果胶酶应用基理及活性检测方法

2013-1-23 16:57:21

随着人们对健康环保纺织品需求的增加以及各国政府对环境保护强制力度的加大,在纺织印染行业中一种新型的纺织助剂———生物酶制剂的应用逐渐发展起来。目前,一种基于果胶酶的新型纺织生物助剂正在应用推广中,它主要用于棉、麻的前处理工艺。由于纺织企业多数对果胶酶的生物特性不甚了解,在工艺应用过程中缺乏相应的检测手段,使其推广受到限制。酶活力(活性)是衡量酶生物活性及含量的重要指标,因此,建立适用于纺织行业的果胶酶酶活检测方法,是十分迫切和必要的。

2果胶酶的酶促作用机理

果胶酶是一类复合酶,是指分解果胶质的多种酶的总称。我们测定的酶活值通常是这一类复合酶协同作用的综合结果。果胶酶可分为两大类:解聚酶和果胶酯酶。解聚酶主要是通过水解作用和反式消去作用,切断果胶和果胶酶分子α-1,4糖苷键,将果胶分子降解为小分子。果胶酯酶的作用是使果胶分子中的甲酯水解,最后形成果胶酸。

催化的反应物。通常,酶制剂的活力是以Ｕ/ｇ酶制剂(或Ｕ/ｍＬ酶制剂)表示,把酶制剂的量和活力联系在一起,称为“比活力”。在特定条件下,通过测定单位量的某种酶制剂在单位时间内催化足够量底物生成反应产物的量,即可测出此酶制剂的比活力。

根据酶促反应动力学的米氏学说,从酶被底物饱和的现象出发,按照“稳态平衡”假说的设想,可推导出如下公式:

产物生成速率=ｋ3[总酶][底物]/([底物]+ｋｍ)(1)

式中:[总酶]———酶的总浓度(ｍｏｌ/ｍＬ);

[底物]———底物浓度(ｍｏｌ/ｍＬ);

ｋ3———在酶促反应的第二步,形成最终产物的速率常数;

ｋｍ———米氏常数(ｍｏｌ/ｍＬ),其值是当酶反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度。

要估计[总酶],首先要固定所有可控制的独

立变量,如ｐＨ值、温度等。

当[底物]>>Ｋｍ时,底物对反应速率的影响可忽略(酶饱和),酶促反应达到最大反应速率Ｖｍａｘ,其结果是:

产物生成速率=ｋ3[总酶]=Ｖｍａｘ=Ｕ

Ｕ就成为总酶量的一种测量。因此,可以通过测定Ｕ来反映酶制剂中有效酶蛋白的含量。

4果胶酶酶活的测定方法概述和比较

测定果胶酶酶活的方法有很多,但基本上都是利用酶促分解果胶产生的粘度下降或生成的还原性醛基来测定果胶酶酶活。这些方法概括起来主要有粘度降低法、滴定法和分光光度法3种。本文分别选取一种较典型的测定方法加以介绍。

4.1粘度降低法

4.1.1原理

果胶溶于水后形成粘稠状溶液,其粘度和溶解度与其聚合和酯化程度有关。可以利用果胶的这种性质,测其酶活力。即在一定温度、酶浓度下和一定反应时间内,测定标准果胶溶液粘度的降低率。

4.1.2操作方法

浴中保温10ｍｉｎ后,加入1ｍＬ酶液,继续

保温,在不同时间分别测定反应混合液流出粘度计小球的时间。对照实验采用经热处理已失活的酶液。

4.1.3计算

粘度下降百分数可用下式表示:

粘度下降(%)=100(Ｔｏ-Ｔ)/(Ｔｏ-Ｔα)(2)

式中:Ｔ、Ｔｏ和Ｔα分别为反应混合液、对照混合液和缓冲液的流出时间(ｓ)。

酶溶液要预先稀释,使粘度降低范围在20%～80%。在此范围内,酶浓度对数与粘度降低率成正比。以酶作用时间为横坐标、粘度下降百分数为纵坐标做标准曲线,在图中查出粘度下降50%时对应酶的作用时间(Ｔ1/2)。在上述条件下,引起粘度下降50%的酶量为10个果胶酶活力单位,即酶活单位=10/(Ｔ1/2/3600)。

4.2滴定法

4.2.1原理

果胶酶彻底水解果胶,生成半乳糖醛酸;半乳糖醛酸可与碘(过量)反应。反应后剩余的碘可用硫代硫酸钠溶液滴定,据此可得出酶解反应产生的半乳糖醛酸的量。以生成半乳糖醛酸的量衡量果胶酶的活力。

4.2.2测定方法

取1%果胶溶液10ｍＬ,加入到5ｍＬ酶液和5ｍＬ水,调ｐＨ至3.5,在50℃水浴中保持2ｈ,取出加热煮沸。冷却后,取5ｍＬ反应液移入碘量瓶中,加1Ｍ碳酸钠溶液1ｍＬ,0.1Ｎ碘液5ｍＬ,摇匀,加塞,于室温下放置20ｍｉｎ,加2Ｎ硫酸2ｍＬ,用0.05Ｎ硫代硫酸钠滴定至淡黄色,加0.5%淀粉指示剂1ｍＬ,继续滴定至蓝色消失为止。记录所消耗的硫代硫酸钠毫升数Ａ。空白试验用10ｍＬ果胶溶液、10ｍＬ水,不加酶液,不经保温,直接取此混合物5ｍＬ于100ｍＬ三角瓶中用于滴定,记录消耗的硫代硫酸钠毫升数Ｂ。

4.2.3计算

在上述条件下,1ｈ酶促转化果胶、生成1ｍｇ当量游离半乳糖醛酸所需的酶量定为一个酶活单位。

每毫升酶液的活力单位=(Ｂ-Ａ)Ｎ×0.51×20.(5×2×5)(3)

式中:Ｎ———硫代硫酸钠的当量浓度;

0.51———1ｍｇ当量硫代硫酸钠相当于

0.51ｍｇ当量的半乳糖醛酸;

20———分解果胶反应液的总体积数;

5、2、5———分别表示反应中加入酶液的毫升数、反应时间、滴定时所取反应液的毫升数。

4.3分光光度法

4.3.1原理

果胶酶分解果胶,产生带有还原性醛基的还原糖(以半乳糖醛酸计),一些显色剂可与其发生显色反应。根据颜色深浅的不同,可以通过分光光度计测定果胶酶酶活值的大小。本文以最常用的ＤＮＳ比色法介绍此检测方法,其显色剂为3,5-二硝基水杨酸。

4.3.2操作方法

取0.5%果胶溶液0.5ｍＬ加入到0.5ｍＬ酶液中,摇匀。在50℃水浴中准确反应0.5ｈ,取出后,迅速在沸水浴中加热5ｍｉｎ,冷却。取0.5ｍＬ反应液移入加有0.5ｍＬＤＮＳ试剂的试管,加4ｍＬ蒸馏水,摇匀,在沸水浴中加热5ｍｉｎ,迅速冷却。用分光光度计在540ｎｍ处测其吸光度值。参比液配制:加热灭活5ｍｉｎ的0.5ｍＬ的稀释酶液与0.5ｍＬ0.5%果胶溶液充分混合。

4.3.3计算

采用标准曲线法,配制一系列已知浓度的标准葡萄糖溶液,在540ｎｍ处测定吸光度(Ａ),以葡萄糖浓度(Ｃ)为横坐标、吸光度(Ａ)为纵光标作Ａ.Ｃ标准曲线(参见5.2节图2)。由标准曲线可得公式:

Ａ=斜率×Ｃ(ｍｇ葡萄糖/ｍＬ)(4)

