原核蛋白表达常见问题解析
原核蛋白表达常见问题解析
1、为什么目的蛋白总是以包涵体的形式出现？
在原核蛋白表达纯化中目的蛋白经常发生错误的折叠，并聚集成为
包涵体。经过诱导，目的蛋白通常可达细胞总蛋白的50%以上。虽然有一定比例的蛋白以可溶的单体形式存在，而多达95%（甚至更多）的蛋白则在包涵体中。实验过程中，可以采取降低诱导温度，例如25–30°C，或降低IPTG浓度(0.01–0.1mM)并延长诱导时间，还有采用特别的
培养基等方法获得更多的可溶蛋白。
2、跨膜蛋白为什么很难表达？
跨膜蛋白的表达成功率相对较低是一个实验结果，究其原理，目前
众说纷纭很多种理论。以我们浅薄的理解层面来看，主要有以下几个
原因：
跨膜蛋白一般都是强疏水性的氨基酸分子和亲水性的分子跳跃式
的连接，形成的亲水疏水的一个最简单的跨膜化学结构，这种结构与
信号肽结构相似，对于原核细胞来说，简单的细胞器很难像真核细胞
一样完成信号肽识别及切除、引导内质网、高尔基体重新包装及分泌
这一复杂过程，有些蛋白是多次跨膜，对于原核细胞来说几乎是不可
能完成的任务。
另外，对于疏水性的片段，在原核细胞中极易形成包涵体，疏水
性多肽会抑制翻译过程，甚至与原核膜结构融合形成毒性，出于生物
自我保护的本能，所有的细胞器都会停止合成蛋白的过程。
3、如何选择蛋白表达宿主菌？
4、我们有哪些原核蛋白纯化方式？如何选择不同的纯化方式？
答：我们公司的蛋白纯化方法大致分为亲和纯化、离子交换、切胶
回收三类。
1、常规情况下，一般携带融合标签（His标签，GST标签，sumo标签，Fc标签），我们可以通过Ni柱、GST柱、Protein A等进行亲和纯化
获得融合蛋白，用亲和纯化的方法一般可以获得85%以上纯度的蛋白，
亲和纯化的方便快捷。
2、如果需要目的蛋白不含有任何标签，怎么选择纯化方式？。
（1）可表达融合蛋白，用蛋白工具酶切割融合蛋白，再进行纯化除去
工具酶。此方法能快速得到蛋白。
（2）可表达不含标签的蛋白，进行离子、分子筛、疏水等纯化，通过AKATA纯化设备获得蛋白。
3、如果需要获得蛋白作为抗原，可以直接通过切胶回收的方式，此方
法获得蛋白纯度较高，进行免疫动物后得到的抗体进行WB反应，灵敏
度较高。
5、表达得到的蛋白是有活性的么？
答：需要让蛋白有活性的条件很复杂，合适的缓冲液体系、盐浓度、蛋白的折叠状态甚至检测活性的方法的细微差别都可能导致活性
的强弱有无，一般情况下，上清表达的蛋白要比包涵体经过变复性纯
化后得到的蛋白活性要好，我们尽量从上清中获得蛋白，期许蛋白形
成的折叠最接近活性状态，这也是我们擅长的。但是在实际实验条件下，我们无法承诺表达纯化的蛋白一定具有客户期望的生理活性。
6、是否所有的位点特异性蛋白酶都有一样的酶切特性，只是识别位点不同？
答：位点特异性蛋白酶(例如凝血酶、肠激酶和Xa因子)通常被用来切割融合蛋白。这些酶的活性和第二点酶切倾向性很不相同。凝血酶在这三种中是特异性活性最高的，能够有效切质量比仅为1:2000的蛋白。Xa因子似乎对于切点周围的序列很敏感，经常会出现特异性位点切割不理想却发生别的位点被切割的情况。肠激酶的专一性是上述三种中最好的，但由于切割效率低（通常要求质量比达到1:10）而显得比较昂贵。另一个需要考虑的问题是：切割完成之后，是否需要去除蛋白酶。在质量比比较高的酶切反应进行完后，通常要通过色谱法处理。比较方便可行的方法是采用生物素化凝血酶结合链亲和素琼脂糖一起使用。尽管没有一种蛋白酶完美无缺，凝血酶还算的上是活性高、专一性好的典型。
7、如果去除信号肽，会不会影响蛋白本身的表达？
答：重组蛋白表达强度不受信号肽调控，所以去除信号肽不会影响蛋白质表达。但是信号肽一方面参与蛋白质折叠成特定空间结构，另一方面其还决定蛋白最终被定位到特定的亚细胞区，一般蛋白只有在特定亚细胞区才能发挥其功能，所以信号肽对蛋白最终活性还是有很大影响的。
8、如何确认表达的蛋白就是我的目的蛋白？
答：可以从以下三个方面予以确认。
首先在分子序列层面，构件好表达载体后，会对表达质粒进行测序确认，有测序文件可以查证。
其次表达过程中，会设置诱导和未诱导的两种裂解液对比，通过SDS-PAGE检测到蛋白条带的差异，在目的蛋白的理论大小位置处，可以看到差异。
最后，可以通过标签抗体或目的蛋白抗体进行WB验证。
9、导致蛋白表达量低或者不表达的原因有哪些？哪类蛋白不容易表达？
答：做原核蛋白表达纯化的人常常被一些问题所困扰，—般来说，在重组蛋白表达宿主的选择中，对原核来源的蛋白质应当只选择大肠杆菌进行表达，而不是真核表达系统，因为通常真核生物的翻译后修饰能力和改善的折叠能力对原核蛋白来说是不必要的，甚至是不想要的。对于真核蛋白来说情况就不同了，因为有大量的实例表明，真核蛋白能在大肠杆菌中进行成功地表达。当使用原核系统表达真核蛋白时，一个非常重要的考虑是: 像所有生物一样，大肠杆菌对密码子的使用有偏性，其tRNA丰度反映了这一偏性。表达含有数个大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白时会受对应的 tRNA丰度的限制而效率不高。tRNA短缺会导致翻译移框、氨基酸错误掺入及翻译提前终止等。这个问题在稀有密码子集中分布于N端时尤其明显。不过，通过合成密码子优化的基因或者使用稀有密码子tRNA丰度增加的商业化工程菌株（如Rosetta菌株，EMD——Novagen）可以避免这个问题。在多数情况下, 如果重组基因是在亲缘关系很远的生物宿主中表达, 密码子偏性也需要加以矫正。
现场检查笔录经典范例
现场检查笔录的制作要领 一、提高现场检查笔录证明力的“四要素” 现场检查笔录是行政执法重要的证据形式之一，所记录的内容是否客观、真实，直接涉及到笔录的证明力。但是，如何保证现场检查笔录所记录内容的客观、真实？全面把握抓住以下“四要素”是核心和关健， 1、必须注意查验和记载在场人员的身份、职务等情况。 在实施现场检查时，由于被检查方陪同人员的职务分工不同，客观上造成了对一些情况的了解和对一些问题的认知不同。因此，弄清现场陪同检查人员的姓名、身份、职务及所负责的工作十分重要和必要。 2、必须注意、记载现场检查的过程。 记载过程应注意： （1）应客观描述实施检查的方式、方法和步骤。 要记录实施检查人员组成情况及其分工情况，特别是要注明陪同检查的证人、被检查方人员参与检查过程的情况。要注意如实、准确地记录哪些人实施了某一具体检查活动。 （2）需要抽样检验的，一定要记录抽样的方式，方法和步骤，包括抽样方案的制定及实施过程、抽样实施人、产品批量/生产日期及规格型号、抽样器具、样品数量及封存形式、抽样单编号等信息。（3）要注意，对生产过程、原料、包装物及检查现场等情况的记载。（对检查现场情况作描述，有利于从空间角度对事实予以证实）。
