荧光共振能量转移动态检测蛋白质相互作用的研究进展
＊［基金项目］国家自然科学基金资助项目（３０９７１０８１；３０８７０９３２；
８１０７０９６１）；山东省自然科学基金资助项目（Ｎｏ．
ＺＲ２０１１ＣＭ０２７；ＺＲ２００９ＤＺ００４）；山东省泰山学者专
项基金
△［通信作者］陈京，Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｉｎｇｃｈｅｎ＠ｗａｒｗｉｃｋ．ａｃ．ｕｋＪ Ｊｉｎｉｎｇ Ｍｅｄ Ｕｎｉｖ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１２，Ｖｏｌ．３５，Ｎｏ．１
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－９７６０．２０１２．０１．０２０·综述·荧光共振能量转移动态检测蛋白质相互作用的研究进展
王 宏１ 蔡 欣１ 白 波２ 陈 京２Δ
（１泰山医学院基础医学院，山东泰安２７１０１６；２济宁医学院神经生物学研究所，山东济宁２７２０６７）
摘 要 荧光共振能量转移（ＦＲＥＴ）技术是近１０年来出现的一种新的检测蛋白质－蛋白质相互作用的技术。它的最大优势是能从“时间、空间、动态、连续”对活细胞中蛋白质之间的相互作用进行检测，该技术不但可以与其他技术结合来研究细胞膜上蛋白质之间的相互作用；而且还可用于分析细胞膜－细胞质－细胞核中所发生的信号转导途径。资料显示，ＦＲＥＴ技术所发挥作用是最近出现的几种技术所无法企及的，这对于疾病发病机制的研究及新的药物靶点的发现具有深远意义。
关键词 荧光共振能量转移；蛋白质－蛋白质相互作用；信号转导
中图分类号：Ｑ２７４ 文献标识码：Ａ 文章编号：１０００－９７６０（２０１２）０２－０６０－０４
机体细胞中种类繁多的蛋白质各具不同的生理功能，从而使细胞对胞外信号做出不同的生物学反应。蛋白质的功能作用经常受不同条件下与不同配体间相互作用的调节。蛋白质之间的相互作用能够整合来自不同信号通路的信号并协调细胞内部的调节机制［１］。因此，研究蛋白质之间相互作用能够给这些研究提供新的见解。在过去的２０年中，已经开发了很多用于探测蛋白质相互作用的技术和方法，这些技术一般分为两部分，１）体外方法，例如免疫共沉淀、ｆａｒ－ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ、ＧＳＴ融合蛋白沉降技术等；２）体内方法，例如酵母双杂交系统，但是这些方法都具有一定的局限性。一方面，基于机械的、离心力高的或去垢剂的细胞裂解，上述方法都可能会改变蛋白质－蛋白质相互作用的自然状态；另一方面，上述技术无法提供活细胞内的特定蛋白间相互作用的时空信息［２］。近年来研究开发的荧光共振能量转移（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎ－ｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ，ＦＲＥＴ）却能克服以上缺点，可以在活细胞中实时动态观测蛋白质之间的相互作用。更重要的是，ＦＲＥＴ还可以与其他技术结合［３］，如生物发光共振能量转移（ＢＲＥＴ）、蛋白互补技术（ＰＣＡｓ）等，既能研究两个蛋白之间的相互作用，还能用来研究３个或更多蛋白之间的相互作用，甚至是对信号网络的研究。本文就ＦＲＥＴ、ＦＲＥＴ与其他一些技术的结合及其应用做一简要综述。１ 荧光共振能量转移（ＦＲＥＴ）技术的原理
ＦＲＥＴ理论描述的是两个荧光团之间的能量转移（图１）。在能量传输过程中，其中的一个荧光团作为能量供体（Ｄ），另一荧光团作为能量受体（Ａ）。以适当的激发光照射Ｄ，将会产生振荡偶极子，如果Ｄ的基态和Ａ的第一激发态的振动能量差相当，或者Ｄ的发射光谱与Ａ的吸收光谱能有效重叠时，当Ｄ与Ａ靠近时，或者说Ｄ与Ａ的偶极子之间的距离足够近时即能产生共振，通过偶极－偶极耦合作用将能量从Ｄ向Ａ转移，即发生非放射能量共振转移；Ａ接受能量从而发射出特异性荧光。在此共振能量转移过程当中，Ｄ特异性荧光的衰减或者Ａ特异性荧光的增强即可被检测到，从而实现ＦＲＥＴ检测［４］。
ＦＲＥＴ中两个常用的荧光蛋白为青色荧光蛋白（ｃｙａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＦＰ）和黄色荧光蛋白（ｙｅｌｌｏｗ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＹＦＰ）。ＦＲＥＴ具有广泛的应用前景，在蛋白质、ＤＮＡ等复合物的研究方面发挥重要作用。Ｋｈａｎ等［５］用ＦＲＥＴ检测出溶血磷脂胆碱能够通过迅速磷酸化和内化来快速激活Ｇ２Ａ，Ｇ２Ａ的活化能促使Ｇαｉ－１和Ｇαｑ／１１和Ｇβγ的释放，Ｇαｉ－１和Ｇαｑ／１１会使胞质内的Ｃａ２＋浓度升高及Ｇ２Ａ的激活促使ＧＲＫ６和β－ａｒ－ｒｅｓｔｉｎ的循环利用；而Ｇβγ能够与激活的Ｈｃｋ相互作用。Ｋａｚｕｔｏｓｈｉ Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ等［６］构建了一对融合的锌指结构蛋白，它们是一种具有Ｎ端二聚化序列和Ｃ端ＧＦＰ突变体的荧光传感蛋白。他们分别在锌指结构的末端标记ＧＦＰ的突变体ＣＦＰ和ＹＦＰ，将这一对锌指结构蛋白混合，并且加入特异
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性的双链ＤＮＡ，作者观察到了ＦＲＥＴ现象。随后加入非特异性的双链ＤＮＡ，没有观察到ＦＲＥＴ明显的改变，这表明了特异性的双链ＤＮＡ发生了二聚化作用
。
图１ ＦＲＥＴ的基本原理
Ａ．ＣＦＰ（供体）和ＹＦＰ（受体）的吸收和发射光谱。ＣＦＰ发射光谱区域与ＹＦＰ吸收光谱区域重叠处引起有效的ＦＲＥＴ信号； Ｂ．ＦＲＥＴ的原理示意图。
２ ＦＲＥＴ技术与其他一些技术的结合及应用２．１ 连续共振能量转移