未知试液测定吸光度值Ａ后,可通过上式求得Ｃ(ｍｇ葡萄糖/ｍＬ)。

在上述条件下,每小时内每毫升果胶酶酶促转化果胶生成1ｍｇ当量还原糖(以半乳糖醛酸计)所需的酶量定义为一个酶活单位。即: 果胶酶活(ｍｇ半乳糖醛酸/ｍＬ·ｈ)=酶液稀释倍数×Ｃ(ｍｇ葡萄糖/ｍＬ)×2×194/180(5) 式中:194/180———葡萄糖换算成半乳糖醛酸的量;

2———测定中稀酶液被0.5%果胶溶液稀释的倍数。

4.43种方法的比较

将粘度降低法用来测定果胶酶的复合酶活力比较准确,但操作过程也相对复杂,且测定灵敏度不高。滴定法设备使用简单,测试重现行好,准确度高,但测定时间长,过程较繁琐,试剂用量较

大。而分光光度法测定的灵敏度、准确度均高,重现性好,试剂用量少,尤其是操作省时、简便。对于上述3种测定方法,根据纺织行业的特点,笔者认为分光光度法更适于纺织工作者应用。下面重点探讨ＤＮＳ比色法在实际应用中的一些具体问题。

5应用ＤＮＳ比色法测定果胶酶酶活

5.1果胶溶液的配制以及酶液的稀释

果胶溶液的配制浓度以及酶液的稀释倍数是相互联系的两个数据,它们的确定对酶活测定结果的正确性起着关键作用。通过完成以下试验,可以确定有关参数条件。

5.1.1材料与方法

5.1.1.1仪器与试剂

ＵＶ—9200分光光度计;果胶(Ｓｉｇｍａ)、果胶酶制剂(ＮＯＶＯ)、3,5-二硝基水杨酸、巴比妥酸、巴比妥钠。

5.1.1.2溶液配制

ＤＮＳ试剂:将6.3ｇ3,5-二硝基水杨酸、262ｍＬ2ｍｏｌ/ＬＮａＯＨ加到500ｍＬ含182ｇ

酒石酸钠的热水溶液中,再加5ｇ苯酚及5ｇ亚硫酸钠,待溶解、冷却后,加蒸馏水定容至1000ｍＬ,贮于棕色瓶中,一周后即可使用。

5.1.1.3配制巴比妥缓冲液(ｐＨ=8.6)

称取1.84ｇ巴比妥酸,置于56～60℃水中溶化,然后加入10.3ｇ巴比妥钠,加蒸馏水定容至1000ｍＬ。

5.1.1.4配制0.5%果胶溶液

准确称取0.5ｇ果胶于烧杯中,用巴比妥缓冲液(ｐＨ=8.6)溶解、稀释定容至100ｍＬ。

5.1.2制作果胶酶稀释倍数与吸光度关系曲线

分别按表1的稀释倍数用蒸馏水稀释果胶酶,将稀释酶液按4.3.2测定吸光度值,以果胶酶稀释倍数的倒数为横坐标,吸光度(Ａ)为纵坐标作关系曲线(见图1)。

5.1.3结果与讨论

由公式(4)、(5)可得出,在酶活相同的情况下,吸光度与酶液稀释倍数的倒数应呈正比例关系。

图1为试验测得的果胶酶稀释倍数的倒数与其酶活力吸光度值关系曲线,从中可看出果胶酶的稀释倍数过低或过高都会偏离正比的线性关系,尤其在稀释倍数过低的情况下。原因可能有以下两点:①根据米氏学说,底物浓度应保持足够大到使酶饱和,达到最大反应速率,酶活值与酶浓度才能成正比。过高的酶液浓度可能使底物浓度相对不足,而不能满足这种正比关系。②根据朗伯-比耳定律,吸光度与浓度间只在一定范围内有较好的正比关系,酶促反应产生的高浓度产物与ＤＮＳ的络合物颜色过深,会超过这一范围产生较大误差。稀释倍数过高时吸光度值也偏离朗伯

-比耳定律,但仍满足底物使酶饱和的条件,因此产生的偏差相对小得多。果胶溶液的配制一定要有足够大的量,但过大的果胶浓度又会使溶液粘度加大,增加操作的误差。经过反复试验,在反应30ｍｉｎ条件下确定0.5%的果胶浓度,效果最好。将表1的最高稀释倍数和最低稀释倍数的吸光度值删除,对其它数据进行回归分析,得到曲线的回归方程为:Ａ=820.72Ｃ(Ｒ2=0.9943)。表明其线性相关度很好,说明当酶制剂稀释液的吸光度值在0.2～0.4范围内时,其酶活值有很高的准确度。用自产的粗酶液进行了同样的试验,也得到相同结果(见表2)。

因此,可以确定果胶溶液浓度为0.5%,控制酶液稀释倍数使吸光度值在0.2～0.4范围内。

5.2葡萄糖标准曲线的绘制

绘制葡萄糖标准曲线的目的,也是找到葡萄糖溶液浓度与吸光度最佳线性关系的范围。绘制的参考数据及结果见表3、图2。由图2可见,在此范围内,曲线有较好的线性关系。

本测定方法采用葡萄糖绘制标准曲线,因为葡萄糖易得,且价钱便宜。用还原糖作为标准曲线,是为了标定果胶分解产生的还原性醛基的量。在公式(5)的求酶活公式中,有一项葡萄糖与半乳糖醛酸的转换系数,可换算为以半乳糖醛酸计。因此,无论用哪种还原糖作标准曲线,结果都是相同的。

5.3试验温度和ｐＨ范围

酶促反应都有最佳反应温度和ｐＨ范围。在最佳酶反应范围内,酶作用的活力最高。最佳酶反应ｐＨ值和温度的范围是由酶的自身性质、特点所决定的,过多偏离此范围会使酶的活性降低

甚至失去活性。因此在测定果胶酶活性时,作用温度和ｐＨ值要与其最佳反应条件范围相一致。最佳酶反应条件一般会由酶制剂厂家提供。在纺织领域应用的果胶酶,一般以碱性果胶酶为主。本试验应用的就是碱性果胶酶,其最佳反应条件是温度45～55℃,ｐＨ范围8～9。配制果胶酶溶液用巴比妥缓冲液(ｐＨ=8.6),在50℃水浴中进行酶促反应可获得最佳试验结果。

5.4减少试验误差的两个要素

5.4.1将灭活的酶液与同样量的、0.5%的果胶溶液混合,作为参比液,可以消除酶液及果胶溶液中所含微量还原性物质对测定值的干扰。这些干扰因素常会使被测酶活偏高。

5.4.2酶促反应时间、温度条件必须严格控制,否则会产生较大误差。为减小误差,应特别注意以下两步操作:①果胶溶液先在50℃恒温水浴中预热5ｍｉｎ。酶液在50℃恒温水浴中2ｍｉｎ后,加入预热过的果胶溶液,迅速混合、记时。这样可使反应一开始就在50℃条件下进行。②酶促反应结束时,应迅速加热反应液,以终止反应。加热结束后,应迅速用自来水流冷却降温。

