原核表达融合蛋白

广义的原核表达，是指发生在原核生物内的基因表达。狭义的原核表达，常出现于生物工程中。是指通过基因克隆技术，将外源目的基因，通过构建表达载体并导入表达菌株的方法，使其在特定原核生物或细胞内表达。

表达载体：为了获得高水平的基因表达产物，人们通过综合考虑控制转录、翻译、蛋白质稳定性及向胞外分泌等诸多方面的因素，设计出了许多具有不同特点的表达载体，以满足表达不同性质、不同要求的目的基因的需要。通常关心的表达载体质粒上的元件包括：启动子、多克隆位点、终止密码、融合Tag（如果有的话）、复制子、筛选标记或报告基因等。现在常用的pET表达系统以及GST-融合蛋白表达系统。

复制子：通常表达载体都会选用高拷贝的复制子。pSC101类质粒是严谨方式复制，拷贝数低，pCoE1，pMBI(pUC)类的复制子的拷贝数高达500以上，是表达载体常用的。通常情况下质粒拷贝数和表达量是非线性的正相关，当然也不是越多越好，超过细胞的承受范围反而会损害细胞的生长。如果碰巧需要2个质粒共转化，就要考虑复制元是否相容的问题。

筛选标记和报告基因：氨苄青霉素抗性是最常见的筛选标记，卡那霉素或者是新霉素次之，通常是另一个载体的筛选标记用。四环素，红霉素和氯霉素等已经日渐式微。抗性基因的选择要注意是否会对研究对象产生干扰，比如代谢研究中要留意抗性基因编码的酶是否和代谢物相互作用。在表达筛选中要注意的问题应该就是LB倒板前加抗生素的温度，温度过高容易导致抗生素失效。对于做表达来说，如果不是要研究启动子的强弱，通常比较少关心或者用到报告基因吧。绿色荧光蛋白是最常用的报告基因了。其他还有半乳糖苷酶、荧光素酶等。一些融合表达Tag也有报告基因的功能。

启动子：启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一。从转录模式上看有组成型表达和诱导调控型表达。lac和Tac，PL和PR，T7是最常用的启动子。

终止子：转录终止子对外源基因在大肠杆菌中的高效表达有重要作用，即控制转录的RNA长度提高稳定性，避免质粒上异常表达导致质粒稳定性下降。放在启动子上游的转录终止子还可以防止其他启动子的通读，降低本底。转录终止子有两类，Rho因子作用下使转录终止mRNA和根据模版上的对称序列形成发夹结构而终止mRNA。常见的是rrnB rRNA操纵子的T1T2串连转录终止子。

核糖体结合位点：启动子下游从转录起始位点开始延伸的一段碱基序列，其中能与rRNA16S亚基3'端互补的SD序列对形成翻译起始复合物是必需的，多数载体启动子下游都有SD序列，也有些载体没有。

表达菌株：表达菌株是我们往往最容易忽视的一点。目前绝大多数重要的目的基因都是在大肠杆菌中表达的。不同的表达载体对应有不同的表达菌株，一些特别设计的菌株更有助于解决一些表达难题。将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：

易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。

表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：

（1）选择标志的编码序列；

（2）可控转录的启动子；

（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；

（4）一个多限制酶切位点接头；

（5）宿主体内自主复制的序列。

原核表达一般程序如下：

获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测

一、试剂准备

1、LB培养基。

2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。

二、操作步骤

（一）获得目的基因

1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。

2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。

（二）构建重组表达载体

1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。

（三）获得含重组表达质粒的表达菌种

1、将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。

2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。

3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。

（四）诱导表达

1、挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃过夜培养。

2、按1∶50比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的300ml培养瓶中, 37℃震荡培养至OD600≌0.4-1.0（最好0.6，大约需3hr）。

3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM作为实验组,两组继续37℃震荡培养3hr。

4、分别取菌体1ml, 离心12000g×30s收获沉淀，用100μl 1%SDS重悬，混匀, 70℃10min。

5、离心12000g×1min，取上清作为样品,可做SDS-PAGE等分析。

6、如果表达蛋白出现在包涵体中，请参考包涵体复性实验

7、如果提取的蛋白浓度不够或含有很多碎片，可采取透析的方法浓缩蛋白，过虑小分子片段。

三、注意事项

1、选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑。如为方便纯化，可选择融合表达；如为获得天然蛋白，可选择非融合表达。

2、融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。

原核表达GST融合蛋白的一些技巧

一、在培养基中加2％的葡萄糖可以抑制lac启动子引发的本底表达，而不会影响IPTG诱导的由tac 启动子控制的表达。(在《分子克隆实验指南》下册1219页提到：最大程度诱导lac启动子需要cAMP激活蛋白（CAP）的参与，而细胞在缺葡萄糖的培养基中生长时CAP活性很高... 这样就容易理解那个加入葡萄糖防止包涵体的方法了。）

二、在提高可溶表达方面可以：

1.20－30度诱导

2.缩短诱导时间

3.在菌液密度较高时短时间诱导

4.加强通气

将表达分成两个阶段，前一个阶段为质粒生长阶段，主要保证质粒的稳定性和提高质粒的拷贝数；后一个阶段为融合蛋白表达阶段，待细菌生长达饱和以后，诱导蛋白表达.