ＦＲＥＴ涉及不同发射光谱的两个荧光蛋白的能量转移，而ＢＲＥＴ是非辐射的生物发光能量转移到一个荧光蛋白上。ＦＲＥＴ、ＢＲＥＴ已经广泛用于检测活细胞中结构蛋白和动态蛋白的相互作用，这两种技术的自由组合，即ＦＲＥＴ－ＢＲＥＴ［７］、ＢＲＥＴ－ＢＲＥＴ、ＦＲＥＴ－ＦＲＥＴ以及３－ＦＲＥＴ（统称ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ，ＳＲＥＴ）等所发挥的作用是最近出现的几种技术单独应用所无法企及的，这些测定法可以测定相互作用的蛋白在亚细胞定位中的作用、实时观测影响多个蛋白复合体的动态事件等，这些方法可以被用来研究活细胞中一系列蛋白质复合体的组装和功能。２．１．１ 高阶寡聚体 利用这两类技术的特性将这两种能量转移技术结合起来可以实时检测活细胞中多个蛋白质之间的相互作用（图２）。目前，已经用ＳＲＥＴ技术实时检测到Ａ２ＡＲ－Ｄ２Ｒ－ＣＢ１Ｒ寡聚体［８］和α１ｂ肾上腺素寡聚体［９］。这些寡聚体的研究是非常重要的，他们拥有独特的结构和信号通路从而改变了原受体蛋白的功能，例如如果对α１ｂ肾上腺素寡聚体进行突变可以发现细胞的迁移和功能有重大变化，另外，这些寡聚体的独特性为新型药物开发也开启了新的天地
。图２ ３－ＦＲＥＴ技术结合的作用原理
２．１．２ 信号转导 Ｇ蛋白偶联受体（Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＧＰＣＲｓ）的信号转导日益复杂化，这些事件的基础是ＧＰＣＲｓ和相关靶分子（例如Ｇ蛋白偶联受体激酶和β－ａｒｒｅｓｔｉｎ）之间存在着蛋白质相互作用。应用ＢＲＥＴ与ＦＲＥＴ联合应用的方法能够检测这些蛋白质之间的相互作用从而有助于揭示ＧＰＣＲｓ的脱敏，内化，运输，合成和再循环等整个信号转导过程。例如ＢＲＥＴ４００
－ＧＦＰ－ＦＲＥＴＧＦＰ－ＹＦＰ和ＢＲＥＴ４８０－ＹＦＰ－ＦＲＥＴＧＦＰ－ＹＦＰ，ＢＲＥＴ４００－ＧＦＰ
涉及腔肠素的氧化和能量转移到ｕｖＧＦＰ（ＵＶ－ｅｘ－ｃｉｔｅｄ ｇｒｅｅｎ ＦＰ），ＢＲＥＴ４８０－ＹＦＰ涉及腔肠素的氧化和能量转移到ｅＹＦＰ，而ｕｖＧＦＰ和ｅＹＦＰ又是ＦＲＥＴ中的完美搭档，由此可见细胞中３个不同蛋白之间可能存在的相互作用也可以被实时动态检测，因此，如果将３者结合起来，即ＢＲＥＴ４８０
－ＹＦＰ－ＢＲＥＴ４００－ＧＦＰ－ＦＲＥＴＧＦＰ－ＹＦＰ则可以检测同一个活细胞中多个蛋白之间的相互作用。Ｂｒｅｔｏｎ等［１０］人用ＢＲＥＴ４８０－ＹＦＰ－ＢＲＥＴ４００－ＧＦＰ－ＦＲＥＴＧＦＰ－ＹＦＰ证实出刺激
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α２ＡＡＲ会使ＧＲＫ２聚集于该受体上，而该受体仍然能与Ｇαｉ１β１γ２偶联。激酶能同时与Ｇα
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、Ｇβ１γ２偶联，并能与受体相互作用，这一现象还可以用于解释ＧＲＫ２的非磷酸化作用。因此，能量转移结合技术能够揭示出ＧＰＣＲ信号转导中不可预期的动力学过程并且该技术适用于多个生物系统，这有助于揭示相关疾病发生的分子机理，探寻相关疾病治疗的新突破点及开发新药。
２．２ ＰＣＡｓ－ＦＲＥＴ
这种结合技术主要ＰＣＡｓ、ＦＲＥＴ两类技术的自由组合，如ＢＩＦＣ－ＦＲＥＴ－ＢＩＦＣ、ＢＩＦＣ－ＦＲＥＴ［１１］等，主要的原理是把荧光蛋白和发光蛋白的Ｎ端或Ｃ端融合到目标受体上，并且让这些受体表达在同一个细胞上，如果这些受体能相互作用，这会产生能量转移，即发生ＲＥＴ。ＢＩＦＣ－ＦＲＥＴ－ＢＩＦＣ运用ＢＩＦＣ中荧光蛋白的重新组合可以分别作为ＦＲＥＴ中的受体和供体（图３）。
２．２．１ 高阶寡聚体和蛋白质复合体的亚细胞定位 ＦＲＥＴ－ＰＣＡｓ的结合应用能够同时识别多个ＧＰＣＲｓ形成的寡聚体，有资料显示，ＦＲＥＴ－ＢｉＦＣ实验表明出ＡＰ－１－ＮＦ－ｋａｐｐａＢ蛋白复合体的存在［１２］，ＢＲＥＴ－ＢｉＦＣ也证实出多巴胺Ｄ２受体、腺苷Ａ２Ａ受体以及亲代谢型谷氨酸受体能形成三聚体。众所周知，蛋白质在内质网上进行生物合成，经高尔基体修饰并运输至质膜上表达，因为ＦＲＥＴ可以成像，所以ＦＲＥＴ－ＢｉＦＣ在实时观测复合体形成的同时还可以对蛋白质复合体进行亚细胞定位（如细胞膜、内质网、高尔基体等）［１３］，从而有助于我们研究蛋白质，甚至是高阶寡聚体的生物合成过程。
图３ ＢＩＦＣ－ＦＲＥＴ－ＢＩＦＣ技术结合的作用原理
两个荧光蛋白被分成２个非荧光片段片段，这４个
片段分别依次标记与４个不同的蛋白质上，如果第１个
蛋白与第２个蛋白有相互作用，那么２个非荧光片段结
合形成１个发光复合体，即发生ＢｉＦＣ；如果第３个蛋白与
第４个蛋白有相互作用，那么两个非荧光片段结合形成１
个荧光复合体，即发生ＢｉＦＣ；如果这４个蛋白之间存在相
互作用，当加入催化底物后，酶反应提供的能量会转移给
荧光蛋白使其发出荧光，即发生ＦＲＥＴ２．２．２ 信号转导网络蛋白复合体 许多蛋白质能够与不同的靶分子相互作用，这些相互作用整合起来形成了一个复杂的联系网络，这个网络中相互作用的蛋白的信号能够通过这个网络传递下去。ＦＲＥＴ－ＰＣＡｓ的联合应用能够可视化这个体系中每个蛋白质之间的相互作用，从而有利于了解特定的蛋白质间的相互作用与调节其定位和信号效率之间的关系。这种联合技术已经被实时检测了多种蛋白质之间相互作用，包括胞质中可扩散的成分以及膜受体，通过对细胞质和细胞核转导成分之间相互作用的研究来追踪不同细胞器间进行的信号转导。用ＢｉＦＣ－ＢＲＥＴ已检测到β２ＡＲ、Ｇ蛋白的γ２亚基以及腺苷酸环化酶能形成一个信号复合体［１４］。除此之外，还可以采用ＢｉＦＣ与ＦＲＥＴ或ＢＲＥＴ联合技术来研究其他ＧＰＣＲｓ的信号转导网络的时空动态、信号蛋白的空间定位和调控体系的机制（图４）。资料显示，ＧＰＣＲｓ不仅能以单体的形式存在，还可以以二聚体甚至是高阶寡聚体的形式存在，这些寡聚体有不同于单体的特异功能特征，包括配体识别、脱敏、内化、再循环、合成及运输等［１５］，本实验室将用该结合技术来研究ＡＰＪ－ΚＯＲ异源二聚体与细胞内Ｇ蛋白、ＧＲＫｓ和β－ａｒｒｅｓｔｉｎ之间的相互作用［１６］，这些相互作用有助于探寻相关疾病治疗的新突破点及新药开发。
图４ Ｇ蛋白偶联受体的脱敏、内化和再循环的过程
１）激动剂与受体结合；２）ＧＲＫｓ介导ＧＰＣＲ发生磷
酸化，β－抑制蛋白与磷酸化的受体结合，受体与Ｇ蛋白
异聚体解耦联，即发生了脱敏反应；３）通过网格蛋白有被
小窝而发生受体内化和内吞；（４）受体重返胞膜（复敏）。
３ 展望
基于荧光和发光新型技术的相互结合已被成功的应用于活细胞ＧＰＣＲｓ高阶寡聚体以及信号
