原核表达步骤
实验方法与步骤
1 表达质粒的构建及测序分析
1.1 cofilin-1的片段的准备
1.1.1 引物设计
根据在GenBank上查找人源cofilin-1的基因序列，用Primer Premier 5.0软件进行上下游引物的设计，并送往上海生物工程技术服务有限公司合成的PCR 引物。引物如下：
引物名称序列
F-cofilin-1 5′-AAGTCGACATATGGCCTCCGGTGTG-3′
R-cofilin-1 5′-TCTCTCGAGGGCTCACAAAGGCTTG-3′将以上引物用灭菌的三蒸水稀释成10μmol/L，分装于Eppendorf管中，-20℃冰箱中保存备用。
1.1.2 cofilin-1片段PCR
1 反应体系：
2.5μl
KOD polymerase(3’-5’核酸外
切酶活性)
KOD polymerase buffer 5μl
MgSO4 2.5μl
DMSO（“万能溶剂”） 2.5μl
dNTPMixture 5μl
PrimerF（底物） 1.5μl
PrimerR 1.5μl
Template（模板）5μl
ddH2O 25μl
Total 50μl
2PCR反应条件：
①94℃预变性3min
②94℃退火30s
③65℃延伸40s
④68℃40s
⑤go to②30个循环
⑥68℃5min
⑦4℃forever
3 琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测
（1）配置浓度为1%的凝胶。称取琼脂糖0.3g，加入30ml 1×TAE电泳缓冲液（Tris-乙酸电泳缓冲液）中，用微波炉加热2min，待凝胶稍冷却，加入2μl EB（溴化乙锭，荧光染色剂）混匀后倾入凝胶铸槽中，插入梳子，并用玻璃棒驱除气泡，待凝胶完全凝结后拔除梳子。
（2）把凝胶置于1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中，加样孔置于负极一侧，然后依次在加样孔中加入50μl Marker、50μl样品＋10μl loading buffer(上样缓冲液，可以显示两条带，前面的蓝色的条带是溴酚蓝，代表的片段大小是300bp，后面的有点绿色的条带是二甲苯青，代表的片段大小在4000bp左右)，盖上电泳盖，以100V电压进行电泳。
（3）当Marker条带充分分开后即可停止电泳，将凝胶移至保鲜膜上，置于凝胶自动成像仪中分析。
4 割胶回收PCR反应体系的扩增产物，用Omega Bio-Tek公司的Gel Extrection Kit进行回收：
（1）将PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下迅速切取含有目的条带的琼脂糖凝胶，放入灭菌的EP管中。DNA在紫外灯下曝光时间不超过30s。
（2）称量凝胶块重量，以1g＝1ml进行计算，加入适量体积的binding buffer，55-65℃加热至凝胶完全融化（约7～10min），每隔2～3min震荡一次。
（3）将Hibind DNA柱子套在2ml的收集管。将上述步骤（2）的溶液转移至Hibind DNA柱子中，10000×g离心1min，弃滤液。
（4）将柱子装回收集管中，加入300μl binding buffer，10000×g离心1min，
弃滤液。
（5）将柱子装回收集管中，加入700μl SPW wash buffer，10000×g离心1min，弃滤液。
（6）重复步骤（5）一次。
（7）弃滤液，将柱子装回收集管中，13000×g离心1min，以甩干柱子。
（8）将柱子安置于灭菌的1.5ml的离心管上，在柱子中央处加入30～50μl的65℃预热的灭菌ddH2O，室温放置2min。13000×g离心2min，洗脱DNA。
1.2 表达载体pET-28a质粒的抽提
接种含pET-28a的大肠杆菌DH5α，37℃培养过夜。质粒抽提采用Omega
Bio-Tek公司的Plasmid Mini Kit I进行质粒小抽：
1 取－20℃冰箱中保存的含pET-28a质粒的DH5α菌种50μl接种于4ml的LB培养基（含卡那霉素100μg/ml）中，37℃，180rpm培养12h。划平板，活化菌种，置于37℃恒温箱中培养过夜，挑单菌落接种于4ml的LB培养基（含卡那霉素
100μg/ml）中（培养基中加卡那霉素抑制杂菌和不含目的基因的菌），37℃，180rpm 培养12h。
2 加入200μl GPS buffer（硅胶柱平衡缓冲液，减少柱子中硅胶模的憎水基团，有利于结合核酸）于柱子中，室温放置2min，10000×g离心2min，弃去掉收集管中的废液，柱子平衡完毕。
3 将菌液移至灭菌的EP管中，室温下，10000×g离心1min，彻底去除上清，收集沉淀菌体。
4 加入200μl Solution I/RNase A混合液，浮涡旋震荡使细菌充分悬浮。
5 往重悬液中加入200μl Solution Ⅱ，轻轻颠倒EP管4-6次，使细菌裂解，室温放置2min，至溶液变成澄清。
6 加入300μl Solution Ⅲ，温和颠倒数次，至溶液出现白色絮状沉淀。室温下，10000×g离心10min。
7 取出平衡后的柱子置于收集管上，将步骤6中的上清全部转移到柱子里。室温下，10000×g离心1min，弃滤液。
8 将柱子装回收集管中，加入500μl HiBind buffer。室温下，10000×g离心1min，弃滤液。
9 将柱子装回收集管中，加入700μl Wash Solution。室温下，10000×g离心1min。重复该步骤一次。
10 重复步骤9一次。
11 弃滤液，将柱子装回收集管中，13000×g离心1min，以甩干柱子。
12 将柱子安置于灭菌的1.5ml的离心管上，在柱子中央处加入30～50μl的65℃预热的灭菌ddH2O，室温放置2min。13000×g离心2mi。
跑1%的琼脂糖凝胶电泳检测质粒抽提纯度。-20℃冰箱中保存备用。
1.3 cofilin-1片段和表达载体的双酶切
用NdeI和XhoI分别酶切PCR产物cofilin-1 cDNA和表达载体pET-28a，37℃水浴反应4h，反应体系如下：
表达载体酶切体系：PCR产物酶切体系：
表达载体15μl cofilin-1片段10μl
92μl10×H Buffer 2μl 10×H Buffer（Ｌ
ＭＨＫＴ代表缓
冲液中盐浓度或
成分不同）
XhoI 1μl XhoI 1μl
NdeI 1μl NdeI 1μl
ddH2O 1μl ddH2O 6μl
Total 20μl Total 20μl
1.4 酶切产物的回收
酶切产物分别进行1%琼脂糖凝胶电泳后，胶回收酶切产物。步骤同PCR反应产物胶回收。
1.5 连接反应
将PCR产物cofilin-1 cDNA的酶切回收产物和表达载体pET-28a的酶切回收