GST融合蛋白构建、表达与纯化

GST 表达融合蛋白载体 pGEX-KG 大小：5006bp ，氨苄青霉素抗性（Amp r ），IPTG 诱导表达酶切位点：BamHI 930、SmaI 937、EcoRI 962、XbaI 966、NcoI 974、SalI 980、XhoI 985、SacI 992、 HindIII 994 GST 分子量：构建pGEX-KG-YFG 重组质粒 1、分析所感兴趣的基因（your favorite gene, YFG ） Primer Premier 5.0软件，分析YFG 含有哪些酶切位点，注意是否与pGEX-KG 载体的多克隆位点有重合 2、确定合适的双酶切位点

3、设计PCR上、下游引物 Primer Premier 5.0软件，设计PCR上、下游引物酶切位点外最多含6个碱基 3’端不是A，最好是G或C，但是不推荐使用GC或CG结尾 3’端至少保证有10个碱基完全配对得分（Rating）大于70 [注意] 上游引物：是否添加适当碱基，确保不打乱开放阅读框下游引物：添加终止密码子（UAA、UAG、UGA） 4、引物合成及保存合成：上海生工生物工程技术服务有限公司（Email：beijing@https://www.360docs.net/doc/dd4329941.html,，Tel：81767586）；纯化方法：柱层析or聚丙烯酰胺凝胶电泳？；价格1.30/碱基保存：贮存浓度：100pmol/μl（100μM），工作浓度：10pmol/μl（10μM），-20°C保存 5、PCR扩增YFG

模板：质粒10ng/μl稀释少量-20°C保存引物：10pmol/μl（10μM）-20°C保存 Taq酶：NEB Quick-Load Taq 2×Master Mix 扩增片段小于2.0kb 反应条件（1）预变性94°C 5 min （2）变性94°C 30 s （3）退火待定30 s （4）延伸72°C 待定（5）重复2-5 25-30个循环（6）补平缺口72°C 10 min （7）暂存10°C [注意] 退火温度：参考4（G+C）+2（A+T）－4（互补碱基），参考Ta Opt（Primer Premier 5.0）延伸时间：Taq酶：1kb/min 循环数小于30，减少错配琼脂糖电泳检测PCR产物 0.8%有效分离范围：10~0.8kb；1.0%有效分离浓度7~0.5kb 50ml TAE加入5μl EB母液（5mg/ml） 100V，30-45min 拍照或者紫外灯下切胶回收 6、构建pGEX-KG-YFG 酶切：双酶切PCR产物、pGEX-KG 回收：PCR产物直接回收、pGEX-KG电泳之后切胶回收连接：pGEX-KG 50ng、插入片段150ng 转化铺平板：Amp r 挑单克隆：Amp r（四个菌落足够了）鉴定：小提质粒酶切or菌体PCR 7、转化BL21（DE3）pLysS菌株检测GST融合蛋白的表达（1）冰上融化BL21（DE3）pLysS感受态细胞（天根）（2）2 ml离心管中，加入25μl BL21+ 3μl质粒（300-500ng），混匀（质粒≤感受态1/10）（3）冰上放置30min （4）42°C，90s