3、必须注意记载涉案物品价格、数量的获取途径、方式。 涉案物品的数量、价格多少，是行政法律赋予的自由裁量权的依据。因此，应注重对涉案物品价格、数量的采集及相关证据的记录。（1）要记明物品的放置场所、码放位置、码放方式； （2）有包装的要记明包装形式和包装标注内容等情况； （3）要记明规格型号、生产日期/批号； （4）要记明获取相关数据的途径、方式。相对人口述的，要写明据什么人介绍；现场清点的，要证明清点方式、参与人；查看帐册、单据的，要记明查看的什么帐册或什么单据并记明编号，必要时制作复制件； （5）散装物品的计量，要记明使用的计量器具的状态及计量过程；（6）数据一定要确切，不能出现“大约”、“等”之类的字眼，计件的一定要精确到个位数，不能估算。 4、必须注意对相关证据、活动、文书制作等情况进行相应的记载。 现场检查笔录作为证据，应与其他证据相互关联和相互印证；因此，在现场检查笔录上有必要记明对书证、物证的采集、抽样过程、封存过程及其文书的制作等情况。如涉及封存（扣押）或登记保存的，应记明封存（扣押）或登记保存决定书、封条的编号，相对人和执法人员应同时在封条上签字。采集的物证、书证一定要由相对人签字确认，在现场检查笔录上也要作相应的记录。对票据、帐册复印时，要由相对人确认票据、帐册复印件与原件相符(核对无误)并签字。
原核蛋白表达常见问题解析
原核蛋白表达常见问题解析 1、为什么目的蛋白总是以包涵体的形式出现？ 在原核蛋白表达纯化中目的蛋白经常发生错误的折叠，并聚集成为 包涵体。经过诱导，目的蛋白通常可达细胞总蛋白的50%以上。虽然有一定比例的蛋白以可溶的单体形式存在，而多达95%（甚至更多）的蛋白则在包涵体中。实验过程中，可以采取降低诱导温度，例如25–30°C，或降低IPTG浓度(0.01–0.1mM)并延长诱导时间，还有采用特别的 培养基等方法获得更多的可溶蛋白。 2、跨膜蛋白为什么很难表达？ 跨膜蛋白的表达成功率相对较低是一个实验结果，究其原理，目前 众说纷纭很多种理论。以我们浅薄的理解层面来看，主要有以下几个 原因： 跨膜蛋白一般都是强疏水性的氨基酸分子和亲水性的分子跳跃式 的连接，形成的亲水疏水的一个最简单的跨膜化学结构，这种结构与 信号肽结构相似，对于原核细胞来说，简单的细胞器很难像真核细胞 一样完成信号肽识别及切除、引导内质网、高尔基体重新包装及分泌 这一复杂过程，有些蛋白是多次跨膜，对于原核细胞来说几乎是不可 能完成的任务。 另外，对于疏水性的片段，在原核细胞中极易形成包涵体，疏水 性多肽会抑制翻译过程，甚至与原核膜结构融合形成毒性，出于生物 自我保护的本能，所有的细胞器都会停止合成蛋白的过程。 3、如何选择蛋白表达宿主菌？
4、我们有哪些原核蛋白纯化方式？如何选择不同的纯化方式？ 答：我们公司的蛋白纯化方法大致分为亲和纯化、离子交换、切胶 回收三类。 1、常规情况下，一般携带融合标签（His标签，GST标签，sumo标签，Fc标签），我们可以通过Ni柱、GST柱、Protein A等进行亲和纯化 获得融合蛋白，用亲和纯化的方法一般可以获得85%以上纯度的蛋白， 亲和纯化的方便快捷。 2、如果需要目的蛋白不含有任何标签，怎么选择纯化方式？。 （1）可表达融合蛋白，用蛋白工具酶切割融合蛋白，再进行纯化除去 工具酶。此方法能快速得到蛋白。 （2）可表达不含标签的蛋白，进行离子、分子筛、疏水等纯化，通过AKATA纯化设备获得蛋白。 3、如果需要获得蛋白作为抗原，可以直接通过切胶回收的方式，此方 法获得蛋白纯度较高，进行免疫动物后得到的抗体进行WB反应，灵敏 度较高。 5、表达得到的蛋白是有活性的么？ 答：需要让蛋白有活性的条件很复杂，合适的缓冲液体系、盐浓度、蛋白的折叠状态甚至检测活性的方法的细微差别都可能导致活性 的强弱有无，一般情况下，上清表达的蛋白要比包涵体经过变复性纯 化后得到的蛋白活性要好，我们尽量从上清中获得蛋白，期许蛋白形 成的折叠最接近活性状态，这也是我们擅长的。但是在实际实验条件下，我们无法承诺表达纯化的蛋白一定具有客户期望的生理活性。
清华经济管理学院案例
清华经济管理学院案例清华同方员工股票期权计划 清华同方员工股票期权计划 中文摘要： 本案例主要讨论了员工股票期权计划在解决委托－代理问题上发挥的作用，深入分析了人力资本的激励机制。本案例结合清华同方的实际，探讨了在中国实施股票期权计划的内外环境，对管理机构、参与范围、执行价格、期权股票来源、数量和分配方式等关键条款的设计进行了研究，总结了一般性的规律与方法。 关键字：股票期权计划人力资本激励机制方案设计 Abstract The case mainly focuses on the Employee Stock Option Plan, its application in solving principal-agent problem and its incentive to human capital. The case also analyses the external environment and internal conditions required when implementing stock option plan. Based on the practice of Tsinghua Tongfang Co. LTD and the current circumstance in China, we discusses the key items such as administrator, eligible employees, exercise price, the total number of shares granted and allocation method, and then summarizes the general rules applicable to design stock option plan. Key Words: Stock Option Plan Human Capital Incentive mechanism Scheme Design 2000年9月，清华同方股份有限公司（以下简称"清华同方"）的董事会秘书正在忙碌地准备员工股票期权计划方案。尽管这一计划早在一年多前就开始酝酿，但员工股票期权计划对于清华同方真的必要吗？期权行权时的股票来源如何解决？到底要拿出多少股份用于股票期权计划？参与对象、行权价格等具体条款又怎么确定呢？尤其是这样的方案怎么才能获得各级主管部门认可，兼顾股东、管理层等各方面的利益呢？作为一家上市公司，一举一动更要考虑二级市场的反应。因此，清华同方的员工持股计划方案必须更加详细、更具有操作性。
