原核蛋白表达

原核蛋白表达常见问题解析

原核蛋白表达常见问题解析 1、为什么目的蛋白总是以包涵体的形式出现？在原核蛋白表达纯化中目的蛋白经常发生错误的折叠，并聚集成为包涵体。经过诱导，目的蛋白通常可达细胞总蛋白的50%以上。虽然有一定比例的蛋白以可溶的单体形式存在，而多达95%（甚至更多）的蛋白则在包涵体中。实验过程中，可以采取降低诱导温度，例如25–30°C，或降低IPTG浓度(0.01–0.1mM)并延长诱导时间，还有采用特别的培养基等方法获得更多的可溶蛋白。 2、跨膜蛋白为什么很难表达？跨膜蛋白的表达成功率相对较低是一个实验结果，究其原理，目前众说纷纭很多种理论。以我们浅薄的理解层面来看，主要有以下几个原因：跨膜蛋白一般都是强疏水性的氨基酸分子和亲水性的分子跳跃式的连接，形成的亲水疏水的一个最简单的跨膜化学结构，这种结构与信号肽结构相似，对于原核细胞来说，简单的细胞器很难像真核细胞一样完成信号肽识别及切除、引导内质网、高尔基体重新包装及分泌这一复杂过程，有些蛋白是多次跨膜，对于原核细胞来说几乎是不可能完成的任务。另外，对于疏水性的片段，在原核细胞中极易形成包涵体，疏水性多肽会抑制翻译过程，甚至与原核膜结构融合形成毒性，出于生物自我保护的本能，所有的细胞器都会停止合成蛋白的过程。 3、如何选择蛋白表达宿主菌？

4、我们有哪些原核蛋白纯化方式？如何选择不同的纯化方式？答：我们公司的蛋白纯化方法大致分为亲和纯化、离子交换、切胶回收三类。 1、常规情况下，一般携带融合标签（His标签，GST标签，sumo标签，Fc标签），我们可以通过Ni柱、GST柱、Protein A等进行亲和纯化获得融合蛋白，用亲和纯化的方法一般可以获得85%以上纯度的蛋白，亲和纯化的方便快捷。 2、如果需要目的蛋白不含有任何标签，怎么选择纯化方式？。（1）可表达融合蛋白，用蛋白工具酶切割融合蛋白，再进行纯化除去工具酶。此方法能快速得到蛋白。（2）可表达不含标签的蛋白，进行离子、分子筛、疏水等纯化，通过AKATA纯化设备获得蛋白。 3、如果需要获得蛋白作为抗原，可以直接通过切胶回收的方式，此方法获得蛋白纯度较高，进行免疫动物后得到的抗体进行WB反应，灵敏度较高。 5、表达得到的蛋白是有活性的么？答：需要让蛋白有活性的条件很复杂，合适的缓冲液体系、盐浓度、蛋白的折叠状态甚至检测活性的方法的细微差别都可能导致活性的强弱有无，一般情况下，上清表达的蛋白要比包涵体经过变复性纯化后得到的蛋白活性要好，我们尽量从上清中获得蛋白，期许蛋白形成的折叠最接近活性状态，这也是我们擅长的。但是在实际实验条件下，我们无法承诺表达纯化的蛋白一定具有客户期望的生理活性。

蛋白体外表达与纯化

蛋白体外表达与纯化随着后基因组时代的到来，蛋白质组成为科学研究的热点。蛋白质作为生命机体的主要活动的承担者，其体外表达与纯化在研究相应基因的功能上有重要意义。蛋白体外表达系统按其表达宿主可分为原核表达系统，真核表达系统和哺乳动物细胞表达系统。一：原核表达系统原核表达系统的宿主菌主要以大肠杆菌为代表，大肠杆菌表达体系是目前应用最广泛的外源基因表达体系，这也是外源基因表达的首选体系。该表达体系的优点：遗传学和生理学背景清楚；容易培养；外源基因经常可以高效表达及操作简单、周期短、成本低等。其不足之处是不能进行典型真核细胞所具有的复杂的翻译后修饰；广泛的二硫键的形成及外源蛋白组装成蛋白复合体的能力也受到限制；另外外源基因产物在大肠杆菌中易形成不溶的包涵体；有时由于真核mRNA的结构特性及密码子使用频率与大肠杆菌的差异，而的不到足够的产物。二：真核表达系统真核表达系统的宿主菌主要以酵母表达系统为代表，酵母基因表达系统的载体通常既能在酵母中进行复制也能在大肠杆菌中进行复制，形成所谓酵母菌――大肠杆菌穿梭载体。因以大肠制备质粒DNA较方便，通常利用大肠杆菌系统构建酵母载体以简化手续，缩短时间。作为基因表达系统的宿主应该具备以下条件：安全无毒，不致病；遗传背景较清楚，容易进行遗传操作；容易进行载体DNA的导入；培养条件简单；有良好的蛋白分泌能力；有类似高等真核生物的蛋白翻译后修饰功能。三：哺乳动物细胞表达系统由于本专业不涉及哺乳动物细胞表达系统的应用，故此不赘述。表达载体的种类及相应的分离纯化方法作为表达载体必须具备以下特征：稳定的遗传复制、传代能力，无选择压力下能存在于宿主细胞内；具有显性的筛选标记；启动子的转录是可调控的；启动子的转录的mRNA能够在适当的位置终止；具有外源基因插入的多克隆位点。在原核表达系统中常用的表达载体有：PET－载体系列，用这类载体表达出的外源蛋白在Ｎ端或Ｃ端或两端均具有his tag。用该载体表达出的外源蛋白通过其末端组氨酸与Ni2+的结合以亲和层析的方法而纯化。PGEX－载体系列，用这类载体表达出的外源蛋白以GST融合蛋白的形式存在，以Glutathione Sepharose 4B 柱亲和层析得以纯化。本实验将以PGEX4T—3为载体，在大肠杆菌BL21DE3菌株中表达外源蛋白OsWAK2为例介绍蛋白的表达与纯化。实验方法与步骤：一：目的蛋白的粗提 1．构建载体，转化BL21DE3宿主菌感受态细胞 2．挑单菌落于10ml 含有60ug/ ml的液体LB培养基中37℃200rpm摇培16—18小时3．取5 ml摇好的菌液加到250 ml备好的含有60ug/ ml的液体LB培养基中37℃200rpm 摇培，至对数生长中后期