His_FemA融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

【收稿日期】2012-04-27【基金项目】湖南省自然科学基金资助课题(10JJ5027);中南大学自由探索研究创新基金(2010112001166)【作者简介】(1971-)，男，副主任技师，医学博士，硕士生导师，从事细菌耐药性及耐药机制研究，Email :zoumingx-iang@126．com ;范学工，通讯作者，教授，博士生导师， Email :xgfan@hotmail．com 文章编号:1005- 376X (2012)10-0878-05【论著】 His-FemA 融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达邹明祥1，李军1，邬国军2，武文君3，张宁洁1，刘文恩1，范学工4 (1．中南大学湘雅医院检验科，湖南长沙410008;2．中南大学基础医学院微生物学系，湖南长沙410078;3．河南中医学院第一附属医院检验科，河南郑州450000;4．中南大学湘雅医院感染病科，湖南长沙 410008) 【摘要】目的构建His 标签的金黄色葡萄球菌甲氧西林耐药相关蛋白FemA 的融合蛋白表达载体，并在大肠埃希菌中表达，为进一步研究femA 基因的生物学功能和临床应用奠定基础。方法根据GenBank 中金黄色葡萄球菌femA 基因序列，利用Primer Premier 5．0设计PCR 引物，并在引物的5'加入BamH I 及Sal I 酶切位点;以金黄色葡萄球菌基因组DNA 为模版，PCR 扩增出femA 基因片段。将目的DNA 片段及质粒pQE30分别进行双酶切、连接并转化大肠埃希菌DH5α;阳性克隆以PCR 、双酶切及测序进行鉴定。将鉴定正确的pQE30-femA 重组质粒转化大肠埃希菌JM109，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG )诱导表达His-femA 融合蛋白;采用SDS-PAGE 及Western blot 分析对表达蛋白进行验证。结果经PCR 、双酶切鉴定及序列测定，证实重组质粒pQE30-femA 构建成功;重组质粒pQE30-femA 转化大肠埃希菌JM109经IPTG 诱导后， SDS-PAGE 和Western blot 分析显示表达出53kD 目的蛋白;经Bandscan 软件分析，目的蛋白质在4h 的表达量占细胞总蛋白的27．5%。结论成功构建了His-FemA 原核表达载体(pQE30-femA )，并在大肠埃希菌中高效表达。【关键词】金黄色葡萄球菌;femA 基因;原核表达;融合蛋白【中图分类号】R378．1+1 【文献标识码】A Construction of His-FemA fusion protein expression vectors and the expressions in pro-karyotic cells ZOU Ming-xiang 1， LI Jun 1，WU Guo-jun 2，WU Wen-jun 3，ZHANG Ning-jie 1，LIU Wen-en 1，FAN Xue-gong 4 (1．Department of Clinical Laboratory ，Xiangya Hospital of Central South University ，Changsha 410008，China ;2．Department of Microbiology ，School of Basic Medicine ，Central South University ，Changsha 410078，China ;3．Department of Clinical Laboratory ，the First Affiliated Hospital of Henan University of Traditional Chinese Medicine ，Zhengzhou 450000，China ;4．Department of Infectious Diseases ，Xiangya Hospital of Central South University ，Changsha 410008，China ) 【Abstract 】Objective To construct His-tagged FemA fusion protein expression vectors ，and express it in E．coli and establish foundation for further studies．Methods PCR primers were designed using Primer Premier 5．0software according to the sequence of femA gene in GenBank．Two restriction endonuclease recognition sites BamH I and Sal I were added to the 5'end of the primer．Genomic DNA from S．aureus was used as the templete for PCR amplification of femA gene．The obtained femA gene and plasmid pQE30were double-enzyme digested respectively ，ligated and transferred into DH5α．The positive clones were selected and the recombinant plasmid pQE30-femA was identified by PCR ，restriction endonuclease analysis and DNA sequencing．Then the identified pQE30-femA was transformed into E．coli JM109and the target protein expression was in-duced by IPTG．The expressed product was identified by SDS-PAGE and Western blot．Results Verified by PCR ，double-en-zyme digested assessment and sequencing ，recombinant plamid pQE30-femA was successfully constructed．SDS-PAGE and Western blot analysis revealed that the recombinant plasmid pQE30-femA expressed a 53kD target protein in E．coli JM109． Bandscan software analysis showed that the expressed target protein at 4h accounted for about 27．5%of the total bacterial pro-tein．Conclusion The His-tagged femA fusion protein expression vectors (pQE30-femA )was successfully constructed and high-effectively expressed in E．coli ．【Key words 】Staphylococcus aureus ;FemA gene ;Prokaryotic expression ;Fusion protein 金黄色葡萄球菌是威胁人类健康的重要致病菌，可引起化脓性感染、食物中毒、表皮剥脱综合征以及血流感染等多种疾病。随着抗菌药物的广泛使用，金黄色葡萄球菌的耐药现象日趋严重［1，2］。其中，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA )不仅具有严重的多重耐药性，同时具有广泛的流行性，极大地增加了患者和社会的医疗负担，已成为全球严重的公共卫生

原核蛋白表达常见问题解析

原核蛋白表达常见问题解析 1、为什么目的蛋白总是以包涵体的形式出现？在原核蛋白表达纯化中目的蛋白经常发生错误的折叠，并聚集成为包涵体。经过诱导，目的蛋白通常可达细胞总蛋白的50%以上。虽然有一定比例的蛋白以可溶的单体形式存在，而多达95%（甚至更多）的蛋白则在包涵体中。实验过程中，可以采取降低诱导温度，例如25–30°C，或降低IPTG浓度(0.01–0.1mM)并延长诱导时间，还有采用特别的培养基等方法获得更多的可溶蛋白。 2、跨膜蛋白为什么很难表达？跨膜蛋白的表达成功率相对较低是一个实验结果，究其原理，目前众说纷纭很多种理论。以我们浅薄的理解层面来看，主要有以下几个原因：跨膜蛋白一般都是强疏水性的氨基酸分子和亲水性的分子跳跃式的连接，形成的亲水疏水的一个最简单的跨膜化学结构，这种结构与信号肽结构相似，对于原核细胞来说，简单的细胞器很难像真核细胞一样完成信号肽识别及切除、引导内质网、高尔基体重新包装及分泌这一复杂过程，有些蛋白是多次跨膜，对于原核细胞来说几乎是不可能完成的任务。另外，对于疏水性的片段，在原核细胞中极易形成包涵体，疏水性多肽会抑制翻译过程，甚至与原核膜结构融合形成毒性，出于生物自我保护的本能，所有的细胞器都会停止合成蛋白的过程。 3、如何选择蛋白表达宿主菌？

4、我们有哪些原核蛋白纯化方式？如何选择不同的纯化方式？答：我们公司的蛋白纯化方法大致分为亲和纯化、离子交换、切胶回收三类。 1、常规情况下，一般携带融合标签（His标签，GST标签，sumo标签，Fc标签），我们可以通过Ni柱、GST柱、Protein A等进行亲和纯化获得融合蛋白，用亲和纯化的方法一般可以获得85%以上纯度的蛋白，亲和纯化的方便快捷。 2、如果需要目的蛋白不含有任何标签，怎么选择纯化方式？。（1）可表达融合蛋白，用蛋白工具酶切割融合蛋白，再进行纯化除去工具酶。此方法能快速得到蛋白。（2）可表达不含标签的蛋白，进行离子、分子筛、疏水等纯化，通过AKATA纯化设备获得蛋白。 3、如果需要获得蛋白作为抗原，可以直接通过切胶回收的方式，此方法获得蛋白纯度较高，进行免疫动物后得到的抗体进行WB反应，灵敏度较高。 5、表达得到的蛋白是有活性的么？答：需要让蛋白有活性的条件很复杂，合适的缓冲液体系、盐浓度、蛋白的折叠状态甚至检测活性的方法的细微差别都可能导致活性的强弱有无，一般情况下，上清表达的蛋白要比包涵体经过变复性纯化后得到的蛋白活性要好，我们尽量从上清中获得蛋白，期许蛋白形成的折叠最接近活性状态，这也是我们擅长的。但是在实际实验条件下，我们无法承诺表达纯化的蛋白一定具有客户期望的生理活性。