十种常见的酶制剂

十种常见的酶制剂（1）纤维素酶纤维素酶，是由多种水解酶组成的一个复杂酶系，自然界中很多真菌都能分泌纤维素酶。习惯上，将纤维素酶分成三类：C1酶、Cx酶和β葡糖苷酶。C1酶是对纤维素最初起作用的酶，破坏纤维素链的结晶结构。Cx酶是作用于经C1酶活化的纤维素、分解β-1，4-糖苷键的纤维素酶。β葡糖苷酶可以将纤维二糖、纤维三糖及其他低分子纤维糊精分解为葡萄糖。自1906年Seilliere在蜗牛的消化液中发现纤维素酶至今已有一百余年了,随着在工业上的广泛应用,特别是在纺织工业、能源工业上的应用,纤维素酶已成为最近十几年酶工程研究的一个焦点。近年来有关纤维素酶的基础研究,包括酶的氨基酸序列、基因的克隆与表达、酶蛋白的空间结构与功能,以及酶蛋白的基因调控等诸多方面都取得显著进展。到目前为止,登记在Swiss2Protein数据库的纤维素酶的氨基酸序列有649条,基因序列有433条。我国对纤维素酶的研究始于上世纪50年代,迄今已有50多年的历史。在纤维素酶的菌种开发、发酵培养、基因的克隆与表达,以及纤维素酶在纺织、能源等方面的应用都取得较大进展. 进入21世纪,利用纤维素酶转化纤维素物质产生葡萄糖进而发酵获得生物乙醇,可以避免对粮食作物的大量损耗,引起了各国政府和研究机构的重视,这其中的关键是纤维素酶的成本问题。由于纤维素酶发酵活力较低,因此其应用成本也较高。同时纤维素酶相比其他糖苷水解酶类,比活力至少要低1～2个数量级,如滤纸酶的比活力为1IU/mg左右,CMC的比活力约为 10IU/mg[7],从而造成酶的作用效率较低。这是两个限制纤维素酶应用的瓶颈问题,也是纤维素酶研究的热点与难点。目前通过传统的菌种诱变和基因工程技术可以较大幅度地提高目的蛋白的表达量,从而提高酶的发酵水平.还可以通过改善发酵条件和工艺,如采用固体发酵来大幅度降低发酵成本。但是提高酶降解天然纤维素的效率则需要,深入研究纤维素酶的结构与功能以及作用方式,进而对其进行有效改造;或者通过筛选新的产酶菌种,发现具有开发潜力的新酶源. （2）脂肪酶脂肪酶即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。脂肪酶基本组成单位仅为氨基酸，通常只有一条多肽链。它的催化活性仅仅决定于它的蛋白质结构。脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等（Hara；

SOD酶活性测定方法

SOD酶活性测定所需药品：（1）0.1mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液： A液：0.1mol/l磷酸氢二钠液 B液：0.1mol/l磷酸二氢钠液 1毫升B+10.76毫升A （2）0.026mol/l蛋氨酸液（Met）：现用现配称取0.3879克蛋氨酸，用1号液定容至100毫升。（3）75*10-5mol/l氯化硝基四氮唑蓝（NBT）液：现用现配称取0.1533克NBT，先用少量蒸馏水溶解，然后定容至250毫升。（4）1umol/lEDTA-2钠和2*10-5mol/l核黄素混合液（5）0.05mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液（6）石英砂实验步骤： 1.酶液制备：称取0.5克鲜叶，放入研钵中，加入3毫升5号液和少量石英砂，于冰浴中研成匀浆。然后用5号液定容至8毫升，于0～4℃、13000g时离心15分钟，上清液即为酶提取液。酶液可在低于0℃下的环境中保存。 2.按下表加入试剂：试剂摇匀后，迅速遮光处理1号杯，其余杯在25℃、光强为4000勒克司的条件下照光处理15分钟，然后立即遮光。接着在560nm下，以1号杯作为空白测定其余杯中溶液的光密度。假定2、3号杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率为100%，然后按下式分别计算其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率。 M/N=100/X M——2、3号杯中溶液的光密度的平均值 N——其余杯中溶液的光密度值 X——其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率然后以酶液量为横坐标，以其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率（X）为纵坐标制作曲线，根据线性好的曲线所得出的函数关系计算抑制NBT光还原的相对百分率为50%时所加入的酶液量，以该酶液量作为1个酶活单位。结果计算：SOD活力按下式计算： A=V*1000*60/（B*W*T）

果胶酶实验报告

实验报告果胶酶在果汁生产中的作用一．实验目的 1.探究不同温度对果胶酶活性的影响; 2.探究不同 ph 对果胶酶活性的影响; 3.探究果胶酶的用量对果汁生产的影响。二．实验原理 1.果胶酶的活性受温度影响。处于最适温度时，活性最高。果肉的出汁率、果汁的澄清度与果胶酶的活性大小成正比。 2.果胶酶的活性受ph影响，处于最适ph，酶的活性最高，高于或低于此值活性均下降。果肉的出汁率、果汁的澄清度与果胶酶的活性大小成正比。 3.在一定的条件下，随着酶浓度的增加，果汁的体积增加；当酶浓度达到某一数值后，在增加酶的用量，果汁的体积不再改变，此值即是酶的最适用量。三．实验材料与用具苹果、果胶酶、盐酸溶液、榨汁机、电子天平、恒温水浴锅、烧杯、量筒、试管、漏斗、温度计、玻璃棒、滤纸、滴管、三脚架四．实验步骤（一）温度对果胶酶活性的影响 1.制备果汁选取一个中等大小的苹果( 约 200g) 洗净后，不去皮，切成小块，放入榨汁机中，加入约 200ml 水，榨取 2min，制得苹果泥。量取一定体积的苹果泥，不同条件下处理后，用滤纸进行过滤即可得到果汁； 2.取9支试管编号并分别加入等量的果汁和果胶酶； 3.将9支试管分别放入30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃的水浴锅中保温10分钟； 4.过滤果汁用量筒测量果汁的里量，并记录数据。（二）ph 对果胶酶活性的影响 1.制备果汁； 2.取5支试管编号并分别加入等量的果汁和果胶酶； 3.将5支试管放入40℃恒温水浴锅中加热； 4.待试管内温度稳定后在5支试管分别加入ph分别为5、6、7、8、9的盐酸溶液； 5.恒温保持10min； 6.过滤果汁用量筒测量果汁的里量，并记录数据。（三）果胶酶的用量对果汁生产的影响 1.配制不同浓度的果胶酶溶液准确称取纯的果胶酶1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、 7mg、8mg、9mg，配制成相等体积的水溶液，取等量放入9支试管中，并编号1～ 9。； 2.在9支试管中加入等量的苹果汁； 3.将上述试管放入恒温水浴加热一段时间。 4.将不同浓度的果胶酶分别迅速与各试管的苹果泥混合，然后再放入恒温水箱中。 5.恒温水浴约20分钟 6.过滤后测量果汁的体积四．实验结果五．分析与结论篇二：果胶酶活性测定实验报告一、实验设计二、实验报告篇三：果胶的实验报告