产物于16℃连接24h，反应体系如下：
cofilin-1 cDNA酶切回收产物18μl
pET-28a酶切回收产物6μl
10× T4 DNA ligase buffer 3μl
T4连接酶3μl
Total 30μl
1.6 感受态大肠杆菌DH5α的制备（将快速生长的大肠杆菌置于经低温预处理的低渗CaCl2溶液中，会造成细胞膨胀，诱导细胞成为感受态，细胞通透性发生改变，在短暂的热刺激后，细胞膜出现许多间隙，外源DNA被细胞吸收，通过复制，表达，实现遗传信息的转移，将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆）
1 于-20℃冰箱中取出保存的大肠杆菌DH5α菌种，于LB固体培养基上划平板，置于37℃恒温箱中培养过夜。挑单菌落，接种试管4ml LB培养基中，37℃，180rpm培养12h。
2 将试管中的菌液按1%的接种量接种到含50ml LB培养基的锥形瓶中，37℃，180rpm，培养2-3h，当OD600=0.3~0.5时，停止摇菌。
3 将锥形瓶中的菌液分别倒入两个已灭菌的50ml离心管中，于冰上放置10min 左右。
4 4℃，4100rpm离心10min，于超净台里弃去上清，离心管倒滤纸上吸干。
5 加入20ml预冷的0.1mol/L CaCl2重悬菌体，4℃，4100rpm离心10min，于超净台里弃去上清，离心管倒滤纸上吸干。
6 加入2ml预冷的0.1mol/L CaCl2重悬菌体，加甘油至终浓度为15%，分装于1.5mlEP管中，转移-80℃保存备用。
1.7 连接产物的转化
1 将感受态大肠杆菌从-80℃冰箱中取出后，立即放在冰上，让其慢慢融化。
2 将16μl连接产物加入100μL感受态大肠杆菌中，轻轻混匀，冰浴30min。
3 将Eppendorf管放入42℃水浴箱中热冲击90s，再迅速冰浴1-2min。
4 于EP管中加入400μl LB培养基，置于摇床上，37℃，50rpm培养45min。
5 将转化后的菌液涂于LB固体培养基上(含卡那霉素20μg)，置于37℃恒温培养箱中倒置培养过夜。
1.8 双酶切鉴定重组子
1.8.1 双酶切鉴定和PCR鉴定
1 从接有重组菌落的平板中挑取单菌，落接种于4ml LB培养基（含卡那霉素100μg/ml）的试管中，37℃，180rpm培养12h，OMEGA质粒抽提试剂盒抽提质粒。
3 限制性内切酶Nde I和Xho I酶切转化子质粒，将反应物置于37℃水浴箱中水浴4h。反应体系如下：
质粒pET28a-cofilin-1 1μl
10×H Buffer 1μl
XhoI 1μl
NdeI 1μl
ddH2O 6μl
Total 10μl
4 电泳分析。将酶切产物、抽提出的未经酶切的质粒和PCR鉴定的反应产物一起进行琼脂糖凝胶电泳分析
1.8.2 重组子的序列分析
挑选经双酶切鉴定和PCR鉴定呈阳性的含重组子的菌落，接种到4ml LB培养基（含卡那霉素100μg/ml）中，37℃、180rpm过夜12h，15％甘油保种（甘油有隔绝空气，衡湿，调节渗透压，并在冷冻过程中起冷冻保护剂的作用）。并送样品英骏公司测序。
2 cofilin-1在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达
2.1 感受态大肠杆菌BL21(DE3)的制备
具体方法和步骤同1.6。
2.2 重组质粒pET28a-cofilin-1转化BL21大肠肝菌感受态细胞
取鉴定正确的重组质粒pET-28a-cofilin-1转化入感受态的大肠杆菌
BL21(DE3)，具体方法和步骤同1.7。于LB固体培养基（含卡那霉素20μg）上划平板，并筛选阳性单克隆。
2.3 cofilin-1的诱导表达
挑单菌落，接种于4ml LB培养基（含卡那霉素100μg/ml）中，37℃，180rpm
培养至OD600=0.8～1.0。取1ml作未诱导对照，其余加IPTG（异丙基硫代半乳糖苷，是一种极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，诱导β-半乳糖苷酶活性，在平板中加入IPTG，可以根据是否呈现白色菌落或噬菌斑而方便挑选出基因重组体）至终浓度1mmol/L，在37℃下诱导4h。
2.4cofilin-1的鉴定
2.4.1SDS-PAGE电泳检测
1 电泳样品制备。离心收集诱导后的菌体，将菌体沉淀重悬100μl ddH2O中，并加入2×SDS-PAGE loading buffer混匀，100℃加热10min，4℃保存备用。
上样量（μl）=270/（菌体OD600×浓缩系数）；（浓缩系数=菌液体积/样品体积）
2 电泳样品制备及凝胶的灌制。12%SDS-PAGE蛋白电泳胶配制成分如下：
成分分离胶(ml) 浓缩胶(ml)
30%丙烯酰胺溶液 4 0.67
ddH2O 3.2 2.7
1.5M Tris-Cl(pH8.8) 2 --
0.5M Tris-Cl(pH6.8) -- 0.5
10%SDS 0.01 0.04
10%APS 0.01 0.06
TEMED 0.005 0.002
按照BIO-RAD公司蛋白质电泳的操作说明书安装好凝胶板。配置12％
SDS-PAGE分离胶，混匀后迅速灌胶，留出灌注浓缩胶所需空间（约1.5cm）。加水覆盖浓缩胶至玻璃板的边缘，室温下垂直放置30min。待分离胶完全凝固后，吸走用于覆盖的水。配置4％的浓缩胶，在已凝固的分离胶上灌入浓缩胶，立即向浓缩胶溶液中插入上样梳子，小心避免混入气泡，室温下垂直放置30min。
3 SDS-PAGE电泳。待浓缩胶完全凝固之后，取下并固定于电泳槽中，槽内加入新配的1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，小心拔出上样梳子，按顺序加样。向槽外加入1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液后，即可连接电源，以恒压方式进行电泳。电泳条件：室温下，浓缩胶恒压50V，分离胶恒压100V，电泳时间约为2h，待溴酚蓝到达分离胶底部，即可停止电泳。
4 染色。从电泳装置取出凝胶板，卸下玻璃板得到的凝胶切去浓缩胶，用蒸馏水清洗凝胶表面的缓冲液。室温下，用染色液浸泡染色，在摇床上温和振动4h 以上。
5 脱色。回收染色液，加入脱色液。室温下，在摇床上温和振动，直至凝胶背景颜色变浅，其间更换脱色液3次。
2.4.2 Western blotting鉴定
1 以2.3.2中的方法进行菌体总蛋白SDS-PAGE电泳。
2 前期处理。根据点样孔的位置及蛋白mark的标记，切下需进行Western blotting 检测的凝胶条带，测量并记录被切下凝胶的长与宽，将凝胶置于电转缓冲液中浸泡。剪6张滤纸和1张PVDF膜，大小与凝胶相同。滤纸浸入预冷的电转缓冲液，PVDF膜先用甲醇活化5min，再浸入预冷的电转缓冲液5min以上，需除去沾在膜上的气泡。
