning;ho-mology-based candidate gene method;e xpressed sequence ta gging method (Li f e Science Research,2002,6(Suppl):148~152) 克隆基因的途径有两种,正向遗传学和反向遗传学途径.前者是依据目标基因所表现的功能为基础,通过鉴定其产物或某种表型突变而进行的;后者则着眼于基因本身,通过特定的序列或在基因组中的位置进行.近几十年来,许多重点实验室致力于植物基因的克隆,到1992年取得了突破性进展.基因的克隆一般采用下列技术:差异表达基因分离技术、转座子标签技术、表达序列标签技术、图位克隆技术和同源序列技术等. 1差异表达基因分离技术 1.1扣除杂交技术扣除杂交技术的原理是用有特异性表达基因的目标样提取mRNA经逆转录形成cDNA探针,与无特异性表达基因的参照样的过量mRNA或cDNA杂交,经两轮充分杂交后,移去杂交分子和过量的无特异性表达基因的参照样mRNA或cD-NA,将不形成杂交体的有特异性表达基因的目标样cDNA纯化富集、扩增,建立相应cDNA文库即为差异表达基因cDNA文库.此技术最早是由Lamar和Palmer于1984年提出[1],他们先用超声波打断雌性小鼠的DNA,用Mbo1完全消化雄性小鼠DNA;将两者一起变性、复性,再将产物克隆入表达载体的Bam H I位点中,只有那些两端有GATC序列的基因才能被克隆入载体,这样就达到了扣除两者共有序列的目的,并得到雄性小鼠 X收稿日期:2002-06-11;修回日期:2002-10-14 作者简介:钟军(1973-),女,湖南沅江人,博士研究生,从事分子遗传学研究.Tel:+86-0731-*******,E-mail:zhhjp@s https://www.360docs.net/doc/e215918140.html,

植物基因克隆实验指导

植物基因克隆实验规则一、植物基因克隆实验课的目标根据基因克隆实验操作的整体性和连贯性特点, 将该实验设计为综合性实验课程，实验内容设计上完全抛弃了原来分散的、孤立的单纯学习某一实验技术的缺陷, 将单个实验综合为系统的、连贯的系列型大实验，注重科研成果在教学中的应用，我们从以往的科研项目中选取了部分研究内容用于学生的综合性实验教学，这是基于教学实验与实际科学研究实验之间的新的实验教学模式。整套实验围绕洋甘菊倍半萜生物合成途径中关键酶基因HMGR的克隆这一研究课题进行操作, 设计的实验内容具有极强的连续性和综合性，让学生在独立实践操作中学习基因克隆的基本研究方法和体会科学研究的严密逻辑和培养科研理念。我们将实验内容设置为8个部分, 实验内容前后衔接紧密, 环环相扣, 不可分割, 前一个实验的结果是下一个实验的材料。该课程使学生获得了整个类似科研实践过程的训练和体验, 学习了从事科研工作的基本功, 对完成自己的毕业论文及将来从事生命科学研究奠定了科研基础。二、实验的进行程序和要求 1、预习学生在课前应认真预习实验指导以及教材有关章节，必须对该次实验的目的要求、实验内容、基本原理和操作方法有一定的了解。 2、讲解教师对该实验内容的安排及注意事项进行讲解，让学生有充分的时间按实验指导的要求进行独立操作与观察。 3、独立操作与观察除个别实验分组进行外，一般由学生个人独立进行操作和观察。在实验中要按实验指导认真操作，仔细观察，作好记录。有关基本技能的训练，要按操作程序反复练习，以达到一定的熟练程度。