浅谈原核表达

浅谈原核表达的技巧摘要：原核表达是表达外源基因常用的方法，具有操作简单、快捷，需时较短，表达产量高，适合工业化等优点。本文作者根据自己的实践经验，总结了原核表达的一些技巧。关键词：原核表达表达载体限制性内切酶将植物、动物、微生物等的目的基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下优点：易于生长和控制；易于培养，实验耗费少；可选择多种大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒。原核表达是近年来表达外源蛋白常用的方法，本文根据自己的实践经验，着重谈谈对原核表达中的技巧问题。一、原核表达一般程序表达前准备-获得目的基因-构建含目的片段的表达载体（测序验证）-转化表达宿主菌-诱导靶蛋白的表达-表达蛋白的分析。二、原核表达中各操作步骤的关键因素及技巧 1.表达前的准备要素：原核表达注重表达前对目的片段、表达载体及表达菌株的分析、选择。正所谓“磨刀不误砍柴功”，经过细致、周全的分析、准备、设计可带来较为顺当的实验，可免去许多不必要的麻烦。（1）对表达载体的分析载体的选择：同样的载体，同样的系统，很可能表达这个蛋白表达量起高，但另外一个就是做不出来，所以表达载体的选择非常重要，没有万能的载体。选择载体通常我们关心质粒上的几个功能组件及所带来的问题：是否为诱导表达型载体，启动子的强弱、多克隆位点、限制性内切酶的位置、终止密码子的有无及位置，融合Tag的有无，筛选报告基因的位置等。所选载体一定要保持原来的遗传背景（有些载体经过多次交换已变异）。选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑，如果为了方便纯化，可选择融合表达；如果为了获得天然蛋白，可选择非融合表达。融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。翻译的起始位点：要表达目的蛋白，在该基因的5’端必须有一起始位点，现在大部分的表达载体都提供起始位点，起始密码子与核糖体结合位点的距离都已被优化，一般情况下不需要自己再加，实际操作时要留意载体图谱上是否注明有起始密码子和终止密码子，如无，还得根据自己的实际情况加上。在起始密码子附近的mRNA二级结构：外源基因其始转录后，保持mRNA的有效延伸、终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键，尤其是在起始密码子附近的mRNA二级结构可能会抑制翻译的起始或者造成翻译暂停从而产生不完全的蛋白。如果利用Primer Premier软件分析DNA或RNA结构上有柄（stem）结构，并且结合长度超过8个碱基，这种结构会因为位点专一突变等因素而变得不稳定，影响正常的翻译。（2）对目的片段的分析基因（或蛋白）的大小：原核表达的成功与否与所要表达的蛋白（或基因）大小有关，一般说来小于5kD或者大于100kD的蛋白都是难以表达的。蛋白越小，越容易被内源蛋白水解酶所降解。在这种情况下可以采取串联表达，在每个表达单位（即单体蛋白）间设计蛋白水解或者是化学断裂位点。如果蛋白较小，那么加入融合标签GST、Trx、MBP或者其它较大的促进融合的蛋白标签就较有可能使蛋白正确折叠，并以融合形式表达。如果蛋白较大，大于60kD的蛋白建议使用较小的标签（如6×组氨酸标签）。对于结构研究较清楚的蛋白可以采取截取表达。当然表达时要根据目的进行截取，如果是要进行抗体制备而截取，那么一定要保证截取的部位抗原性较强。对于抗原性也可

