肿瘤基因检测的解读流程(修订版)

从临床进入基因检测流程是入口，检测结果结合临床信息进行合理解读是出口，

这一入一出之间需经历检测前临床咨询部分、实验室部分、信息分析部分、临床解读部分共四个环节。其中的第四部分临床解读部分即是根据检测结果、患者信息、医生共识综合判断，临床和遗传咨询有效衔接、充分沟通，最终出具临床解

读报告。

在做成临床解读报告之前，首先需要将解读的各个环节进行明确，包括解读的步骤流程，解读的技术细节。这样才有可能真正的做到解读的规范化，使解读过程有据可依，有章可循，才能出具一份好的临床解读报告，基因检测才能更好的服务患者和临床医生。从大的框架讲，基因检测数据解读可分为三个步骤：原始数据→分析数据、基于数据库的解读→与患者个体表征/临床病例结合的解读。

1、读懂原始数据

将测序的原始序列数据（FASTQ）去除接头及低质量序列，经BWA软件比对至GRCh37/38（NCBI版本）或hg19/hg38（UCSC版本）人类基因组参考序列上，Picard去除重复序列，使用GATK检测SNV与Indel变异，使用ANNOVAR 进行变异注释。最后获得一份.vcf文件（图1）。

图1 从测序的原始序列数据到vcf文件的流程一份vcf文件包含如下基本信息。

Chr：变异所在的染色体

Start：变异在染色体上的起始位置

End：变异在染色体上的结束位置

Ref：参考基因组的序列

Alt：检测样本基因组的序列

Func.refGene：变异所处参考基因的功能区（exonic，intronic，UTR3，UTR5，splicing，upstream，downstream，intergenic）（此处的exonic特指外显子编码氨基酸区，不包括外显子的UTR区）

Gene.refGene：变异所处参考基因名称（如果是基因间，则是两侧的基因）GeneDetail.refGene：非外显子区处于特定转录本中的具体位置（如果是基因间，则是距离两侧的基因的距离）

ExonicFunc.refGene：外显子区的变异类型（frameshift insertion，frameshiftdeletion，stopgain，stoploss，nonframeshift insertion，nonframeshiftdeletion，synonymous SNV，nonsynonymous SNV），如果这一栏是一个“.”的话，就说明该变异不在外显子区

AAChange.refGene：氨基酸水平的改变（同一个基因可能具有多个转录本，氨基酸改变的位置在不同的转录本中有可能不一样）

经注释后的vcf文件还会包含如下信息：

CLINSIG：该变异在ClinVar数据库中的临床意义（Benign，Likely benign，Uncertain significance，Likelypathogenic，Pathogenic，Drug-response）CLINDBN：该变异所引起的疾病名称

CLINACC：该变异的登记号和版本号（VariantAccession and Versions）

CLINSDB：该变异所引起疾病所在数据库名称

CLINSDB：该变异所引起疾病所在数据库中的ID

PopFreqMax：该变异人群中的最大等位基因频率

1000_All：该变异在千人基因组计划数据库中的人群等位基因频率

1000_AFR：该变异在千人基因组计划数据库中非洲人群的等位基因频率

1000_AMR：该变异在千人基因组计划数据库中美国人群的等位基因频率

1000_EAS：该变异在千人基因组计划数据库中东亚人群的等位基因频率

1000_EUR：该变异在千人基因组计划数据库中欧洲人群的等位基因频率

1000_SAS：该变异在千人基因组计划数据库中南亚人群的等位基因频率

Snp138：该变异在dbSNP数据库中的ID

Cosmic70：该变异在癌症体细胞突变数据库COSMIC中的ID

ESP6500siv2_ALL：该变异在美国国家心肺血液研究所的ESP6500数据库中的人群等位基因频率

ESP6500siv2_AA：该变异在美国国家心肺血液研究所的ESP6500数据库中的非洲裔人群等位基因频率

ESP6500siv2_EA：该变异在美国国家心肺血液研究所的ESP6500数据库中的欧洲裔人群等位基因频率

ExAC_All：该变异在ExAC数据库中的人群等位基因频率

ExAC_AFR：该变异在ExAC数据库中非洲人群的等位基因频率

ExAC_AMR：该变异在ExAC数据库中美国人群的等位基因频率

ExAC_EAS：该变异在ExAC数据库中东亚人群的等位基因频率

ExAC_FIN：该变异在ExAC数据库中芬兰人群的等位基因频率

ExAC_NFE：该变异在ExAC数据库中非芬兰欧洲人群的等位基因频率

ExAC_OTH：该变异在ExAC数据库中除已指定人群之外的人群等位基因频率ExAC_SAS：该变异在ExAC数据库中南亚人群的等位基因频率

CG46：该变异在CG46数据库中的人群等位基因频率。CG46是由CompleteGenomics（BGI）公司对46个样本的全基因组测序而建立的数据库，截止2017年，他们已经对超过20000个样本进行了全基因组测序和分析。

ICGC_Id：国际癌症基因协作组中各研究的ID

ICGC_Occurrence：该变异在ICGC数据库中的发生情况。该栏数据结构如COCA-CN|1|187|0.00535，指中国结直肠癌的研究（https://https://www.360docs.net/doc/e812849694.html,/），在187例患者中有1例发生突变，突变比例为0.00535

Nci60：该变异在nci60数据库中的等位基因频率。Nci60是被广泛用于药物筛选的人类60种肿瘤细胞系组合，已经进行了全外测序。随着研究的进步，美国

癌症研究所NCI在2016年宣布NCI-60细胞系“退休”，PDX新模型“上任”。Interpro_domain：InterPro算法预测的突变所处的保守结构域

（https://www.360docs.net/doc/e812849694.html,/interpro/）

dbscSNV_ADA_SCORE：基于adaptive boosting预测变异对剪接位点改变的可能性

dbscSNV_RF_SCORE：基于Random Forest预测变异对剪接位点改变的可能性。得分代表剪接影响的可能性大小，如果dbscSNV_ADA_SCORE和dbscSNV_RF_SCORE得分均小于0.6，则对剪接位点没有影响（PMID: 28132688）。

Omim_phenotype：在OMIM数据库中该基因（不是该变异）对应的表型

QUAL：测序质量分数，计算方法为Q = -10log10(e)，可衡量碱基未正确检出

的概率。

FILTER：对变异位点做进一步的过滤。无论你用什么方法对变异位点进行过滤，

过滤完了之后，在FILTER一栏都会留下过滤记录，如果是通过了过滤标准，那

么这些通过标准的好的变异位点的FILTER一栏就会注释一个PASS，如果没有

通过过滤，就会在FILTER这一栏提示除了PASS的其他信息（other FILTER flag）。如果这一栏是一个“.”的话，就说明没有进行过任何过滤

INFO&FORMAT：该栏数据结构

GT:AD:AF:ALT_F1R2:ALT_F2R1:FOXOG:QSS:REF_F1R2:REF_F2R1。GT：基因型，对于一个二倍体生物，0表示跟REF一样，1表示表示跟Alt一样；2表示第二个Alt；AD：对应两个以逗号隔开的值，这两个值分别表示覆盖到REF和Alt碱基的reads数，相当于支持REF和支持Alt的测序深度；AF：支持Alt的测序深度占总测序深度的比例，即等位基因丰度