餐饮服务食品安全执法中现场检查笔录的常见问题及制作要点
餐饮服务食品安全执法中《现场检查笔录》的常见问题和对策 现场检查笔录是行政执法人员在日常食品安全监督检查或者案件调查过程中对现场进行实地检查时所做的客观记录，是一种法定的证据形式，是实施行政处罚的重要证据，具有较强的证明效力。但在实际工作中，许多基层执法人员对其重要性认识不足，在制作现场检查笔录时不认真，造成笔录质量不高，证据效力降低或者无效。 一、二师卫生监督系统现场检查笔录常见的问题 （一）程序违反规定 1、不记载出示执法证件，表明执法身份的程序。国家局制定的餐饮服务食品安全监管执法文书现场检查笔录中没有预设填制执法人员姓名和执法证号的空白处，在书写笔录时很容易将出示执法证件情况和执法人员姓名及执法证号记录下来。根据《行政处罚法》的规定，执法人员在进行现场检查时，必须向当事人出示行政执法证件，才能依法实施检查，未记载出示执法证件、表明执法身份就无法证明遵守了法定程序。 2、现场检查笔录终了处无2名以上执法人员签名。有的笔录只有1名执法人员签名，有的笔录只有当事人签名而执法人员忘记签名，这就无法证明现场检查时执法人员是2人以上。根据《行政处罚法》的规定，行政机关在进行检查时，执法人员不得少于2人。 （二）用语不规范
1、使用模糊性语言。对物品数量描述时使用“大约”、“大概”、“估计”等模糊词语，或“多”、“少”、“余”、“左右”等不定词语，用“卫生一般”、“垃圾遍地”、“冰箱里乱放东西”、“制度不健全”等抽象的词语代替具体的描写，这是制作现场检查笔录的一大禁忌。 2、使用简略语甚至写错别字。使用含义不清，容易发生歧义的简略语，如“无证经营”、“无证上岗”、“无三防设施”等。这种简略语不能准确具体的描写出违法行为，还容易产生歧义，无法根据检查笔录对事实进行定性。笔录中更不能出现错别字，错别字不但影响笔录的制作质量，也容易产生不良后果，特别是被检查人的名称要写对，这既是对被检查人的尊重，也可减少以后可能发生诉讼时的麻烦。 3、使用推定性质的结论性语言。如有的笔录将现场未见餐饮服务许可证记录为无餐饮服务许可证，将检查时未发现购进票据记录为无购进票据等，有的笔录进行主观认定，先入为主，使用“违法”、“非法”、“擅自”等词语，或者直接在笔录中叙述当事人违反的法律条款。笔录应只记载现场实况，不作评价和结论。 4、与询问笔录、告知书等混淆。有的现场检查笔录出现“当事人陈述”购进物品的数量、价格等内容，使现场检查笔录变成了询问笔录。有的现场笔录中包含事先告知的内容，这类现场检查笔录混淆了与询问笔录、行政告知文书的不同内涵和功能，没有发挥现场笔录证明违法事实客观存在的特有功能。 （三）内容不全面
用友ERP-U8操作中的常见问题分析及解决方案(一)
用友ＥＲＰ－Ｕ８操作中的常见问题分析及解决方案(一) 摘要：用友ERP－U8财务软件作为目前多数学校会计电算化教学的操作软件，在实际教学过程中，由于学生的误操作往往会出现许多与教学要求不相符的问题，需要结合多年的教学实践，进行归纳、总结并提出相应的解决方案，以帮助学生和财务工作者更好地理解与应用。关键词：财务软件；会计电算化；解决方案 会计电算化课程是会计及会计电算化专业的核心课程，目前，该课程常用用友ERP－U8作为教学软件，学生在实践过程中往往出现许多问题，本人通过这几年的教学指导，对教学中学生遇到的难点问题进行归纳分析，提出解决对策，以进一步提高学生的实际操作能力，同时，也给广大财务人员提供帮助。 一、系统管理问题 问题1：其他系统在运行时，屏幕出现提示：某某机器正在执行某操作，当前功能暂时不能执行，请在退出其他功能后再执行当前功能。分析：以系统管理员身份注册进入系统管理，执行“视图一清空单据锁定”，再执行“视图一刷新”，退出系统管理即可。 问题2：新建账套后，系统提示操作员非法。分析：原因是操作员没有该账套的操作权限，系统不允许进入该账套进行操作。方法：以Admin或账套主管的身份注册进入系统管理系统，进行相应赋权即可。 问题3：当执行“数据权限分配”功能，打开“权限浏览”窗口时，在“用户及角色”下没有出现想要出现的操作员，以至于无法进行相应授权操作。分析：用友ERP－U8软件提供了记录级和字段级数据权限的精确控制功能，对于数据级和金额级权限设置，必须是在系统管理的功能权限分配之后才能进行，如果在系统管理中没有给有关操作员赋权，就会导致这一问题。方法：执行总账子系统“系统菜单”中的“选项”功能，在“账簿”选项卡中选择“明细账查询权限控制到科目”、“凭证审核控制到操作员”。 二、科目编码方案错误 问题：在进行编码方案设置时，系统默认32222，且一级编码不能调整。分析：用友ERP－U8的会计编码沿用的仍然是2000年之前财政部颁布的会计科目编码，即一级编码除外资企业和股份制企业为4位数外，其余均为3位数。但新的《企业会计制度》规定所有企业的会计科目一级编码均为4位数。方法：在建账时行业性质选择为新会计制度科目或股份制，这一问题就解决了。 三、凭证填制错误 问题1：填制凭证时，屏幕上出现“日期不能超前建账日期”或“日期不能滞后系统日期”的提示。分析：“日期不能超前建账日期”是指填制凭证时录入的业务日期跳到系统建账以前了。“日期不能滞后系统日期”是指填制凭证时录入的业务日期超过了计算机系统日期(CMOS时钟所记录)，即跑到未来去处理业务了。方法：区别不同的情况，或重新正确建账，正确设定总账启用日期；或在填制凭证时，调整业务日期；或退出总账系统，更改计算机系统日期后重新登录总账系统，再接着进行填制凭证的工作。 问题2：填制凭证时，当使用应收账款、应收票据科目或应付账款、应付票据科目时，屏幕上出现“不能使用应收系统]的受控科目”或“不能使用应付系统]的受控科目”的提示。分析：在会计科目设置中，定义的客户、供应商核算的科目将自动被设置成应收系统、应付系统的受控科目。方法：如果不需要由应收系统、应付系统受控，应在进行相应会计科目设置时，不指定受控系统，而设置为空，即由总账直接控制，再填制凭证时，就不会再出现前面的提示了。 四、审核、查询凭证错误 问题1：不能进行审核凭证操作。分析：(1)当前操作员没有进行此项操作的权限，审核凭证的功能菜单被隐藏。(2)所要审核凭证的筛选条件不满足实际情况，找不到欲审核的凭证。(3)
现场检查笔录常见问题