4、演示每次的实验都备有演示内容，其目的是帮助学生了解某些实验中的难点，扩大在实验课有限时间内获得更多感性知识的机会。 5、作业实验报告参照硕士毕业论文的格式写，必须强调科学性，实事求是地记录、分析、综合。在实验结束时呈交。 6、小结每次实验结束后，由师生共同小结本次实验的主要收获及今后应注意的问题。三、实验规则和注意事项 1、每次上课前，必须认真阅读实验指导，明确本次实验的目的要求、实验原理和注意事项，熟悉实验内容、方法和步骤。 2、上实验课时必须携带实验指导、记录本及文具等。进入实验室要按规定座位入座。 3、实验时要遵守纪律，听从教师指导，保持肃静。有问题时举手提问，严禁彼此谈笑喧或随意走动，也不得私自进行其他活动。 4、实验时要遵守实验操作规程，严格按照教师的安排和实验指导的要求进行。操作观察要认真仔细，边做、边看、边想，认真做好实验记录。 5、要爱护仪器和器材设备，注意节约实验材料、药品和水电。如有损坏器材应立即报告并主动登记、说明情况。 6、实验结束后，应清理实验台面，认真清理好仪器、药品及其他用品，放回原处，放好凳子，方可离开实验室。值日生要负责清扫地面，收拾实验用品，处理垃圾，关好水、电、门窗后再离开。

DNA分子克隆技术(也称基因克隆技术)

DNA分子克隆技术（也称基因克隆技术）：在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接，转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA分子克隆(或基因克隆)。其基本步骤包括：制备目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成DNA重组→导入宿主细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。载体（vecors）在细胞内自我复制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的DNA分子片段。主要目的是获得某一基因或NDA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，随着引入的DNA片段不同，有两种DNA库，一种是基因组文库（genomic library）,另一种是cDNA库。载体所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。细菌质粒是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为1-20kb，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。最常用的质粒是 pBR322。基因库的建造含有某种生物体全部基历的随机片段的重组DNA克隆群体，其含有感光趣的基因片段的重组子，可以通过标记探针与基因库中的重组子杂交等方法而筛选出来，所得到的克隆经过纯化和扩增，可用于进一步的研。其主步骤包括：（1）构建基因库迅速的载体；(2)DNA片段的制备；（3）DNA片段与载体DNA 的连接；（4）包装和接种。 cDNA库的建造是指克隆的DNA片段，是由逆转录酶自mRNA制备的cDNA。cDNA库包括某特定细胞的全部cDNA克隆的文库，不含内含子。特异基因的筛选常用的方法有：（1）克隆筛选即探针筛选法；（2）抗体检测法，检测其分泌蛋白质来筛选目的基因；（3）放射免疫筛选法，查出分泌特异抗原的基因；（4）免疫沉淀法，进行特异基因的筛选。核酸序列测定 DNA的碱基序列决定着基因的特性，DNA序列分析（测序，sequencing）是分子生物学重要的基本技术。无论从基因库中筛选的癌基因或经PCR法扩增的基因，最终均需进行核酸序列分析，可藉以了解基因的精细结构，获得其限制性内切酶图谱，分析基因的突变及对功能的影响，帮助人工俣成基因、设计引物，以及研究肿瘤的分子发病机制等。测序是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基础上建立起来的。目前最常用的方法有Maxam-Gilbert的化学降解少和Sanger的双脱氧法等，近年来已有DNA序列自动测定仪问世。化学降解法是在DNA的片段的5`端标记核素，然后用专一性化学试剂将DNA特异地降解，在电泳和自显影后，可得到从标记端延伸的片段供测读序列和进行比较。一般能读出200-250个核苷酸序列。双脱氧法是采用核苷酸链终止剂，如：2`，3`-双脱氧核苷三磷酸ddNTP(如ddTTP、ddTTP、ddGTP和ddCTP中的一种)掺入到DNA链中以终止链的延长，与掺入4种正常的dNTP的混合物分成四组进行反应，这样可得到一组结尾长衙不一、不同专一性核苷酸链终止剂结尾的DNA片段，经凝胶电泳分离和放射自显影，可读出合成的DNA核苷酸序列，根据碱基互补原则，可推算出模板DNA分子的序列。