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转导网络中蛋白复合体的研究。虽然这些技术仍存在缺陷（不能在原生环境中直接进行检测），但这些技术在不断得到改善和拓展。例如为了证实ＧＰＣＲｓ寡聚体在原生环境中的存在，已经开发出一种新型ＴＲ－ＦＲＥＴ方法，该方法的核心是被荧光配体标记的受体。该方法已被成功运用到原生组织中并成功地展示出乳腺中催产素受体寡聚体的存在［１７］。ＬＡ Ｈｕ等人在此基础上以人类Ｃ５ａ受体为模型开发出一种研究ＧＰＣＲ－配体之间连接的新型ＴＲ－ＦＲＥＴ方法，以ＴＲ－ＦＲＥＴ为基础的方法是一种非放射性、更快速并且具有较高的灵敏性，这种测定法能够被简单地应用于高通量的药物筛选［１８］。经过改善以后的技术的结合可用于更深层次的研究，如将ＢＲＥＴ－ＴＲＦＲＥＴ结合起来，发现蛋白酶激活受体１能与Ｇαｉ１、β－ａｒｒｅｓｔｉｎ １而非Ｇαｉ１形成预组装复合物［１９］。因此，随着技术的拓展和开发，他们将是很多研究领域中强有力的生物技术，例如用于药物发现，这为、癌症、糖尿病、心血管疾病的治疗带来新的曙光。
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［１２］ＹＪ Ｓｈｙｕ，ＣＤ Ｓｕａｒｅｚ，ＣＤ Ｈｕ．Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｐ－１Ｎｆ－Ｋａｐ－ｐａｂ Ｔｅｒｎａｒｙ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｉｎ Ｌｉｖｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｂｉｆｃ－ＢａｓｅｄＦｒｅｔ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，２００８，１０５（１）：１５１－１５６．［１３］ＲＶ Ｒｅｂｏｉｓ，Ｍ Ｒｏｂｉｔａｉｌｌｅ，Ｄ Ｐｅｔｒｉｎ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ＰｒｏｔｅｉｎＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ ｗｉｔｈ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏＤｅｔｅｃｔ Ｍｕｌｔｉｐａｒｔｎｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｉｎ Ｌｉｖｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００８，４５（３）：２１４－２１８．
［１４］Ｃａｉ Ｘ，Ｃｈｅｎ Ｊ，Ｂａｉ Ｂ．Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｏｌｅ ｏｆ ＧＰＣＲｓｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ［Ｊ］．Ｊ Ｃｈｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉ，２０１１，５３５－５４１．
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（收稿日期 ２０１２－０１－０５）
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1荧光共振能量转移 原理 如果两个荧光团相距在1~10 nm之间,且一个
1.荧光共振能量转移 原理 如果两个荧光团相距在1~10 nm之间,且一个荧光团的发射光谱与另一个荧光团的吸收光谱有重叠,当供体被入射光激发时,可通过偶极-偶极耦合作用将其能量以非辐射方式传递给受体分子,供体分子衰变到基态而不发射荧光,受体分子由基态跃迁到激发态,再衰变到基态同时发射荧光。这一过程称为荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)。 优点 1.适用于活细胞和固定细胞的各类分子, 2.灵敏度和分辨率高,并能清晰成像, 3.准确度高，操作简便 4.最直观地提供蛋白质相互作用的定位和定量信息, 缺点 首先,FRET对空间构想改变十分敏感,其测量范围在1~10 nm,但如果待测蛋白原本就相当接近, FRET信号已经达到最大值,此时一些刺激引起的微小的构想改变就可能无法引起FRET信号的很大改变; 其次,存在光漂白作用, FRET需要起始激发光激发D,这时就很难避免对A的间接激发,这样的交叉激发降低了分析的灵敏性; 第三,存在其他一些本底荧光的干扰; 另外,起始激发光可能会破坏一些光敏的组织和细胞,产生光毒性。这些缺点很大程度上限制了FRET的进一步发展。
2.蛋白质双杂交技术 原理 以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型, 将前者与Gal4的DB结构域融合, 另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)。如果在Snf1和Snf2之间存在相互作用, 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活相应基因的转录与表达。这个被激活的、能显示“诱饵”和“猎物”相互作用的基因称之为报道基因(reporter gene)。通过对报道基因表达产物的检测, 反过来可判别作为“诱饵”和“猎物”的两个蛋白质之间是否存在相互作用。 酵母双杂交系统的优点及局限 双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道
荧光共振能量转移技术的基本原理和应用
荧光共振能量转移技术的基 本原理和应用 -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