NORMAL：与肿瘤组织对应的正常组织中的信息，一般通过外周血测序获得TUMOR：肿瘤组织中的信息

此外还可能包含各种算法对非同义突变保守性预测值，这些算法包括SIFT prediction(T: tolerated; D: deleterious)，PolyPhen HumanDiv prediction

(D:Probably damaging, P: possibly damaging; B: benign)、LTR、MutTaster、MutationAssessor、FATHMM、CADD、GERP++等等。

2、分析挖掘数据

对全外显子检测（或者属于较大pannel范畴的情况也可以），可以进行肿瘤突变负荷（Tumor mutationburden）计算。临床研究表明，使用PD1/PD-L1

抑制剂等免疫治疗药物时，具有较高突变负荷的患者具有较好的客观缓解率(ORR)、较长的无进展生存期(PFS)，同时持续临床疗效(DCB)也更佳。然而，由于目前没有统一的肿瘤突变负荷计算方法，在做纵向比较时需谨慎。该分析使用的计算方法为，肿瘤组织中突变丰度大于等于5%，正常组织中突变丰度小于等于1%，ExonicFunc.refGene一栏去除“.”、synonymous SNV、unknown 标签的数据，PopFreqMax一栏去除人群等位基因频率大于0.1%的数据（注意保留“.”）。此外，免疫治疗相关的一些基因突变（如EGFR、干扰素信号通路的JAK、B2M等）值得关注。

对全外显子检测，能够发现大量的体细胞突变。有的突变是致病性的称为为驱动突变或司机突变（与之对应的称为乘客突变或继发性突变），这些突变或导致

DNA修复缺陷，或导致细胞不受调控的增殖生长，或导致细胞不能正常凋亡，

或导致细胞侵袭性增强，或导致免疫逃逸。因而从大量的体细胞突变中鉴定肿瘤的驱动基因突变既是基因检测的重要目的之一，同时也是一项艰难的工作。一般来说一个肿瘤的发生其驱动基因突变的数目为0-8个，且他们不会分布于同一个关键的肿瘤相关信号通路中（比如BRAF和KRAS，比如APC和CTNNB1）或并行的两个重要信号通路中（比如PIK3CA和KRAS）。一般来说原癌具有较为明显突变热点聚集倾向（比如KRAS和PIK3CA），而抑癌基因的突变位点较为分散（比如RB1和VHL）。

对全外显子检测目前已经在肿瘤中得到较为广泛的应用，如何高效寻找驱动基因

突变急需指导和规范化的文件，但由于肿瘤细胞突变多为体细胞突变，遗传性突

变领域的规范化文件（后面会具体讲）难以照搬使用。因为体细胞突变的意义和

遗传性突变的意义比如致病性突变这样的描述有所不同，比如我们可以采用响应

药物的突变（responsive）、耐药突变（resistant）、驱动性突变（driver）、继发性突变（passenger）来描述突变的意义。值得庆幸的是，2017年伊始，

分子病理协会（Association for Molecular Pathology, AMP）、美国临床肿

瘤协会（American Societyof Clinical Oncology）和美国病理学家联盟（College ofAmerican Pathologists）对高通量测序在肿瘤诊疗领域的应用从

突变记载（HGVS）、注释解读、报告进行了指导和规范（PMID: 27993330）。该指导规范中对参考序列数据库（如NCBI）、人群基因频率数据库（如1000G、ExAC）、肿瘤数据库（如COSMIC、ICGC）、疾病数据库（如HGMD、ClinVar）、预测软件（如PolyPhen2、Human Splicing Finder）的使用和注意事项给出

了意见。该规范还推荐对肿瘤细胞的体细胞变异划分为四个级别：具有确定性临

床意义的突变（variants with strong clinical significance，Level A和Level B）、可能具有临床意义的突变（variants with potential clinical significance，Level C和Level D）、临床意义不明的突变（variants of unknown clinical significance）、良性或可能良性的突变（variants deemed benign or likely benign），并详细阐述如何将检测到突变结合数据库以归类到这四个级别中。

其中具有确定性临床意义/可能具有临床意义的突变包括四个等级的证据：

Level A：可作为预测药物反应或耐药性的FDA批准的针对特定类型肿瘤（适应症）的治疗的突变；或者已经被包括在专业指南中（如肿瘤的NCCN）作为特定类型肿瘤的治疗、诊断或预后的突变；

Level B，可作为预测药物反应或耐药性的基于充分研究和专家共识的治疗的突

变，或者是基于充分研究和专家共识的具有特定疾病诊断、预后意义的突变；

Level C，可作为预测药物反应或耐药性的FDA或专业协会批准的跨适应症的治疗的突变，或者是已经作为临床试验的入组参考标准，或者是基于多项研究的具有特定疾病诊断、预后意义的突变；

Level D，基于临床前研究、案例报道的可能具有临床意义的突变；或者有研究

表明该突变有助于疾病诊断和预后判断。

目前，寻找肿瘤驱动基因突变的具体策略可以说是多种多样（图2）。通过寻找热点基因的热点突变（recurrent mutation）是一种较为确定的策略，相关的研究证据较为充分。例如EGFR的突变主要发生在胞内酪氨酸激酶（TK）区域的前四个外显子上（18~21），目前发现的TK区域突变有30多种。缺失突变主要发生在外显子19上，最常见的是del E746-A750，替代突变最常见的是发生在外显子21上的L858R，复制或插入突变发生在外显子20上。发生在外显子20上的替代突变T790M为耐药突变，研究还发现L858Q、D761Y、T854A等耐药突变。HER2基因在乳腺癌、膀胱癌、结直肠癌、胃癌中主要突变方式是扩

增或者表达上调，鲜有突变，在20～30%的乳腺癌中存在HER2基因明显扩增或过表达，但是在肺癌中，其激活机制为扩增、过表达及点突变，点突变在肺癌

中的发生概率约占2-4%，多发生在其激酶结构域中，常见的激活性点突变包括p.S310, p.L755，p.G776L, p.V777L，p.S855I，p.N857S 等。BRAF V600E 突变临床意义在Pubmed中有上百遍报道。BRAF突变存在于1%–3%的非小细胞肺癌中。V600E是最常见的肿瘤驱动突变，在肺癌中也有多种其他类型的BRAF突变被报道，包括G466V、G469A和D594G。尽管性药物例如vemurafenib在包含BRAF V600E突变的黑色素瘤中高度有效，但这些药物对BRAF其他位点突变，或者V600E突变肺癌中的肿瘤驱动活性还需评估。