酶制剂在食品工业中的应用论文

酶制剂在食品工业中的应用摘要：酶制剂是一类特殊的食品添加剂，具有催化高效性，专一性等显著特点。文章综述了食品工业中酶制剂利用及新动向，包括淀粉糖、油脂、蛋白质加工、面包、啤酒、饮料工业以及改善苦味的酶类的应用。并介绍了酶与食品的关系、酶制剂在食品生产中用于保藏、改善质量和增加营养价值、增加品种种类、提高便捷性和提高食品生产效率等作用。并对酶制剂在食品工业中的发展方向和安全问题进行了讨论。关键词：酶制剂；食品工业；应用酶是一类具有专一性生物催化能力的蛋白质。而从生物体中提取的具有酶活力的制品，称为酶制剂。酶制剂主要用于食品加工和制造业方面，它在对提高食品生产效率和产量、改进产品风味和质量等方面有着其它催化剂所无法替代的作用。另外，酶制剂在日化、纺织、环境保护和饲料等行业也有着较广泛的应用。随着发酵工业的发展，酶制剂的主要来源已被微生物所取代，它具有不受季节、地区和数量等因素影响的特性，还具有种类多、繁殖快、质量稳定和成本低等特点。随着微生物育种技术的发展，酶制剂的种类越来越多，分类也越来越细。目前我国已工业化生产的、且用于食品工业的酶制剂主要有：淀粉酶、异淀粉酶、果胶酶和蛋白酶等，它们在食品加工中都起着十分重要的作用。当然，尽管目前我国酶制剂行业的发展已有了长足进步，但与发达国家相比，还有很大差距。为进一步加快酶制剂产业技术的进步，今后应注重在调整产品结构、增加新品种、提高产品质量和竞争力、实现规模化经营和拓宽应用领域等方面作深入的研究。 1．酶与食品的关系在食品生产加工中，为了保持食物原有的色、香、味和结构，就要尽量避免引起剧烈的化学反应。酶是一类具有专一性生物催化能力的蛋白质，因此作用条件非常温和。许多酶所催化的反应从动植物最初生长时就开始了，当它被作为食品时，其体内酶的催化作用仍然继续进行着。如动物体死后，其合成代谢停止，而分解代谢加快，因此就会导致组织腐败，但这可能也会改善某些食品原料的风味。在大多数成熟的水果中，由于某些酶的增加，会使得其呼吸速度加快，淀粉转变为糖，叶绿素发生降解，细胞体积快速增加。这些变化，对于水果风味的改善是有益的；而对蔬菜来讲，叶绿素的降解则是有害的。 2．与食品生产有关的酶制剂 2．1与淀粉糖和甜味剂生产有关的酶制剂淀粉酶工业上应用酶制剂已有数十年的历史，淀粉加工用酶所占比例达到15%，是酶制剂最大的市场。近年来淀粉酶类耐热性大大提高，并已通过基因工程技术改善其品质。特别要提到的是一系列新的酶制剂的发现和应用，如在1995年已经工业化的酶转化淀粉生产海藻糖，改变了先前从酵母等食物中抽提的生产方法，生产成本大大下降。这种糖不仅耐酸、耐热、防龋齿，还可抑制蛋白质变性和油脂酸败，市场日益扩大。 2．2与油脂生产有关的酶制剂油脂是人类食品的主要营养成分之一，有赋予食品不可缺少的风味，而且用酶法生产有益健康的油脂的正逐步应用成熟，如用DNA等高度不饱和脂肪酸作为食品的原材料所制作的食品销售额已达400亿日元。 2．3与蛋白质有关的酶制剂蛋白质在食品加工中，不仅具有营养的功能还具有各种物理功能，提高这类功能将会增加其附加值，要达到这个目的需要利用蛋白酶类。为了以蛋白质水解后的产物作为生产氨基酸系列的调味品，就必须把蛋白质彻底分解为氨基酸。 2．.4与面包生产有关的酶制剂

面粉中常用的酶制剂的作用机理及应用方法

面粉中常用的酶制剂的作用机理及应用方法在全球范围内，广大消费者和大多数政府对食品质量和安全问题的认识在不断提高，对于食品的标准、质量、卫生以及对食品添加剂等安全性评价越来越重视，随着安全性评价的不断深入，检测技术的不断进步，某些食品添加剂对人体健康的潜在危害性得以揭示，人们开始寻找对人体无害的添加剂。酶制剂被称为绿色面粉改良剂，添加入面粉后，在蒸煮、焙烤过程中将失活，无残留，不会对人体健康造成威胁。馒头、面包制作与酶的关系密切，许多年以前，人们就开始将从麦芽中提取的淀粉酶应用于品质改良。近年来，酶制剂在面粉中的应用得到了发展，除以往焙烤工业中用到的真菌α-淀粉酶和木聚糖酶以外，葡萄糖氧化酶、脂肪酶、麦芽糖淀粉酶等单酶及几种单酶复配而成的复合酶，开始引入各种专用粉中；以酶制剂为主要成分的面粉改良剂已表现出良好的应用前景。下面对以上各种酶作逐一介绍。一、淀粉酶淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称,包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶，常用的有α-淀粉酶和糖化酶。 1、α-淀粉酶 α-淀粉酶又称淀粉1，4-糊精酶，别名为液化型淀粉酶，能够切开淀粉链内部的α-1，4-糖苷键，将淀粉水解单糖，低聚糖和糊精等长短不一的水解产物，大多数α-淀粉酶的分子量为50.000左右，每个分子含有一个Ca+2,最适pH值为5.0～7.0最适温度随来源不同差别较大，生产此酶的微生物主要有枯草杆菌、黑曲霉、米曲霉和根霉。面包制作的原理是在小麦面粉中加酵母和水，揉匀做面团，在30℃左右醒发几小时，酵母作用于小麦粉中的发酵糖，生成二氧化碳，面团成多孔性，再在200℃左右温度下烘烤。面包在烘制过程中温度上升是淀粉被糊化，并急速地受到淀粉酶作用，使粘度降低。放入红炉的面包，随着温度的上升酵母急速发酵，气体量增加，热的气体就膨胀，由于挥发成分的气体而使体积增大。温度上升，蛋白质凝固是膨胀后的形态固定而形成面包的骨架，面粉中含有α-淀粉酶和β-淀粉酶，通常，含量不稳定，α-淀粉酶的活性偏低，导致面团发酵过程生成的糖量不足，酵母产生的二氧化碳，不够，面包的体积较小和内部干硬。因此，优良的面包制造，必须添加适量的α-淀粉酶。在面包生产中添加α-淀粉酶，使面包变得柔软，增强伸展性和保持气体的能力，容积增大，出炉后制成触感较好的面包，此外，由于α-淀粉酶作用淀粉所生成的糊精，对改良面包外皮色泽已有较好的效果。 2、真菌α-淀粉酶真菌α-淀粉酶简称FAA,来源于米曲霉，作为传统酶制造，是第一个应用于面包制作的微生物酶，它取代了麦芽是由于麦芽中的淀粉酶含量不稳定，而且含有蛋白水解酶，真菌α-淀粉酶具有更稳定的活性而不含蛋白质酶活性，所以此酶应用十分广泛。真菌α-淀粉能水皆直链淀粉和支链淀粉的α-1，4-糖苷键生成麦芽糊精和麦芽糖。其最适pH值为4.0～5.0最适温度为50℃～60℃。

果胶酶的制备与应用

1104110116 1041101班食品学院陈家晟 2013/6/25

摘要：果胶酶是分解果胶质酶类的总称。通常包括聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶酯酶(PE)、果胶裂解酶(PL)等主要组分。本文主要叙述了果胶酶的制备方法和主要的应用。关键词：果胶；果胶酶；黑曲霉；制备；应用；前言：50年前国外就将果胶酶应用于果汁的加工，现有商品果胶酶制剂生产。近年来，为了满足国内市场对果胶酶的需求，一些研究单位对果胶酶的生产菌种及研制[1]展开了积极的研究。此外，随着中国三大产业的发展，特别是第一和第二产业的高速发展，果胶酶的应用也越来越广泛。现在果胶酶主要应用于果汁加工和果酒酿造。除此之外，果胶酶在茶和咖啡的发酵、桔子脱囊衣、麻料脱胶、废水处理、造纸、榨油等领域也有应用。 1.果胶酶及其简述 1.1果胶酶的定义果胶酶，英文别名:Pectase; Polygalacturonase，是个多酶复合物，通常包括原果胶酶、果胶甲酯水解酶、果胶酸酶。果胶酶由黑曲霉经发酵精制而得。外观呈浅黄色粉末状。主要用于果蔬汁饮料及果酒的榨汁及澄清，对分解果胶具有良好的作用。 1.2果胶酶的特性特性：作用pH:3.0-6.0，最适作用pH:3.0 温度特性：作用温度为15-55℃左右。最适作用温度为 50℃。 1.3果胶酶的作用原理果胶酶是从根霉中提取的,可以分解细胞间的果胶物质，可以澄清果汁和分离细胞。2.果胶酶的制备 2.1高产酶菌株的选育激光诱变育种:由成熟的黑曲霉斜面孢子制成一定浓度的孢子悬液，在搅拌条件下，采用810nm多模连续输出的半导体激光进行辐照.将辐照过的抱子悬液进行分离培养，挑单菌落接种于装有含1%果胶的麦芽汁试管中，置30℃恒温培养5-6d，观测并选出透明层较对照为最长的试管，将其孢子接种于斜面培养，在发酵培养基进行复筛，选出产酶最高者[2]. 2.2果胶酶的生产工艺固体发酵生产果胶酶工艺流程: 培养料拌料 ↓ 灭菌 ↓ 斜面菌种→麸皮菌种→接种曲盘发酵培养 ↓ 出曲浸提 ↓ 离心甩滤→去渣 ↓ 填充剂脱色 ↓↓ 成品包装←喷雾干燥←超滤浓缩