克隆技术及其应用_陈大元

科技与社会克隆技术及其应用陈大元 (中国科学院动物研究所生殖生物学国家重点实验室　北京　100080) 摘要　“克隆”的含义是无性繁殖,即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系,这个细胞系中每个细胞的基因彼此是相同的。动物克隆,就是指通过无性繁殖由一个细胞产生一个和亲代遗传性状一致,形态非常相像的动物。随着动物克隆研究的发展、克隆技术将广泛应用于医学、畜牧业和濒危动物保护等领域。关键词　克隆,动物,胚胎细胞, 体细胞 “克隆”是“clone” 的音译,其含义是无性繁殖,即由同一个祖先细胞分裂繁殖而成的纯细胞系,该细胞系中每个细胞的基因彼此是相同的。动物克隆, 就是指通过无性繁殖由一个细胞产生一个和亲代遗传性状一致、形态非常相像的动物。科学家们很早就开始了动物克隆的研究。早在1938年,德国胚胎学家Sp emann即提出“奇异的实验”的设想。1952年,英国科学家Briggs和King 首次报道了蛙的核移植研究。1962年,英国剑桥大学的Gurdon获得了成年蛙。我国已故科学家童第周教授在20世纪60—70年代曾用囊胚细胞进行鱼类细胞核移植工作,获得属间和种间移核鱼,使我国鱼类核移植研究居世界领先水平。早期的动物克隆研究仅限于两栖类和鱼类,直到20世纪80年代,核移植克隆技术才开始应用于哺乳动物。根据供核细胞的不同,可将动物克隆研究分为三个阶段: 1　胚胎细胞克隆阶段 1981年,Illmensee和Hop pe报道了他们用小鼠的正常囊胚或孤雌活化囊胚的内细胞团细胞作为核供体,直接注入去掉雌雄原核的受精卵胞质中,重构胚体外发育到桑葚胚或囊胚后移植寄母子宫,获得克隆小鼠,这是第一次用胚胎细胞对哺乳类进行核移植获得成功。1983年,美国科学家利用核移植技术和细胞融合方法获得了克隆小鼠。1986年,英国的Willadsen用绵羊的8—16细胞阶段的胚胎细胞作为供体进行核移植,首次应用电融合的方法克隆出一只小羊。此后,科学家们又相继克隆出小鼠、绵羊、牛、兔、猪和猴等。我国科学家也在20世纪90年代成功开展了胚胎细胞克隆兔、山羊、小鼠、牛和猪等研究。 2　同种体细胞克隆阶段 1997年2月,英国罗斯林研究所Wilmut等人宣布,他们用6岁成年羊的高度分化的乳腺细胞进行了核移植,成功地获得了克隆羊“多莉”[10]。这是第一次用成年体细胞作为供核细胞,由此说明高度分化的成年动物的体细胞可在适当条件下发生逆转, 　2002年中　国　科　学　院　院　刊第3期　收稿日期:2002年4月25日 DOI:10.16418/j.issn.1000-3045.2002.03.005