原核表达步骤

Chi l 原核表达基本试验步骤将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测，其中包括：一、试剂准备（1）LB培养基。（2）1M IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于10ml ddH2O

中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。 CCY的IPTG是1M的，用时进行1000倍稀释。二、操作步骤（一）获得目的基因 1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。 2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。（二）构建重组表达载体 1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。我们用Soultion I连接。（三）获得含重组表达质粒的表达菌种 1、将连接产物转化大肠杆菌BL21，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。

大规模可溶性蛋白原核表达与纯化步骤

大规模可溶性蛋白纯化实验操作 Hao Lab in SII 1. 取20 μL E.coli BL21目的菌种加入装有10 ml LB培养基的50 ml离心管中，加入氨苄青霉素(Biobasic inc, #AB0028) 至终浓度为100 μg/ml或硫酸卡那霉素(生工，#0408) 至终浓度为50 μg/ml，37°C, 250 rpm, 摇菌过夜。 2. 取过夜培养的菌液8 ml加入400 ml (1:50) 含有相同浓度抗生素的LB中培养，间断检测菌液OD600值，37°C, 250 rpm, 摇菌大约60~120 min，待其OD600值达到0.6~0.8之间，加入0.4 mM IPTG (碧云天，#ST098), 30°C, 220 rpm, 诱导表达3 h。 3. 收集菌液至50 ml离心管中，7,000 × g, 4°C离心3 min, 弃上清收集沉淀，进行下步实验或置于-80°C冰箱保存。摇菌用的锥形瓶用84消毒液浸泡或高压灭菌。 4. 将收集到的菌体重悬于20 ml 冰冷的Lysis buffer中，震荡混匀。以下步骤均置于冰上。 5. 向菌体重悬液加入甘油至终浓度为10%，加入EDTA 至终浓度为0.5 mM，充分混匀。 6. 冰上超声：功率为仪器最大功率的60%，脉冲时间为1 s，间隔时间为1 s，总时间7~15 min。 7. 超声后的蛋白溶液于8,000 × g，4°C离心30 min。 15,000 × g, 4°C离心15 min可省略步骤10。 8. 在步骤7离心的同时。取下20 ml新层析柱(Qiagen, #34964)的帽子并剪掉底部尖端再盖上帽子，加入混匀的50% NI-NTA beads (Qiagen, #S13-26-36-46; GST beads, GE, #17-0756-01) 悬液2 ml。 9. 取下层析柱的帽子使NI-NTA beads重悬液体流净再盖上帽子，加入PBS至总体积约20 ml，用5 ml 移液器轻柔吹打混匀(避免气泡产生)，静置5 min之后取下层析柱的帽子将液体放空并盖上帽子，重复二次。 10. 取步骤7，离心后的上清用0.45 μm滤器(Millipore, #SLGP033RS) 过滤，滤液置于50 ml离心管中。 11. 取适量蛋白溶液将NI-NTA beads重悬并转移到装有蛋白溶液的50 ml离心管中。4°C摇荡过夜。空的层析柱加入约10 ml PBS，4°C保存。 12. 将摇荡过夜的beads和蛋白混合液以50 × g, 4°C离心1 min使beads沉淀。保留上清于4°C冰箱，可以考虑用旧的beads做二次结合。 13. 用10 ml PBS重悬beads, 50 × g, 4°C离心1 min, 弃上清，重复一次。再以20 ml wash buffer 重悬，装入层析柱中，静置5 min, 取下层析柱的帽子，收集0.5 ml流出的液体并保存于2ml离心管中待检测，标记为20W-1，剩余液体流空再盖上帽子。 14. 用20 ml wash buffer重悬NI-NTA beads，静置5 min，取下层析柱的帽子，流空液体，盖上帽子。 15. 用20 ml wash buffer重悬NI-NTA beads，静置5 min，取下层析柱的帽子收集0.5ml流出的液体并保存于2ml离心管中待检测，标记为20W-3，剩余液体液体流空，盖上帽子。 16. 加入5 ml Elution buffer重悬NI-NTA beads，静置5 min，取下层析柱的帽子，收集液体，于15 ml新离心管中并留样品20 μl, 标记为E-1。为盖上帽子。用Nanodrop2000粗测蛋白浓度。再以3 ml Elution buffer 重复三次上述步骤，收集至另一新15 ml离心管中。 17. 回收beads: 洗脱后的NI-NTA beads以20 ml PBS重悬，静置5 min，取下层析柱的帽子，流空液体，盖上帽子。再以20 ml PBS重复两次上述步骤。再用20 ml 0.5 M NaOH重复一次，加入约10 ml 30%乙醇置于4°C保存。 19. 将16步得到的蛋白溶液加入3 KDa的15 ml超滤管(Millpore, #UFC900396)中, 4,000 × g, 4°C离心45 min进行超滤。倒掉超滤管底的废液，将约为15 ml PBS加入超滤管中，轻轻颠倒混匀，4,000 ×g, 4°C离心45 min，倒掉超滤管底的废液。重复超滤四次，最后一次离心1 h。如果16步第一次收集的蛋白溶液粗测浓度大于0.5 mg/ml，可以先超滤第一次洗脱得到的5ml蛋白溶液，其它的再用同一个超滤管进行第二次超滤。纯化后的蛋白溶液留样20 μl标为EC，加入终浓度为40%的甘油，每管100 μl分装，-80°C保存。 SDS-PAGE检测各样品的蛋白浓度及纯度。