《药品监督行政处罚程序规定》第二十一条规定：“凡能证明案件真实情况的书证、……、现场检查笔录等，为药品监督管理行政处罚证据”。最高人民法院《关于行政诉讼证据若干问题的规定》第６３条也规定：“（２）鉴定结论、现场笔录、勘验笔录、档案材料以及经过公证或者登记的书证优于其他书证、视听资料和证人证言……”。由此可见，现场检查笔录证明效力大于证人证言、又可作为定案依据,是药品监管部门发现案源、立案调查、查办案件、实施行政处罚的重要证据之一,其所记录的内容是否客观真实，直接关系到笔录的证明力。这就要求制作现场检查笔录要做到客观、真实、全面、准确、规范。但在实际操作中，许多基层执法人员对其重要性认识不够，做记录时马马虎虎，造成现场检查笔录质量不高，影响办案效率。 现场检查笔录常见问题 一、用语的主观性。有的药监执法人员在制作现场检查笔录时加入主观内容。主要有：一是对物品数量描述不准确。使用“大约”、“大概”、“估计有”等模糊词语，或“多”、“余”、“左右”等不定词语。如“医用脱脂棉重约200克”，“土霉素片240片左右”等等。二是现场进行主观认定。使用“违法”、“非法”、“擅自”等词语。如：××卫生室违法使用过期失效的药品等。三是现场检查笔录与调查笔录混淆不清。如有的现场检查笔录以“据当事人口述”、“×××讲（交待）”的形式来确认当事人购进、售出物品的数量、价格等。 二、记录不全面。有的执法人员不能全面记录检查的内容、方法、结果和相关人员的行为等情况。所记的主体性内容不够全面。主要有：一是只重视记现场检查的结果而不记录检查活动的相关环境。如“注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠”外包装标示[贮藏]：“密闭、在冷处保存”，该卫生室放在常温下保存，而未记录当天常温温度是多少度。二是只记录执法人员的检查行为而未记录被检查人的活动状况。如被检查人是在售药，还是在配合查找有关票据等。三是只记录发现药品的数量而未记录其数据来源和获取途径。如未记录在检查过程中确定的药品、器械数量是通过盘点、称重，还是查票据获得的。五是只记录当事人未签名的事实而未注明其不签名的真正原因。 三、记录的内容前后不一致。对现场检查药品、器械需要采取先行登记保存或查封扣押措施的，未在现场检查笔录中记载。有的还出现查封扣押（先行登记保存）的物品清单上注明的药品、器械的名称、计量单位、规格、批号、效期、生产日期、生产厂家、数量，与现场检查笔录记录的同类品名不一致。出现证据之间不能相互印证。 四、不重视辅助性项目填写，记录不完整。有的执法人员对现场检查笔录中辅助性项目填写不完整，甚至漏填。主要有：检查时间填写不准确，页码漏填。有的只填写现场检查的日期和开始时间，结束时间忘记填，页码漏填；检查地点填写不准确。大多按被检查单位《许可证》正本上地址填写，也有的地址在《许可证》副本上已变更，但其正本未变，这样地址填写就不真实。如卫生院，检查地点是药房、药库、还是哪个职能科室表达不清；单位名称不写全称，被检查人身份填写不准确。如村卫生室《医疗机构执业许可证》上注明的法定负责人，大多是村主任，而不是该卫生室负责人或从业人员，这样在现场检查笔录上只填写法定代表人的姓名，不填写卫生室真正的负责人；也有的卫生院《医疗机构执业许可证》上注明的法定代表人是前任，没有填写现任负责人姓名等相关内容。被检查人如果是个人，没有填写其身份证号码。
建筑施工安全检查存在较常见问题
建筑施工安全检查存在较常见的问题 一、安全管理 1、工程项目未办理安全监督登记手续 2、未按规定配备专职安全员 3、项目经理、安全员无安全生产知识考核合格证 4、未制定安全管理目标(伤亡控制指标和安全达标、文明施工目标 5、专业性较强的项目未单独编制专项施工方案 6、专项方案(安全措施针对性不强 7、专项方案(安全措施未落实 8、无书面安全技术交底 9、安全技术交底针对性不强 10安全技术交底未履行签字手续 11无定期安全检查记录 12、检查出事故隐患未按规定整改 13、未按规定进行安全教育 14、班组安全活动无记录 15、特种作业人员无证上岗 16、无现场安全标志总平面图 17、未按现场安全标志总平面图设置安全标志
18、未建立工伤事故档案 二、文明施工 1、施工现场未按规定设置围挡 2、施工现场未实施封闭管理,无门卫及门卫制度 3、进出大门未设置车辆冲洗台 4、污水外流污染路面 5、材料未按规定堆放整齐 6、易燃易爆物品未分类存放 7、未经处理泥浆水、污水排入城市管网 8、在建工程兼做宿舍 9、生活区、办公区与施工区无明显分隔措施 10. 食堂不符合卫生要求 11、食堂未使用清洁燃料 12、厕所无水冲设施 13、厕所卫生不符合要求 14、现场未按规定配置消防灭火器材 15、未执行动火审批手续和动火监护 16、无消防器材平面布置图 17、宿舍通风差,不整洁 18、现场无保健区药箱、急救措施和急救器材 19、未建立施工不扰民措施
三、脚手架 1、脚手架高度超过规范规定无设计计算书 2、脚手架施工方案未经审核批准 3、脚手架施工方案不具体、不能指导施工 4、脚手架立杆少底座 5、脚手架无扫地杆 6、架体与建筑物少拉结 7、未按规定设置剪刀撑 8、脚手架未按规定设置密目式安全网 9、施工层未设 1.2m 高防护栏杆 10. 施工层未设 18cm 高挡脚板 11、脚手架搭设未按规定办理验收手续 12、施工层脚手架内立杆与建筑物之间未进行封闭 13、架体未设上下通道 14、卸料平台未经设计计算 15、悬挑式钢平台安装不符合设计要求 16、落地式卸料平台支撑系统与脚手架连结 17、卸料平台无荷载限定标志 18、脚手架杆件搭设间距不符合要求 四、施工用电
用友财务软件中常见问题及解答
用友软件常见问题汇总 一、用友软件安装及登陆常见问题汇总 1问题现象：在安装SQL SERVER 2000时，提示某个程序挂起，安装必须重启，重启仍是这个问题 解决方法：修改注册表。 （1）开始——运行——输入regedit，点击确定。 （2）在HKEY_LOCAL_MACHINE\SYSTEM\CurrentControlSet\Control\Session Manager右边找到PendingFileRenameOperations项目，并删除它。这样就可以清除安装暂挂项目。再次安装正常。 2问题现象：工作站不能登录服务器的几种解决方法： 解决方法a服务器的自带防火墙是否开启，若开启——网上邻居——右键——属性——本地连接——右键——属性——高级——设置——关闭 b工作站修改hosts文件，打开C:\WINNT\system32\drivers\etc目录下的hosts文件（以记事本的方式打开即可），在最后一行写上服务器的ip和服务器的计算机名称，保存即可。 