图2 鉴定驱动基因突变策略（PMID: 24479672）

热点基因的热点突变在很多数据库中有不完全的收录，这些数据库有Civic数据库，OncoKB数据库，Personalized cancer therapy数据库，Clinical Knowledgebase数据库等等。

预测变异对蛋白质功能的影响，可以作为寻找肿瘤驱动突变的一种有益补充方法。比较常见的预测工具如SIFT、PolyPhen2、MutationAssessor等等，这些算法的原理一般是基于氨基酸的进化保守性，有的考虑到蛋白质结构域的功能（例如TP53蛋白的有害突变多位于DNA结合结构域），还有的会考虑蛋白的空间结构。对于检测到的变异各算法预测值在上述的vcf文件中可查阅。对于SIFT，值越小变异有害性的可能性越大，推荐阈值0.05；对于PolyPhen2，值越大变异有害性的可能性越大，推荐阈值0.3；对于MutationAssessor，值越大变异有害性的可能性越大，推荐阈值8，需要注意的是，不同的参考文献阈值可能不同（PMID: 23819521）。

将基因放在信号通路中分析，这对于不是十分常见的小众肿瘤驱动基因寻找有很

大帮助。在美国，每年有大约18,000名患者被确诊为脑膜瘤。它们约占原发性脑肿瘤的三分之一，女性患病比率高一倍。但是一直以来对于脑膜瘤的遗传突变了解甚少。在一项研究中（PMID: 23334667），科学家们对17个脑膜瘤样本进行了全基因组或是外显子组测序。在这些肿瘤中发现改变基因后，研究人员随后又对另外两组肿瘤进行了测序。研究人员发现，相比大多数类型的肿瘤，脑膜瘤具有较少数量的遗传改变或损伤。在一些肿瘤中，他们发现两个在已知致癌信号通路中发挥作用的基因存在突变。在3个肿瘤中发现的SMO，是Hedgehog 信号的成员。在5个肿瘤中发现了AKT1，该基因参与了与乳腺癌、结直肠癌和

肺癌相关的PI3K-AKT-mTOR信号。第6个肿瘤具有一个从前已知的，与mTOR 信号通路相关的突变。总的来说，这些突变基因信号通路构成了所研究的15%脑膜瘤的重要驱动子。

对于遗传性肿瘤，可以借助遗传病致病基因鉴定的方案，流程即1、了解临床资料2、核心表型转化为中文人类表型标准用语(CHPO)3、基因检测及其质控4、生信分析5、遗传学分析，包括关联候选基因、遗传变异位点分析解读和家系验

证6、表型相似度分析。2013年ACGM推荐的与遗传性肿瘤/遗传病相关基因包括BRCA1、BRCA2、TP53、STK11、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、APC、MUTYH、VHL、MEN1、RET、PTEN、RB1、SDHC、SDHD、TSC1、TSC2、WT1、NF2等（PMID：23788249）。查找正常对照组织突变丰度（N_Freq）≥40%，比对遗传性肿瘤相关突变基因，是否有遗传性肿瘤相关胚系突变，查看

并按照下述步骤进行确认。按照基因名+c.__或基因名+p.__进行google搜索或进入NCBI、HGMD、OMIM等网站查阅是否有相关致病性报道，按照ACMG 指南进行位点致病性判定或可借助InterVar在线辅助判定（仅适用于exon范围内突变）。发现遗传性肿瘤相关的基因突变，还应推荐家族其他直系血亲进行

基因检测做进一步的确认。

美国医学遗传学与基因组学学会（American Collegeof Medical Genetics and Genomics, ACMG）和分子病理协会（Association forMolecular Pathology, AMP）在2015年对临床实验室的基因检测进行了指导和规范（PMID: 25741868）。该指导规范主要就是适用于孟德尔遗传病相关基因变异或者是生

殖系变异。指导规范推荐记载突变遵循统一的规范——人类基因组变异协会

（Human GenomeVariation Society, HGVS），并将变异根据人群基因频率（population data）、软件预测（computational data）和功能试验（functional data）等参数分为五个级别：致病性突变（pathogenic）、可能致病性突变（likelypathogenic）、意义不明突变（uncertain significance）、可能良性

突变（likely benign）和良性多态性突变（benign）。这五个级别如何认定？

该规范列出了致病性/可能致病的各种情况的支持证据，证据强度依次包括超强

证据（PVS1）、强证据（PS1-4，注意这里的数字不代表证据强度的区别，仅

表示同一证据强度的不同的证据情况，下同）、中度证据（PM1-6）、支持性

证据（PP1-5），良性多态性/可能良性证据强度依次包括独立证据（BA1）、

强证据（BS1-4）、支持性证据（BP1-6）。需要特别指出的是对于致病性突变

和引起蛋白功能缺失的突变区别开来，只有一种突变对某种疾病具有因果关系（causative），才能够被认定为致病性突变。应当注意到致病性突变这个定义

对于多基因遗传病其实不太适合。同时应该注意到当一个突变被报道为致病性的

时候，对于个人或者健康管理人员可能认为它是一个可干预的突变（actionable）。此外，该规范还对数据库使用、文献使用、软件预测使用给出了指导性的建议。

最后也是最重要的是报告的呈现形式，标注突变判定依据，功能注释，文献出处，

遗传规律，及其他可能的相关疾病症状。在研究进展更新后，特别是以前被认定

为意义不明突变时，最好能够对突变数据进行再分析更新。将突变进行分类也是

有帮助的，比如该突变意义不明，但该突变所在的基因与已知疾病建立了明确的

关系；比如突变属于偶然性发现（Incidental Findings）。

3、面向临床干预的解读

首先应充分收集患者个体表型数据、家族病史、临床病理和临床治疗的资料，这些信息对鉴定驱动基因、了解发病机制、指导用药和治疗方案、耐药与预后分析具有很大的价值。

其次在进行临床干预解读时应考虑到FDA批准靶向治疗药物及其伴随检测、NCCN指南推荐的治疗方案。对于FDA和NCCN指南未涉及的，可参考文献（包括基于FDA/NCCN和文献编辑的二级数据库），但是要考虑到文献报道的证据强度，比如是什么机构的研究，发表在什么期刊上；要考虑到文献的证据级别比如是临床试验、还是案例报道、还是临床前的研究。具体可参考AMP关于体细胞突变和遗传性突变的证据强度划分的指导意见。

最后还应考虑和制药公司/医疗机构/研究机构的临床试验尽可能对接。

凝结数据分析和临床注释于一张纸的报告可以说并不容易，而且它决定了终端客户的最终体验。临床解读报告应当做到简洁明了、重点突变的原则，体现严谨而缜密的逻辑机构，达到便于阅读、理解和指导临床干预的目的。