水稻基因的图位克隆技术

水稻基因的图位克隆技术吴自明 (江西农业大学,作物生理生态与遗传育种教育部重点实验室,农业部双季稻生理生态与栽培重点实验室,江西省作物生理生态与遗传育种重点实验室,江西南昌330045) 摘要综述了水稻图位克隆技术的原理、技术环节及其在水稻基因克隆上的应用,分析了当前存在的主要问题,并对其应用前景作出了展望。关键词水稻;图位克隆;基因中图分类号 S 511 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2008)34-14905-02 Map based C lo ning T echnique of R ice Genes WU Zi m ing (Key Laboratory of C rop Ph ysiology,Ecol ogy and Genetic B reeding,Mi nistry of Ed ucation,Key Laboratory of Ph ysiology,Ecology and C ultivati on of Double C roppin g Rice,Mini stry of Agriculture,Key Lab oratory of Crop Physi ology,Ecology an d Genetic Breedin g of Jian gxi Province,Jiangxi Agricultural Uni versi ty,Nanchang,Jiangxi 330045)Abstract The p rinciple an d tech nical links of m ap based gene cloni ng techniq ue i n rice an d its applications in the gene cloni ng of rice were s um ma rized .And the mai n existing problems at present were analyzed .And its applicati on foregrou nd was p redicted.Key w ords Rice;Map based cloni ng;Gene 基金项目江西省教育厅项目(GJJ09477);江西农业大学博士启动基金;江西农业大学校自然科学基金。作者简介吴自明(1974-),男,江西鄱阳人,副教授,从事植物分子生物学研究。收稿日期 2008 10 06 近年来,水稻基因组研究进展非常迅速,高密度遗传图谱和物理图谱的构建,全基因组序列的公布,数以万计ES T 、全长c DN A 等序列及功能分析数据的释放以及新型水稻分子标记及其高效检测技术的发展等,为基因的图位克隆带来了新的思路和方法。同时,这些新的进展也能够使基因的精细定位和物理图谱构建等相关工作大大简化,使基因的图位克隆朝着更加简便、快速的方向发展。1 图位克隆技术原理图位克隆(Ma p based Cloning)又称定位克隆(Positional Cloning),1986年首先由剑桥大学的Alan Co ulson 提出[1]。用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行,无需预先知道基因的D N A 序列,也无需预先知道其表达产物的有关信息,而是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。实现基因图位克隆的关键是筛选与目标基因连锁的分子标记。近几年来,水稻各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的日趋完善,在很大程度上得益于以粳稻日本晴和籼稻9311为代表的基因组测序的完成[2-3]。目前已有几十种技术可用于分子标记筛选,其中最常用的是简单序列长度多态性(SSLPs)、单核苷酸多态性(SNPs)和插入缺失多态性(Inser tio n/Deletio n,InDel)[4-7]。Shen 等利用日本晴和9311基因组序列构建了水稻基因组水平的D NA 多态性数据库,其中包括1703176个单核苷酸多态性(Single Nucleo tide Polymor phis m,SNP)和479406个插入缺失多态性(InDel)[8]。Fe ltus 等通过对除去多重拷贝序列及低质量序列后的日本晴和9311基因组草图的比对分析,得到408898个D N A 多态性,包括SNP 和单碱基I nD el [9],这些差别的核苷酸通常位于非编码区[10]。目前,常把SNP 多态性转化成基于P CR 的剪切扩增多态性(Cle ave d Amplified P olymorphic Se que nc es,CAPS)或CAPS 衍生的dCAPS 标记[11-12]。CAPS 标记是PCR 反应和酶切相结合产生的一种分子标记。如果不同材料间在PCR 扩增区域有S NP 位点,且该位点是限制性内切酶作用位点,那么不同材料的PCR 扩增产物经特定的酶切后,再进行琼脂糖凝胶电泳就会表现多态性。当SNP 恰好位于限制性酶切位点比较少时,这种情况可以在CAPS 标记的基础上通过在扩增引物中引入错配碱基,则可以结合SNP 位点引入新的限制性内切酶作用位点,产生和CAPS 标记类似的多态性,这就是dCAPS 的方法。用CAPS 或dCAPS 的方法则可以将几乎所有的SNP 位点转化成以P CR 为基础的分子标记[12] 。 2 图位克隆技术环节 2.1 构建遗传作图群体对于基因图位克隆而言,构建特殊的遗传作图群体是筛选与目标基因紧密连锁分子标记的关键环节。常用的作图群体有F 2、近等基因系、重组自交系等群体,水稻常用F 2群体。创建F 2群体应注意优先选择基因组已测序的日本晴、9311和培矮64S 等品种为亲本之一。2.2 基因初定位一般说来,当标记为显性遗传时,欲获得最大遗传信息量的F 2群体,需借助于进一步子代测验,以分辨F 2中的杂合体。为此,Mic helmo re 等发明分离群体分组分析法(Bulke d Se gre ga nt Ana lysis,BS A)以筛选目标基因所在局部区域的分子标记[13]。其原理是将目标基因的F 2(或BC)代分离群体各个体仅以目标基因所控制的性状按双亲表型分为2群,每一群中各个体D N A 等量混合,形成2个D N A 混合池(如抗病和感病、不育和可育),并且用目的基因附近的所有分子标记对混合D NA 样品池进行分析,根据所有池中包含有交换的DN A 池的比例来确定与目的基因连锁最紧密的分子标记和目的基因附近所有分子标记的顺序。混合样品作图可以极大提高分子标记分析效率,减小D NA 提取工作量。 2.3 基因精细定位一旦把目标基因初步定位在2个标记之间后,就可以从国际水稻基因组测序计划(IRG SP)公布的序列中下载这2个标记区域的部分P AC/BAC 克隆序列。利用软件SSRI T 搜索克隆序列中的微卫星序列,然后选择合适的微卫星序列进行特异PCR 引物的设计。也可以直接借助于公共数据库的序列进行比较,如寻找R GP 基因组数据库(粳稻)与中国华大基因组数据库(籼稻)的单核苷酸多态性(SNP)序列差异,设计CAPS 或dCAPS 标记和插入/缺失多态安徽农业科学,J ou rn al of An hui Agri.Sci.2008,36(34):14905-14906 责任编辑张彩丽责任校对张士敏