融合蛋白表达系统

研究者们在分离到某一基因后，要对其编码蛋白质进行研究最理所当然的工作就是表达，即：有目的性地合成外源基因产物。在重组 DNA技术的发展早期，人们认为在基因的前面有一个强启动子和一个起始密码子就足以在大肠杆菌中获得很好的表达。随后，认识到获得有效的翻译所需的条件要复杂得多，除了要有强启动子和起始密码子外，良好的表达尚需编码目的蛋白的mRNA中含有核糖体结合位点，表达水平受密码子喜好程度的影响，也受编码序列中其他目前尚未明了的因素影响。通过改变起始密码子前端的序列，或者在不改变蛋白质序列的条件下利用密码子的简并性改变5’末端编码序列往往有助于解决问题。通常，两个基因之间的融合表达能更快地解决这些问题。在这种方式中，目的基因被引入某个高表达蛋白序列(fusion tag)的3’末端，比如大肠杆菌的一段序列，或者任一可在大肠杆菌中高度表达的基因，它提供良好表达所必需的信号，而表达出的融合蛋白的N末端含有由fusion tag编码的片段。fusion tag所编码的可能是整个功能蛋白或是其中的部分。比如6x His Tag、β-半乳糖苷酶融合蛋白和trpE融合蛋白、谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白以及硫氧还蛋白(Trx)融合蛋白等。由于利用tag 选择融合表达是为了简化重组一是fusion tag位于目的蛋白的N端，这时tag 帮助提高目的蛋白的表达，缺点是纯化的表达产物中可能会有不完整的目的蛋白，原因是在翻译过程中意外中断的少量(C端)不完整的表达产物会一起被纯化。另一是fusion tag位于目的蛋白的C端，这可以保证只有完整的表达产物才会被纯化。当目的蛋白的功能区位于N端时，fusion tag位于C端可能减少对其功能的影响，反之亦然。进行融合蛋白的表达经常会遇到三个问题，它们是：表达蛋白的溶解性、稳定性和fusion tag的存在。前两个问题在融合蛋白表达系统和非融合蛋白表达系统都会遇到，而第三个问题是融合蛋白系统所独有的。裂解融合蛋白以除去fusion tag 为了对目的蛋白进行生化及功能分析，通常要从目的蛋白上去除fusion tag部分。早期已建立了数种对融合蛋白进行位点特异性裂解的方法。化学裂解如溴化氰(Met↓)、BNPS-3-甲基吲哚(Trp↓)、羟胺(Asn↓Gly)等，不但便宜且有效，往往还可以在变性条件下进行反应。但由于裂解位点的特异性低和可能对目的蛋白产生的不必要修饰，使该法渐渐被酶解法取代。酶解的方法相对来说反应条件较温和，更重要的是，普遍用于此用途的蛋白酶都具有高度的特异性。其中有用的酶有：Xa因子、凝血酶、肠激酶、凝乳酶、胶原酶。所有这些酶都具有较长的底物识别序列(如在凝乳酶中为7个氨基酸)，从而降低了蛋白质中其他无关部位生断裂的可能性。而酶解法存在成本高(这些蛋白酶价格一般都相当昂贵)，反应时间长等问题，更重要的是蛋白酶本身不可避免地会混入目的蛋白中，造成新的污染，提高纯化的复杂性。