3 转膜。按如下顺序放置湿转仪：阴极（黑面）—海绵—3张滤纸—凝胶—PVDF 膜—3张滤纸—海绵—阳极（白面）。每层需从左到右铺上，铺好后在其上面加小量预冷的电转缓冲液，在用试管从左到右滑动以排去叠层中可能残留的气泡。电转条件：4℃，100mA恒流转膜1h。
4 封闭。从电转装置取下PVDF膜，剪下一角作为标记。用TBST清洗PVDF膜的表面，加入适量封闭液，室温下，在摇床上温和振动，封闭1h。
5一抗体和目的蛋白的结合。取出PVDF膜，用TBST清洗PVDF膜的表面，放入杂交袋，加适量1:3000稀释的一抗稀释液，尽可能排除气泡，封口，4℃过夜。
取出PVDF膜，用TBST漂洗3次，每次5min。
6 二抗体和一抗体的结合。将膜放入杂交袋内，加适量稀释后的辣根过氧化物酶标记的二抗稀释液，尽可能排除气泡，封口，室温下，在摇床上温和振动1h。取出PVDF膜，用TBST漂洗3次，每次5min。
6 显影。取出PVDF膜，用滤纸小心吸干膜上的液体。将ECL液加入Eppendorf 管内混匀，滴加在PVDF膜上，充分接触后，用滤纸小心吸干膜上的多余的液体，用保鲜膜包好。暗室中，加X光片（剪下一角以作标记）压片曝光，洗片顺序：显影液—自来水—定影液—自来水。X光片晾干后，分析结果。
2.4 重组菌的生长曲线
1 接种50μl重组菌到4ml LB培养基（含卡那霉素100μg/ml）的试管中，在培养箱中，37℃，180rpm培养12h。
2 转接1.5ml试管中的菌液到含50ml LB培养基的锥形瓶（含氨苄青霉素
100μg/ml）中（如果转化并连接成功的大肠杆菌具有抗氨苄能力），在培养箱中，37℃，180rpm培养。
3 以接种前的LB培养基为空白，测定接种后菌液的OD600，每隔1h取样一次，以OD600和重组菌生长时间绘制生长曲线。
2.5 最佳表达条件的筛选
2.5.1 诱导剂IPTG的用量的筛选
1 将重组菌以3%的接种量分别转接至含50ml LB培养基的锥形瓶（含氨苄青霉素100μg/ml）中，37℃，180rpm培养。
2 待OD600约等于0.6～0.8时，分别加入IPTG至终浓度为0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L。37℃，180rpm培养4h。
3 诱导4h后，取样测定菌液OD600，同时取出1ml菌液样品，如步骤2.4.1进行菌体总蛋白的SDS-PAGE电泳，检测cofilin-1蛋白的表达。电泳结果用凝胶成像仪的软件进行光密度扫描分析，确定重组蛋白在总蛋白中的含量，并选取cofilin-1蛋白表达量在菌体总蛋白中所占比例最高的为诱导剂IPTG的用量。
2.5.2 诱导温度的筛选
1 将重组菌以3%的接种量分别转接至含50ml LB培养基的锥形瓶（含氨苄青霉素100μg/ml）中，37℃，180rpm培养。
2 根据2.5.1的结果选取合适的IPTG浓度，待OD600约等于0.6～0.8时，加入IPTG 后，分别于20℃、25℃、30℃、37℃进行诱导。180rpm培养8h。
3 诱导8h后，取样测定菌液OD600，同时取出1ml菌液样品，如步骤2.4.1进行菌体总蛋白的SDS-PAGE电泳，检测cofilin-1蛋白的表达。电泳结果用凝胶成像仪的软件进行光密度扫描分析，确定重组蛋白在总蛋白中的含量，并选取cofilin-1蛋白表达量在菌体总蛋白中所占比例最高的为诱导温度。
2.5.3 诱导时间的筛选
1 将重组菌以3%的接种量分别转接至含50ml LB培养基的锥形瓶（含氨苄青霉素100μg/ml）中，37℃，180rpm培养。
2 根据2.5.1和2.5.2的结果选取合适的IPTG浓度和诱导温度，待OD600约等于
0.6～0.8时，加入IPTG后，分别于4h、8h、10h、12h、16h、20h、24h取样测定菌液OD600，同时取出1ml菌液，样品经处理后，置4℃保存备用。
3 待样品收集完成后，如步骤2.4.1进行菌体总蛋白的SDS-PAGE电泳，检测cofilin-1蛋白的表达。电泳结果用凝胶成像仪的软件进行光密度扫描分析，确定重组蛋白在总蛋白中的含量，并选取cofilin-1蛋白表达量在菌体总蛋白中所占比例最高的为诱导时间。
3 cofilin-1蛋白纯化与鉴定
3.1 菌体裂解上清的制备
1 称量菌体湿重，以1：10的比例加入PBS（pH7.8）缓冲液（磷酸缓冲液），涡旋震荡使菌体重悬，直到没有菌块存在。
2 在冰浴条件下，超声破碎菌液，参数功率条件：800W；超声时间3s；间歇时间6s；超声循环99次，超声次数：2～3次。
3 4℃，17000×g离心30min，分别收集收集上清和沉淀。
4 如步骤2.4.1进行SDS-PAGE电泳检测。
3.2 cofilin-1重组蛋白的纯化
1 镍琼脂糖凝胶（固定金属离子亲和色谱，利用蛋白质表面的氨基酸，如组氨酸与多种过渡金属Cu，Zn,Ni,Co,Fe发生特殊的相互作用，利用这个原理把富含这类氨基酸的蛋白质分离出来）预处理。取出镍琼脂糖凝胶8g，放入蒸馏水中充分搅拌清洗，静置2h后倾去上层蒸馏水。将层析柱装好垂直固定于滴定架上，使镍琼脂糖凝胶沿玻璃棒倒入柱内，并用PBS（pH7.8）冲洗。
2 层析柱平衡。用100～200ml 0.5mol/L NaOH缓冲液平衡柱子，静置30min，用蒸馏水冲洗至流出液pH呈中性；再用100～200ml 0.1mol/L EDTA（络合剂，和碱金属，稀土元素和过渡金属形成稳定的水溶性络合物）缓冲液平衡柱子，静置30min，蒸馏水冲洗。处理完后，将镍琼脂糖凝胶浸泡于0.5mol/L硫酸镍中过夜。控制流速1ml/min。
3 加样及洗脱穿透峰1。用PBS（pH7.8）将多余的硫酸镍冲洗下来，待流出液的吸光值不再变化时，加入样品，待样品液面与柱面相切时，再加入PBS（pH7.8）洗脱。控制流速1ml/min，检测波长为280nm，收集洗脱峰。
4 洗脱杂蛋白峰2。待流出液的吸光值不再变化时，用30mM/L咪唑的缓冲液洗脱杂蛋白，流速为2ml/min，检测波长为280nm。留样电泳，收集洗脱峰。
5 洗脱目的蛋白峰3。待流出液的吸光值不再变化时，用300mM/L咪唑的缓冲液洗脱cofilin-1重组蛋白，流速为2ml/min，检测波长为280nm。收集洗脱峰。
6 层析柱再生。用0.5mol NaOH和纯水各流洗200ml，再用20%的乙醇流洗
100ml，流速为2ml/min，放置4℃冰箱保存。
7 SDS-PAGE电泳。以2.3.2中的方法对纯化中收集的样品进行SDS-PAGE电泳检测。
3.3 cofilin-1重组蛋白脱咪唑（咪唑能竞争性的结合到柱子上，使带His标签的目的蛋白丧失了结合位点，从而被洗脱下来）