基因突变的检测方法

基因突变的检测方法基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据检测目的和实验室条件选择时参考。 PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。Sarkar等认为对于大于200bp的片段，用其RNA分子来做SSCP会提高其录敏度。应用PCR-SSCP检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因，也是检测抑癌基因p53突变最常用的方法，仅检测第5-8外显子即可发现85％以上的p53基因突变。由于该法简便快速，特别适合大样本基因突变研究的筛选工作。异源双链分析法（HA） HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似，所不同的是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA，也只适合于小片段的分析。但HA对一些不能用SSCP 检出的突变有互补作用，两者结合使用，可使突变检出率提高到近100％。

肿瘤基因检测的解读流程

从临床进入基因检测流程是入口，检测结果结合临床信息进行合理解读是出口，这一入一出之间需经历检测前临床咨询部分、实验室部分、信息分析部分、临床解读部分共四个环节。其中的第四部分临床解读部分即是根据检测结果、患者信息、医生共识综合判断，临床和遗传咨询有效衔接、充分沟通，最终出具临床解读报告。在做成临床解读报告之前，首先需要将解读的各个环节进行明确，包括解读的步骤流程，解读的技术细节。这样才有可能真正的做到解读的规范化，使解读过程有据可依，有章可循，才能出具一份好的临床解读报告，基因检测才能更好的服务患者和临床医生。从大的框架讲，基因检测数据解读可分为三个步骤：原始数据→分析数据、基于数据库的解读→与患者个体表征/临床病例结合的解读。1、读懂原始数据将测序的原始序列数据（FASTQ）去除接头及低质量序列，经BWA软件比对至GRCh37/38（NCBI版本）或hg19/hg38（UCSC版本）人类基因组参考序列上，Picard 去除重复序列，使用GATK检测SNV与Indel变异，使用ANNOVAR进行变异注释。最后获得一份.vcf文件（图1）。

Func.refGene：变异所处参考基因的功能区（exonic，intronic，UTR3，UTR5，splicing，upstream，downstream，intergenic）（此处的exonic特指外显子编码氨基酸区，不包括外显子的UTR区） Gene.refGene：变异所处参考基因名称（如果是基因间，则是两侧的基因）GeneDetail.refGene：非外显子区处于特定转录本中的具体位置（如果是基因间，则是距离两侧的基因的距离） ExonicFunc.refGene：外显子区的变异类型（frameshift insertion，frameshiftdeletion，stopgain，stoploss，nonframeshift insertion，nonframeshiftdeletion，synonymous SNV，nonsynonymous SNV），如果这一栏是一个“.”的话，就说明该变异不在外显子区 AAChange.refGene：氨基酸水平的改变（同一个基因可能具有多个转录本，氨基酸改变的位置在不同的转录本中有可能不一样）经注释后的vcf文件还会包含如下信息： CLINSIG：该变异在ClinVar数据库中的临床意义（Benign，Likely benign，Uncertain significance，Likelypathogenic，Pathogenic，Drug-response）CLINDBN：该变异所引起的疾病名称 CLINACC：该变异的登记号和版本号（VariantAccession and Versions）

基因突变的检测方法(完整资料).doc

此文档下载后即可编辑基因突变的检测方法基因突变的检测方法基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据检测目的和实验室条件选择时参考。 PCR-SSCP法PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp 的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过

肿瘤个体化治疗相关基因突变检测试剂技术审查指导原则

肿瘤个体化治疗相关基因突变检测试剂技术审查指导原则本指导原则旨在指导注册申请人对肿瘤个体化治疗相关基因突变检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。本指导原则是针对肿瘤个体化治疗相关基因突变检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要详细阐明理由，并对其科学合理性进行验证，提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。一、范围本指导原则所述肿瘤个体化治疗相关基因突变检测试剂是指利用基于聚合酶链式反应（PCR）方法的核酸检测技术，以肿瘤个体化治疗相关的突变基因为检测目标，对人体样本（包括组织、体液等）提取的核酸组分中的目标序列进行体外检测的试剂。本指导原则所指基因突变的类型包括置换、插入、缺失、基因重排、

拷贝数异常及核糖核酸（RNA）表达异常等广义的基因突变。本指导原则的技术要求是基于荧光探针PCR方法确立的，对于高分辨熔解曲线PCR方法、Luminex平台或核酸检测芯片等其他基于PCR的分子生物学检测技术，可能部分要求不完全适用或本指导原则所述技术指标不够全面，申请人可以根据实际产品特性选择适合的方法或补充需要的评价和验证，但需阐述不适用的理由，并验证其科学合理性，同时确认性能评价的充分性。本指导原则所涉及试剂的方法学不包括荧光原位杂交（Fluorescence in situ Hybridization，FISH）、核酸序列测定、染色体核型分析及免疫组化技术等用于肿瘤个体化治疗指导的其他方法学。本指导原则适用于进行首次注册申报和相关许可事项变更的产品。二、注册申报资料要求（一）综述资料综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、研究结果的总结评价以及同类产品上市情况介绍等内容，其中同类产品上市情况介绍部分应着重从方法学及不同基因突变类型检出能力等方面写明拟申报产品与目前市场上已获批准的同类产品之间的主要区别。若尚无同品种批准上市，则应详细论述作为检测靶标的突变基因与个体化治疗方案的相关性，说明理论依据。提交的资料应符合《体外诊断试剂注册管理办法（试行）》（国食药监械〔2007〕229号）（以下简称《办法》）和《体外诊断试剂注册申报资料基本要求》（国食药监械〔2007〕609号）的相关要求。（二）产品说明书说明书承载了产品预期用途、标本采集及处理、实验方法、检测结果解释以及注意事项等重要信息，是指导实验室工作人员正确操作、临床医生针对检验结果给出合理医学解释的重要依据，因此，产品说明书

干细胞的突变与肿瘤

干细胞的突变与肿瘤干细胞是一类具有自我更新和增殖分化能力的细胞，肿瘤干细胞是存在于肿瘤组织中的一小部分具有干细胞性质的细胞群体，能够驱使肿瘤的形成。不同的是，干细胞的增殖具有相对稳定性，其数目保持相对恒定，而肿瘤细胞虽可以无限增殖，但却失去了自稳定性的特点。其机制可能是由于干细胞基因突变及突变累积、非整倍体扩增、不对称分裂、端粒酶作用以及信号转导途径和微环境异常导致干细胞增殖分化机制失调1。早期的研究表明，单一细胞获得4~7次基因突变将发生恶性转化2。组织更新快的上皮组织、造血系统是肿瘤高发部位，组织自我更新越快，复制、转录过程中基因发生突变的概率越高。由于干细胞具有无限增生能力，在体内可长期存在，这使基因突变更容易在干细胞中发生和积累。已有报道指出某些结肠癌和白血病产生于积累了多次突变的干细胞3, 4。结直肠上皮所有的细胞来源于隐窝底部4~6个干细胞，干细胞不断向表面增生，干细胞增生形成分化细胞的数量和分化细胞死亡或脱落的数量维持平衡。用放射线诱导突变人类肠隐窝细胞发生表型变化大约需1年时间，分化细胞仅有2天的寿命，而1年正好是单一突变的干细胞增生形成肿瘤的时间。越来越多的证据表明，肿瘤产生于积累了多次突变的组织特异性干细胞或骨髓衍生的间充质干细胞（MSC）的恶性转化5-7。如果人体内存在积累了多次突变或恶性转化的干细胞8，它们是可能通过遗传传递给后代的,这也许是存在高癌发病家族的一种可能的原因和解释9。最近，Nat Cell Biol发表的1篇文章阐述了老化过程中积累的基因组损伤对干细胞功能的影响10。干细胞和体细胞中年龄依赖的DNA损伤积累可能是老化的干细胞功能障碍的原因。干细胞具有长期的自我更新能力，然而这种能力同