GST_talin1融合蛋白的原核表达及纯化

收稿日期:2007-12-22;修回日期:2008-01-11 作者简介:吴　爽(1979-),女,硕士,助教,教学和研究方向,细胞生物学,E 2mail:wushuang 21977@https://www.360docs.net/doc/dd4329941.html,;通迅作者:耿建国(1955-),男,博士,研究员,研究方向,细胞粘连与迁移。 GST 2talin1融合蛋白的原核表达及纯化吴　爽 1,2 ,耿建国 2 (1广东药学院基础学院组织胚胎教研室,广州　510006;2中科院生化细胞研究所分子细胞生物学实验室,上海　200031) 摘　要:应用PCR 方法扩增talin1的cDNA,并将其重组入谷胱甘肽转硫酶融合基因表达载体pGEX 24T 21中,获取人源的GST 2talin1融合蛋白,为下阶段深入的研究talin1的结构、功能、及其与之相互作用的蛋白打下基础。经酶切、序列鉴定,选择正确重组子,将其质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),I PTG 诱导表达,用Glutathi one Sephar ose 4B 柱纯化,western bl ot 鉴定。克隆得到了一个2400bp 的talin1的c DNA 片断,重组质粒目的DNA 测序正确,纯化出分子量约为12116k D 的融合蛋白。用基因工程方法使GST 2talin1重组质粒在原核细胞表达并成功纯化出GST 2talin1融合蛋白。关键词:talin;P 2选凝素;GST 2融合蛋白;亲和层析中图分类号:Q51 文献标识码:A 文章编号:1008-9632(2008)03-0033-03 P -选凝素(P -selectin )是一种由细胞产生的粘附分子(adhesion molecules ),存在于细胞表面,能够介导细胞与细胞间或细胞与基质间相互接触和结合。其在炎症反应、凝血机制、甚至在某些肿瘤转移等方面发挥重要作用[1] 。一直以来P 2selectin 受到许多研究者的青睐。P 2selectin 分子的特性到目前为止,人们已有较丰富的研究。本实验室以P 2selectin 的cyt op las m ic domain 为饵从人白细胞cDNA 文库中筛选到几个基因,经测序可知其中之一为talin1(从第1672个氨基酸残基到蛋白末端)。因此本试验利用重组DNA 技术,获得talin1的cDNA,构建了GST 2talin1融合蛋白表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化该融合蛋白,为进一研究talin1与P 2selectin 是否存在相互作用及相互作用机制,奠定了基础。1　材料和方法1.1　材料1.1.1　菌株、质粒　人源talin1的cDNA 及融合表达载体pGEX 24T 21为实验室保存。DH5 α及BL21大肠杆菌感受态购自上海申能博采生物公司。1.1.2　生化试剂和分子生物学试剂　引物由上海生工生物有限公司合成,限制性内切酶、T 4DNA 连接酶购自Pr omega 公司,1kb DNA Marker 、DNA 片断快速纯化及回收试剂盒购自北京鼎国生物技术公司,PCR 试剂购自日本T AK ARA 公司,氨苄青霉素为上海华舜生物公司产品。1.2　方法1.2.1　目的基因的扩增及纯化　根据已公布的人源talin1的cDNA 序列设计talin1的引物,上游引物T1的序列为5′23′at cag tag gaa ttc atg cg gga cct aga cca gg;下游引物T2的序列为5′23′ga agt cat ctc gag gtg ctc atc tcg aag ctc tg,在上下游引物中分别加入EcoR I 和XhoI 酶切位点。PCR 反应总体积为50 μL,包括ddH 2O 4015μL 、10×buffer 5μL 、4dNTP 1μL 、上下游引物各1μL 、模板1μL 、La Taq 酶015μL 。反应条件为:94℃2m in,94℃50s 、56℃50s,72℃2m in,72℃5m in,共35个循环。所获得的PCR 产物以1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。将目的条带切下,用DNA 片断快速纯化回收试剂盒回收。1.2.2　pGEX 24T 212talin1重组质粒的构建　将纯化的PCR 产物和pGEX 24T 21载体用EcoR I 和XhoI 双酶切后,分别回收酶切产物。取回收后的talin1片断815 μL,载体片断015μL,10×T 4DNA 连接酶buffer 1μL,T 4DNA 连接酶013μL,16℃连接过夜。1.2.3　重组质粒的筛选和鉴定　将连接产物全量转化入DH5 α感受态细菌,在含有氨苄青霉素(Amp )的LB 上37℃筛选培养过夜。次日挑取单个菌落,培养12h 后小量抽取质粒,用EcoR I 和XhoI 双酶切,筛选阳性重组质粒并送上海英骏生物技术有限公司测序。 3 3

融合蛋白定义

融合蛋白科技名词定义中文名称：融合蛋白英文名称：fusion protein 定义1：融合基因的表达产物，或通过生物学和化学方法融合的两个或两个以上蛋白质。所属学科：免疫学（一级学科）；应用免疫（二级学科）；免疫学检测和诊断（三级学科）定义2：通过基因工程方法将编码不同蛋白质的基因片段按照正确的读框进行重组，将其表达后获得的新蛋白质。所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）定义3：由两段或多段基因序列串联形成的融合基因表达所产生的蛋白质。所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科）本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布目录

融合蛋白 - 技术概况融合蛋白技术是为获得大量标准融合蛋白而进行的有目的性的基因融合和蛋白表达方法。利用融合蛋白技术，可构建和表达具有多种功能的新型目的蛋白。技术特点融合蛋白融合基因可在原核细胞(如大肠杆菌) 也可在真核细胞中进行表达。原核表达系统的特点是时程短，费用低，是科研中的主要工具。其缺点是真核蛋白表达没有得到确切修饰；大量蛋白常常沉淀成不溶性包涵体聚合物，需要复杂的变性和复性过程；大量蛋白的分泌较困难。真核表达系统的特点是蛋白翻译后加工机会多，甚至可被改造成人源型；真核细胞易被转染，具有遗传稳定性和可重复性；产物可被分泌，提纯简单，成本低。技术内容构建融合蛋白的基本原则是，将第一个蛋白的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，以实现两个基因的共同表达。具体步骤有： 1.进行目的基因的克隆：根据基因序列互补原则，设计合适的引物序列，以cDNA为模板，利用PCR技术扩增不同的目的DNA片段。 2.在载体中进行重组：通过限制内切酶将两个DNA片段进行酶切并回收，然后通过连接酶将两个具有相同末端酶切位点的基因片段进行体外连接，并克隆到高表达质粒载体中，构建重组质粒。 3.将重组表达载体转染宿主细胞并利用选择标志进行筛选及测序。 4.融合基因的诱导表达及表达蛋白的纯化。技术关键在构建融合蛋白中，一个关键的问题是两蛋白间的接头序列( Linker )，即连接肽。它的长度对蛋白质的折叠和稳定性非常重要。如果接头序列太短，可能影响两蛋白高级结构的折叠，从而相互干扰；如果接头序列太长，又涉及免疫原性的问题，因为接头序列本身就是新的抗原。一般来说， 3-5 个氨基酸的Linker 可满足大部分融合蛋白的正确折叠的要求。有人尝试在融合蛋白间加入一段有疏水性和一定伸展性的较长肽链，如(Gly4Ser1)，目的是将两者分开，以缓解相互干扰作用，并获得了满意的结果。但具体涉及到每种蛋白时，需具体分析。当我们构建融合蛋