3问题现象：‘服务无法启动或依存的标记被删除’ 服务器安装完毕登陆正常，但是客户端安装完毕，重启以后，用友通无法正常启动，手工在服务里面启动，提示‘服务无法启动或依存的标记被删除’ 解决方案: 在注册表里面 HKEY_LOCAL_MACHINE\SYSTEM\CurrentControlSet\Services将UFNet值删掉，重启电脑，这时不再提示服务没有启动，配置服务器，登陆正常。 4问题现象: 打开用友通时，提示：运行时错误70，拒绝的权限。 解决方案:提示一般有两种可能: 一是机器名字有特殊字符造成, 二是DLL文件组件注册有问题,请使用服务工具--752里的注册DLL文件的工具, 如果还不能解决,请重装一下软件. 5问题现象：登录软件的时候提示“无法连接到服务器”，出现提示：“运行时错误‘48’：文件未找到：Client.Dll”。点击确定后出现提示：“运行时错误‘440’：Automation”。 解决方法一： 重启计算机按F8，进入‘最后一次正确配置’模式，启动后再正常启动计算机即可。解决方法二： 先停止SQL和用友通的服务，把client.dll从system32复制到system下，再把system32下的那个删掉，重新注册system下的client.dll，再重启sql和用友通的服务。 二、总账系统常见问题汇总 1、问题描述：当总账模块月末结账的时候，提示：工作未通过检查，不可以结账。 解决方法：当出现这个提示的时候，可以点击“上一步”按钮，查看工作报告。 当出现以下情况时，总账不能结账： 1)、本月有未记账的凭证（即使该凭证已经作废）； 2）、总账和明细账对账不平（总账与辅助明细账对账不平没有影响）； 3）、其他模块没有结账（这是尤其需要注意的，当同时启用了其他模块，需要其他模块结账之后，总账才能结账。）。
蛋白体外表达与纯化
蛋白体外表达与纯化 随着后基因组时代的到来，蛋白质组成为科学研究的热点。蛋白质作为生命机体的主要活动的承担者，其体外表达与纯化在研究相应基因的功能上有重要意义。 蛋白体外表达系统按其表达宿主可分为原核表达系统，真核表达系统和哺乳动物细胞表达系统。 一：原核表达系统 原核表达系统的宿主菌主要以大肠杆菌为代表，大肠杆菌表达体系是目前应用最广泛的外源基因表达体系，这也是外源基因表达的首选体系。该表达体系的优点：遗传学和生理学背景清楚；容易培养；外源基因经常可以高效表达及操作简单、周期短、成本低等。其不足之处是不能进行典型真核细胞所具有的复杂的翻译后修饰；广泛的二硫键的形成及外源蛋白组装成蛋白复合体的能力也受到限制；另外外源基因产物在大肠杆菌中易形成不溶的包涵体；有时由于真核mRNA的结构特性及密码子使用频率与大肠杆菌的差异，而的不到足够的产物。二：真核表达系统 真核表达系统的宿主菌主要以酵母表达系统为代表，酵母基因表达系统的载体通常既能在酵母中进行复制也能在大肠杆菌中进行复制，形成所谓酵母菌――大肠杆菌穿梭载体。因以大肠制备质粒DNA较方便，通常利用大肠杆菌系统构建酵母载体以简化手续，缩短时间。作为基因表达系统的宿主应该具备以下条件：安全无毒，不致病；遗传背景较清楚，容易进行遗传操作；容易进行载体DNA的导入；培养条件简单；有良好的蛋白分泌能力；有类似高等真核生物的蛋白翻译后修饰功能。 三：哺乳动物细胞表达系统 由于本专业不涉及哺乳动物细胞表达系统的应用，故此不赘述。 表达载体的种类及相应的分离纯化方法 作为表达载体必须具备以下特征：稳定的遗传复制、传代能力，无选择压力下能存在于宿主细胞内；具有显性的筛选标记；启动子的转录是可调控的；启动子的转录的mRNA能够在适当的位置终止；具有外源基因插入的多克隆位点。 在原核表达系统中常用的表达载体有：PET－载体系列，用这类载体表达出的外源蛋白在Ｎ端或Ｃ端或两端均具有his tag。用该载体表达出的外源蛋白通过其末端组氨酸与Ni2+的结合以亲和层析的方法而纯化。PGEX－载体系列，用这类载体表达出的外源蛋白以GST融合蛋白的形式存在，以Glutathione Sepharose 4B 柱亲和层析得以纯化。 本实验将以PGEX4T—3为载体，在大肠杆菌BL21DE3菌株中表达外源蛋白OsWAK2为例介绍蛋白的表达与纯化。 实验方法与步骤： 一：目的蛋白的粗提 1．构建载体，转化BL21DE3宿主菌感受态细胞 2．挑单菌落于10ml 含有60ug/ ml的液体LB培养基中37℃200rpm摇培16—18小时3．取5 ml摇好的菌液加到250 ml备好的含有60ug/ ml的液体LB培养基中37℃200rpm 摇培，至对数生长中后期
清华同方台式电脑总是蓝屏怎么办
清华同方台式电脑总是蓝屏怎么办 清华同方台式电脑总是蓝屏的解决方法一： 第一种:如果你的电脑经常蓝屏，不管是你没有重装系统,还是后来重装系统了,还是出现蓝屏,那说明是你硬件的问题，直接硬件就是内存条或者是显卡。一般这是因为内存或显卡金手指氧化或者和插槽接触不良，导至的蓝屏现象.处理方法是：你可以先断电,打开机厢,把内存拨出来,用橡皮擦对着金手指的部位(也就是有铜片的地方,)来回的擦上几回,然后换一根内存槽插回,就ok,如果这样做了还是蓝屏，你就要检查显卡，说明是显卡的问题，也是用同上的方法做，就ok了。一般百分之八十的电脑都可以解决. 第二种: 就是硬盘出现坏道了，当这个电脑读到坏道处，就卡住了，后台还在不断的运行,cpu占有率马上达到很高,并接着就兰屏了，处理方法：一般情况下是用hdd进行修复，如果修复不了，哪就只能换硬盘了。 第三种情况:就是显存和显卡的显存芯片出现虚焊,也会不断的出现兰屏,方法就是给显存补加焊锡就ok, 第四就是:电脑中毒了,造成了内存过入了病毒,破坏了操作系统，造成无法引导系统，就一直蓝屏，哪就要重装系统,或者一键还原。 5第五种:是因为非法关机,比如停电,强行关机,或者突然死
机,开机以后就会现自检,也是蓝屏,在读秒,一般情况下,让它自己读过去,就ok了,可能会浪费一点时间,但一定要它自己读过去,因为这样是硬盘检查磁盘的过程,一般第一次读过去了,下次就不会出现了..千万不要用esc停止,不能下次又会蓝屏,重新来一次.如果每天都要自检的话,哪你就要在进入系统后:开始--运行----“chkntfs /t:0”,一般问题就解决了. 清华同方台式电脑总是蓝屏的解决方法二： 1.如果使用盗版系统，有可能会出现这样的问题，建议：使用正版。 2.如果对电脑没有影响或偶尔出现不用管它，重启电脑会自动消失。 3.病毒引起的，升级杀毒软件，对电脑全盘杀毒。 4.硬件上的原因，主要是内存条不兼容引起的，必要时更换内存。 5.系统或其它软件引起的，检查电脑年、月、日是否正确。 6.驱动不稳定，重新安装或及时更新驱动。同时使用优化大师、360、鲁大师清理垃圾文件也会出现该问题。 7.打开或关闭ie、qq、游戏、播放器等出现该内存不能为read 或written，首先想到的可能就是这款软件的问题。 8.如果您使用ie8，打补丁后，很多网友反映不太稳定。最简单的解决办法就是：下载更换其它浏览器。比如：360安全浏览器、世界之窗浏览器、傲游等. 9.系统本身有问题，及时安装官方发行的补丁，必要时重装系统