肿瘤基因检测的解读流程

从临床进入基因检测流程是入口,检测结果结合临床信息进行合理解读是出口，这一入一出之间需经历检测前临床咨询部分、实验室部分、信息分析部分、临床解读部分共四个环节。其中的策四部分临床解读部分即是根据检测结果、患者信息、医生共识综合判断，临床和遗传咨询有效衔接、充分沟通，最终出具临床解读报告。在做成临床解读报告之前，首先需要将解读的各个环节进行明确，包括解读的步骤流程，解读的技术细节。这样才有可能真正的做到解读的规范化，使解读过程有据可依，有章可循，才能出具一份好的临床解读报告，基因检测才能更好的服务患者和临床医生。从大的框架讲，基因检测数据解读可分为三个步骤：原始数据T分析数据、基于数据库的解读-与患者个体表征/临床病例结合的解读。 1、读懂原始数据将测序的原始序列数据（FASTQ ）去除接头及低质量序列，经BWA软件比对至GRCh37/38 （NCBI 版本）或hgl9/hg38 （UCSC版本）人类基因组参考序列上;Picard去除重复序列使用GATK 检测SNV与Indel变异使用ANNOVAR 进行变异注释。最后获得一份.vcf文件（图1）。

Ph?*e 1 ： primary processing R*w (FQW) 图1从测序的原始序列数据到vcf文件的流程—份vcf文件包含如下基本信息。 CI LT Start End Ref Alt Func. re fGenc Gene, re fGcno GeneDotail. refGone ExonicFunc. / efGeno ofGone Chr:变异所在的染色体 Start :变异在染色体上的起始位置 End :变异在染色体上的结束位置 Ref :参考基因组的序列 Alt:检测样本基因组的序列 Func.refGene :变异所处参考基因的功能区（exonic Jntronic ,UTR3 ,UTR5 , splicing , upstream , downstream , intergenic ）（此处的exonic 特扌旨夕卜显子编码氨基酸区，不包括外显子的UTR区） Phas? 2: variant detection Phase 3: variant annotation

肿瘤基因突变检测

肿瘤基因突变检测癌症是一类难以预防的疾病，中晚期癌症治愈的可能性又很小，而早期癌症的治愈率可达65%以上，有些肿瘤可达90%以上，因此，战胜癌症的关键是早期发现癌症。由于癌症早期常无特殊症状，甚至毫无症状，故癌症的早期发现、早期诊断主要是通过定期健康体检和人群筛查完成。目前筛查癌症的方法主要是通过化验血肿瘤指标及B超、CT、MRI、PET-CT 等检查，但这些方法的敏感性和特异性均不高，发现有异常时往往已是中晚期。 17种常见高发肿瘤，包括乳腺癌（breast cancer）、结肠癌（colorectalcancer）、子宫癌（endometrial cancer）、脑胶质瘤（glioma）、白血病（leukemia）、肺癌（lungcancer）、淋巴癌（lymphoma）、成神经管细胞瘤（medulloblastoma）、黑色素癌(melanoma)、间皮瘤(mesothelioma) 、多性骨髓瘤(multiple myeloma) 、卵巢癌(ovarian cancer)、胰腺癌(pancreatic cancer) 、真性红细胞增多(polycythemia vera) 、前列腺癌(prostatecancer) 、肾细胞癌(renal cell cancer)和恶性内瘤(sarcoma)，其发病机制涉及与多种肿瘤发生共同相关的肿瘤易感基因群介导的分子改变，参与了肿瘤发生的早期分子事件。系统寻找和探讨它们在肿瘤发生发展过程中的遗传学变异，对阐明肿瘤早期发生机制及寻找肿瘤早期预警、早期诊断和早期治疗的分子靶标都具有重要的现实意义。利用高通量分子测序技术平台，可同时开展多个肿瘤基因突变检测项目，如EGFR、K-RAS 、N-RAS、B-RAF、PI3K 、p53、p16、BRCA1、

基因突变的检测方法

基因组不稳定与肿瘤

基因组不稳定与肿瘤细胞有丝分裂时染色体分离错误导致子细胞中整条染色体非整倍体突变，或者DNA损伤引起染色体结构改变，造成的基因易位、缺失、反转、断裂等统称为基因组不稳定（genomic instability ）1, 2。染色体不稳定导致某些基因的拷贝数增加或者缺失，改变细胞的命运。有丝分裂检控点缺陷、中心体复制或者姐妹染色单体分裂错误等是染色体非整倍体突变形成的主要原因。整条染色体的不稳定性可能导致原癌基因的拷贝数增加、肿瘤抑制基因的缺失，使得细胞更容易适应周围环境的改变，最终形成肿瘤细胞3-7。细胞代谢异常或者外界因素如紫外照射等造成DNA损伤，当DNA 损伤应答和修复机制受损或缺陷时，会导致某些基因的突变或失活，进而导致细胞死亡或者成为肿瘤细胞[8-9]。事实上所有肿瘤细胞都伴随基因组不稳定，比如2/3的人类肿瘤在细胞分裂过程中获得额外的或者丢失整条染色体[1]。肿瘤中染色体分离相关基因极少发生突变，此种突变主要与原癌基因诱导的有丝分裂相关[10]。原癌基因的激活与抑癌基因的失活直接或间接的影响了有丝分裂并调控了染色体的分离。如人类肿瘤通常高表达Ras，导致中心体复制，在有丝分裂后期形成多极纺锤体，染色体错误分配形成微核或双核细胞[11]。同样CDK4、Ras下游原癌基因、B-Raf异常表达都会导致基因组不稳定[12-14]。而肿瘤抑制基因Rb和P53的突变也通过影响中心体、染色体、纺锤体等导致有丝分裂异常[15-16]。DNA损伤修复相关功能或者DNA损伤应答机制缺陷会造成染色体结构改变。如DNA损伤应答信号通路中的激酶ATM和CHK2功能缺陷会导致DNA损伤修复的缺失[2]。目前以基因组不稳定为切入点治疗肿瘤也取得了一定进展。高水平的染色体