红色荧光蛋白的原核表达

红色荧光蛋白（RFP ）的原核表达生物学实验教学中心报告题目红色荧光蛋白（RFP ）的原核表达作者姓名饶慧班级学号 0802班/2008114010214 指导教师王友如完成时间 2011年02月

目录引言 (1) 1实验材料及实验仪器 (4) 1.1实验材料 (4) 1.2实验仪器 (5) 2实验方法 (7) 2.1 重组质粒的构建 (7) 2.2工程菌株的活化 (7) 2.3诱导表达 (8) 2.4 SDS-PAGE检测表达蛋白 (8) 3 结果与分析 (9) 总结 (10) 参考文献 (11) 致谢 (13)

红色荧光蛋白的原核表达饶慧（指导老师：王友如）（湖北师范学院生命科学学院生物科学0802班湖北黄石435002）摘要实验目的：研究红色荧光蛋白（Red Fluorescent Protein，RFP）基因在大肠杆菌中原核表达。实验方法：通过分别将DH-5ɑ(pDsRed-N1)和DH-5ɑ(pET-28ɑ)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-RFP，将重组质粒通过转化的方法把含红色荧光蛋白（RFP）外源基因转入大肠杆菌体内进行表达，再用IPTG诱导RFP基因表达，可以看到显现红色，最后根据SDS-PAGE电泳结果，判断RFP基因在大肠杆菌中是否成功表达。实验结果：结果显示构建的重组质粒pET-28ɑ-RFP在E.coli中成功表达。关键词红色荧光蛋白；质粒重组；原核表达；诱导表达

分子生物学综合实验 Prokaryote Expression of Red Fluorescent Protein (RFP) Rao Hui (Class 0802, College of Biology Science ,Hubei Normal University, Huangshi, Hubei,435002 ) Abstract Objective: To study the expression of the RFP gene in the E.coli. Methods: Extract the plasmid of the DH-5ɑ (pDsRed-N1) and DH-5ɑ (pET-28ɑ). Then the two plasmids are cut by enzyme and are connected to form pET-28a-RFP recombined plasmid. Guiding the recombined plasmid, which contains exogenous genes of RFP, into E.coli for expression, through transformative method. The expression of RFP gene can be induced by the IPTG and then we can see red. Finally, judging whether the RFP gene has expressed successfully in E.coli according to the results of SDS-PAGE electrophoresis. Results: The results suggest that pET-28ɑ-RFP recombined plasmid has successfully expressed in E.coli. Keywords Red Fluorescent Protein; Recombined Plasmid; Prokaryote Expression; Induced Expression

浅谈原核表达

浅谈原核表达的技巧摘要：原核表达是表达外源基因常用的方法，具有操作简单、快捷，需时较短，表达产量高，适合工业化等优点。本文作者根据自己的实践经验，总结了原核表达的一些技巧。关键词：原核表达表达载体限制性内切酶将植物、动物、微生物等的目的基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下优点：易于生长和控制；易于培养，实验耗费少；可选择多种大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒。原核表达是近年来表达外源蛋白常用的方法，本文根据自己的实践经验，着重谈谈对原核表达中的技巧问题。一、原核表达一般程序表达前准备-获得目的基因-构建含目的片段的表达载体（测序验证）-转化表达宿主菌-诱导靶蛋白的表达-表达蛋白的分析。二、原核表达中各操作步骤的关键因素及技巧 1.表达前的准备要素：原核表达注重表达前对目的片段、表达载体及表达菌株的分析、选择。正所谓“磨刀不误砍柴功”，经过细致、周全的分析、准备、设计可带来较为顺当的实验，可免去许多不必要的麻烦。（1）对表达载体的分析载体的选择：同样的载体，同样的系统，很可能表达这个蛋白表达量起高，但另外一个就是做不出来，所以表达载体的选择非常重要，没有万能的载体。选择载体通常我们关心质粒上的几个功能组件及所带来的问题：是否为诱导表达型载体，启动子的强弱、多克隆位点、限制性内切酶的位置、终止密码子的有无及位置，融合Tag的有无，筛选报告基因的位置等。所选载体一定要保持原来的遗传背景（有些载体经过多次交换已变异）。选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑，如果为了方便纯化，可选择融合表达；如果为了获得天然蛋白，可选择非融合表达。融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。翻译的起始位点：要表达目的蛋白，在该基因的5’端必须有一起始位点，现在大部分的表达载体都提供起始位点，起始密码子与核糖体结合位点的距离都已被优化，一般情况下不需要自己再加，实际操作时要留意载体图谱上是否注明有起始密码子和终止密码子，如无，还得根据自己的实际情况加上。在起始密码子附近的mRNA二级结构：外源基因其始转录后，保持mRNA的有效延伸、终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键，尤其是在起始密码子附近的mRNA二级结构可能会抑制翻译的起始或者造成翻译暂停从而产生不完全的蛋白。如果利用Primer Premier软件分析DNA或RNA结构上有柄（stem）结构，并且结合长度超过8个碱基，这种结构会因为位点专一突变等因素而变得不稳定，影响正常的翻译。（2）对目的片段的分析基因（或蛋白）的大小：原核表达的成功与否与所要表达的蛋白（或基因）大小有关，一般说来小于5kD或者大于100kD的蛋白都是难以表达的。蛋白越小，越容易被内源蛋白水解酶所降解。在这种情况下可以采取串联表达，在每个表达单位（即单体蛋白）间设计蛋白水解或者是化学断裂位点。如果蛋白较小，那么加入融合标签GST、Trx、MBP或者其它较大的促进融合的蛋白标签就较有可能使蛋白正确折叠，并以融合形式表达。如果蛋白较大，大于60kD的蛋白建议使用较小的标签（如6×组氨酸标签）。对于结构研究较清楚的蛋白可以采取截取表达。当然表达时要根据目的进行截取，如果是要进行抗体制备而截取，那么一定要保证截取的部位抗原性较强。对于抗原性也可