1 ephadexG-25（交联葡聚糖凝胶的种类有G-10、G-15、G-25、G-50、G-75、G-100、G-150、和G-200。G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克）预处理。取出ephadexG-25约30g，放入蒸馏水中充分搅拌清洗，静置2h后倾去上层蒸馏水。将层析柱装好垂直固定于滴定架上，使镍琼脂糖凝胶沿玻璃棒倒入柱内，并用超纯水冲洗。
2 层析柱平衡。用300ml超纯水冲洗，控制流速1ml/min，检测波长为280nm，。
3 待流出液的吸光值不再变化时，将3.2制备的cofilin-1重组蛋白上样，流速为3ml/min。
4 用超纯水1洗脱，流速为3ml/min，检测波长为280nm。收集洗脱峰。当蛋白峰下降时，每隔1min收集少量液体加入20μl的硝酸银混匀，当出现白色沉淀时，停止收集溶液。
5 层析柱再生。用0.5mol/L NaOH和纯水各流洗200ml，再用20%的乙醇流洗100ml，流速为2ml/min，放置4℃冰箱保存。
6 SDS-PAGE电泳。以2.3.2中的方法对纯化中收集的样品进行SDS-PAGE电泳检测。
7 将脱咪唑后的蛋白溶液置于-20℃过夜，待溶液结冰后，放入冷冻干燥机中冻
干成粉末，收集后放-20℃保存。
3.4 cofilin-1重组蛋白分子量的测定
cofilin-1蛋白送暨南大学生命与健康工程研究院用基质辅助激光解吸/电离
飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）测定其精确分子量。
4 cofilin-1重组蛋白生物活性的检测
4.1 样品前处理
称取粉末状的cofilin-1重组蛋白及actin蛋白（即“肌动蛋白”，β-Actin是PCR 常用的内参，β-Actin抗体是Western Blot很好的内参指数）分别溶于适量的双蒸水中，充分溶解。置于冰上待用。
4.2 BCA法测定蛋白浓度
BCA法原理是：在碱性的条件下，二价铜离子可以被蛋白质还原成一价铜离子，BCA与一价铜离子结合形成稳定的紫蓝色复合物，该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度有正比关系。
（1）BSA标准曲线的制备。
准备8个1.5mL EP管，按照下面配制浓度分别为0μg/μl、0.025μg/μl、0.05μg/μl、0.1μg/μl、0.2μg/μl、0.3μg/μl、0.4μg/μl、0.5μg/μl的BSA标准溶液。
编号 1 2 3 4 5 6 7 8
(0.5m g/ml)
0 50 100 200 400 600 800 1000 BSA(μl)
PBS（μl）1000 950 900 800 600 400 200 0
Total volume
1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 （μl）
（2）蛋白样品的处理。
将蛋白样品用PBS稀释后，涡旋混匀后，加入96孔板，每个样品3个复孔，每个孔加入10μl。将BCA试剂按比例混合后，每个孔加入100μl。37℃放置30min。用酶标仪检测，波长为570nm。
4.3 非变性PAGE电泳检测
1 准备Eppendorf管标记编号1～9。将样品分别加入EP管中，actin蛋白溶液向1～9管每管分别加入20μmol/L；DNase I蛋白溶液向2～9管每管分别加入16μmol/L；
cofilin-1蛋白溶液向3～9管每管分别加入5μmol/L、10μmol/L、12.5μmol/L、
15μmol/L、20μmol/L、25μmol/L、30μmol/L。最后每管分别加入8×G-buffer和双蒸水，使终浓度为1×G-buffer，终体积为16μl，充分混匀，整过程在冰上进行。
2 将Eppendorf管放入22℃水浴箱中，反应20min。
3 取出Eppendorf管置于冰上，加入5×非变性PAGE loading buffer混匀。
4 10%非变性PAGE蛋白电泳胶配制成分如下：
成分分离胶(ml) 浓缩胶(ml)
30%丙烯酰胺溶液 3.33 0.53
ddH2O 3,87 2.93
1.5M Tris-Cl(pH8.8)
2.5 --
0.5M Tris-Cl(pH6.8) -- 0.5
10%APS 0.01 0.06
TEMED 0.004 0.006
5 如步骤2.4.1进行非变性PAGE蛋白电泳。电泳条件：4℃，浓缩胶恒压30V，分离胶恒压70V，电泳时间约为5h，待溴酚蓝到达分离胶底部，即可停止电泳。
5 cofilin-1重组蛋白多克隆抗体的制备
5.1 动物免疫步骤
1 样品的处理。将冻干的粉末状的cofilin-1重组蛋白溶解于PBS中，终浓度为
1mg/mL，用0.2μm的滤器过滤除菌。把除菌后的cofilin-1重组蛋白溶液与弗氏完全佐剂以1：1完全混合制备成（"油包水"乳状液，能够非常有效的诱导产生高浓度的抗体。弗氏完全佐剂含结核分枝杆菌的细胞壁成分，用于初次免疫刺激。）。cofilin-1混合物终浓度浓度为0.5mg/ml。
2 初次免疫。准备家兔4只，取免疫前血清为阴性对照组，向家兔背部的皮下多点注射cofilin-1与弗氏完全佐剂的混合物，共注射1ml。
3 加强免疫。每隔10天，进行臀部的皮下多点注射cofilin-1与弗氏不完全佐剂（不完全佐剂是油剂（石蜡油或植物油）与乳化剂（羊毛脂或吐温（Tween）80）相混合而成。在不完全佐剂中加入死的分枝杆菌，即成为费氏完全佐剂。就是刺激机体产生免疫应答）的混合物，cofilin-1混合物终浓度浓度为0.5mg/ml，共注射1ml。第三次免疫后10天，耳动脉抽血，4℃过夜，第二天离心分离血清，ELISA
法检测抗血清的效价。当效价合格后，便可停止免疫，否则继续加强免疫。
4 抗血清初步处理。抗血清效价达到要求后，剪断兔的颈动脉采血，所采集的血液在室温下放置2h左右，再放置4℃过夜，第二天4000×g离心4min收集抗血清，抗血清分装后放-20℃冰箱保存。
5.2 ELASA检测抗血清的效价
1 包被。用包被缓冲液（一般Elisa包被用的缓冲液都是偏碱性的碳酸盐缓冲液（pH8-9)，目的就是要让被包被的蛋白质暴露较多的阴性集团，更稳定的吸附到板子上。）稀释cofilin-1粉末，至终浓度为1μg/mL。将溶液加入酶标板内，每孔100μl，4℃过夜。
2 洗涤。将酶标板中液体甩干，用洗涤液洗涤3次，每次3min。
3 封闭。每孔加入封闭液100μl，37℃放置2h。
4 洗涤。将酶标板中液体甩干，用洗涤液洗涤3次，每次3min。
5 一抗与蛋白的结合反应。将抗血清用稀释液稀释成1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000、1:256000，每孔100μL，每个浓度设置2个复孔，37℃放置2小时。