原核表达步骤

原核表达及纯化总结教学提纲

原核表达及纯化总结

His标签重组蛋白大量表达及纯化一筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化DH5α鉴定表达载体和目的片段的连接一般为10μL连接体系，此步转化方法如下：取100μL DH5α感受态细胞，加入到10μL连接产物体系中 ↓ 冰上放置30min ↓ 42℃准确热激90秒 ↓ 冰上放置3min ↓ 加入300μL无Amp+ 的LB培养基，37℃ 100rpm/min振荡培养1h ↓ 将400μL菌液全部涂LB平板（含Amp+）水平放置30 min待菌液完全吸收后，在37℃温箱中倒置培养过夜（12~16 h），直至出现单菌落。 2 阳性克隆的PCR鉴定方法如下挑取单菌落于200μL含Amp+LB培养基中（用2.0的离心管），摇床200rpm/min，37℃培养4h，待菌液浑浊后，取1μL做菌液PCR鉴定。 PCR扩增体系如下：取1 μL菌液作为模板反应体系如下：模板 1 μL 10×PCR反应缓冲液（含Mg2+） 2 μL

dNTP(2.5 mmol/L/each) 1.6 μL 上游引物（10 μmol/L） 1 μL 下游引物（10 μmol/L） 1 μL Taq酶（5 U/μL）0.3 μL ddH2O 13.1μL Total 20 μL 条件： 94℃预变性 10min 94℃变性 45s 50℃退火 45s 72℃延伸 1min，30个循环的扩增反应 72℃延伸 10 min 4℃∞ 1%琼脂糖凝胶电泳检测：电泳上样时：Marker DL2000上样3μL 样品（1μL loadingbuffer +6μL PCR产物混匀上样） 100V，20min；紫外透射仪检测，出现目的带的对应菌落为阳性克隆。（注意：记得保存菌种） 3 阳性克隆质粒抽提取阳性克隆菌液200μL，加3ml含Amp+ LB液体培养基，37℃ 200rpm/min 培养3-4h，待菌液浑浊后，进行质粒抽提。质粒抽提方法如下：取1.5mL菌液于1.5mL离心管中 ↓ 12000rpm离心30s，弃上清 ↓

原核表达步骤总结

原核表达步骤原核表达先要将基因克隆到原核表达载体上，然后通过转化到 JM109或BL21等菌株中，诱导表达蛋白，然后进行蛋白纯化。本实验方案的前提是，目的基因已克隆到载体，并已转进入JM109菌株中。 1．鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌JM109或BL21中大量表达（1）制样 1 . 挑取经过双酶切鉴定的单克隆菌落于700ul LB培养基，加入0.7ul Amp（100mg/mL），37o C200r/min摇床培养，过夜活化。 2. 以1：50比例（200ul），将活化的过夜培养物加入10mL LB液体培养基中，加入10uLAmp（100mg/ml），37o C200r/min摇床扩大培养2h-3h，期间取样监控菌液的OD值，控制菌液OD600在0.6-1.0之间，以使大肠杆菌处于最适合表达外源蛋白的生长状态。(一般3h时，菌液浓度及达到标准，但是不同的基因对菌的影响不同，所以第一次实验时需要确定这个最佳时间) 3. 从10ml扩大培养物中取3ml菌液作为不加IPTG的空白对照（CK），其余7ml菌液加入7ul IPTG（储存浓度为0.5mol/l），使IPTG 终浓度达到0.5mmol/l。以200r/min的转速，37o C摇床培养3h。 4. 以5000r/min离心2min收集菌体，倾倒上清，每个离心管收集3ml培养物。 5. 加入1ml dH2O，将管底沉淀用振荡器打散以充分洗涤，8000r/min 离心2min，倾倒上清。 6. 重复步骤5。将离心管中的水倒干净。（二）菌落SDS-PAGE 1. 在收集的菌体中加入200ul 1×SDS PAGE loading buffer(可根据沉淀的量增加或减少loading buffer的量，一般200ul比较合适)。用漩涡器剧烈震荡，确保将管底沉淀震散。 2. 将样品于100℃恒温加热器上开盖加热10min（Marker也要加热）。样品凉后，12000r/min离心3min，取每管的上清点样。上样量一般30ul—40ul，marker 20ul。（3）SDS-PAGE分析 1. 根据目的片段的大小，制作不同浓度的分离胶蛋白分子量 (kDa)凝胶浓度 (%) 4-4020