RAS基因突变与恶性肿瘤靶向药物的选择

上海佳辰投资发展有限公司https://www.360docs.net/doc/e812849694.html, Ras基因突变与恶性肿瘤靶向药物的选择研究表明约30%的人类恶性肿瘤与Ras基因突变有关。在细胞的讯息传递路径上，Ras主要为活化控制基因转录的激酶，从而调节细胞的增生与分化，其与肿瘤细胞的生存，增值，迁移，扩散，血管生成均有关系。作为Ras抑制剂，安卓健在靶向治疗药物中优势明显。 2008年6月在美国临床肿瘤学会(ASCO)年会上发布了临床研究结果，即Ras 突变型患者并不能从抗EGFR治疗中获益,反而徒增不良反应危险和治疗费用；而Ras野生型患者就很有可能从这类药物治疗中获益。 2008年，Ras基因突变检测被写入第3版《美国国立癌症综合网络(NCCN)结直肠癌临床实践指南》。该指南明确指出两点,一是所有转移性结直肠癌患者都应检测Ras基因状态,二是只有Ras野生型患者才建议接受EGFR抑制剂治疗，如爱必妥（西妥昔单抗）和维克替比（帕尼单抗）。 2009年《NCCN非小细胞肺癌临床实践指南》明确指出：当Ras基因如果发生了突变，则不建议病人使用特罗凯（厄洛替尼）进行分子靶向治疗。欧洲药监局和美国FDA明确规定了在使用靶向药物爱必妥和维克替比治疗转移性大肠癌前必须检测Ras基因。 2011年，NCCN提出肿瘤患者接受EGFR靶向药物治疗之前，必须进行Ras 基因突变检测，根据检测结果决定是否使用EGFR靶向药物作为临床治疗措施。新的指南规定，只有肿瘤有野生型（正常）Ras基因的患者，才能接受表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂治疗。 ASCO中最新的临床数据表明，如果Ras基因突变，患者无法从多吉美（索拉非尼）靶向治疗中受益。如果RAS基因突变，安卓健是目前全球被证明唯一有效的RAS抑制剂药物，目前该药物已经完成了一期临床，其有效性和安全性得到了肯定。根据NCCN，Ras突变是肿瘤形成的早期事件，因此原发肿瘤和转移癌突变状态有很强相关性。由于这个原因，取原发肿瘤或者转移癌做Ras基因型检测都可以，不必一定采新鲜的活检标本。上海佳辰投资发展有限公司https://www.360docs.net/doc/e812849694.html,

ras基因突变与肿瘤的关系

第41卷　第4期 2005年12月青岛大学医学院学报 ACTA ACADEMIA E MEDICINA E QIN GDAO UNIV ERSITA TIS Vol.41,No.4December 2005 [收稿日期]2005207209;　[修订日期]2005208212[作者简介]顾华丽(19732),女,硕士,主治医师。 ras 基因突变与肿瘤的关系顾华丽1,田字彬2 (青岛大学医学院附属医院,山东青岛　266003　1　急诊内科;　2　消化内科) 现认为人类肿瘤的发生是由于控制正常细胞增殖、分化和凋亡的多个基因突变的结果。这其中ras 基因突变引起的关注较高,从1982年Weinberg 和Barbacid 首先从人膀胱癌细胞中克隆出活化的癌基因C 2Ha 2ras 以来,由于它与人类恶性肿瘤的相关性,人们对其基因、蛋白及其参与的信号转导通路进行了广泛深入的研究,针对Ras 蛋白的肿瘤靶向治疗目前也成为肿瘤治疗学的研究热点。 1　ras 基因的发现 ras 基因首先在Harvery 鼠肉瘤病毒(Ha 2MSV )和Kirsten 鼠肉瘤病毒(Ki 2MSV )的子代基因中被发现,在这种子代病毒中发现含有来源于宿主细胞的基因组的新基因序列[1],此后人们将这种宿主细胞基因称为ras 基因。1982年 Weinberg 和Barbacid 首先从人膀胱癌细胞系中分离出一种转化基因,可使N IH3T3细胞发生恶性转化,而从正常人组织中提取的DNA 则无此种作用。随后,Santos 与Parada 发现上述转化基因并非新型基因,而是Harvery 鼠肉瘤病毒 ras 基因的人类同源基因,命名为H 2ras 。同年,Krontiris 在人肺癌细胞中发现Kirsten 鼠肉瘤病毒基因的同系物,称为 K 2ras 。另一种相似的基因是在人神经母细胞瘤DNA 感染N IH3T3细胞时发现的与ras 类似的基因,称为N 2ras [2],此种基因和病毒无关。 2　ras 基因的结构 ras 基因在进化中相当保守,广泛存在于目前研究的各种真核生物如哺乳类、果蝇、真菌、线虫及酵母中,提示它有重要的生理功能。哺乳动物的ras 基因家族有三个成员,分别是H 2ras 、K 2ras 、N 2ras ,其中K 2ras 的第四个外显子有A 、 B 两种变异体[3]。各种ras 基因具有相似的结构,均由四个外显子组成,分布于全长约30kb 的DNA 上。它们的编码产物为相对分子质量2.1万的蛋白质,故称为P21蛋白[4]。目前已证明,H 2ras 位于人类11号染色体短臂上 (11p15.1～p15.3),K 2ras 位于12号染色体短臂上(12p1.1～pter ),N 2ras 位于1号染色体短臂上(1p22～p32),除了K 2ras 第四个外显子有变异外,每个ras 基因编码P21的序列都平均分配在四个外显子上,而内含子的序列及大小相差很大,因而整个基因也相差很大,如人K 2ras 有 35kb 长,而N 2ras 长为3kb 。由于有两个第四号外显子,K 2ras 可以两种方式剪接,但编码K 2ras 2B 的mRNA 含量高。除K 2ras 2B 含有188个氨基酸外,其他两种Ras 蛋白均含有 189个氨基酸。 3　R as 蛋白的结构和功能3.1　Ras 蛋白的结构 Ras 蛋白为膜结合型的GTP/G DP 结合蛋白,相对分子质量为2.1万,定位于细胞膜内侧。它由188或189个氨基酸组成,它的第一个结构域为含有85个氨基酸残基的高度保守序列,接下来含有80个氨基酸残基的结构域中,Ras 蛋白结构轻微不同,除了K 2Ras 末端25个氨基酸由于不同的外显子而分为A 型和B 型外,其余Ras 家族成员最后四个氨基酸均为Cys1862A 2A 2X 2COO H 序列。Ras 蛋白存在4种异构型:H 2Ras 、N 2Ras 、K 2Ras4A 和K 2Ras4B ,它们是3种基因的产物,其中K 2Ras4A 和K 2Ras4B 是同一基因不同剪接的结果。 3.2　Ras 蛋白的功能 Ras (P21)蛋白位于细胞膜内侧,它在传递细胞生长分化信号方面起重要作用。它属于三磷酸鸟苷(GTP )结合蛋白(一种细胞信息传递的耦联因子),通过GTP 与二磷酸鸟苷(G DP )的相互转化来调节信息的传递。P21与GTP 和 G DP 有很强的亲和性,而且有较弱的GTP 酶活性。正常情况下P21和G DP 结合并没有活性,当细胞外的生长分化因子把信号传导到胞膜内侧的P21时,可增强P21与GTP 结合活性,使P21和GTP 结合成为激活状态,信号系统开放。因为P21有GTP 酶活性,可使GTP 水解成G DP ,P21和 G DP 结合后P21失活,信号系统关闭。正常情况下P21的GTP 酶活性很弱,当和GTP 酶激活蛋白(GA P )结合后其水解速度可提高1万倍而使P21失活。P21和G DP 结合后可以激活鸟苷酸释放蛋白(GNRP ),GNRP 使P21释放G DP 结合GTP ,因此通过GTP 和G DP 的相互转化可以有节制地调节P21对信号系统的开启和关闭,完成生长分化信号传入细胞内的过程。 Ras 蛋白在合成后,需要经过两种方式翻译后修饰,才可定位于细胞膜内侧[5]。①通过FTase 在Ras 蛋白羧基端的CAAX 四肽结构中的Cys 残基上加上一个类异戊二烯基团法尼基,随后AAX 残基从C 端上断裂脱落,法尼基化Cys 发生羧甲基化,此修饰使Ras C 端具有疏水性;②N 2或H 2 ras 的半胱氨酸的S 2酰基化,长链的S 2酰基取代基使ras 具有疏水性。有研究表明,激活ras 的表达能增强血管生长因子(例如V EGF/VPF )的表达,提示Ras 蛋白在血管生成中发挥作用,抑制Ras 蛋白活性能抑制依赖Ras 蛋白的肿瘤细