荧光共振能量转移技术的基本原理和应用荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）作为一种高效的光学“分子尺”，在生物大分子相互作用、免疫分析、核酸检测等方面有广泛的应用。在分子生物学领域，该技术可用于研究活细胞生理条件下研究蛋白质-蛋白质间相互作用。蛋白质-蛋白质间相互作用在整个细胞生命过程中占有重要地位，由于细胞内各种组分极其复杂，因此一些传统研究蛋白质-蛋白质间相互作用的方法如酵母双杂交、免疫沉淀等可能会丢失某些重要的信息，无法正确地反映在当时活细胞生理条件下蛋白质-蛋白质间相互作用的动态变化过程。FRET技术是近来发展的一项新技术，为在活细胞生理条件下对蛋白质-蛋白质间相互作用进行实时的动态研究提供了便利。 荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移（即发生能量共振转移）。FRET是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发射更强于本身的特征荧光（敏化荧光），也可以不发荧光（荧光猝灭），同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长。能量转移的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等因素有关。作为共振能量转移供、受体对，荧光物质必须满足以下条件： ①受、供体的激发光要足够分得开；②供体的发光光谱与受体的激发光谱要重叠。 人们已经利用生物体自身的荧光或者将有机荧光染料标记到所研究的对象上，成功地应用于核酸检测、蛋白质结构、功能分析、免疫分析及细胞器结构功能检测等诸多方面。（传统有机荧光染料吸收光谱窄，发射光谱常常伴有拖尾，这样会影响供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠程度，而且供、受体发射光谱产生相互干扰。相对于传统有机荧光染料分子，量子点的发射光谱很窄而且不拖尾，减少了供体与受体发射光谱的重叠，避免了相互间的干扰；由于量
荧光共振能量转移(FRET)技术在生物研究探究中的运用资料精
荧光共振能量转移（FRET）技术在生物研究中的应用 高裕锋分析化学B200425012 摘要：简要综述了荧光共振能量转移（FRET）技术在生物研究中的一些应用。核酸的结构、DNA测序、核酸杂交、蛋白质结构和蛋白质相互作用等的研究是生命科学研究重要组成部分，相关工作一直备受关注，而FRET技术被广泛应用于相关领域研究中，并取得了较突出的结果。 关键词：荧光共振能量转移（FRET），核酸结构，DNA测序，核酸杂交，蛋白质结构，蛋白质相互作用。 生命科学被誉为21世纪的科学，为了揭示生命的奥妙，人们投入了大量的工作。其中对于核酸和蛋白质的研究备受关注，大量的新技术与新方法被用于该领域的研究中。荧光共振能量转移技术是一项经典的荧光技术，但是随着荧光成像技术的发展，二者相互结合，成为了生命科学领域的一个重要研究手段[1,2]。本文简单介绍了基于FRET原理的新技术在生物研究中的一些应用。 一、FRET基本原理[3] FRET现象是Perrin在20世纪初首先发现的，1948年，Foster[4,5]创立了理论原理。FRET 指荧光能量给体与受体间通过偶极－偶极耦合作用以非辐射方式转移能量的过程，又称为长距离能量转移。产生FRET的条件（图1）主要有三个：（1）给体与受体间在合适的距离（1～10 nm）；（2）给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠，这是能量匹配的条件；（3）给体与受体的偶极具一定的空间取向，这是偶极－偶极耦合作用的条件。 图1 产生FRET条件示意图
FRET 的效率用E 表示，E 用式（1）计算：其中R 0为Foster 距离，表示某一给定给体与受 60660R E R R =+ （1） 240D DA R const n J κφ?=???? （2） 体间能量转移效率为50％时的距离；R 为给体与受体的实际距离。R 0可由式（2）计算：其中κ2 是方向因素,n 是溶剂的反射系数,φD 是供体探针结合到蛋白的量子效率, J DA 是供体发射波长和受体吸收波长的交叠系数。 由式（2）可看出R 0对于给定的给－受体是一个特征值，因此，式（1）中E 值与 R 的关系紧密，这也成为了FRET 用于测定分子间或基团间距离的重要理论依据。 E 值可由以下几种方式测定：用荧光强度表征（ E=1- I DA / I D ，I DA 表示A 存在时D 的荧光强度）；用量子产率表征（ E=1-φDA /φD ）；用荧光寿命表征（E=1-τDA /τD ）。这表示研究FRET 可以通过不同的实验设备，既可以用普通光谱仪测定其荧光强度、量子产率，也可以用时间分辨仪测定其荧光寿命。 随着成像技术的发展，用显微成像的方法可更直观地观测FRET 地发生。 二、FRET 探针 FRET 需要两个探针，即荧光给体与荧光受体，要求是给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定交叠，而与受体的发射光谱尽量无交叠。 常用的探针主要有三种：荧光蛋白、传统有机染料和镧系染料。 荧光蛋白[6]是一类能发射荧光的 天然蛋白及其突变体，常见的有绿色荧光蛋白（GFP ）、蓝色荧光蛋白（BFP ）、 青色荧光蛋白（CFP ）和黄色荧光蛋白（YFP ）等。不同蛋白的吸收和发射波长不同，可 根据需要组成不同的探针对。荧光蛋白的突出优点是自身为生物分子，可有效地与目标分子融 合，更易于在生物环境中使用，且其种类多，可满足不同光谱需要。其缺陷是分子体积大， 空间分辨率较低，且可能与目标分子作用产生化学发光，需要较长地时间来确定荧光形式， 不利于动力学研究。为克服这些缺陷，常使用荧光蛋白与其他染料联用或用其他染料对来研究。 传统有机染料是指一些具有特征吸收和发射光谱地有机化合物组成地染料对。常见的有荧光素、罗丹明类化合物和 青色染料Cy3、Cy5等。该类染料分子体积较小，种类较多且大部分为商品化的分子探针染料，因此应用较为广泛。 镧系染料[7]一般与有机染料联用分 别作为FRET 的给－受体，其主要优点是：测量量可
荧光共振能量转移