EMSA操作方法(原核表达纯化蛋白)

三、凝胶滞留试验（EMSA）凝胶迁移滞留试验（electrophoretic mobility shift assays，EMSA）是研究核酸与蛋白质相互作用简单、快速、敏感的方法，目前已经成为转录因子研究的经典方法，并且用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。其基本原理是蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合，电泳时这种复合物比无蛋白结合的自由探针在凝胶中泳动的速度慢，即表现为相对滞后。（一）转录因子-标签融合蛋白和标签蛋白的原核表达纯化以GST标签为例。裂解液：25mM pH7.8Tris-HCl、100mM NaCl、2 mM Na EDTA、1mM DTT和 2 1×Complete Protease InhibitorCocktail。洗脱液：50 mMpH7.8Tris-HCl、200mM NaCl、1mM DTT、0.02%（v/v）Triton X-100和10 mM还原性谷胱甘肽。 EDTA、1mM DTT和1×Complete 透析液：25mM pH8.0 Tris-HCl、1mM Na 2 Protease InhibitorCocktail。 1将转化了pGEX-4T-2载体或者pGEX-4T-2-目的基因重组载体的BL21大肠杆菌在5 mL含100 μg mL-1氨苄青霉素的LB培养液中37℃、200 rpm震荡培养12 h。 2 取1 mL菌液加入100 mL 含100 μg mL-1氨苄青霉素的LB培养液中，37℃、200 rpm震荡培养至OD600为0.5左右。 3 加入IPTG至终浓度为0.5 mM，28℃、200 rpm培养6 h。 4 冰上放置10 min，4℃、3000×g离心1 5 min，收集菌体并称重。 5 每克菌体加入3 mL裂解液，重悬菌体，加入溶菌酶至终浓度为0.5 mgmL-1，在冰上温和地搅动菌液30 min。 6 超声波破碎30 s（破碎10 s停10 s）。 7 4℃、12000×g离心30 min，上清液用0.45μm滤膜过滤，向滤液中加入5 M NaCl，使NaCl的浓度为200 mM。 8 去掉Glutathione Sepharose 4 Fast Flow中的储存液，用5倍树脂体积

原核表达步骤

实验方法与步骤 1 表达质粒的构建及测序分析 1.1 cofilin-1的片段的准备 1.1.1 引物设计根据在GenBank上查找人源cofilin-1的基因序列，用Primer Premier 5.0软件进行上下游引物的设计，并送往上海生物工程技术服务有限公司合成的PCR 引物。引物如下：引物名称序列 F-cofilin-1 5′-AAGTCGACATATGGCCTCCGGTGTG-3′ R-cofilin-1 5′-TCTCTCGAGGGCTCACAAAGGCTTG-3′将以上引物用灭菌的三蒸水稀释成10μmol/L，分装于Eppendorf管中，-20℃冰箱中保存备用。 1.1.2 cofilin-1片段PCR 1 反应体系： 2.5μl KOD polymerase(3’-5’核酸外切酶活性) KOD polymerase buffer 5μl MgSO4 2.5μl DMSO（“万能溶剂”） 2.5μl dNTPMixture 5μl PrimerF（底物） 1.5μl PrimerR 1.5μl Template（模板）5μl ddH2O 25μl Total 50μl 2PCR反应条件：

①94℃预变性3min ②94℃退火30s ③65℃延伸40s ④68℃40s ⑤go to②30个循环 ⑥68℃5min ⑦4℃forever 3 琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测（1）配置浓度为1%的凝胶。称取琼脂糖0.3g，加入30ml 1×TAE电泳缓冲液（Tris-乙酸电泳缓冲液）中，用微波炉加热2min，待凝胶稍冷却，加入2μl EB（溴化乙锭，荧光染色剂）混匀后倾入凝胶铸槽中，插入梳子，并用玻璃棒驱除气泡，待凝胶完全凝结后拔除梳子。（2）把凝胶置于1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中，加样孔置于负极一侧，然后依次在加样孔中加入50μl Marker、50μl样品＋10μl loading buffer(上样缓冲液，可以显示两条带，前面的蓝色的条带是溴酚蓝，代表的片段大小是300bp，后面的有点绿色的条带是二甲苯青，代表的片段大小在4000bp左右)，盖上电泳盖，以100V电压进行电泳。（3）当Marker条带充分分开后即可停止电泳，将凝胶移至保鲜膜上，置于凝胶自动成像仪中分析。 4 割胶回收PCR反应体系的扩增产物，用Omega Bio-Tek公司的Gel Extrection Kit进行回收：（1）将PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下迅速切取含有目的条带的琼脂糖凝胶，放入灭菌的EP管中。DNA在紫外灯下曝光时间不超过30s。（2）称量凝胶块重量，以1g＝1ml进行计算，加入适量体积的binding buffer，55-65℃加热至凝胶完全融化（约7～10min），每隔2～3min震荡一次。（3）将Hibind DNA柱子套在2ml的收集管。将上述步骤（2）的溶液转移至Hibind DNA柱子中，10000×g离心1min，弃滤液。（4）将柱子装回收集管中，加入300μl binding buffer，10000×g离心1min，