融合蛋白标签

在蛋白质功能及结构研究过程中，研究的首要任务就是利用多种方法获得纯化的具有完整结构及生物学功能并能够正确折叠的高度纯化蛋白质。除了蛋白质的研究，具有特定生物活性的高价值蛋白质的生产也需要对蛋白质产品进行纯化。因此，科研人员和工业生产往往大量采用多种多样的表达系统来获得高表达的蛋白质，对其纯化后进行研究或加工，这些表达系统包括原核表达系统、酵母菌表达系统、昆虫动物细胞表达系统、真核细胞表达系统等。如何将系统中表达的目标蛋白质与其他蛋白分离，一直是表达纯化中的一个重点。为了克服从复杂样品中纯化单一蛋白质这种困难，科学家利用生物物质，特别是酶和抗体等蛋白质，具有识别某种特定物质并与该物质分子特异性结合的能力，利用生物分子间的这种特异性结合能力而形成的亲和纯化技术。亲和标签纯化技术已广泛应用于蛋白质，特别是重组蛋白的分离纯化中。在重组蛋白的亲和纯化中，利用基因工程技术，将经过改造优化的亲和标签与目标蛋白融合表达，通过一步简单快速的亲和层析，直接获得纯度较高的重组融合蛋白，已成为重组蛋白纯化的一个通用方法，具有结合特异性高、纯化步骤简便、纯化条件温和、适用性广泛等优点，为蛋白质的有效纯化提供了一条解决的途径，广泛应用于蛋白质结构与功能的研究及重组蛋白纯化工艺的开发中。自从20世纪70年代中期融合标签技术出现以来，亲和标签已成为一种重组蛋白纯化十分有效的工具，具有结合特异性高、纯化条件温和、纯化步骤简便、适用性广泛等显著优势。通常，亲和标签定义为对特定的生物或化学配基具有高度亲和力的一段氨基酸序列。到目前为止，已经出现了种类众多、功能各异、用途多样的亲和标签，极大地促进了对重组蛋白的有效纯化。根据自身分子量大小的不同，亲和标签可以分为两大类：一类是结合固定化配基的短肽标签，如His-tag、FLAG-tag、Strep-tagⅡ等；另一类是识别小分子配基的蛋白标签，如GST、MBP等。短肽标签： His-tag：His标签是目前高通量蛋白纯化最普遍使用的亲和标签，广泛用于多种重组蛋白在各种表达系统的表达与纯化中。His标签一般为5~15个组氨酸，被认为是重组蛋白纯化的首选标签，具有以下优点：（1）位于目标蛋白Ｎ端的His标签与细菌的转录翻译机制相互兼容，利于蛋白的表达；（2）His标签几乎