不同类型肿瘤的基因组研究综述

不同类型肿瘤的基因组研究 [摘要]肿瘤的发病率和死亡率逐年递增，与心血管疾病一同成为造成人群死亡的主要原因。DNA序列的变异是所有肿瘤细胞发生的重要的分子层面原因。多基因的发生低频率改变可能逐渐聚集导致肿瘤发生，但是要发现这些低频变异位点需要大规模样本进行全基因组检测，全基因组关联研究可以帮助我们实现这个目标。肿瘤基因组研究工作目前发现了许多肿瘤的致癌基因。本文将主要阐述肺癌、肝癌、乳腺癌的基因组研究。关键词：肿瘤、全基因组关联研究、肿瘤基因组 1.全基因组关联研究全基因组关联研究（genome-wideassociation studies,GWAS）是以微阵列技术为基础，通过对大规模的群体DNA样本进行全基因组高密度遗传标记分型，寻找与复杂疾病相关的遗传因素的研究方法。目前，GWAS研究已经在100多种肿瘤中发现了上千个低频变异位点[1]。单核苷酸多态性GWAS（single-nucleotide polymorphisms GWAS,SNP-GWAS)和少量的拷贝数变异GWAS（copy number variation GWAS,CNV-GWAS）是现阶段GWAS研究的主要方向。大量研究发现SNP在肿瘤的发生中扮演重要的角色。大量研究发现SNP在肿瘤的发生中扮演重要的角色。SNP即在不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷酸序列一致，而只有一个碱基不同的现象。SNP是人类基因组DNA 序列中最常见的变异形式。在数以百万计的SNP中，对肿瘤发生和药物治疗有重大影响的SNP只占很小一部分。从整个基因组SNP，到导致氨基酸编码改变或基因表达调控改变的SNP，最后到导致蛋白质活力改变的SNP，数目都在迅速递减。联合SNPs和肿瘤表型的研究，可以为肿瘤预测、诊断和药物敏感性分析提供精确的遗传标志。拷贝数变异（copy number variation，CNV）：指在人类基因组中广泛存在的，从1000bp到数百万bp范围内的缺失、插入、重复和复杂多位点变异。拷贝数变异是染色体结构性差异的一种形式。CNV通过改变基因的份数影响表达程度，打乱基因编码区结构，改变基因调控序列的位置或长度，暴露隐形突变等方式影响个体表型[2]。 2.不同类型肿瘤基因组研究

恶性髓系血液肿瘤基因突变检查临床意义-陆道培血液肿瘤中心血液科主任童春容

恶性髓系肿瘤基因突变检查的临床意义陆道培血液?肿瘤中心童春容对恶性血液病的诊断与分型，目前专家的共识是应采用MICM的整合诊断方法，也就是联合形态学、免疫学、染色体、基因分析来诊断与分型，以达到更全面准确的诊断、指导精确治疗的目的。我中心既往已经可以筛查100多种急性白血病的融合基因，并能检测一些恶性血液病的突变基因，基因突变包括基因丢失、新基因插入或被替代等。既往的研究显示，40%多的急性白血病有白血病特异的融合基因。恶性血液病是多种基因异常或突变的结果，我中心最近成功采用基因测序方法筛查数十种基因突变，与既往的方法比较，可以检测以上基因的全部突变位点，提高了基因突变的检出率。如NPM1有40多种突变位点，既往的方法只能检测其中最常见的10种突变位点，而目前的方法可检测几乎NPM1的全部突变位点。基因突变的筛查有以下临床意义。一帮助诊断恶性血液病一些恶性血液病，尤其是骨髓增殖性肿瘤(MPN)、骨髓增生异常综合征(MDS)、MDS/MPN综合征等，没有特异性的免疫学、染色体或融合基因异常，在早期时主要表现为血液细胞轻度升高或降低，难以与再生障碍性贫血、类白血病反应等良性疾病鉴别。既往诊断主要靠排除多种疾病，并需要较长时间的观察才能诊断。几乎所有恶性血液肿瘤都能检查到某种或多种基因突变，因此当具有髓系恶性肿瘤的临床表现及一些实验室特征时，相关基因突变阳性对这些疾病的诊断有重要意义，基因突变检查可明显提高恶性血液肿瘤的准确率及速度。还有一些髓外恶性血液病，由于组织标本少，其它方法难以有足够标本诊断；或治疗获得完全缓解后来到我院，怀疑既往的诊断。因此我们发展了用骨髓/血涂片、组织切片等少量标本做几十种基因突变检查的方法，对于这些患者可以用治疗前做其它检查留存的标本（骨髓涂片、血液涂片、组织切片等）来检测恶性血液病的基因突变，从而帮助进一步确定恶性血液病的诊断及预后，并帮助治疗选择。 1JAK2（包括V617F和Exon12）基因突变在髓系恶性肿瘤诊断中的价值JAK2基因突变可见于多种MPN及其它恶性血液病。JAK2 V617F突变见于约95%的真性红细胞增多症（PV）, JAK2 Exon12突变见于2-5%的PV，实际上全部的PV 患者都有JAK2的激活性突变。JAK2 V617F突变见于50-60%的原发性血小板增多症(ET)或原发性骨髓纤维化（PMF），50-80%的伴铁粒幼红细胞及血小板增多的难治性贫血（RARS-T）有JAK2 V617F突变。但是其它一些恶性血液病也可伴 JAK2 V617F基因突变，如见于8%的慢性粒单核细胞白血病，还可偶见于少数急性髓性白血病（AML）、MDS、慢性髓性白血