克隆技术及其应用与发展

克隆技术及其应用与发展目前克隆技术、基因工程研究正突飞猛进向前发展，基因概念及其理论的建立，打开了人类了解生命并控制生命的窗口。基因研究已成为当前科学研究中最有决定性的领域之一，成为推动生物、食品和制药产业发展的引擎。众所周知，20世纪遗传学的发展举世瞩目，由于遗传学的发展，科学的社会功能以及社会对科学的制约更受关注，从试管婴儿到克隆技术再到人类基因图谱的绘制无不牵动着世人的心。21世纪是生物技术革命的世纪，克隆技术的应用将促进遗传学，细胞发育生物学，产科学等学科的研究进展，有利于整个世界的科学进步和生活质量的提高，对人类的生活将会产生深远的影响。克隆、克隆技术以及克隆的基本过程 “克隆”一词源于“Clone”的音译，指的是人工诱导动、植物的无性繁殖过程，这门生物技术就叫克隆技术。无性繁殖是指不经过雌雄两性生殖细胞的结合，只由一个生物体产生后代的生殖方式，如：由植物的根、茎、叶等经过压条或嫁接等方式产生新个体。绵羊、猴子和牛等动物没有人工操作是不能进行无性繁殖的。克隆的基本过程是先将含有遗传物质的供体细胞的核移植到去除了细胞核的卵细胞中，利用微电流刺激等使两者融合为一体，然后促使这一新细胞分裂繁殖发育成胚胎，当胚胎发育到一定程度后再被植入动物子宫中使动物怀孕便可产下与提供细胞者基因相同的动物。这一过程中如果对供体细胞进行基因改造，那么无性繁殖的动物后代基因就会发生相同的变化。我们可将其研究或操作的对象分为基因克隆、细胞克隆和个体克隆三大类。基因克隆是指在分子(DNA)水平上开展研究工作以获得大量的相同基因及其表达产物。细胞克隆则是在细胞水平上开展研究工作以获得大量相同的细胞。个体克隆则是经过一系列的操作产生一个或多个与亲代完全相同的个体，这种克隆所用的生物材料可能是一个细胞，也可能是一个组织。可以看出，基因克隆、细胞克隆和个体克隆是在三个不同的层次上开展的研究工作，以原有的基因或细胞或生物个体作为模板，复制出多个与原来模板完全相同的基因或细胞或生物个体来。这就有点像大家利用复印机复印资料，或用胶片冲洗照片一样，从原有的资料或底片复制出许多完全一样的资料或照片来。但实际上并非复制胚胎，只是从成年人体内的一个细胞抽取当中包含的基因资料，然后将植入一个没有核子的卵子细胞内，通过体外受精的方法使这个新细胞发育成一个胚胎。例如小羊多利就是利用体细胞进行细胞核移植而克隆成功的，多利羊的产生与三只母羊有关，其克隆过程如下：科学家选取了三只母羊，先将一只母羊的卵细胞中所有遗传物质吸出，然后将另一只6岁母羊的乳腺细胞与之融合，形成一个含有新遗传物质的卵细胞，并促使它分裂发育成胚胎，当这一胚胎生长到一定程度时再将它植入第三只母羊的子宫中，由它孕育并产下克隆羊多利，出生的“羊多”小绵羊与6岁母羊具有完全相同的外貌。克隆技术在相关领域的应用克隆的最终产物，如克隆牛、克隆鼠等都不是最重要的成果，基因克隆技术应是建立转基因动物模板的核心和关键性技术，利用转基因动物的体细胞大量复制出具有相同优良性状的个体。由于动物体细胞克隆可以复制出的数量巨大的优良个体，因此动物克隆技术可以首先应用于畜牧业育种上。通常在动物育种中所采用的方法主要是杂交育种，即把两个具有不同优良性状的雌雄个体进行交配，然后在后代中去选择人们所需要的个体。要获得一个优良品种，往往需要几年甚至几十年的时间，而且必须不断地进行育种。如果采用动物个体克隆技术，就可以大量复制出人类所需要的优良个体，还可以大大缩短育种时间和节省大量的人力、物力。克隆技术的完善为转基因动物的繁殖开辟了一条通道，应用克隆技术可以将转基因绵羊