6 洗涤。将酶标板中液体甩干，用洗涤液洗涤3次，每次3min。
7 酶标抗体反应。用稀释液将HRP标记的羊抗兔IgG-按1:3000稀释，每孔100μL，37℃保温2小时。
8 洗涤。将酶标板中液体甩干，用洗涤液洗涤3次，每次3min。
9 显色.。加100μl TMB，37℃避光放置15min，加入50μl 2mol/L H2SO4终止显色。利用酶标仪检测结果。使用条件：波长为450nm，参比波长为630nm读数。
多克隆抗体的效价公式：阴性对照OD值记为N，免疫后抗血清OD值记为P，若P/N≧2.1，且P-N>0.2，即判为阳性结果，以出现阳性反应的最高稀释度作为抗体的效价。
5.3 cofilin-1抗体的纯化与检测
5.3.1 盐析操作步骤
1 取15ml的抗cofilin-1兔血清与15ml生理盐水充分混合。向混合液慢慢滴加饱和硫酸铵30ml（硫酸铵饱和度为50%），并不断搅拌至百色浑浊物出现，4℃放置3
小时以上，使其充分沉淀。
2 3000rpm离心20min，弃上清，以生理盐水溶解沉淀至30ml，慢慢滴加饱和硫酸铵20ml（硫酸铵饱和度为40%），并不断搅拌至百色浑浊物出现，4℃放置3
小时以上，使其充分沉淀。
3 3000rpm离心20 min，弃上清，以生理盐水溶解沉淀至30ml，慢慢滴加饱和硫酸铵14.7ml（硫酸铵饱和度为33%），并不断搅拌至百色浑浊物出现，4℃放置3小时以上，使其充分沉淀。
4 3000rpm离心20min，弃上清，将所得沉淀物以的PBS(pH7.4)溶解至15ml。
5 将溶液分装到超滤离心管，3000rpm离心20min，弃离心管下层滤液，向上层溶液再加入PBS混合。
6 重复步骤5多次，将脱盐后的蛋白溶液置于4℃保存备用。
5.3.2 DEAE离子交换层析
1 DEAE-SephadexA-50预处理。取出DEAE-SephadexA-50（以下简称A-50）8g，放入蒸馏水中充分搅拌清洗，静置2h后倾去上层蒸馏水。将层析柱装好垂直固定于滴定架上，A-50沿玻璃棒倒入柱内，并用PBS（pH7.4）冲洗。
2 层析柱平衡。用100～200ml 0.5mol/L NaOH缓冲液平衡柱子，静置30min，用蒸馏水冲洗至流出液pH呈中性；再用100～200ml 0.5mol/L HCl缓冲液平衡柱子，静置30min，用蒸馏水冲洗至流出液pH呈中性；用100～200ml 0.5mol/L NaOH缓冲液平衡柱子，静置30min，用蒸馏水冲洗至流出液pH呈中性。处理完后，将A-50浸泡于PBS（pH7.4）中过夜。控制流速1ml/min。
3 加样及洗脱。向层析柱内加入PBS（pH7.4），待流出液的吸光值不再变化时，加入样品，待样品液面与柱面相切时，再加入PBS（pH7.4）洗脱。控制流速1ml/min，检测波长为280nm。。
4 收集样品。在开始洗脱的同时就以试管分部收集样品。
5 层析柱再生。用NaCl洗脱蛋白质，待流出液的吸光值不再变化时，再以蒸馏水洗去柱中盐。然后按层析柱平衡的过程将A-50再处理一遍。用无水酒精洗2次，放置4℃冰箱保存。
6 SDS-PAGE电泳。以2.3.2中的方法对纯化中收集的样品进行SDS-PAGE电泳检测。
5.4 纯化抗体的检测
5.4.1 纯化抗体效价的测定
以5.2中的方法对纯化后抗体的效价进行ELASA检测。
5.4.2 western blotting鉴定多克隆抗体的特异性
1 细胞总蛋白的提取
用胰酶分别消化MEF和Atg细胞，室温下，放置1～2min。观察中方瓶底部起白色雾状时，将消化液倒掉，用吸管将未倒净的消化液洗掉。加入6ml的培养液，用吸管轻轻吹打使细胞充分悬浮，吸出3ml分装到另一中方瓶，再加入3ml 培养液混匀，放培养箱内，37℃培养2天，待瓶内细胞长满后，即可进行以下操作：
（1）用胰酶消化细胞，室温下，放置1～2min。
（2）将消化液倒掉，用吸管将未倒净的消化液洗掉。
（3）加入6ml的培养液，用吸管轻轻吹打使细胞充分悬浮。
（4）将悬浮细胞液转移到15ml离心管内，室温下，3000rpm离心5min。
（5）取出离心管，倒掉培养液，倒置在滤纸上，吸尽培养液。
（6）加入1ml PBS，涡旋混匀，室温下，3000rpm离心5min。
（7）倒掉PBS，倒置在滤纸上，吸尽PBS。
（8）加入60μl PIPA裂解液（含2%的PMSF），立即置于冰上，裂解30min，每5min 涡旋混匀，混匀后立即置于冰上。4℃，12000rpm离心15min
（9）取上清置于Eppendorf管中，-20℃保存备用。
2 western blotting具体操作步骤参照2.4.2
浅谈原核表达
浅谈原核表达的技巧 摘要：原核表达是表达外源基因常用的方法，具有操作简单、快捷，需时较短，表达产量高，适合工业化等优点。本文作者根据自己的实践经验，总结了原核表达的一些技巧。 关键词：原核表达表达载体限制性内切酶 将植物、动物、微生物等的目的基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下优点：易于生长和控制；易于培养，实验耗费少；可选择多种大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒。原核表达是近年来表达外源蛋白常用的方法，本文根据自己的实践经验，着重谈谈对原核表达中的技巧问题。 一、原核表达一般程序 表达前准备-获得目的基因-构建含目的片段的表达载体（测序验证）-转化表达宿主菌-诱导靶蛋白的表达-表达蛋白的分析。 二、原核表达中各操作步骤的关键因素及技巧 1.表达前的准备要素：原核表达注重表达前对目的片段、表达载体及表达菌株的分析、选择。正所谓“磨刀不误砍柴功”，经过细致、周全的分析、准备、设计可带来较为顺当的实验，可免去许多不必要的麻烦。 （1）对表达载体的分析 载体的选择：同样的载体，同样的系统，很可能表达这个蛋白表达量起高，但另外一个就是做不出来，所以表达载体的选择非常重要，没有万能的载体。选择载体通常我们关心质粒上的几个功能组件及所带来的问题：是否为诱导表达型载体，启动子的强弱、多克隆位点、限制性内切酶的位置、终止密码子的有无及位置，融合Tag的有无，筛选报告基因的位置等。所选载体一定要保持原来的遗传背景（有些载体经过多次交换已变异）。选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑，如果为了方便纯化，可选择融合表达；如果为了获得天然蛋白，可选择非融合表达。融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。 