现场施工质量和安全检查存在的问题和隐患及整改措施
现场施工质量和安全检查 存在的问题和隐患及整改措施 为进一步加强公司外墙外保温施工质量和安全生产工作，强化提高施工人员对质量和安全生产重要性的意识，严防质量和安全事故的发生，认真落实“百年大计、质量第一”及“关爱生命、以人为本”的管理核心和“安全生产、预防为主”的重要性，保障外墙外保温施工质量和安全生产工作的顺利进行。经公司研究决定，于2012年5月份开始不定期对公司所有的外墙外保温施工现场进行质量和安全生产检查，彻底排查施工中存在的质量和安全隐患，对检查发现的质量和安全问题及隐患积极的督促落实整改，严格杜绝发生质量和安全事故。 一、安全方面的存在问题和隐患： 从检查情况看，一部分项目部质量和安全生产工作落实的较好，进步的较快。但是一部分项目部对安全意识和安全生产的重要性认识不足，发现存在很多安全隐患和问题，主要表现在以下几个方面： 1.不按时召开施工人员班前会及进行施工用具使用前的安全检查。 2.劳保防护用品质量差和佩戴不规范：⑴安全代用其他绳子代替甚至不戴，低挂高用。⑵不戴安全帽和不系帽带。 3.吊篮使用不规范，私自加长和超重。 4.使用吊篮时易坠落物品未固定。 5.用电不规范，私拉乱接，不用的电器设备未进行防雨淋措施。 6.脚手架未按标准架设，铺板未固定和使用探头板。
7.高温天气和雨季施工防雷击。 8.施工现场安全防火意识差未配备灭火器材。 9. 起重件和吊篮下人员逗留。 10. 材料堆放混乱，建筑垃圾无及时清运，文明施工管理较差。 二、存在以上问题的主要原因： 1.项目经理和公司驻工地代表及现场管理人员对“百年大计、质量第一”及“关爱生命、以人为本”的管理核心意识和“安全生产、预防为主”重要性严重认识不足，对安全生产管理重视不够，未正确认识“管生产必须管安全”，“谁主管、谁负责”安全生产的原则。 2.施工人员素质低，安全意识淡薄，管理难度大，安全教育未落实到位，施工人员安全生产意识得不到有效提高。 3. 项目经理和公司驻工地代表及现场管理人员管理检查督促不到位和不敢大胆管理，管理素质较为粗放，对施工现场检查不及时、不认真，未履行管理职责，安全生产管理的作用发挥不到位，对现场存在的质量和安全隐患视而不见和进行管理，对检查中指出的问题置若罔闻，不虚心接受和认真督促整改，助长了施工人员在质量和安全生产方面采取能拖就拖、得过且过的不正之风。 三、措施和办法： 1. 项目经理和公司驻工地代表及现场管理人员要特别重视单位安全生产工作的重要性，进一步增强抓好隐患排查工作的责任感，明确自己的责任，始终把安全生产工作摆在各项工作的首位来抓，不断提高对安全生产重要性的认识。牢固树立“安全第一、预防为主”的理念，时刻把施工人员的生命
安全生产执法过程中常见问题
安全生产执法过程中常见问题 肖承雄 在实际执法过程中仍然存在着一些问题，影响了安全生产行政执法的规范运行。 一、先调查后立案。按照《安全生产违法行为行政处罚办法》第十八条的规定，对发现生产经营单位及有关人员应当给予行政处罚的行为的，应当予以立案，填写统一的立案审批表，并全面、客观、公正地进行调查，收集有关证据。这一条是行政机关依法启动行政处罚程序的重要环节，是对案件进行深入调查取证的前提。立案必须填写立案审批表，同时附上相关的材料（举报材料、上级交办或者有关部门移交的材料等），由分管领导批准，指定两人以上办案人员负责调查处理。但是在实践中，执法人员常常是发现案件后即对案件进行调查取证，待案件事实清楚、取证结束后才填写立案审批表，这就导致虽然有立案，但此时的立案是在案件调查取证后进行的，违背了法律设定“立案”程序的本意，使“立案”失去了法律意义，这种做法是不符合法律程序要求的。 二、询问笔录不规范，内容表述不清。行政案件调查询问笔录，是办案人员为了查清案件事实而对当事人和其他相关人员进行询问调查时制作的书面记录，是行政执法机关依法办案的重要证
据。询问笔录制作的质量好坏，将直接关系到案件的调查和处理，也是日后行政复议、行政诉讼的重要证据。可以说，询问笔录在案件的查处过程中起到了举足轻重的作用。但是，在制作询问笔录的过程中往往存在以下问题： （1）案前准备工作不充分，没有拟好询问调查提纲。有的执法人员认为做调查提纲麻烦，摸着石头过河，导致心中没有数，不知道先问什么后问什么，该问什么不该问什么，该记什么，不该记什么，有时候很简单的违法事实，却询问的前言不搭后语，甚至一件小事情多次找当事人也询问不清，没有目的性，孰不知，我们面对的当事人是十分复杂的，询问笔录一次不清楚，下次再问，有可能什么也得不到，或者得到相反的结果，也有可能错过调查机会。因此好的调查提纲，能使执法人员对整个案件的调查脉络清楚，因此，在调查询问笔录制作前，执法人员应先熟悉案情，分清主次，掌握笔录重点所在，对要解决的问题做到心中有数，拟好提纲，这样调查时才能有的放矢，也不会被被调查人漫无边际的话语搞乱方向，到时候记录有用的信息，舍弃无的信息，既简明扼要又做到事实清楚； （2）询问当事人的时候不表明身份。《中华人民共和国行政处罚法》第三十七条明确规定，行政机关在调查或者进行检查时，执法人员不得少于两人，并应当向当事人或者有关人员出示证件。也就是说，执法人员在对有关场所进行检查、询问当事人和相关人员之前必须向相对人表明身份，这是法律所规定的不可
建筑施工安全检查常见问题汇总
建筑施工安全检查常见问题汇总 一、安全管理 1、工程项目未办理安全监督登记手续。 2、未按规定配备专职安全员。 3、项目经理、安全员无安全生产知识考核合格证。 4、未制定安全管理目标（伤亡控制指标和安全达标、文明施工目标）。 5、专业性较强的项目未单独编制专项施工方案。 6、专项方案（安全措施）针对性不强。 7、专项方案（安全措施）未落实。 8、无书面安全技术交底。 9、安全技术交底针对性不强。
10、安全技术交底未履行签字手续。 11、无定期安全检查记录。 12、检查出安全隐患未按规定整改。 13、未按规定进行安全教育。 14、班组安全活动无记录。 15、特种作业人员无证上岗。 16、无现场安全标志总平面图。 17、未按现场安全标志总平面图设置安全标志。 18、未建立工伤事故档案。 二、文明施工 1、施工现场未按规定设置围挡。