植物基因的克隆｜植物基因克隆的基本步骤

植物基因的克隆 08医用二班姚桂鹏0807508245 简介克隆（clone）是指一个细胞或一个生物个体无性繁殖所产生的后代群体。通常所说的基因克隆是指基于大肠埃希菌的DNA片段（或基因）的扩增，主要过程包括目标DNA的获取、重组载体的构建、受体细胞的转化以及重组细胞的筛选和繁殖等。本文主要介绍植物基因的特点、基因克隆的载体、基因克隆的工具酶、基因克隆的策略以及植物目的基因的分离克隆方法等内容。关键词植物基因基因克隆载体工具酶克隆策略分离克隆方法 Plant gene cloning Introduction Cloning (clone) refers to a cell or an individual organisms asexual reproduction produced offspring. Usually said cloning genes means

based on escherichia coli segment of DNA (or genes), including the main course target DNA, restructuring of the carrier, transformation of receptor cells and reorganization of screening and reproductive cells. This paper mainly introduces the characteristics of plant gene and gene cloning and carrier, gene clone tool enzyme, gene cloning and plant gene strategy of separation cloning method, etc. Keywords Plant gene cloning tool enzyme gene cloning vector method of separation of cloning strategy 一、植物基因的结构和功能基因（gene）是核酸分子中包含了遗传信息的遗传单位。一般来说，植物基因都可分为转录区和非转录的调控区两部分。（一）植物基因的启动子启动子（promoter）是指在位于结构基因上游决定基因转录起始的区域，植物积阴德启动子包括三个较重要的区域，一时转录起始位点，而是转录起始位点上游25~40bp的区域，三是转录起始位点上游-75bp处或更远些的区域。（二）植物基因的增强子序列

目的基因PCR扩增产物的克隆

目的基因PCR扩增产物的克隆 [实验原理] 1.PCR产物回收在高离子盐存在的情况下，DNA片断选择性的吸附于离心柱内的硅基质膜上，再通过一系列快速的漂洗、离心的步骤去蛋白液和漂选液，将引物、核苷酸、蛋白酶等杂质去除，最后用低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净DNA从硅基质膜上洗脱。 2.T载体与PCR产物的连接源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA 分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。因为DNA片断有两个端点，所以切割时出现两种可能，一种是单酶切，另一种是双酶切，这两种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。对于单酶切来说，载体与供体的末端都相同，连接可以在任何末端之间进行，这样就导致了大量的自连接产物。为了减少自环的高本底，可对载体进行5’除磷酸处理，原理是连接酶只能连接DNA 片断的3’OH末端与5’端，所以除磷后载体不会自环。一旦有外源片断插入时，由外源片断提供5’端就能与载体进行连接。通过这种方法可大大减少由载体的自身成环造成的高本底。对于双