基因突变的检测方法

基因突变的检测方法基因突变的检测方法基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据检测目的和实验室条件选择时参考。 PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。Sarkar等认为对于大于200bp的片段，用其RNA分子来做SSCP会提高其录敏度。应用PCR-SSCP检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因，也是检测抑癌基因p53突变最常用的方法，仅检测第5-8外显子即可发现85％以上的p53基因突变。由于该法简便快速，特别适合大样本基因突变研究的筛选工作。异源双链分析法（HA） HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似，所不同的是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA，也只适合于小片段的分析。但HA对一些不能用SSCP 检出的突变有互补作用，两者结合使用，可使突变检出率提高到近100％。突变体富集PCR法（mutant-enriched PCR）本法的基本原理是利用ras基因家族某个密码子部位存在已知的限制性内切酶位点，如K-ras基因第12密码子的BstNI位点，第13密古巴子有BgⅠⅡ位点。用链续二次的巢式PCR来扩增包括K-ras第12、13密码子的DNA片段，在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA片段，野生型因被酶切而不能进入第二次PCR扩增，而突变型则能完整进入第二次PCR扩增并得到产物的富集。变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradinent electrophoresis,DGGE） DGGE法分析PCR 产物，如果突变发生在最先解链的DNA区域，检出率可达100％，检测片段可达1kb，最适

肺癌相关的基因突变

不可否认美国的科研技术较为发达，尤其是恶性肿瘤的研究，更是在我国的前列。肺癌是目前威胁我国人民健康的第一大恶性肿瘤疾病，根据《2012中国肿瘤登记年报》中显示，目前肺癌高居我国恶性肿瘤发病率和死亡率的第一位。目前我国也在不断的研究，但是根据美国的一项调查研究发现，发现不吸烟的肺癌患者比吸烟者更可能携带两种特殊遗传突变中的一种。下面就具体的看下：表皮生长因子受体（EGFR）基因突变主要发生在腺癌中。腺癌是吸烟和非吸烟人中最常见的肺癌类型。这些突变能够增加病人对靶向EGFR基因的药物吉非替尼和厄洛替尼的敏感性。美国德克萨斯大学西南医学中心的Gazdar博士和同事分析了来自519名病人的初级肿瘤组织样品。研究人员还同事分析了来自一些病人的分恶性肺脏组织的DNA突变以及其他单独的癌组织。根据研究发现，其中EGFR基因的突变在不吸烟的肺癌患者中更常见。同时还发现这种突变在腺癌中比其他类型的肺癌（如鳞癌，大细胞癌）中更常见，而且妇女患者携带这种突变的可能性比男性高。但是一些研究人员在8％的肺癌中发现了EGFR信号通路中的一种基因KRAS的突变，但是在携带EGFR突变的癌症中没有发现这种基因的突变。也就是意味着这两种基因可能很少存在同时突变的。这种突变在男性、白种人和吸烟者中更常见。因此，这些数据表明可能存在两种截然不同的与肺癌形成有关的分子途径。吸烟者的癌症形成途径可能与KRAS基因突变有关，而不吸烟的人的致癌途径则与EGFR基因突变有关。然而KRAS基因突变也是目前一些患者出现耐药的一个原因。如一些患者出现吉非替尼和厄洛替尼的耐药，研究人员也发现存在KRAS基因突变。目前来说，针对KRAS基因突变治疗的药物是没有的，但是存在一些在研的抗癌新药如AZD6244，安卓健㈢等等。感兴趣的患者可以去关注。

(完整版)肺癌基因突变分子靶向治疗

NCCN 2018第2期第NSCL-H页载文如下： NCCN Guidelines Version 2.2018 Non-Small Cell Lung Cancer NSCL-H EMERGING TARGETED AGENTS FOR PATIENTS WITH GENETIC ALTERATIONS 译为中文即：基因改变患者的靶向性药物 1Ou SH, Kwak EL, Siwak-Tapp C, et al. Activity of crizotinib (PF02341066), a dual mesenchymal-epithelial transition (MET) and anaplastic lymphoma kinase (ALK) inhibitor, in a non-small cell lung cancer patient with de novo MET amplification. J Thorac Oncol 2011;6:942-946. 2Camidge RD, Ou S-HI, Shapiro G, et al. Efficacy and safety of crizotinib in patients with advanced c-MET-amplified non-small cell lung cancer. J Clin Oncol 2014;32(Suppl 5): Abstract 8001. 3Frampton GM, Ali SM, Rosenzweig M, et al. Activation of MET via diverse exon 14 splicing alterations occurs in multiple tumor types and confers clinical sensitivity to MET inhibitors. Cancer Discov 2015;5:850-859.

1_肿瘤相关突变基因检测试剂(高通量测序法)性能评价通用注册技术审查指导原则

附件1 肿瘤相关突变基因检测试剂（高通量测序法）性能评价通用注册技术审查指导原则本指导原则旨在指导注册申请人对肿瘤相关基因检测试剂分析性能评价注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。本指导原则是针对肿瘤相关基因检测试剂分析性能评价的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要详细阐明理由，并对其科学合理性进行验证，提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。一、适用范围本指导原则所述肿瘤相关基因检测试剂分析性能评价主要是指基于高通量测序（high-throughput sequencing）即下一代测 —1 —

序（next generation sequencing，NGS），又称为大规模平行测序（massively parallel sequencing，MPS），体外检测人体组织肿瘤细胞中的肿瘤相关基因变异。用于检测体细胞突变的NGS正在广泛用于肿瘤诊疗相关的分子检测，包括对特定基因的DNA/RNA进行测序，以寻找与肿瘤临床诊疗相关的基因变异。肿瘤基因突变类型包括点突变、插入、缺失、基因重排、拷贝数异常等广义的基因突变。基于NGS测序原理的体外诊断（In Vitro Diagnosis，IVD）检测可能包括以下步骤：样本收集、处理和保存、核酸提取及处理、文库制备、测序和碱基识别、序列比对、变异识别和过滤、变异注释和解读以及检测报告的生成。同时，某些产品还可能会包括软件部分，但上述相关步骤并不一定被全部包括，应根据产品的具体设计流程来进行判断。对于每个检测步骤，申请人需要结合产品设计和临床意义来建立特定的可接受的质量评价指标和合格判断标准。此外，为满足产品特定预期用途，申请人需通过科学和适当的检测性能研究来确定适用的试剂、消耗品、仪器和软件。基于上述考虑因素，NGS检测产品的设计和工作流程中的任何差异均可能导致结果的不同，因此申请人需要清楚地描述相关检测性能指标。分析性能评价的初衷在于提出产品性能有效性、安全性相关问题的假设，然后通过研究进行确认。NGS在测序通量及发现未知基因变异方面具有优势，但是在NGS技术应用需求及使用中存在包括相关临床样本收集处理、NGS检测内容、测序流程、—2 —