植物五种酶活性检测方法

植物五种酶活性检测方法(总 2页) -CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1 -CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除

选择茶树不同品种，每个茶枝接种5头叶蝉，按不同的时间点 (0h/6h/12h/18h/24h/36h/48h/72h/96h)取样，每个样品重复三次，测定 PPO/POD/PAL/CAT/LOX 五种酶活。 1、多酚化酶（Polyphenoloxidase，PPO）活性的测定适量茶鲜叶（3g）,料液比1:2，加入内含5%PVP（w/v）经遇冷的pH为7.2的柠檬酸-磷酸盐缓冲液（0.1mol/L）,冰浴研磨，隔夜浸提12h，于4℃、9000r/min离心35min，取上清液，过滤得到初酶液。取200ml初酶液，加入0.1mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH5.6)200uL,混合反应液1.2ml（0.1mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲液：0.1脯氨酸：1%邻苯二酚 =10:2:3），反应30min（37℃恒温水浴锅），6mol尿素1.2ml终止反应， 460nm波长测吸光度。对照为不加邻苯二酚的反应混合液。酶活性单位：本实验条件下，以邻苯二酚反应液在460nm处吸光度值每分钟增加0.01为一个活性单位。 2、苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanineammonialyase，PAL）活性的测定称取新鲜样品0.5g于预冷研钵中，加入6ml 0.1mol/L（pH8.8）硼酸钠-硼酸缓冲液，加入适量的石英砂，冰浴研磨后转入离心管中。混匀后在4℃冰箱中浸提4h。4℃10000r/min离心20min，取上清液即为酶提取液。取酶提取液0.2ml，加入由硼酸钠缓冲液配制的0.1mol/L L-苯丙氨酸，2.8ml蒸馏水，摇匀，在40℃水浴上反应30min，冰浴中终止反应，测定OD290值，以相同体积缓冲液代替酶液进行同样的反应为对照。PAL的酶活性以每小时在290nm处吸光度变化0.01OD为一个活力单位。 3、脂氧合酶(linoleate:oxygen oxidoreductase，LOX)活性的测定取0.2g新鲜样品，加7ml经4℃预冷的1mol/L（pH7.6）的tris-HCL缓冲液冰浴上研磨。4℃、12000r/min离心25min,上层清液即为LOX酶提取液。 Lox酶活性单位以每分钟在234nm处吸光度变化0.01OD作为一个活力单位。 4、过氧化物酶（PDA）的活性测定（愈创木酚法）

果胶酶及其在食品工业中应用

果胶酶及其在食品工业中应用 10化本2班禤金萍 2010364223 摘要：果蔬是我们日常生活中必不可少的食品之一，随着生活水平的提高和消费结构的转变，饮料等果蔬加工产品更加受到大众的青睐。而在加工过程离不开酶的参与，果胶酶在工业生产领域中是一种重要的新型酶类，在果蔬饮料中的应用非常广泛，可用于果汁的提取、澄清、提高出汁率等方面。关键词：果胶酶；应用；展望 1.果胶酶结构和来源果胶分子是由不同酯化度的半乳糖醛酸以α-1，4糖苷键聚合而成的多糖链，常带有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、海藻糖、芹菜糖等组成的侧链，游离的羧基部分或全部与钙、钾、钠离子，特别是与硼化合物结合在一起[1]。果胶分子的结构因植物的种类、组织部位、生长条件等的不同而不同，其大致的结构简图如图1所示，总体可分为光滑区(smooth region)和须状区(hairy region)两部分，主要由HGA、RG-I和RG-II三个结构区域构成，其中RG-II常以二聚体的形式存在。果胶酶(Pectinase)是世界四大酶制剂之一，是分解果胶质酶类的总称，主要包括原果胶酶、果胶酯酶、多聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶四大类。[2]果胶酶主要由黑曲霉产生，按作用方式的不同分为两大类，脂酶和解聚酶，后者包括水解酶和裂解酶。 2.果胶酶的应用果胶酶主要应用于食品工业特别是果汁果酒的加工业，近年来也不断开拓了新的用途。我国学者对果胶酶的应用开展了较广泛而深入的研究。

2.1果蔬汁提取目前果汁的提取方法主要是加压榨出和过滤,果汁加工时首先将植物细胞壁破坏。大多数植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶物质等组成,细胞壁的结构较紧密,单纯依靠机械或化学方法难以将其充分破碎。另外,果胶随成熟度的增加,酯化程度较高,也是影响出汁率的主要因素之一。用果胶酶处理可以破坏果实细胞的网状结构,提高果实的破碎程度,有效降低其黏度,改善压榨性能,提高出汁率和可溶性固形物含量,从而就能在压榨时达到提高出汁效率并缩短压榨时间的目的,同时把大分子的果胶物质降解后,有利于后续的澄清、过滤和浓缩工序。[3]例如在苹果汁生产中,苹果要先经机械压榨,然后离心获得果汁,但果汁中仍然含有较多的不溶性果胶而呈浑浊状。直接将果胶酶加到苹果汁中,处理后经加热杀菌、灭酶、过滤得到澄清的果汁。 2.2果汁澄清果胶酶可以降低果汁粘度，使果汁易于被处理而透明澄清。澄清机理的实质包括果胶的酶促水解和非酶的静电絮凝两部分。果汁中有很多物质如纤维素、蛋白质、淀粉、果胶物质等影响澄清，且果胶物质是造成果汁浑浊的主要原因。加入果胶酶澄清处理后，粘性迅速下降，浑浊颗粒迅速凝聚，使果汁迅速澄清、易于过滤。果胶酶能随机水解果胶酸和其他聚半乳糖醛酸分子内部的糖苷键，生成分子质量较小的寡聚半乳糖荃酸，使其粘度迅速下降，容易榨汁过滤，提高果浆出汁率，改善果汁澄清效果。[4] 果胶裂解酶(PL)对苹果汁有较好的澄清作用，但对葡萄汁效果不明显。对于柑橘汁，因要求雾样混浊，应当使用不含果胶酯酶(PE)的聚半乳糖醛酸内切酶(endo-PG)进行处理。由于果胶裂解酶可避免甲醇的产生，也可避免部分脱酯的果胶同钙离子形成沉淀，还可避免构成各种水果芳香性成分的酯类物质的损失。所以有研究表明果胶酶制剂若用于果蔬汁和果酒加工，最好含有较多量果胶裂解酶(PL)。[5] 2.3改善果蔬饮料的营养成分利用果胶酶生产果蔬汁不仅提高了出汁率,而且保留了果蔬汁中的营养成分。首先果蔬汁的可溶性固形物含量明显提高，而这些可溶性固形物由可溶性蛋白质和多糖类物质等营养成分组成,果蔬汁中的胡萝卜素的保存率也明显提高。酶处理后的果汁的葡萄糖、山梨糖和果糖含量显著提高,蔗糖含量略有下降,总糖含量上升。甜玉米、胡萝卜的试验有相似的结果。此外,由于果胶的脱酯化和半乳糖醛酸的大量生成, 造成果汁的可滴定酸度上升,pH下降[6]。芳香物质含量也有明显提高,经果胶酶处理后的葡萄汁,各种酯类、萜类、醇类和挥发性酚类含量提高,葡萄汁的风味更佳。由于细胞壁的崩溃,类胡萝卜素、花色苷等大量色素溶出,大大提高了果蔬汁的外观品质。K、Na、Ca、Zn 等矿物质元素含量也有较大提高。[7] 3.其他方面的应用在咖啡发酵过程中利用产碱性果胶酶微生物除去咖啡豆的黏表皮。有时添加碱性果胶酶来去除含大量果胶质的果肉状表层。纤维素酶和半纤维素酶的协同作用可促进咖啡豆黏表皮的降解。碱性果胶酶也可用于茶叶加工。碱性果胶酶处理可促进茶叶发酵，不过要仔细调节用酶剂量以免破坏茶叶。碱性果胶酶还可通过破坏茶叶中的果胶物质来改善速溶茶粉在冲泡过程中形成泡沫的性能。 4.展望果胶酶是应用于果蔬汁生产中且主要的酶类,它可以较大幅度地提高果蔬品