FRET技术研究PEDF和目标蛋白 之间在小鼠神经元（神经胶质细胞）的 相互作用 一、FRET技术基本原理 荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移（即发生能量共振转移）。FRET是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发射更强于本身的特征荧光（敏化荧光），也可以不发荧光（荧光猝灭），同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长。能量转移的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等因素有关。作为共振能量转移供、受体对，荧光物质必须满足以下条件： ①受、供体的激发光要足够分得开； ②供体的发光光谱与受体的激发光谱要重叠。 人们已经利用生物体自身的荧光或者将有机荧光染料标记到所研究的对象上，成功地应用于核酸检测、蛋白质结构、功能分析、免疫分析及细胞器结构功能检测等诸多方面。（传统有机荧光染料吸收光谱窄，发射光谱常常伴有拖尾，这样会影响供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠程度，而且供、受体发射光谱产生相互干扰。最新的一些报道将发光量子点用于共振能量转移研究，克服了有机荧光染料的不足之处。相对于传统有机荧光染料分子，量子点的发射光谱很窄而且不拖尾，减少了供体与受体发射光谱的重叠，避免了相互间的干扰；由于量子点具有较宽的光谱激发范围，当它作为能量供体时，可以更自由地选择激发波长，可以最大限度地避免对能量受体的直接激发；通过改变量子点的组成或尺寸，可以使其发射可见光区任一波长的光，也就是说它可以为吸收光谱在可见区的任一生色团作能量供体，并且保证了供体发射波长与受体吸收波长的良好重叠，增加了共振能量转移效率。） 以GFP的两个突变体CFP（cyan fluorescent protein）、YFP（yellow fluorescent protein）为例简要说明其原理：CFP的发射光谱与YFP的吸收光谱有相当的重叠，当它们足够接近时，用CFP的吸收波长激发，CFP的发色基团将会把能量高效率地共振转移至YFP的发色基团上，所以CFP的发射荧光将减弱或消失，主要发射将是YFP的荧光。两个发色基团之间的能量转换效率与它们之间的空间距离的6次方成反比，对空间位置的改变非常灵敏。例如要研究两种蛋白质a和b间的相互作用，可以根据FRET原理构 建融合蛋白，这种融合蛋白由三部分组成：CFP（cyan fluorescent protein）、蛋白 质b、YFP（yellow fluorescent protein）。用CFP吸收波长433nm作为激发波长，实验灵巧设计，使当蛋白质a与b没有发生相互作用时，CFP与YFP相距很远不能发生荧光共振能量转移，因而检测到的是CFP的发射波长为476nm的荧光；但当蛋白质a与b
荧光共振能量转移技术的基本原理和应用
荧光共振能量转移技术的基本原理和应用荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）作为一种高效的光学“分子尺”，在生物大分子相互作用、免疫分析、核酸检测等方面有广泛的应用。在分子生物学领域，该技术可用于研究活细胞生理条件下研究蛋白质-蛋白质间相互作用。蛋白质-蛋白质间相互作用在整个细胞生命过程中占有重要地位，由于细胞内各种组分极其复杂，因此一些传统研究蛋白质-蛋白质间相互作用的方法如酵母双杂交、免疫沉淀等可能会丢失某些重要的信息，无法正确地反映在当时活细胞生理条件下蛋白质-蛋白质间相互作用的动态变化过程。FRET技术是近来发展的一项新技术，为在活细胞生理条件下对蛋白质-蛋白质间相互作用进行实时的动态研究提供了便利。 荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移（即发生能量共振转移）。FRET是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发射更强于本身的特征荧光（敏化荧光），也可以不发荧光（荧光猝灭），同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长。能量转移的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等因素有关。作为共振能量转移供、受体对，荧光物质必须满足以下条件： ①受、供体的激发光要足够分得开；②供体的发光光谱与受体的激发光谱要重叠。 人们已经利用生物体自身的荧光或者将有机荧光染料标记到所研究的对象上，成功地应用于核酸检测、蛋白质结构、功能分析、免疫分析及细胞器结构功能检测等诸多方面。（传统有机荧光染料吸收光谱窄，发射光谱常常伴有拖尾，这样会影响供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠程度，而且供、受体发射光谱产生相互干扰。相对于传统有机荧光染料分子，量子点的发射光谱很窄而且不拖尾，减少了供体与受体发射光谱的重叠，避免了相互间的干扰；由于量子点具有较宽的光谱激发范围，当它作为能量供体时，可以更自由地选择激发波长，可以最大限度地避免对能量受体的直接激发；通过改变量子点的组成或尺寸，可以使其发射可见光区任一波长的光，也就是说它可以为吸收光谱在可见区的任一生色团作能量供体，并且保证了供体发射波长与受体吸收波长的良好重叠，增加了共振能量转移效率。）
荧光漂白恢复_荧光共振能量转移和荧光相关光谱检测的技术特点
ZHONGGUO YIXUEZHUANGBEI 于 淼① 高 建① [文章编号] 1672-8270(2009)06-0008-02 [中图分类号] R 197 [文献标识码] B Characteristics of application and technology on FRAP , FRET and FCS/Yu Miao , Gao Jian//China Medical Equipment,2009,6(6):8-9. [Abstract] Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP), fluorescence resonance energy transfer (FRET) and fluorescence correlation spectroscopy (FCS) are three experimental techniques based on the fluorescence analysis that are commonly used to study molecular interaction. In this article, we will discuss and compare the application and technical specifications for FRAP , FRET and FCS.