原核表达融合蛋白

原核表达融合蛋白广义的原核表达，是指发生在原核生物内的基因表达。狭义的原核表达，常出现于生物工程中。是指通过基因克隆技术，将外源目的基因，通过构建表达载体并导入表达菌株的方法，使其在特定原核生物或细胞内表达。表达载体：为了获得高水平的基因表达产物，人们通过综合考虑控制转录、翻译、蛋白质稳定性及向胞外分泌等诸多方面的因素，设计出了许多具有不同特点的表达载体，以满足表达不同性质、不同要求的目的基因的需要。通常关心的表达载体质粒上的元件包括：启动子、多克隆位点、终止密码、融合Tag（如果有的话）、复制子、筛选标记或报告基因等。现在常用的pET表达系统以及GST-融合蛋白表达系统。复制子：通常表达载体都会选用高拷贝的复制子。pSC101类质粒是严谨方式复制，拷贝数低，pCoE1，pMBI(pUC)类的复制子的拷贝数高达500以上，是表达载体常用的。通常情况下质粒拷贝数和表达量是非线性的正相关，当然也不是越多越好，超过细胞的承受范围反而会损害细胞的生长。如果碰巧需要2个质粒共转化，就要考虑复制元是否相容的问题。筛选标记和报告基因：氨苄青霉素抗性是最常见的筛选标记，卡那霉素或者是新霉素次之，通常是另一个载体的筛选标记用。四环素，红霉素和氯霉素等已经日渐式微。抗性基因的选择要注意是否会对研究对象产生干扰，比如代谢研究中要留意抗性基因编码的酶是否和代谢物相互作用。在表达筛选中要注意的问题应该就是LB倒板前加抗生素的温度，温度过高容易导致抗生素失效。对于做表达来说，如果不是要研究启动子的强弱，通常比较少关心或者用到报告基因吧。绿色荧光蛋白是最常用的报告基因了。其他还有半乳糖苷酶、荧光素酶等。一些融合表达Tag也有报告基因的功能。启动子：启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一。从转录模式上看有组成型表达和诱导调控型表达。lac和Tac，PL和PR，T7是最常用的启动子。终止子：转录终止子对外源基因在大肠杆菌中的高效表达有重要作用，即控制转录的RNA长度提高稳定性，避免质粒上异常表达导致质粒稳定性下降。放在启动子上游的转录终止子还可以防止其他启动子的通读，降低本底。转录终止子有两类，Rho因子作用下使转录终止mRNA和根据模版上的对称序列形成发夹结构而终止mRNA。常见的是rrnB rRNA操纵子的T1T2串连转录终止子。核糖体结合位点：启动子下游从转录起始位点开始延伸的一段碱基序列，其中能与rRNA16S亚基3'端互补的SD序列对形成翻译起始复合物是必需的，多数载体启动子下游都有SD序列，也有些载体没有。表达菌株：表达菌株是我们往往最容易忽视的一点。目前绝大多数重要的目的基因都是在大肠杆菌中表达的。不同的表达载体对应有不同的表达菌株，一些特别设计的菌株更有助于解决一些表达难题。将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；

原核表达步骤

Chi l 原核表达基本试验步骤将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测，其中包括：一、试剂准备（1）LB培养基。（2）1M IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于10ml ddH2O

中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。 CCY的IPTG是1M的，用时进行1000倍稀释。二、操作步骤（一）获得目的基因 1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。 2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。（二）构建重组表达载体 1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。我们用Soultion I连接。（三）获得含重组表达质粒的表达菌种 1、将连接产物转化大肠杆菌BL21，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。

原核表达步骤

蛋白质表达的性质

蛋白质表达的性质关键词：大肠杆菌，细胞，试剂，标准物质，北京标准物质网 1.所需要的蛋白表达量如果只是需要少量蛋白，比如筛选一系列点突变体的酶活性，酶学检测可以在大肠杆菌粗提物中进行，采用多数通用表达质粒即可，没有必要花很大精力去优化方案来提高表达量。如果实验蛋白需要量大，就有必要尝试不同宿主载体系统和纯化方法，从中找出大批量表达蛋白的可行方案。外源蛋白水平与生理状态下的内源蛋白相仿，有助于蛋白功能或蛋白相互作用研究。 2.表达蛋白的可溶性在抗体制备时不一定要求蛋白可溶，而研究蛋白功能时可溶性蛋白是关键。利用大肠杆菌表达的融合蛋白常常形成包涵体，相对容易进行纯化，不易被降解。若需要的是可溶性蛋白，可以采用降低复性温度，降低表达水平，改变携带蛋白和尝试不同宿主菌株等方法提高蛋白溶解性。 3.表达蛋白的稳定性在大肠杆菌中表达的外源蛋白尤其是真核蛋白常常稳定性不足。将融合蛋白以包涵体形式表达，或者采用缺失已知蛋白酶的大肠杆菌菌株作为宿主，可减少不稳定蛋白质的降解。由于不同菌株内蛋白酶的水平不同，对于某一特定融合蛋白来说，尝试不同菌株有助于提高蛋白稳定性。 4.蛋白质分子量在哺乳动物细胞中，不加标签的外源蛋白和内源蛋白由于分子量相同在免疫印迹上难以区分，表达融合蛋白有助于两者的区分。一般来说小于5kD或者大于100kD的蛋白表达比较困难。蛋白越小，越容易被内源蛋白水解酶所降解，在这种情况下可以采取融合蛋白表达，在每个单体蛋白之间设计蛋白水解或者是化学断裂位点。如果蛋白较小，可以加入GST、Trx、MBP等较大的标签蛋白可能促进蛋白正确折叠：如果蛋白大于60kD则建议用6×His、HA等较小的标签。对于结构研究清楚的大蛋白可以根据实验目的表达截短蛋白(truncated protemin)，如果是为抗体制备，一定要保证截取抗原性较强的部分。 5.是否需要活性蛋白如果蛋白表达的目的仅仅是获得一些制备抗体的材料，就没有必要获得活性蛋白。如果目的蛋白表达是用于功能研究，那么保持或者恢复蛋白的活性是非常重要的，纯化难易相对不重要。如果需要表达具有生物学功能的膜蛋白或分泌性蛋白，例如细胞膜表面受体或细胞外的激素和酶，则更需要利用真核细胞表达。当表达蛋白是用于结构研究，最好是以可溶性蛋白的形式。在不同大肠杆菌菌株尝试表达蛋白，减少体内蛋白异常折叠，尽可能减少体外变性从而保持正常蛋白构象。