果胶酶活性的检测

果胶酶活性的检测目的本检测方法是用来确定本公司果胶酶的催化活性。本方法适用于各种固体和液体果胶酶制剂。说明本方法适合于果胶酶的质量分析和质量控制领域。但不是本公司产品及其它公司产品的绝对活力的预测，而各种酶制剂的最终的酶活力在良好的实验操作下仍可发挥出更好的催化活力。原理果胶物质主要存在于植物初生壁和细胞中间，果胶物质是细胞壁的基质多糖。果胶包括两种酸性多糖（聚半乳糖醛酸、聚鼠李半乳糖醛酸）和三种中性多糖（阿拉伯聚糖、半乳聚糖、阿拉伯半乳聚糖）。果胶酶本质上是聚半乳糖醛酸水解酶，果胶酶水解果胶主要生成怜半乳糖醛酸，可用次碘酸钠法进行半乳醛酸的定量,从而测定果胶酶活力。果胶酶活力单位定义 1g（或1ml液体酶）酶粉，于50.0C、pH3.5条件下，每分钟催化果胶水解生成1 微克半乳糖醛酸的酶量为一个活力单位。 1. 试剂和仪器 * 本标准所使用所有的试剂若无任何说明，均为分析纯 1.1醋酸1.2 碘1.3 碘花钾1.4 浓硫酸 1.5果胶（sigma公司）1.6硫代硫酸钠1.7碳酸钠1.8可溶性淀粉 1.9 水浴锅1.10碘量瓶 2.试剂的制备 2.1p H 3.5的酸水用醋酸将蒸馏水调至3.5

2.21%果胶溶液：准确称取分析纯果胶1g,用酸水溶解煮沸，冷却后过滤，定至100ml。 2.20.1N 碘液：准确称取碘化钾5g,用蒸馏水溶解后，加入2.54g碘，溶解后定容至100ml。 2.30.025mol/L 硫代硫酸钠：准确称取6.2g硫代硫酸钠，加蒸馏水后定容至1L 2.40.5%可溶性淀粉指示剂：准确称取可溶性淀粉0.5g放入沸水中消煮至透明。 2.51M碳酸钠溶液：准确称取10.6g碳酸钠，定容于100ml的水中 2.62N硫酸：吸10ml 的浓硫酸倒入170ml 的水中 2.7酶样的制备准确称取1.000g固体酶或移取1ml液体酶样，定容至100ml，于50C水浴浸取1 小时，过滤，滤液为供试酶液。则该酶已经稀释100 倍。 3.程序 3.1取1%果胶酶10ml加入5ml酶液和5ml蒸馏水（PH3.5）,在50C水浴中保温反应1 小时。 3.2取出后加热煮沸2~3min,冷却后，补水至20ml。 3.3取5ml反应液于100ml碘量瓶中，加1M碳酸钠溶液1ml, 0.1N碘液 5 m l ，摇匀，具塞，于室温暗处下放置20min。 3.4取出后加2N硫酸2ml，立即用0.05N硫代硫酸钠溶液滴定至浅黄色，加

果胶酯酶(pectinesterase ,PE )试剂盒说明书

货号: QS2628 规格：20样果胶酯酶（pectinesterase，PE）试剂盒说明书电位滴定法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。测定意义：果胶酯酶属果胶酶系，催化水解果胶中甲氧基生成果胶酸，从而增加果胶在水中的溶解度，广泛存在于高等植物和可以降解细胞壁的细菌和真菌中，起内源调控植物细胞壁上及细胞之间果胶含量的作用，在食品工业中具有及其重要的作用和开发前景。测定原理：果胶酯酶催化水解果胶分子释放H+，是反应体系的的pH下降，用碱液保持体系的pH始终保持在7，通过碱消耗的量反映果胶酯酶的活性。需自备的仪器和用品：天平、研钵、常温离心机、自动电位滴定仪。试剂的组成和配制：提取液：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前每瓶加双蒸水100mL充分溶解。试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加少量蒸馏水于50℃加热溶解，冷却后转入1L容量瓶，用蒸馏水定容。试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加少量蒸馏水溶解，转入1L容量瓶，用蒸馏水定容。样品处理：将组织样品捣碎，按照样品质量(g)和提取液体积(mL)为1: 10的比列（建议取约0.5g样品，加入5mL提取液）冰浴研磨，再于8000g、4℃离心15min，取上清液待测。测定操作： 1.试剂一于50℃保温10min，同时打开电位滴定仪，用蒸馏水清洗仪器。 2.用试剂二补液，补液结束后用取50mL试剂一，用试剂二滴定到pH为7。 3.加入待测样品5mL，将滴定延迟时间设为180s，用试剂二滴定至pH为7。 4.滴定结束后记录消耗的试剂二体积V（mL）和滴定至终点所需时间T（S）。计算公式：酶活定义：每g组织每秒钟消耗NaOH的量定义为一个酶活单位。 PE活性（U/g 鲜重）= V/(T-180)×F/W V：滴定所消耗的NaOH的量，mL；T-180：反应时间，S；F：样品稀释倍数；W：样品质量，g 注意事项： 1.补液结束后检查输液管中是否有气泡，有气泡要补液清除气泡后再进行样品滴定。 2.实验前先做预实验，如果酶活力太高，滴定超过5min不能达到滴定终点，则需要将样品稀释2-5倍进行测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。第1页，共1页