[Key words] FRAP; FRET; FCS; Fluorescence Analysis [First-author's address] Laboratory Center, China Medical University, Shenyang 110001, China. 荧光漂白恢复、荧光共振能量转移和荧光相关光谱检测的技术特点 [摘要] 荧光漂白恢复(FRAP)、荧光共振能量转移(FRET)和荧光相关光谱(FCS)是三种以荧光为基础的检测技术，常用来研究分子间相互作用。对三种技术的特点做以比较和讨论。 [关键词] 荧光漂白恢复；荧光共振能量转移；荧光相关光谱；荧光检测 作者简介 于淼,女,(1980- )，硕士，助教。现就职于中国医科大学实验技术中心，主要从事激光扫描共聚焦显微镜工作。 FRAP：经荧光素标记的某一区域被光照射后，荧光物质的光化学结构被破坏，荧光强度下降，但随之此处荧光强度会逐渐恢复，荧光强度与恢复强弱及快慢代表周围分子扩散的速率或分子运动速度[1]。 FRET：受激态荧光素（供体）将其能量向另一个荧光素（受体）传递，使后者被激发，这一过程称荧光能量共振转移。测定FRET程度的参数，包括供体淬灭、受体发射、供体荧光寿命、供体荧光去极化等[2]。 FCS：是一种通过检测微区内（共焦体积）分子 的荧光信息（强度、波动、波长等）来分析样品特性的检测 技术，类似于传统的荧光分光光度计，主要用于液态样品的成份分析[3]。 以上三种技术的主要参数有： 扩散率：测量扩散的速率，通常表现在分子和分子络合物的扩散系数。 多组分扩散：用来检测和区别单个和多组分之间扩散的能力。 运动分量：检测能够自由扩散的组分。 ①中国医科大学实验技术中心 辽宁 沈阳 110001
荧光共振能量转移技术的基本原理和应用
荧光共振能量转移技术的基本原理和应用 荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）作为一种高效的光学“分子尺”，在生物大分子相互作用、免疫分析、核酸检测等方面有广泛的应用。在分子生物学领域，该技术可用于研究活细胞生理条件下研究蛋白质-蛋白质间相互作用。蛋白质-蛋白质间相互作用在整个细胞生命过程中占有重要地位，由于细胞内各种组分极其复杂，因此一些传统研究蛋白质-蛋白质间相互作用的方法如酵母双杂交、免疫沉淀等可能会丢失某些重要的信息，无法正确地反映在当时活细胞生理条件下蛋白质-蛋白质间相互作用的动态变化过程。FRET技术是近来发展的一项新技术，为在活细胞生理条件下对蛋白质-蛋白质间相互作用进行实时的动态研究提供了便利。 一、FRET技术基本原理 荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移（即发生能量共振转移）。FRET是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发射更强于本身的特征荧光（敏化荧光），也可以不发荧光（荧光猝灭），同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长。能量转移的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等因素有关。作为共振能量转移供、受体对，荧光物质必须满足以下条件： ①受、供体的激发光要足够分得开； ②供体的发光光谱与受体的激发光谱要重叠。 人们已经利用生物体自身的荧光或者将有机荧光染料标记到所研究的对象上，成功地应用于核酸检测、蛋白质结构、功能分析、免疫分析及细胞器结构功能检测等诸多方面。（传统有机荧光染料吸收光谱窄，发射光谱常常伴有拖尾，这样会影响供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠程度，而且供、受体发射光谱产生相互干扰。最新的一些报道将发光量子点用于共振能量转移研究，克服了有机荧光染料的不足之处。
单分子荧光共振能量转移技术
研究生光谱 技术与应用课程 作业 河南大学 单分子荧光共振能量转移技术 学生：郭爱宇 学号：104753120870 学院：物理与电子学院 年级专业：2012级光学工程 课程名称：光谱技术及应用
指导老师：郭立俊教授
单分子荧光共振能量转移技术 摘要：单分子荧光共振能量转移技术(single molecule fluorescence resonance energy transfer, smFRET) 通过检测单个分子内的荧光供体及受体间荧光能量转移的效率，来研究分子构象的变化。在单分子探测技术发展之前，大多数的分子实验是探测分子的综合平均效应(ensemble averages)，这一平均效应掩盖了许多特殊的信息。单分子探测可以对体系中的单个分子进行研究，得到某一分子特性的分布状况，也可研究生物分子的动力学反应。介绍了近来单分子荧光共振能量转移技术的进展。 关键词：单分子；荧光共振能量转移；荧光基团 1 引言 光谱技术是研究生物分子最常用的方法之一。在单分子光谱（single molecule spectroscopy, SMS）探测技术发展以前，大多数的实验是探测分子的综合平均效应，得到的是由大量对象组成的一个整体所表现出的平均响应和平均值，这一平均效应掩盖了许多特殊的信息。而单分子探测可对体系中的单个分子进行研究，通过与时间相关过程的探测，能实时了解生物大分子构象变化的信息。2002年美国第46届生物物理年会表明单分子仍是生物物理学目前和今后重点发展的研究领域。主要的技术手段包括生物大分子荧光光谱，单分子荧光能量转移谱、与原子力显微镜结合进行单分子水平的分子间相互作用力的测量，以及可进行单分子操作的激光光钳，高时间分辨率的单分子轨迹追踪等[1]。由此可见，单分子荧光技术具有重要的地位。 标记在生物大分子上单个荧光基团的各种特性变化能够提供有关分子间相互作用、酶活性、反应动力学、构象动力学、分子运动自由度(molecular freedom of motion)及在化学和静电环境下活性改变的信息。近年，在动态结构生物学研究领域，用单分子荧光光谱技术研究生物分子构象变化的方法主要有两种：一是通过单分子荧光偏振的各向异性（single molecule fluorescence polarization anisotropy，smFPA）研究生物分子的构象动力学(conformational dynamics)和旋转运动(rotational motions)。另一个是单分子对荧光共振能量转移(single pair