原核表达综述

[Merck推荐]原核表达秘笈之宿主菌株选择指南在原核蛋白表达过程中，选择构建一个合适原核表达体系需要综合考虑3大因素：表达载体、宿主菌株、表达诱导条件,以获得最满意的表达效果。事实上，在平时的实验中，最容易被忽视的就是宿主菌的选择——多数人会直接选择自己实验室曾经用过的表达菌株，或者是载体配套的菌株，而不去追究原因——即使表达结果不佳，大多在表达条件和载体上找原因，也不会考究菌株的选择是否适合。作为原核表达的宿主，对外源基因的表达会产生一定的影响，是勿庸置疑的。每一个宿主细胞都像一个微观的小工厂，按照细胞固有的程序完成“你给它们安排的生产任务”——因为很难亲眼观察微观世界中表达是如何进行的，当出现问题时，我们需要经验判断问题所在。宿主细胞对原核表达可能会产生哪些影响呢？知其然还要知其所以然。比如，菌株内源的蛋白酶过多，可能会造成外源表达产物的不稳定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。堪称经典的BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺陷型，也是我们非常熟悉的表达菌株。大名鼎鼎的BL21(DE3)融源菌则是添加T7聚合酶基因，为T7表达系统而设计。真核细胞偏爱的密码子和原核系统有不同，因此，在用原核系统表达真核基因的时候，真核基因中的一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子，从而导致表达效率和表达水平很低。改造基因是比较麻烦的做法，Rosetta 2系列就是更好的选择——这种携带pRARE2质粒的BL21衍生菌，补充大肠杆菌缺乏的七种（AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA 及CGG）稀有密码子对应的 tRNA，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。（已经携带有氯霉素抗性质粒）当要表达的蛋白质需要形成二硫键以形成正确的折叠时，可以选择K–12衍生菌Origami 2系列，thioredoxin reductase (trxB) 和glutathione

原核表达操作

蛋白质的表达、分离、纯化实验标签：蛋白质表达分离纯化蛋白质表达、分离、纯化可以：（1）探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理；（2）供作结构与功能的研究；（3）作为催化剂、营养剂等。详细实验方法原核表达法实验方法原理携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在 37℃，IPTG 诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA ）使镍离子（Ni 2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC ）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。实验材料大肠杆菌BL21 试剂、试剂盒 LB 液体培养基氨苄青霉素Washing BufferElution BufferIPTG 蒸馏水胰蛋白胨酵母粉氯化钠仪器、耗材摇床离心机层析柱离心管移液枪枪头盒烧杯玻璃棒实验步骤一、试剂准备 1. LB 液体培养基：Trytone 10 g ， yeast extract 5 g ，NaCl 10 g ，用蒸馏水配至1000 mL 。 2. 氨苄青霉素：100 mg/mL 。 3. 上样缓冲液：100 mM NaH 2PO 4，10 mM Tris ，8M Urea ，10 mM 2-ME ， pH8.0。 4. Washing Buffer ：100 mM NaH 2PO 4，10 mM Tris ，8 M Urea ，pH6.3。 5. Elution Buffer ：100 mM NaH 2PO 4，10 mMTris ，8M Urea ， 500 mM