面包体系中常用的乳化剂和三种酶制剂

问题：至少介绍两种面包体系中常用的乳化剂和三种酶制剂。答：1.乳化剂。在面包等烘焙制品加工中，淀粉决定面团和面包的主要性能，而乳化剂与淀粉的相互作用，可以从根本上必一些对于烘焙食品重要的淀粉性能。例如，利用乳化剂可以减少淀粉的吸水性和膨胀性，提高淀粉糊化温度。许多学者从不同角度研究和论述各种乳化剂对最大粘度的影响，有的使用一定的乳化剂来提高最大粘度，有的则利用乳化剂来降低最大黏度。此外，乳化剂还能够抑制和减小直链淀粉的老化，对面包起保鲜作用。对于面包，无论是其工业化生产，还是手工制作，使用乳化剂均可以改进和提高面包质量，使之更加易于生产加工。（1）卵磷脂：是面包制作中使用时间最长的乳化剂。早在1924年，人们就已经知道，面粉中加少量卵磷脂就能对面筋以及面团产生作用。试验研究不同磷脂对面筋的作用证明，磷脂对谷蛋白纤维起到润滑作用，从而使谷蛋白纤维更好地相互滑动，赋予面团较高的延伸性，添加0.5%-1.0%磷脂就能提高面团的延伸性。自1930年以来，美国面包工业中就使用卵磷脂作为乳化剂。卵磷脂可以减少面团的揉和时间，改进面团性能，特别是使面团有良好的坚度和工艺性能，并能够改善面包内部组织和增大面包体积。在面包制作中，卵磷脂与甘油单、二酸酯复配使用，具有协同作用。使用这种混合乳化剂可以抵消原料的质量波动，改进生产工艺过程，节省起酥油，并能明显改善成品的总体质量。（2）SSL（硬脂酰缩二乳酸钠）与CSL（硬脂酰缩二乳酸钙）： SSL为乳白色或微黄色粉未或脆性固体，略有焦糖味，吸湿性强，易吸潮结块。在水中不溶解，但能分散于热水中，可溶于热的油脂。CSL为白色至奶油色粉未或薄片状物，或块状物，无臭，具有特殊的焦糖气味。难溶于冷水，稍溶于热水，经加热、强烈搅拌，可完全溶解。易溶于热的油脂中，冷却时则呈分散态析出。SSL和CSL受热时，色泽会加深且酸值增高，因此，它们的耐热性较差。此外，酸、碱和脂肪分解酶都会导致水解，故在水系中不宜在较高温度下长时间存放。硬脂酰乳酸脂及其钠盐和钙盐能够与蛋白质发生强烈的相互作用，在面团调制过程中，它们与小麦粉中面筋蛋白质相互作用，其亲水基团与麦胶蛋白结合，其疏水基团与麦谷蛋白结合，而形成面筋网络，从而提高了面团的延伸性、弹性

脲酶的测定方法

一、脲酶测定(比色法) 脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。 1、试剂配制：（1）pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g 氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL 丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。使用前，取A、B 两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。（3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，（1.9g次氯酸钠溶于1L水中）溶液稳定。（4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。（5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL 含0.1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。 2、操作步骤称取5ｇ土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15ｍｉｎ; 往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ6.7),仔细混匀。在37℃恒温箱中培养24ｈ。然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。取滤液1mL置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至10mL,然后加入4mL苯酚钠溶液,并立即加入3mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后,立即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,在波长578ｎｍ处测定吸光值。脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。

果胶裂解酶活力测定方法

果胶裂解酶活力测定方法 1定义在测定条件下，每分钟作用果胶产生1μmol双键所需酶量定义为一个酶活力单位（IU）。 2 原理果胶裂解酶作用果胶产生不饱合寡聚半乳糖醛酸。反应产物分子中C－4和C－5之间有一与C－5上羧基相连的双键，使之在235nm波长有最大吸收。分子消光系数为5500cm2 /mmol。 3 试剂 3.1 琥珀酸钠（C4H4O4Na2·6H2O） 3.3 浓盐酸（HCL） 3.2 琥珀酸（C4H6O4） 3.4 果胶（Sigma公司，P9135）本标准中所用的试剂，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和符合GB/T 6682中规定的三级水。 4 仪器和设备 4.1 实验室常用仪器设备。 4.6 秒表（数字显示） 4.2 恒温水浴：（30±0.5℃）。 4.7 分析天平（0.0001g） 4.3 分光光度计（波长范围200-1000nm） 4.8 磁力搅拌器。 4.4 移液管 4.9 离心机：转速为30000r/min 以上。 4.5 酸度计：精确至小数点后2位。 5 溶液 5.1 0.05mol/L，pH=5.2琥珀酸缓冲液称取琥珀酸钠（C4H4O4Na2）13.51g于900ml水中，溶解后用琥珀酸（C4H6O4）调pH值至5.2，定容至1000ml，校正pH值后置冰箱中备用。 5.2 2mol/L盐酸准确量取16.7ml浓盐酸，用水定容至100ml。 5.3 0.425%果胶溶液（底物）称取0.425g果胶于80ml缓冲液中，至少搅拌3h，溶解后于4℃放置16h，30000rpm/min 离心30min，用缓冲液定容至100ml, 4℃保存。 6 分析步骤： 6.1待测酶液的制备 6.1.1 根据酶活力确定稀释倍数，使酶浓度控制在大约 0.06-0.09u/mL,即光吸收值在0.25—0.40范围内。 6.1.2 称取酶粉1g，精确至0.0001g，（或吸取酶液1.00 ml）。用蒸馏水溶解，置于磁力搅拌器上搅拌10分钟，全部移入容量瓶中，稀释倍数小于500倍的直接用缓冲液(5.2)溶解。4000rpm/min离心5分钟，上清液液根据稀释倍数再进行稀释，最后一次用缓冲液稀释，供测试用。

各种酶活力测定方法及注意事项

碱性蛋白酶及各种蛋白酶活力测定方法及测定有感因长期测定碱性蛋白酶酶活力与角蛋白酶活力与胶原酶活力和弹性蛋白酶活力，碱性蛋白酶活力测定还好，因有国家标准，测定按照国标来便可大大减少误差。其余酶活力测定过程中因无统一标准且底物差异大，导致长期酶活力测定的混乱，各种酶活力测定方法与各种试剂添加，最后实际测定的酶活力只能仅作参考。以下是各种蛋白酶活力测定方法及标曲绘制：碱性蛋白酶测定方法根据国标GB/T 23527-2009 附录B 蛋白酶活力测定福林法以下是方法

碱性蛋白酶的测定方法参考 GB/T 23527-2009 附录 B 中福林酚法进行，即 1 个酶活力单位（U/mL）定义为 1 mL 酶液在 40℃、pH= 10.5 条件下反应 1 min 水解酪蛋白产生 1 μg 酪氨酸所需要的酶量，主要步骤如下。 2.2.6.1 标准曲线的绘制（1）L-酪氨酸标准溶液：按表 2-6 配制。表 2-6 L-酪氨酸标准溶液配置表 Table 2-6 L-Tyrosine standard solution form 管号酪氨酸标准溶液的浓度/ （μg/mL）取 100 μg/mL 酪氨酸标准溶液的体积/（mL）取水的体积/ （mL）

0 0 0 10 1 10 1 9 2 20 2 8 3 30 3 7 4 40 4 6 5 50 5 5 （2）分别取上述溶液各 1.00 mL，各加 0.4 mol/L 碳酸钠溶液 5.0 mL，福林试剂使用液 1.00 mL，置于 40 ℃±0.2 ℃水浴锅中显色 20 min，用分光光度计于波长 680 nm，10 mm 比色皿，以不含酪氨酸的反应管作为空白，分别测定其吸光度值，以吸光度值 A 为纵坐标，酪氨酸浓度 C 为横坐标，绘制 L-酪氨酸标准曲线。图 2-1 L-酪氨酸标准曲线 Fig. 2-1 L-tyrosine standard curve 根据作图或用回归方程计算出当吸光度为 1 时的酪氨酸的量（μg），既为吸光度常数 K 值。其 K 值应在 95-100 范围内。上图所示标准曲线符合要求，可用于下一步实验。 2.2.6.2 测定方法（1）计算方法 X = A × K × 4 / 10 × n = 2 / 5 × A × K × n 式（2-1）式中，X —样品的酶活力，μ/g； A —样品平行实验的平均吸光度； K —吸光常数； 4 —反应试剂的总体积，mL； 10—反应时间 10 min，以 1 min 计； n —稀释倍数。（2）测定方法 ①先将干酪素溶液放入 40 ℃±0.2 ℃恒温水浴中，预热 5 min。 ②按下列程序操作，进行测定。于 680 nm 波长，用 10 mm 比色皿测其吸光度。