荧光共振能量转移动态检测蛋白质相互作用的研究进展
＊［基金项目］国家自然科学基金资助项目（３０９７１０８１；３０８７０９３２； ８１０７０９６１）；山东省自然科学基金资助项目（Ｎｏ． ＺＲ２０１１ＣＭ０２７；ＺＲ２００９ＤＺ００４）；山东省泰山学者专 项基金 △［通信作者］陈京，Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｉｎｇｃｈｅｎ＠ｗａｒｗｉｃｋ．ａｃ．ｕｋＪ Ｊｉｎｉｎｇ Ｍｅｄ Ｕｎｉｖ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１２，Ｖｏｌ．３５，Ｎｏ．１ ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－９７６０．２０１２．０１．０２０·综述·荧光共振能量转移动态检测蛋白质相互作用的研究进展 王 宏１ 蔡 欣１ 白 波２ 陈 京２Δ （１泰山医学院基础医学院，山东泰安２７１０１６；２济宁医学院神经生物学研究所，山东济宁２７２０６７） 摘 要 荧光共振能量转移（ＦＲＥＴ）技术是近１０年来出现的一种新的检测蛋白质－蛋白质相互作用的技术。它的最大优势是能从“时间、空间、动态、连续”对活细胞中蛋白质之间的相互作用进行检测，该技术不但可以与其他技术结合来研究细胞膜上蛋白质之间的相互作用；而且还可用于分析细胞膜－细胞质－细胞核中所发生的信号转导途径。资料显示，ＦＲＥＴ技术所发挥作用是最近出现的几种技术所无法企及的，这对于疾病发病机制的研究及新的药物靶点的发现具有深远意义。 关键词 荧光共振能量转移；蛋白质－蛋白质相互作用；信号转导 中图分类号：Ｑ２７４ 文献标识码：Ａ 文章编号：１０００－９７６０（２０１２）０２－０６０－０４ 机体细胞中种类繁多的蛋白质各具不同的生理功能，从而使细胞对胞外信号做出不同的生物学反应。蛋白质的功能作用经常受不同条件下与不同配体间相互作用的调节。蛋白质之间的相互作用能够整合来自不同信号通路的信号并协调细胞内部的调节机制［１］。因此，研究蛋白质之间相互作用能够给这些研究提供新的见解。在过去的２０年中，已经开发了很多用于探测蛋白质相互作用的技术和方法，这些技术一般分为两部分，１）体外方法，例如免疫共沉淀、ｆａｒ－ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ、ＧＳＴ融合蛋白沉降技术等；２）体内方法，例如酵母双杂交系统，但是这些方法都具有一定的局限性。一方面，基于机械的、离心力高的或去垢剂的细胞裂解，上述方法都可能会改变蛋白质－蛋白质相互作用的自然状态；另一方面，上述技术无法提供活细胞内的特定蛋白间相互作用的时空信息［２］。近年来研究开发的荧光共振能量转移（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎ－ｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ，ＦＲＥＴ）却能克服以上缺点，可以在活细胞中实时动态观测蛋白质之间的相互作用。更重要的是，ＦＲＥＴ还可以与其他技术结合［３］，如生物发光共振能量转移（ＢＲＥＴ）、蛋白互补技术（ＰＣＡｓ）等，既能研究两个蛋白之间的相互作用，还能用来研究３个或更多蛋白之间的相互作用，甚至是对信号网络的研究。本文就ＦＲＥＴ、ＦＲＥＴ与其他一些技术的结合及其应用做一简要综述。１ 荧光共振能量转移（ＦＲＥＴ）技术的原理 ＦＲＥＴ理论描述的是两个荧光团之间的能量转移（图１）。在能量传输过程中，其中的一个荧光团作为能量供体（Ｄ），另一荧光团作为能量受体（Ａ）。以适当的激发光照射Ｄ，将会产生振荡偶极子，如果Ｄ的基态和Ａ的第一激发态的振动能量差相当，或者Ｄ的发射光谱与Ａ的吸收光谱能有效重叠时，当Ｄ与Ａ靠近时，或者说Ｄ与Ａ的偶极子之间的距离足够近时即能产生共振，通过偶极－偶极耦合作用将能量从Ｄ向Ａ转移，即发生非放射能量共振转移；Ａ接受能量从而发射出特异性荧光。在此共振能量转移过程当中，Ｄ特异性荧光的衰减或者Ａ特异性荧光的增强即可被检测到，从而实现ＦＲＥＴ检测［４］。 ＦＲＥＴ中两个常用的荧光蛋白为青色荧光蛋白（ｃｙａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＦＰ）和黄色荧光蛋白（ｙｅｌｌｏｗ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＹＦＰ）。ＦＲＥＴ具有广泛的应用前景，在蛋白质、ＤＮＡ等复合物的研究方面发挥重要作用。Ｋｈａｎ等［５］用ＦＲＥＴ检测出溶血磷脂胆碱能够通过迅速磷酸化和内化来快速激活Ｇ２Ａ，Ｇ２Ａ的活化能促使Ｇαｉ－１和Ｇαｑ／１１和Ｇβγ的释放，Ｇαｉ－１和Ｇαｑ／１１会使胞质内的Ｃａ２＋浓度升高及Ｇ２Ａ的激活促使ＧＲＫ６和β－ａｒ－ｒｅｓｔｉｎ的循环利用；而Ｇβγ能够与激活的Ｈｃｋ相互作用。Ｋａｚｕｔｏｓｈｉ Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ等［６］构建了一对融合的锌指结构蛋白，它们是一种具有Ｎ端二聚化序列和Ｃ端ＧＦＰ突变体的荧光传感蛋白。他们分别在锌指结构的末端标记ＧＦＰ的突变体ＣＦＰ和ＹＦＰ，将这一对锌指结构蛋白混合，并且加入特异 ０６
单分子对荧光共振能量转移(spFRET)
单分子对荧光共振能量转移（spFRET）