植物基因克隆

来自dxy 22003luocong 植物基因全长克隆几种方法的比较基因是遗传物质基本的功能单位，分离和克隆目的基因是研究基因结构、揭示基因功能及表达的基础，因此，克隆某个功能基因是生物工程及分子生物学研究的一个重点。经典克隆未知基因的方法比如通过筛选文库等有个共同的弊病, 即实验操作繁琐, 周期较长、工作量繁重,且不易得到全长序列。又由于在不同植物中目的基因mRNA丰度不同，所以获得目的基因的难易程度又不一样，特别是对于丰度比较低的目的基因即使使用不用的方法也不一定能获得成功。近年来随着PCR技术的快速发展和成熟.已经有多种方法可以获得基因的全长序列, 比如经典的RACE技术，染色体步移法和同源克隆法等，本文主要综述几种重要的克隆方法的原理和运用，并且比较分析这几种方法的优缺点，为你的实验节约时间和成本。 1 RACE技术 1985年由美国PE-Cetus公司的科学家Mulis等[1]发明的PCR技术使生命科学得到了飞跃性的发展。1988年Frohman等[2] 在PCR技术的基础上发明了一项新技术, 即cDNA末端快速扩增技术( rapid amplification of cDNA ends, RACE), 其实质是长距PCR( long distance, PCR)。通过PCR由已知的部分cDNA 序列, 获得5′端和3′端完整的cDNA, 该方法也被称为锚定PCR ( anchored PCR) [3] 和单边PCR( one-sidePCR) [4]。RACE技术又分为3?RACE和5?端RACE。3′RACE 的原理是利用mRNA 的3′端天然的poly(A) 尾巴作为一个引物结合位点进行PCR, 以Oligo( dT) 和一个接头组成的接头引物( adaptor primer, AP)反转录mRNA得到加接头的第一链cDNA。然后用一个正向的基因特异性引物( gene-specific primer, GSP) 和一个含有接头序列的引物分别与已知序列区和poly(A) 尾区退火, 经PCR扩增位于已知序列区域和poly( A) 尾区之间的未知序列，若为了防止非特异性条带的产生, 可采用巢式引物( nested primer) 进行第二轮扩增, 即巢式PCR( nested PCR) [5，6]。5?RACE 跟3?RACE原理基本一样，但是相对于3?RACE来说难度较大。 5'-RACE受到诸多因素的影响而常常不能获取全长，因此研究者都着手改进它。这些措施主要是通过逆转录酶、5'接头引物等的改变来实现的，因此出现了包括基于“模板跳转反转录”的SMART RACE技术( switching mechanism at 5′ end of RNA transcript) [7] , 基于5′脱帽和RNA酶连接技术的RLM-RACE技术(RNA ligase mediated RACE)[8], 利用RNA连接酶为cDNA第一链接上寡聚核苷酸接头的SLC RACE技术(single strand ligation to single-stranded cDNA)[9] , 以及以内部环化的cDNA第一链为模板进行扩增的自连接或环化RACE技术(self-ligation RACE or circular RACE)[10]，和通过末端脱氧核苷酸转移酶( TdT)加尾后引入锚定引物的锚定RACE技术( anchored RACE)[11]。笔者主要介绍两种比较新的RACE技术，基于…模板跳转?的SMART RACE 技术和末端脱氧核苷酸转移酶( TdT)加尾技术。 1.1基于‘模板跳转’的SMART RACE技术[7，12]