果胶酶的生产技术

果胶酶的生产技术课程：食品生物技术专业：班级：学号：姓名：完成时间：2011 年5月15日

果胶酶的生产技术摘要：果胶酶是一类分解果胶质的酶的总称，它能将复杂的果胶分解为半乳糖醛酸等小分子。目前果胶酶在食品、纺织、医药、造纸、环境、生物技术、饲料等领域得到广泛应用。果胶酶主要来自微生物。综述了微生物果胶酶生产茵的菌种、选育、鉴定、发酵方法和发酵条件优化，酶的分离纯化、酶学性质和分子生物学方面的研究进展，并介绍了果胶酶的应用进展，最后展望了微生物果胶酶研究的广阔前景。关键词：微生物果胶酶果胶；果胶酶；几丁聚糖；固定化研究现状展望 1 果胶果胶分子是由不同酯化度的半乳糖醛酸以a一1，4糖苷键聚合而成的多糖链，常带有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、海藻糖、芹菜糖等组成的侧链，游离的羧基部分或全部与钙、钾、钠离子，特别是与硼化合物结合在一起m．它存在于所有的高等植物中，沉积于初生细胞壁和细胞间层，在初生壁中与不同含量的纤维素、半纤维素、木质素的微纤丝以及某些伸展蛋白(extensin)[2]相互交联，使各种细胞组织结构坚硬，表现出固有的形态．果胶分子的结构因植物的种类、组织部位、生长条件等的不同而不同，总体可分为光滑区(smooth region)和须状区(hairy region)两部分，主要由HGA、RG-I和RG-II三个结构区域构成，其中RG-II常以二聚体的形式存在．同其它植物多糖一样，果胶也是多分子的、多分散的、多结构的、有高级空间构象的，也具有一定的相对分子质量分布． 2 果胶酶 2.1 果胶酶(pectolytic enzyme or pectinase)是指能够分解果胶物质的多种酶的总称． 2.2 果胶酶的分布许多霉菌及少量的细菌和酵母菌都可产生果胶酶，主要以曲霉和杆菌为主．新近报道的其它茵有青霉如意大利青霉(Penicillium itaticum)、扩展青霉(Penicillium expansum)以及Penicillium

温度和pH对果胶酶活性的影响

一、课题目标简述果胶酶的作用；检测果胶酶的活性；探究温度和pH对果胶酶活性的影响以及果胶酶的最适用量；搜集有关果胶酶应用的资料。二、课题重点与难点课题重点：温度和pH对果胶酶活性的影响。课题难点：果胶酶的最适用量。三、课题背景分析随着生活水平的提高，水果几乎成为人们生活中的必需品，果汁饮料也深受人们的喜爱。将水果制成果汁，不仅有利于解决水果丰收季节的产、销、运输和保存等多方面的问题，而且提高了水果的附加值，满足了人们不同层次的需要。课题背景从与社会的联系、与学生生活的联系入手，引入课题研究。教师在教学过程中，可以以本地某种水果的生产、贮存、加工和运输为素材，让学生做一个简单的估算，从而认识到果汁加工的经济效益。例如，可以让学生计算生产一升苹果汁大约需要多少斤苹果，苹果与苹果汁的价格相差多少；等等。此外，教师还可以联系学生已有的关于酶的知识，引导学生认识果胶酶的特性及其作用。四、基础知识分析与教学建议知识要点：1.果胶酶的作用；2.酶的活性的定义；3.影响酶活性的因素；4.果胶酶的用量。教学建议：关于果胶酶作用的教学，教师可以先展示图4-1，介绍植物细胞壁的成分和细胞与细胞之间的胞间层成分，说明这些成分对果汁制作的影响，从而引出果胶酶在果汁生产过程中的作用。图4-1 植物细胞壁及细胞之间胞间层的成分五、实验安排及注意事项本课题的研究建立在必修模块“探究影响酶活性的条件”的基础之上，与必修模块的探究的不同之处主要体现在两个方面：一是酶的活性不是通过定性分析而是通过定量分析来进行探究的；二是本课题并不仅仅满足于探究温度和pH对酶活性的影响，还探究了果胶酶的最适用量，对生产实践具有指导意义。本课题可用3～4课时。其中，探究温度对果胶酶活性的影响的实验可以参考下面的教学思路进行。

果胶酶提取液

果胶酶提取液简介：天然果胶类物质以原果胶、果胶(Pectin)、果胶酸的形态广泛存在于植物的果实、根、茎、叶中，是细胞壁的一种组成成分，它们伴随纤维素而存在，构成相邻细胞中间层粘结物，使植物组织细胞紧紧黏结在一起。果胶酶(Pectinase)是一类分解果胶质酶类的总称，实质是多聚半乳糖醛酸水解酶，包括原果胶酶，果胶酯酶，多聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶四大类，广泛存在于植物果实和微生物中，主要用于食品、酿酒、环保、医药、纺织及日化用品行业。 Leagene 果胶酶提取液主要用于提取植物组织或果实中果胶酶。500ml 可提取160次样本左右。该试盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。组成：自备材料： 1、蒸馏水 2、实验材料：桃子、李子、苹果、杏等果实或其他植物组织 3、研钵或匀浆器 4、试管或离心管 5、离心机操作步骤(仅供参考)： 1、取果实或其他植物组织，洗净，擦干，称取剪碎的新鲜样品，置于提前预冷的研钵或匀浆器. 2、加入预冷的果胶酶提取液，充分研磨或匀浆后转入离心管或试管. 3、离心，留取上清液，即为果胶酶粗提液。注意事项： 1、果胶酶提取液应密闭保存，避免有效成分挥发。 2、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。有效期：24个月有效。编号名称CS0481 Storage 果胶酶提取液 500ml RT 使用说明书1份

相关：编号名称 CS0201细胞线粒体分离试剂盒 DC0032Masson三色染色液 DM0007瑞氏-姬姆萨复合染色液 NR0001DEPC处理水(0.1%) PS0013RIPA裂解液(强) TC1167尿素(Urea)检测试剂盒(脲酶波氏比色法) TO1013丙二醛(MDA)检测试剂盒(TBA比色法)

常见蛋白酶抑制剂

当前位置：生物帮 > 实验技巧 > 生物化学技术 > 正文蛋白酶及蛋白酶抑制剂大全日期：2012-06-13 来源：互联网标签：相关专题：解析蛋白酶活性测定聚焦蛋白酶研究新进展摘要 : 破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。以下列举了5种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度恩必美生物新一轮2-5折生物试剂大促销！ Ibidi细胞灌流培养系统-模拟血管血液流动状态下的细胞培养系统广州赛诚生物基因表达调控专题蛋白酶抑制剂破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。以下列举了5种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度。由于蛋白酶抑制剂在液体中的溶解度极低，尤其应注意在缓冲液中加人蛋白酶抑制剂时应充分混匀以减少蛋白酶抑制剂的沉淀。在宝灵曼公司的目录上可查到更完整的蛋白酶和蛋白酶抑制剂表。常用抑制剂 PMSF 1)抑制丝氨酸蛋白酶(如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶)和巯基蛋白酶(如木瓜蛋白酶); 2)10mg/ml溶于异丙醇中; 3)在室温下可保存一年; 4)工作浓度:17~174ug/ml(0.1~1.0mmol/L); 5)在水液体溶液中不稳定，必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF。 EDTA 1)抑制金属蛋白水解酶; 2)0.5mol/L水溶液，pH8~9;