生物物理学系 郑晓惠 学号 10281034 一 引言 光谱技术是研究生物分子最常用的方法之一。在 单分子光谱（single molecule spectroscopy, SMS） 探测技术发展以前，大多数的实验是探测分子的 综合平均效应，得到的是由大量对象组成的一个 整体所表现出的平均响应和平均值，这一平均效 应掩盖了许多特殊的信息。而单分子探测可对体 系中的单个分子进行研究，通过与时间相关过程 的探测，能实时了解生物大分子构象变化的信息。 2002 年美国第 46 届生物物理年会表明单分子仍是 生物物理学目前和今后重点发展的研究领域。主 要的技术手段包括生物大分子荧光光谱，单分子 荧光能量转移谱、与原子力显微镜结合进行单分 子水平的分子间相互作用力的测量，以及可进行 单分子操作的激光光钳，高时间分辨率的单分子 轨迹追踪等[1]。由此可见，单分子荧光技术具有重 要的地位。 标记在生物大分子上单个荧光基团的各种特 性变化能够提供有关分子间相互作用、酶活性、 反应动力学、构象动力学、分子运动自由度 (molecular freedom of motion)及在化学和静电环境 下活性改变的信息。近年，在动态结构生物学研 究领域，用单分子荧光光谱技术研究生物分子构 象变化的方法主要有两种：一是通过单分子荧光 偏 振 的 各 向 异 性 （ single molecule fluorescence polarization anisotropy，smFPA）研究生物分子的 构象动力学(conformational dynamics)和旋转运动 (rotational motions)。 另一个是单分子对荧光共振能 量转移(single pair fluorescence resonance energy transfer, spFRET)，在单分子水平测量一个分子内 或两个不同分子间的距离变化和相互作用。本文 主要就后者做简要介绍。 二 原理 荧光共振能量转移是指当两种不同的荧光生色团 离的较近，且其中一种生色团（供体, donor）的发 射谱与另一种生色团 （受体, acceptor） 的激发谱有 相当程度的重叠时，当供体被激发时，受体会因 供体激发能的转移而被激发。其直观表现就是供 体产生的荧光强度较其单独存在时要低的多，而 受体发射的荧光却大大增强，同时伴随它们荧光 寿命的相应缩短和延长。能量转移效率与两个生 色团激发谱和发射谱的重叠程度、供体与受体跃 迁偶极的相对取向、供受体间的距离有密切关系， 其经典公式为 E=R06/(R6+ R06), R0 为能量传递达到 50%的距离。选定供、受体对之后，可将 R0 看作 恒量。能量转移的发生将改变供、受体的去偏振 程度、荧光寿命、荧光强度等，测定这些参数值 就可得出 E。利用 R0 和实验测得的 E 就可测得供 受体间的距离 R。 用此方法测量生色团距离的方法 被称为光谱尺，可测量 1.0-10.0nm 之间的距离。 spFRET 是在一个生物大分子或两个相互作用的分 子上标记两个不同的荧光基团。同样，当供体的 发射光谱与受体的吸收光谱相重叠时，发生共振 能量转移。通过探测能量转移效率，就可确定两 点间的距离。由于相对取向和光谱重叠积分等不 确定因素，该方法不能准确确定绝对距离。但可 通过监测供体-受体的相对距离变化，结合其时间 变化推测生物大分子在生命活动中的构象变化。 该技术不仅有非常好的静态定位能力，也能提供 分子内或分子间两个荧光基团在距离和方向上的 动态变化。由于每次只观察一对供、受体系统， 因此能在毫秒时间尺度内观察这些变化，从而将 具有不同能量转移效率的亚群分开。将这种方法 扩展， 可用于研究生物多聚体的组成动力学、 DNA 限制性内切酶酶切反应，以及 DNA 发夹结构的去 折叠等。 三 方法 1 设备 单分子荧光探测必须满足两个基本要求，一是在 被照射的体积中只有一个分子与激光发生相互作 用；二是要确保单分子的信号大于背景的干扰信 号。背景信号来自于 Raman 散射、Rayleigh 散射、 溶剂中杂质、盖玻片产生的荧光和探测器的暗电 流。因此，进行单分子探测要求 (1) 激发容积要 小，因为背景的吸收与激发体积成正比，尽量减 小激发体积可降低背景干扰， （2）高效的收集光 学系统， （3）灵敏的探测器， （4）采用针孔装置， 或将溶剂中杂质预漂白以及用低荧光光学材料等 方法清除背景荧光。 常 用 的 装 置 是 近 场 光 学 扫 描 显 微 镜 (near-field scanning optical microscope NSOM)，其最小激发 体积小于 10-2m3。该方法在单分子荧光的探测中 发挥了很重要的作用。可监测单个生物大分子的 构造变化，例如旋转和纳米水平上的距离变化。 其不足是扫描时需要通过复杂的控制系统来保持 适当的样品与探针之间的距离，并且其近场激发
生物发光共振能量转移
BRET 生物发光共振能量转移 技术简介： 生物发光共振能量转移（BRET）技术是近10年来出现的一种新的检测蛋白质-蛋白质相互作用的技术.它的最大优势是能在活细胞中实时进行检测，因此能够进行相互作用动力学的研究。在应用这个系统研究感兴趣的蛋白前，首先需要将Rluc或者EYFP 融合到每个蛋白或者他们的辅蛋白上。在细胞中，融合蛋白共表达，然后和荧光素酶和其底物腔肠素反应，当能量供体Rluc，能量受体EYFP 之间距离比较近的时候 (10-100?)，那么光将从Rluc(峰值480nm发射)传递到EYFP，形成它的激发，并且发射一个波长在530nm 的发射光，BRET 量化的程度以发射光530nm 和480nm 的比率表示。 实验流程 1、用于BRET的表达质粒构建； 2、融合蛋白表达检测； 3、BRET实验； 4、实验结果分析及提交实验报告 客户提供 1、目的基因cDNA（也可由我公司提供基因克隆） 2、用于实验细胞（如果我公司细胞库有可不需提供） 公司提供 详细实验步骤、使用仪器、及结果分析等详细实验报告。 服务周期和价格 具体咨询本公司 荧光共振能量转移（FRET） 荧光共振能量转移-FRET（Fluorescent Resonance Energy Transfer） 指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移。
（1）FRET发生条件： 能量匹配：供体分子的发射光谱可以被受体分子吸收并产生荧光信号。供体分子的发射光谱应与受体分子的激发光谱必须有显著重叠（>30%）； 作用距离：供体分子与受体分子的作用距离为1-10nm； FRET效率公式：用于计算分子/基团间作用距离R 偶极-偶极作用：供体分子与受体分子作用时的向量必须满足一定条件。 （2）FRET的应用： 通过FRET技术可以获得有关两个蛋白分子之间相互作用的空间信息（作用距离、作用方向、能量传递效率）。常用于解决如下问题：蛋白分子的共定位；蛋白分子聚合体；转录机制；转化途径；分子运动；蛋白折叠等生物学问题。 （3）FRET常见的供体-受体荧光分子对： 荧光蛋白 类： 染料类：