翻译的起始位点：要表达目的蛋白，在该基因的5’端必须有一起始位点，现在大部分的表达载体都提供起始位点，起始密码子与核糖体结合位点的距离都已被优化，一般情况下不需要自己再加，实际操作时要留意载体图谱上是否注明有起始密码子和终止密码子，如无，还得根据自己的实际情况加上。 在起始密码子附近的mRNA二级结构：外源基因其始转录后，保持mRNA的有效延伸、终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键，尤其是在起始密码子附近的mRNA二级结构可能会抑制翻译的起始或者造成翻译暂停从而产生不完全的蛋白。如果利用Primer Premier软件分析DNA或RNA结构上有柄（stem）结构，并且结合长度超过8个碱基，这种结构会因为位点专一突变等因素而变得不稳定，影响正常的翻译。 （2）对目的片段的分析 基因（或蛋白）的大小：原核表达的成功与否与所要表达的蛋白（或基因）大小有关，一般说来小于5kD或者大于100kD的蛋白都是难以表达的。蛋白越小，越容易被内源蛋白水解酶所降解。在这种情况下可以采取串联表达，在每个表达单位（即单体蛋白）间设计蛋白水解或者是化学断裂位点。如果蛋白较小，那么加入融合标签GST、Trx、MBP或者其它较大的促进融合的蛋白标签就较有可能使蛋白正确折叠，并以融合形式表达。如果蛋白较大，大于60kD的蛋白建议使用较小的标签（如6×组氨酸标签）。对于结构研究较清楚的蛋白可以采取截取表达。当然表达时要根据目的进行截取，如果是要进行抗体制备而截取，那么一定要保证截取的部位抗原性较强。对于抗原性也可以利用软件分析，比如Vector NIT Suite或者一些在线软件，不过在分析之余也要认识到这是一种资料统计的结论，
原核表达遇到瓶颈怎么办(终审稿)
原核表达遇到瓶颈怎么 办 TPMK standardization office【 TPMK5AB- TPMK08- TPMK2C- TPMK18】
我想表达遇到的第一个瓶颈估计就是为什么我的外源片段插到载体里面，PCR鉴定没问题，双酶切也OK，可是就是不见表达。一般我们是如何判断没有表达呢？大多都是首先进行SDS-PAGE。在跑胶的时候一定要设对照，比较严谨的电泳对照，应该是：Marker，标准品阳性对照（如果有，且打算做Western的话），以及空白载体（诱导）和重组载体（不诱导）2个阴性对照，再加上诱导不同时间的表达结果。Marker用于判断条带大小，标准品用于判断Western体系包括抗体显色剂和操作的可靠性，以及精确判断大小；空白载体（诱导）负对照有助于判断在非诱导条件下的本底表达；而重组载体（不诱导）负对照则有助于判断诱导的效果以及排除诱导剂对宿主菌潜在的干扰，或者是区分细菌内源和外源表达产物——偷懒可不是好习惯，会影响结果判断。注意，接种表达和接种做感受态都类似，一定要用挑单克隆、加足量抗生素、过夜培养的新鲜菌液转种最好，在筛选压力下生长旺盛的种子液远比经过4℃保存的菌液要好得多，也许是因为保存时间长会导致抗生素失效部分细菌丢失质粒或者其他变化。反正就是一种经验做法。 跑SDS-PAGE的话可以用考马斯亮兰染，它灵敏度在100ng左右；但是不能跟着做Western了。银染的灵敏度在0.1～1 ng；有钱还可以用Sypro Red，灵敏度高还可以继续做Western。WesternBlot是蛋白质定性和半定量的最通用的技术，具体细节可参考生物通WesternBlot技术专题，我们有详细介绍的。 在做过Western Blot仍没有检测到表达带，那么就要开始进行下一步的分析了。首先，看看载体的多克隆位点和片断插入的序列，是否有因为酶切连接而意外引入了转录终止信号。有时载体几经多个实验人员的周转，反复插入片断，或者是粘端
原核表达步骤
1.将已经成功转有重组表达载体pET-28a-CYP83A1的表达菌 E. coli.BL21(DE3)在LB固体培养基（50μg/mL Kan）上划线接种培 2.挑取单菌落，接种于5mL的LB液体培养基(50μg/mL Kan)中，37℃，180r/min振荡培养过夜。 3.取500μL过夜培养的菌液转接入100mL新的LB液体培养基(50μg/mL Kan)中，37℃，190r/min振荡培养到菌液OD600 =0.6~0.8。 4.分组培养：实验组加入终浓度为1mmol/L的IPTG，对照组不加IPTG，37℃，190r/min诱导培养6h。 5.8000r/min离心2min，收集细菌，用1×PBS(0.01mol/L)缓冲液悬浮。 6.冰上超声波破碎，功率30w，工作5s，间歇5s，总时间2min。 7.4℃、12000r/min离心10min，分离上清与沉淀，取100μL上清与等体积的2×上样缓冲液混合；用200μL1×上样缓冲液悬浮沉淀，沸水浴5min后，对上清和沉淀进行SDS-PAGE检测。
重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达及SDS-PAGE分析 挑测序正确的单克隆接种到3mLLB（50μg·mL-1Kan）培养基中，振荡培养12h后，将菌液按1﹕100的比例加入到300mL LB（50μg·mL-1Kan）培养基中200r/min37℃振荡培养至OD600为0.5—0.6时，加入IPTG（使终浓度为1mmol·L-1）进行诱导表达，分别在37℃诱导4h，4℃保存备用。未加IPTG诱导的pET-28a-CsFOMT收集作为阴性对照。诱导全部完成后，各取50mL 菌液离心收集细菌，加入SDS上样缓冲液，悬浮混匀，100℃3min，12000r/min离心1min，取上清4℃保存备用。另取50mL菌液离心收集菌体后用1×PBS（PH7.4）将沉菌悬起，经过超声波细胞破碎（20mm的变幅杆，400W，超声2s，间隔5s，重复60次），10000r/min离心10min分离上清和沉淀，上清和沉淀样品中分别加入SDS上样缓冲液，混匀，沸水浴，取上清和沉淀分别进行SDS-PAGE（5%浓缩胶，12%分离胶），然后分析蛋白表达结果
原核表达