2、施工现场未实施封闭管理，无门卫及门卫制度。 3、进出大门未设置车辆冲洗台。 4、污水外流污染路面。 5、材料未按规定堆放整齐。 6、易燃易爆物品未分类存放。 7、未经处理泥浆水、污水排入城市管网。 8、在建工程兼做宿舍。 9、生活区、办公区与施工区无明显分隔措施。 10、食堂不符合卫生要求。 11、食堂未使用清洁燃料。 12、厕所无水冲设施。
13、厕所卫生不符合要求。 14、办公区、宿舍区、施工现场未按规定配置消防灭火器材。 15、未执行动火审批手续和动火监护。 16、无消防器材平面布置图。 17、宿舍通风差，不整洁。 18、现场无保健区药箱、急救措施和急救器材。 19、未建立施工不扰民措施。 三、脚手架 1、脚手架高度超过规范规定无设计计算书。 2、脚手架施工方案未经审核批准。 3、脚手架施工方案不具体、不能指导施工。
用友u8使用中常见问题分析
用友u8使用中常见问题分析 [提要] 在多年从事会计电算化用友u8教学过程中，发现有一些问题学生容易反复出错，软件容易反复出现同样的问题。本文就有关的解决方法与技巧进行阐述。 关键词：用友u8；UFO报表；出纳签字 一、出纳无法签字，或者无法打开现金日记账及银行日记账 原因分析：出现这种情况首先需要检查是否给出纳赋予了相关的权限，有的学生比较粗心，建账时建了几个账套，赋予权限时没有选好相应要赋权的账套，结果要给A账套赋权变成了给B赋权，自然出纳在A账套中就没有相关权限。 正确的做法应该是：先选好左边用户后，再到右边选好对应要赋权的账套，或者先选账套，再选用户，关键是一定保证用户赋权是在正确的账套中。 如果不是第一个原因，其次要检查在会计科目设置中是否进行了指定会计科目的操作，如果指定了，操作是否正确。有的学生会把现金与银行存款同时指定在现金科目中，或是全部指定在银行存款科目中。正确的做法应该是：从基础设置-会计科目-编辑—指定科目，先点左边的现金总账，在待选科目中选择现金科目添加到右边的已选科目内，然后再点左边的银行总账科目，在待选科目中选择银行存款添加到右边的已选科目内。这样，现金总账的已选科目内只有现金，银行总账的已选科目内只有银行存款。如果已选科目内出现其他的内容则是错误的，要改正。 如果不是上述两种原因，则要检查是否学生已经先进行了记账操作甚至有的学生已经进行了结账的操作。按照用友软件设置的程序，应该先进行出纳签字，再记账，最后结账。出现这种问题，主要是学生没有掌握用友财务软件流程操作方面的程序，如果进行了结账，则要先取消结账：用账套主管的身份登录，点期末-结账-选择好要反结账的月份-同时按CTRL+SHIFT+F6取消结账；然后再取消记账：用账套主管的身份登录，点期末-对账-CTRL+H出现恢复记账前账套已经激活的提示，点凭证下恢复记账前账套-最后一次记账即可。 二、利用软件自动结转期间损益时，金额数值显示红字 原因分析：由于用友软件设计会计科目时，是默认费用类科目是借方表示增加，如果表示减少也不能计入贷方，而是在借方用红字表示，例如取得利息收入1，000，则在财务费用借方输入-1，000，按确定后会变成红字1，000。同理收入类科目是贷方表示增加，表示减少则在贷方输入负数。例如投资收益亏损1，000，则要在投资收益贷方输入-1，000，按确定后会变成红字1，000。如果做会计凭证时把借贷方方向弄反，费用类在贷方有正数或收入类在借方有正数，则采用自动期间损益结转会出现红字。我们利用报表模板自动生成利润表时，用友
笔录及现场检查笔录的制作事项
1、违法行为当事人发案的来龙去脉或当事人与被检查场所的关系； 2、场所的概况。情况复杂的场所应交代方位，必要时绘图说明 3、与违法行为有关的物品、工具、设施的名称、规格、数量、状况、摆放位置、使用情况及相关的书证、物证； 4、与违法行为有关的旁证人员的情况，包括当事人及其无利害关系人对此事了解情况； 5、执法人员检查的活动及结果； 6、当事人在执法活动中的异常表现及其行为； 7、现场询问当事人、旁证人员，现场照片、录像、绘图，当事人主动提交的证据的情况； 8、交代取证、强制措施的情况。情况复杂、规模较大的，可以按照分工，由检查人员按照各自的检查任务，分别制作笔录，但最后应制作汇总笔录，总领整个笔录情况。 9、《现场检查笔录》应在现场检查时当场制作，不能今天检查，第二天才完成笔录。 10、笔录写好后要交给当事人阅读或向其宣读，并由当事人签章(逐页)。当事人拒绝签名或不能签名的应当注明原因，并且由2名以上执法人员在笔录上签字。有其他人在场时，可由其他人签名。法律、法规和规章对现场检查笔录的制作形式另有规定的，从其规定。 11、客观实录，不加评论。追求客观真实，是制作笔录的真谛，应该用纪实、叙述的写作手法来记录检查的情况，切忌在笔录中作评论、推断。现场笔录应该是执法人员在现场所看、所听的实录，而不应是询问笔录。 12、贴近案情，详略得当。可以采取“由大到小”、“由粗到细”的方法，首先简要描述大环境、方位地点，再收缩到具体需要重点检查的位置；从具体数量、现场痕迹等等作好记录。对与具体案情关联不大的内容，可以简写，而对于与案情关联紧密的人员情况、工具、检查过程，甚至能证明案件事实的地面、物品、痕迹、损毁物的状况都应详记，并尽可能地加以固定、提取。 13、抓住重点，讲究技艺。现场检查中，往往可以意外地发现一些对定案十分关键的证据，要注意策略，可以采取以虚掩实、迂回反抄的方法将这些证据予以固定、提取。 制作现场检查笔录 现场检查笔录是我们烟草执法机关对涉嫌违法当事人或涉嫌违法的卷烟依法进行检查时，对检查情况制作的书面记录，它是一种法定的证据形式，是一种十分规范的法律文书。但是有些执法人员在制作现场检查时候，不仅现场检查笔录有空项，而且往往容易出现以下问题，从而造成现场检查笔录证据效力降低或者无效。 （1）现场检查笔录有空项；
用友ERP-U8操作中的常见问题分析及解决方案(1)