GST_talin1融合蛋白的原核表达及纯化

收稿日期:2007-12-22;修回日期:2008-01-11 作者简介:吴　爽(1979-),女,硕士,助教,教学和研究方向,细胞生物学,E 2mail:wushuang 21977@https://www.360docs.net/doc/0015347504.html,;通迅作者:耿建国(1955-),男,博士,研究员,研究方向,细胞粘连与迁移。 GST 2talin1融合蛋白的原核表达及纯化吴　爽 1,2 ,耿建国 2 (1广东药学院基础学院组织胚胎教研室,广州　510006;2中科院生化细胞研究所分子细胞生物学实验室,上海　200031) 摘　要:应用PCR 方法扩增talin1的cDNA,并将其重组入谷胱甘肽转硫酶融合基因表达载体pGEX 24T 21中,获取人源的GST 2talin1融合蛋白,为下阶段深入的研究talin1的结构、功能、及其与之相互作用的蛋白打下基础。经酶切、序列鉴定,选择正确重组子,将其质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),I PTG 诱导表达,用Glutathi one Sephar ose 4B 柱纯化,western bl ot 鉴定。克隆得到了一个2400bp 的talin1的c DNA 片断,重组质粒目的DNA 测序正确,纯化出分子量约为12116k D 的融合蛋白。用基因工程方法使GST 2talin1重组质粒在原核细胞表达并成功纯化出GST 2talin1融合蛋白。关键词:talin;P 2选凝素;GST 2融合蛋白;亲和层析中图分类号:Q51 文献标识码:A 文章编号:1008-9632(2008)03-0033-03 P -选凝素(P -selectin )是一种由细胞产生的粘附分子(adhesion molecules ),存在于细胞表面,能够介导细胞与细胞间或细胞与基质间相互接触和结合。其在炎症反应、凝血机制、甚至在某些肿瘤转移等方面发挥重要作用[1] 。一直以来P 2selectin 受到许多研究者的青睐。P 2selectin 分子的特性到目前为止,人们已有较丰富的研究。本实验室以P 2selectin 的cyt op las m ic domain 为饵从人白细胞cDNA 文库中筛选到几个基因,经测序可知其中之一为talin1(从第1672个氨基酸残基到蛋白末端)。因此本试验利用重组DNA 技术,获得talin1的cDNA,构建了GST 2talin1融合蛋白表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化该融合蛋白,为进一研究talin1与P 2selectin 是否存在相互作用及相互作用机制,奠定了基础。1　材料和方法1.1　材料1.1.1　菌株、质粒　人源talin1的cDNA 及融合表达载体pGEX 24T 21为实验室保存。DH5 α及BL21大肠杆菌感受态购自上海申能博采生物公司。1.1.2　生化试剂和分子生物学试剂　引物由上海生工生物有限公司合成,限制性内切酶、T 4DNA 连接酶购自Pr omega 公司,1kb DNA Marker 、DNA 片断快速纯化及回收试剂盒购自北京鼎国生物技术公司,PCR 试剂购自日本T AK ARA 公司,氨苄青霉素为上海华舜生物公司产品。1.2　方法1.2.1　目的基因的扩增及纯化　根据已公布的人源talin1的cDNA 序列设计talin1的引物,上游引物T1的序列为5′23′at cag tag gaa ttc atg cg gga cct aga cca gg;下游引物T2的序列为5′23′ga agt cat ctc gag gtg ctc atc tcg aag ctc tg,在上下游引物中分别加入EcoR I 和XhoI 酶切位点。PCR 反应总体积为50 μL,包括ddH 2O 4015μL 、10×buffer 5μL 、4dNTP 1μL 、上下游引物各1μL 、模板1μL 、La Taq 酶015μL 。反应条件为:94℃2m in,94℃50s 、56℃50s,72℃2m in,72℃5m in,共35个循环。所获得的PCR 产物以1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。将目的条带切下,用DNA 片断快速纯化回收试剂盒回收。1.2.2　pGEX 24T 212talin1重组质粒的构建　将纯化的PCR 产物和pGEX 24T 21载体用EcoR I 和XhoI 双酶切后,分别回收酶切产物。取回收后的talin1片断815 μL,载体片断015μL,10×T 4DNA 连接酶buffer 1μL,T 4DNA 连接酶013μL,16℃连接过夜。1.2.3　重组质粒的筛选和鉴定　将连接产物全量转化入DH5 α感受态细菌,在含有氨苄青霉素(Amp )的LB 上37℃筛选培养过夜。次日挑取单个菌落,培养12h 后小量抽取质粒,用EcoR I 和XhoI 双酶切,筛选阳性重组质粒并送上海英骏生物技术有限公司测序。 3 3

原核表达

pET原核表达金标准（转） pET, 原核, 表达转自网络 pET，原核表达金标准（转） pET 载体中，目标基因克隆到T7 噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供T7 RNA 聚合酶来诱导表达。Novagen 的pET 系统不断扩大，提供了用于表达的新技术和选择，目前共包括36 种载体类型、15 种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。优点 ?是原核蛋白表达引用最多的系统 ?在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低 ?真正的调节表达水平的“变阻器”控制 ?提供各种不同融合标签和表达系统配置 ?可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌?许多载体以LIC 载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆PCR 产物 ?许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化阳性pFORCE TM 克隆系统具有高效克隆PCR 产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。 pET 系统概述 pET 系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。根据最初由Studier 等开发的T7 启动子驱动系统，Novagen 的pET 系统已用于表达成千上万种不同蛋白。控制基础表达水平