原核表达 一、原理 1、E . coli 表达系统 E . coli 是重要的原核表达体系。在重组基因转化入E . coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。 2、外源基因的诱导表达 提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。常用的有温度诱导和药物诱导。本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。 不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。 二、材料 1、诱导表达材料 ( 1 ) LB （Luria—Bertani）)培养基 酵母膏(Yeast extract) 5g 蛋白胨(Peptone) 10g NaCl 10g 琼脂(Agar) 1-2% 蒸馏水(Distilled water) 1000ml pH 7.0 适用范围：大肠杆菌 ( 2 ) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20 ℃保存。 ( 3 ) l×凝胶电泳加样缓冲液： 50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 ) 50 mmol / L DTT 2 % SDS （电泳级） 0.1 ％溴酚蓝 10 ％甘油 2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料 1 ）酶溶法 （1）裂解缓冲液： 50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 ) 1 mmol / L EDTA 100 mmol / LNaCI （2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。 （3）10 mg / mL 溶菌酶。 （4）脱氧胆酸。 （5）1 mg / mL DNase I。 2 ）超声破碎法 ( 1 ) TE 缓冲液。 ( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液： 100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 ) 100 mmol / L DTT 4 %SDS 0.2 ％溴酚蓝 20 ％甘油
原核表达步骤
Chi l 原核表达基本试验步骤 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件： （1）选择标志的编码序列； （2）可控转录的启动子； （3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)； （4）一个多限制酶切位点接头； （5）宿主体内自主复制的序列。 原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测，其中包括： 一、试剂准备 （1）LB培养基。 （2）1M IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于10ml ddH2O
中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。 CCY的IPTG是1M的，用时进行1000倍稀释。 二、操作步骤 （一）获得目的基因 1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。 2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 （二）构建重组表达载体 1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。我们用Soultion I连接。 （三）获得含重组表达质粒的表达菌种 1、将连接产物转化大肠杆菌BL21，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。
如何做原核表达
如何做原核表达 人们合成与生物相关的物质是从尿素开始的，1828年，德国化学家维勒人工合成了存在于生物体的这种有机物。在1960年我国科学家采用化学方法首次成功地合成了具有生物活性的蛋白质——胰岛素。随着内切酶的发现和基因工程技术的发展，人们发现用各种不同的载体在原核、真核系统中进行蛋白表达更为行之有效。而这其中大肠杆菌表达系统发展得最为迅速、成熟。原核表达具有操作方便、快捷，需时较短，表达量大，适合工业化生产等优点。虽然也有缺少糖基化和表达后加工等问题，当有了其它多种表达系统后，原核系统仍是我们合成外源蛋白的首选。 在网上看到有人把原核表达技术分成四个等级：初次尝试扫盲、乱棍打枣入门、系统优化中级和自成一体高手，觉得十分有意思。但是根据笔者自己的经验以及耳闻目睹的一些经历告诉我：做表达？那是谋事在人，成事在天。有时候你把克隆做出来了，双酶切鉴定没问题，测序没问题，可是就是看不到表达带。原因当然可以分析，实验也是可以改进，但是窜改一下戈尔泰的话：“成功的实验都是一样的，失败的实验各有各的不幸。”在实验遇到瓶颈的时候要如何进行分析，找到问题的症结是我们的实验关键所在。在准备进行原核表达的时候需要考虑的因素很多，市面上可供选择的载体、菌株也很多，要如何进行正确的选择，找到适合自己的载体是十分重要的。所以，现在要对目前常用的一些载体进行介绍，让我们对其相关产品及其表达原理进行了解，以方便实验设计。 首先来一些大肠杆菌表达的基本概念：一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株，如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂，如果是融合表达还包括纯化系统或者Tag检测等等。选择表达系统通常要根据实验目的来考虑，比如表达量高低，目标蛋白的活性，表达产物的
原核表达步骤
原核表达步骤
Chi l 原核表达基本试验步骤 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件： （1）选择标志的编码序列； （2）可控转录的启动子； （3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)； （4）一个多限制酶切位点接头； （5）宿主体内自主复制的序列。 原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测，其中包括： 一、试剂准备 （1）LB培养基。 （2）1M IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于10ml ddH2O
中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。 CCY的IPTG是1M的，用时进行1000倍稀释。 二、操作步骤 （一）获得目的基因 1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。 2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 （二）构建重组表达载体 1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。我们用Soultion I连接。 （三）获得含重组表达质粒的表达菌种 1、将连接产物转化大肠杆菌BL21，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。