用友ＥＲＰ－Ｕ８操作中的常见问题分析及解决方案摘要：用友ERP－U8财务软件作为目前多数学校会计电算化教学的操作软件，在实际教学过程中，由于学生的误操作往往会出现许多与教学要求不相符的问题，需要结合多年的教学实践，进行归纳、总结并提出相应的解决方案，以帮助学生和财务工作者更好地理解与应用。 关键词：财务软件；会计电算化；解决方案 会计电算化课程是会计及会计电算化专业的核心课程，目前，该课程常用用友ERP－U8作为教学软件，学生在实践过程中往往出现许多问题，本人通过这几年的教学指导，对教学中学生遇到的难点问题进行归纳分析，提出解决对策，以进一步提高学生的实际操作能力，同时，也给广大财务人员提供帮助。 一、系统管理问题 问题1：其他系统在运行时，屏幕出现提示：某某机器正在执行某操作，当前功能暂时不能执行，请在退出其他功能后再执行当前功能。分析：以系统管理员身份注册进入系统管理，执行“视图一清空单据锁定”，再执行“视图一刷新”，退出系统管理即可。 问题2：新建账套后，系统提示操作员非法。分析：原因是操作员没有该账套的操作权限，系统不允许进入该账套进行操作。方法：以Admin或账套主管的身份注册进入系统管理系统，进行相应赋权即可。 问题3：当执行“数据权限分配”功能，打开“权限浏览”窗口时，在“用户及角色”下没有出现想要出现的操作员，以至于无法进行相应授权操作。分析：用友ERP－U8软件提供了记录级和字段级数据权限的精确控制功能，对于数据级和金额级权限设置，必须是在系统管理的功能权限分配之后才能进行，如果在系统管理中没有给有关操作员赋权，就会导致这一问题。方法：执行总账子系统“系统菜单”中的“选项”功能，在“账簿”选项卡中选择“明细账查询权限控制到科目”、“凭证审核控制到操作员”。 二、科目编码方案错误 问题：在进行编码方案设置时，系统默认32222，且一级编码不能调整。分析：用友ERP－U8的会计编码沿用的仍然是2000年之前财政部颁布的会计科目编码，即一级编码除外资企业和股份制企业为4位数外，其余均为3位数。但新的《企业会计制度》规定所有企业的会计科目一级编码均为4位数。方法：在建账时行业性质选择为新会计制度科目或股份制，这一问题就解决了。 三、凭证填制错误 问题1：填制凭证时，屏幕上出现“日期不能超前建账日期”或“日期不能滞后系统日期”的提示。分析：“日期不能超前建账日期”是指填制凭证时录入的业务日期跳到系统建账以前了。“日期不能滞后系统日期”是指填制凭证时录入的业务日期超过了计算机系统日期(CMOS时钟所记录)，即跑到未来去处理业
大规模可溶性蛋白原核表达与纯化步骤
大规模可溶性蛋白纯化实验操作 Hao Lab in SII 1. 取20 μL E.coli BL21目的菌种加入装有10 ml LB培养基的50 ml离心管中，加入氨苄青霉素(Biobasic inc, #AB0028) 至终浓度为100 μg/ml或硫酸卡那霉素(生工，#0408) 至终浓度为50 μg/ml，37°C, 250 rpm, 摇菌过夜。 2. 取过夜培养的菌液8 ml加入400 ml (1:50) 含有相同浓度抗生素的LB中培养，间断检测菌液OD600值，37°C, 250 rpm, 摇菌大约60~120 min，待其OD600值达到0.6~0.8之间，加入0.4 mM IPTG (碧云天，#ST098), 30°C, 220 rpm, 诱导表达3 h。 3. 收集菌液至50 ml离心管中，7,000 × g, 4°C离心3 min, 弃上清收集沉淀，进行下步实验或置于-80°C冰箱保存。 摇菌用的锥形瓶用84消毒液浸泡或高压灭菌。 4. 将收集到的菌体重悬于20 ml 冰冷的Lysis buffer中，震荡混匀。以下步骤均置于冰上。 5. 向菌体重悬液加入甘油至终浓度为10%，加入EDTA 至终浓度为0.5 mM，充分混匀。 6. 冰上超声：功率为仪器最大功率的60%，脉冲时间为1 s，间隔时间为1 s，总时间7~15 min。 7. 超声后的蛋白溶液于8,000 × g，4°C离心30 min。 15,000 × g, 4°C离心15 min可省略步骤10。 8. 在步骤7离心的同时。取下20 ml新层析柱(Qiagen, #34964)的帽子并剪掉底部尖端再盖上帽子，加入混匀的50% NI-NTA beads (Qiagen, #S13-26-36-46; GST beads, GE, #17-0756-01) 悬液2 ml。 9. 取下层析柱的帽子使NI-NTA beads重悬液体流净再盖上帽子，加入PBS至总体积约20 ml，用5 ml 移液器轻柔吹打混匀(避免气泡产生)，静置5 min之后取下层析柱的帽子将液体放空并盖上帽子，重复二次。 10. 取步骤7，离心后的上清用0.45 μm滤器(Millipore, #SLGP033RS) 过滤，滤液置于50 ml离心管中。 11. 取适量蛋白溶液将NI-NTA beads重悬并转移到装有蛋白溶液的50 ml离心管中。4°C摇荡过夜。空的层析柱加入约10 ml PBS，4°C保存。 12. 将摇荡过夜的beads和蛋白混合液以50 × g, 4°C离心1 min使beads沉淀。 保留上清于4°C冰箱，可以考虑用旧的beads做二次结合。 13. 用10 ml PBS重悬beads, 50 × g, 4°C离心1 min, 弃上清，重复一次。再以20 ml wash buffer 重悬，装入层析柱中，静置5 min, 取下层析柱的帽子，收集0.5 ml流出的液体并保存于2ml离心管中待检测，标记为20W-1，剩余液体流空再盖上帽子。 14. 用20 ml wash buffer重悬NI-NTA beads，静置5 min，取下层析柱的帽子，流空液体，盖上帽子。 15. 用20 ml wash buffer重悬NI-NTA beads，静置5 min，取下层析柱的帽子收集0.5ml流出的液体并保存于2ml离心管中待检测，标记为20W-3，剩余液体液体流空，盖上帽子。 16. 加入5 ml Elution buffer重悬NI-NTA beads，静置5 min，取下层析柱的帽子，收集液体，于15 ml新离心管中并留样品20 μl, 标记为E-1。为盖上帽子。用Nanodrop2000粗测蛋白浓度。再以3 ml Elution buffer 重复三次上述步骤，收集至另一新15 ml离心管中。 17. 回收beads: 洗脱后的NI-NTA beads以20 ml PBS重悬，静置5 min，取下层析柱的帽子，流空液体，盖上帽子。再以20 ml PBS重复两次上述步骤。再用20 ml 0.5 M NaOH重复一次，加入约10 ml 30%乙醇置于4°C保存。 19. 将16步得到的蛋白溶液加入3 KDa的15 ml超滤管(Millpore, #UFC900396)中, 4,000 × g, 4°C离心45 min进行超滤。倒掉超滤管底的废液，将约为15 ml PBS加入超滤管中，轻轻颠倒混匀，4,000 ×g, 4°C离心45 min，倒掉超滤管底的废液。重复超滤四次，最后一次离心1 h。 如果16步第一次收集的蛋白溶液粗测浓度大于0.5 mg/ml，可以先超滤第一次洗脱得到的5ml蛋白溶液，其它的再用同一个超滤管进行第二次超滤。 纯化后的蛋白溶液留样20 μl标为EC，加入终浓度为40%的甘油，每管100 μl分装，-80°C保存。 SDS-PAGE检测各样品的蛋白浓度及纯度。