pET 系统提供6 种载体- 宿主菌组合，能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白，所以进行优化选择是必要的。宿主菌株质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌（λDE3 溶原菌）中表达目标蛋白。在λDE3 溶原菌中，T7 RNA 聚合酶基因由lacUV5 启动子控制。未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。而宿主菌带有pLysS 和pLyE 时调控会更严紧。pLys 质粒编码T7 溶菌酶，它是T7 RNA 聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未诱导细胞中转录目标基因的能力。pLysS 宿主菌产生低量T7 溶菌酶，而pLysE 宿主菌产生更多酶，因此是最严紧控制的λDE3 溶原菌。有11 种不同DE3 溶原化宿主菌。使用最广泛的为BL21 及其衍生菌株，它的优点在于缺失lon 和ompT 蛋白酶。B834 菌株为甲硫氨酸营养缺陷型，因此可用35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记。BLR 为recA - 衍生菌株，改善了质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列的目标质粒。两个硫氧还蛋白还原酶( trxB ) 突变菌株(AD494,BL21 trxB ) ，有利于大肠杆菌胞浆中二硫键形成。Origami TM 和OrigamiB 菌株为trxB/gor 双突变，这两个酶是主要还原途径的关键酶。Origami 和OrigamiB 宿主菌的主要优点是能形成正确折迭的含有二硫键的蛋白。新的Rosetta TM 菌株补充了四种大肠杆菌稀有密码子的tRNA ，改善了由于密码子使用频率不同而引起的一些真核蛋白低表达。其它菌株背景包括K-12 菌株HMS174 和NovaBlue ，象BLR 一样为recA - 。这些菌株可稳定表达其产物可能导致DE3 噬菌体丢失的某些目标基因。由于存在F 附加体编码的高亲和力lacIq 阻遏蛋白，NovaBlue 为一个有用的严紧型宿主菌。此外，Novagen 提供了λDE3 溶原化试剂盒，用于制备其它遗传背景的新表达宿主菌。表达高毒性基因或制备新的λDE3 溶原菌的另一替代方法是通过l CE6 感染提供T7 RNA 聚合酶。虽然不如用IPTG 诱导λDE3 溶原菌方便，这种策略也被优先用于一些应用中。

原核表达及纯化方法

原核表达及纯化-His tag 一、原核表达 1.挑取一个单菌落（重组表达载体），接种到10mL LB培养基中（注意抗生素抗性）。37℃，过夜摇菌。 2.次日，将菌液接种到1L LB培养基中（1:50~1:100），继续培养至OD600=0.6 时（0.6~0.8），加1×IPTG诱导4h。（加IPTG前留样（诱导前全菌蛋白） 200μL做SDS-PAGE） 3.收菌： (1)200μL诱导后全菌； (2)小量表达：收集5mL诱导后全菌，12000g离心1min，裂解沉淀，分别收集上清（可溶性）和沉淀（包涵体）中的蛋白。大量表达：收集1L诱导后全菌，4℃，4500g离心15~30min。二、可溶性分析目的：重组蛋白是否表达，是可溶性的还是包涵体形式。根据这个结果选择纯化方法。（1）各用30μL 4×SDS Loading buffer重悬诱导前和诱导后的菌体（200μL）；用500μL 1×Binding Buffer重悬菌体（5mL），超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）；4℃，19000g离心15min，分离上清和沉淀；（2）用30μL 4×SDS Loading buffer重悬沉淀；（3）取10μL上清蛋白加10μL 4×SDS Loading buffer；（4）将诱导前全菌，诱导后全菌，上清蛋白和包涵体蛋白煮沸5~10min。（5）各取10μL 用于SDS-PAGE检测（12%的胶）。三、小量富集实验样品制备：

取5mL诱导全菌，用500μL 1×Binding Buffer（8M Urea）溶解，超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）。4℃，19000g离心15min，取上清用于富集实验。（留样做SDS-PAGE）富集： 1.装柱：取30μL~50μL体积的Ni柱料（纯柱料）于1.5mL离心管中。 2.平衡：向离心管中加200μL 1×Binding Buffer（8M Urea），混匀1min，700g 离心1min，去上清；重复一次。 3.上样：将制备的上清蛋白加到离心管中，混匀30min（混匀仪上）。700g离心1min，上清即为穿透（留样做SDS-PAGE）。 4.淋洗：加50μL 1×Binding Buffer（8M Urea，5mM咪唑），混匀，700g离心1min，分离上清，留样做SDS-PAGE；加50μL 1×Binding Buffer（8M Urea，10mM咪唑），混匀，700g离心1min，分离上清，留样做SDS-PAGE；加50μL 1×Binding Buffer（8M Urea，20mM咪唑），混匀，700g离心1min，分离上清，留样做SDS-PAGE； 5.洗脱：加50μL 1×Elution Buffer（8M Urea，50mM咪唑），混匀，700g离心1min，分离上清，留样做SDS-PAGE；加50μL 1×Binding Buffer（8M Urea，3000mM咪唑），混匀，700g离心 1min，分离上清，留样做SDS-PAGE； 6.取少量柱料做SDS-PAGE；注：用定量工作液估计蛋白的浓度：2μL待测蛋白溶液+180μL定量工作液，根据颜色的变化可以估计蛋白的浓度。对富集过程进行监控。四、大量富集实验样品制备：用50mL 1×Binding Buffer（8M Urea）溶解菌体，超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）或者用高压破碎仪（推荐）。4℃，19000g 离心15min，取上清用于富集实验。（留样做SDS-PAGE）富集： 1.装柱：将1mL Ni柱料装入层析柱，用至少三个柱体积的超纯水以工作流速（每滴/3S）压实柱料，以获得均一的柱床，同时避免带入气泡。

原核蛋白表达