基因克隆技术攻略：让更多的新手迅速走出基因克隆的阴霾

基因克隆技术攻略：让更多的新手迅速走出基因克隆的阴霾一直以来都想把自己在基因克隆方面的心得写出来，让更多的刚刚进入生命科学领域的人受益，因为自己刚开始做克隆时也遇到过各种问题，经过较长时间的总结和实践，我的题组现在的基因克隆都是一次到位的，基本不需要重复做。其实我只是一个只有几十万科研经费的小青椒，不过我对科研非常热爱，我喜欢买实验用的各种酶啊，好用的耗材之类的东东超过我对自己的衣服鞋子的热爱，所以我看起来穿的及其普通，可是我的实验花费有点奢华，呵呵，可能像我这样的人不多吧，哈哈，反正无所谓开心就好。下面言归正传（1）是酶切位点的选择。我的实验室有Takara、Promega以及NEB三种公司的常用的酶，这极大的丰富了我们的选择，所以在设计PCR产物的酶切位点之前首先要看看哪两个酶之间是可以进行同时酶切的。因为这三家公司的双酶切表的组合完全不同，最佳的方案是我们能够按照需要去选择合适的酶。有人说这得花很多钱吧，其实不然，Takara几乎每年9月都有一次促销活动，在他们七折的时候我一下买了三千块钱的酶，这一年来有用之不尽的感觉。Promega的酶也非常好用，而且长期五折，我也是常用的酶买了一批放在实验室里。至于NEB的实在是有一点贵的，我一般不批量买了，在NEB买的一般都是不常用的酶，比如FseI、AscI等等。酶的选择是实验成功的关键吆。（2）PCR引物的设计这一点我不想多说，虽然有很多的攻略里面讲到了PCR引物设计的原则等等，大家设计的时候要参考各种原则，我认为不然，因为做过实验的战友都清楚，有的时候很多PCR引物的选择是没有选择的，比如我要扩增一个完整的基因的ORF框，那么它的起始密码子，终止密码子部分都要克隆出来的，不能多也不能少一个碱基，即使起始部位或者终止部位的AT含量很高，高到你难以忍受，那怎么办呢，基本我们没有选择，如果实在是没办法的条件下，只能在PCR引物的5端加入人为设计的碱基而把引物的扩增部分后移或前移来避开难以扩增的部位，我不知道说清楚没有，如果引物序列OK，可以忽略上句话。所以大多数情况下引物我们是没得选择的，那么我们只能从PCR扩增条件上下功夫。（3）PCR扩增对于PCR扩增其实不同的基因可能策略不同，我来说几点相同的。首先很多新手会忽略引物的浓度问题，我在最开始做PCR的时候因为当时的基因非常容易扩增，所以其实我的条件并不是最佳的，但当时把基因扩出来了我也没有在意，直到有一天我需要在基因的5端加入3个HA标签，这样的PCR引物长度差异很大，一支引物100多bp，一支引物只有30bp，于是当我还有以前的条件时我扩不出任何的基因。当时扩了几次都不成功，各种温度都试过了也不成。于是我静下心来，把PCR的实验条件进行了全方位优化，在PCR 反应体系中，把引物调整到各种浓度的，把模板调整到各种浓度的，有的加Mg2+，有的加BSA，还使用梯度PCR的条件，试了各种扩增温度的，结果让我很开心，最后我的基因被扩增出来了，而且好亮好亮的那种。记得当时自己高兴地跳了起来。也许这就是科研的魅力吧！在这次试验中我找到了最佳的PCR条件，这是三年前的事了，这个条件让我在三年中屡试不爽，几十个基因的扩增从未失手过。其实体系很简单，50ul体系中buffer 5ul、Mg2+ 1mM、dNTP 0.2mM、引物每支1ul（配成10umol/L浓度)、PCR酶一般是0.5ul、其余部分用水补平，混匀，离心一下，进行PCR扩增。其中引物从公司拿到干粉后我一般用水溶解至100umol/L浓度保存，吸取少量稀释十倍后用于PCR反应，这个浓度是最佳的。所以PCR 体系中引物并不是越多越好，同样的模板的量也很关键，一般我都在10ng-100ng之间，太少或太多都会抑制PCR反应。当然，不同的基因其退火温度差异较大，建议第一次做直接做梯度PCR，设置的温度范围宽些，总会有扩出来的。反正把反应体系加好，把温度控制好应该就万事大吉了，如果这样仍然扩不出来，那就直接调整DNA模版的量吧，其他的因素应该不是原因（当然得保证引物，以及酶的质量得前提下）。（4）PCR产物的酶切，这是最简单的一步，一般我都是酶切过夜的。因为我认为PCR产物切得尽可能的充分对克隆很重要，毕竟保护性碱基只有几个。