原核表达步骤总结
原核表达步骤 原核表达先要将基因克隆到原核表达载体上，然后通过转化到 JM109或BL21等菌株中，诱导表达蛋白，然后进行蛋白纯化。本实验方案的前提是，目的基因已克隆到载体，并已转进入JM109菌株中。 1．鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌JM109或BL21中大量表达 （1）制样 1 . 挑取经过双酶切鉴定的单克隆菌落于700ul LB培养基，加入0.7ul Amp（100mg/mL），37o C200r/min摇床培养，过夜活化。 2. 以1：50比例（200ul），将活化的过夜培养物加入10mL LB液体培养基中，加入10uLAmp（100mg/ml），37o C200r/min摇床扩大培养2h-3h，期间取样监控菌液的OD值，控制菌液OD600在0.6-1.0之间，以使大肠杆菌处于最适合表达外源蛋白的生长状态。(一般3h时，菌液浓度及达到标准，但是不同的基因对菌的影响不同，所以第一次实验时需要确定这个最佳时间) 3. 从10ml扩大培养物中取3ml菌液作为不加IPTG的空白对照（CK），其余7ml菌液加入7ul IPTG（储存浓度为0.5mol/l），使IPTG 终浓度达到0.5mmol/l。以200r/min的转速，37o C摇床培养3h。 4. 以5000r/min离心2min收集菌体，倾倒上清，每个离心管收集3ml培养物。 5. 加入1ml dH2O，将管底沉淀用振荡器打散以充分洗涤，8000r/min 离心2min，倾倒上清。 6. 重复步骤5。将离心管中的水倒干净。 （二）菌落SDS-PAGE 1. 在收集的菌体中加入200ul 1×SDS PAGE loading buffer(可根据沉淀的量增加或减少loading buffer的量，一般200ul比较合适)。用漩涡器剧烈震荡，确保将管底沉淀震散。 2. 将样品于100℃恒温加热器上开盖加热10min（Marker也要加热）。样品凉后，12000r/min离心3min，取每管的上清点样。上样量一般30ul—40ul，marker 20ul。 （3）SDS-PAGE分析 1. 根据目的片段的大小，制作不同浓度的分离胶 蛋白分子量 (kDa)凝胶浓度 (%) 4-4020
原核表达步骤
实验方法与步骤 1 表达质粒的构建及测序分析 1.1 cofilin-1的片段的准备 1.1.1 引物设计 根据在GenBank上查找人源cofilin-1的基因序列，用Primer Premier 5.0软件进行上下游引物的设计，并送往上海生物工程技术服务有限公司合成的PCR 引物。引物如下： 引物名称序列 F-cofilin-1 5′-AAGTCGACATATGGCCTCCGGTGTG-3′ R-cofilin-1 5′-TCTCTCGAGGGCTCACAAAGGCTTG-3′将以上引物用灭菌的三蒸水稀释成10μmol/L，分装于Eppendorf管中，-20℃冰箱中保存备用。 1.1.2 cofilin-1片段PCR 1 反应体系： 2.5μl KOD polymerase(3’-5’核酸外 切酶活性) KOD polymerase buffer 5μl MgSO4 2.5μl DMSO（“万能溶剂”） 2.5μl dNTPMixture 5μl PrimerF（底物） 1.5μl PrimerR 1.5μl Template（模板）5μl ddH2O 25μl Total 50μl 2PCR反应条件：
①94℃预变性3min ②94℃退火30s ③65℃延伸40s ④68℃40s ⑤go to②30个循环 ⑥68℃5min ⑦4℃forever 3 琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测 （1）配置浓度为1%的凝胶。称取琼脂糖0.3g，加入30ml 1×TAE电泳缓冲液（Tris-乙酸电泳缓冲液）中，用微波炉加热2min，待凝胶稍冷却，加入2μl EB（溴化乙锭，荧光染色剂）混匀后倾入凝胶铸槽中，插入梳子，并用玻璃棒驱除气泡，待凝胶完全凝结后拔除梳子。 （2）把凝胶置于1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中，加样孔置于负极一侧，然后依次在加样孔中加入50μl Marker、50μl样品＋10μl loading buffer(上样缓冲液，可以显示两条带，前面的蓝色的条带是溴酚蓝，代表的片段大小是300bp，后面的有点绿色的条带是二甲苯青，代表的片段大小在4000bp左右)，盖上电泳盖，以100V电压进行电泳。 （3）当Marker条带充分分开后即可停止电泳，将凝胶移至保鲜膜上，置于凝胶自动成像仪中分析。 4 割胶回收PCR反应体系的扩增产物，用Omega Bio-Tek公司的Gel Extrection Kit进行回收： （1）将PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下迅速切取含有目的条带的琼脂糖凝胶，放入灭菌的EP管中。DNA在紫外灯下曝光时间不超过30s。 （2）称量凝胶块重量，以1g＝1ml进行计算，加入适量体积的binding buffer，55-65℃加热至凝胶完全融化（约7～10min），每隔2～3min震荡一次。 （3）将Hibind DNA柱子套在2ml的收集管。将上述步骤（2）的溶液转移至Hibind DNA柱子中，10000×g离心1min，弃滤液。 （4）将柱子装回收集管中，加入300μl binding buffer，10000×g离心1min，
原核表达详细步骤
原核表达详细步骤 PartⅠ选择表达的目的基因 一、基因序列 1. 得到靶基因DNA（cDNA）序列，有几种方式寻找正确的读码顺序: ①利用生物信息学在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA 的ORF中找到正确的读码。 ②实验方法，即得到蛋白，进行测序，然后在DNA上找到正确的读码。 ③利用mRNA的特征，找到启动子，编码区，终止子。在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子（cDNA）。 2. 注意事项： ①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS可以是DNA上的定义，也可以是mRNA上的定义，分为complete CDS和partial CDS,是从第一个核酸开始读，连续读下去，complete CDS读码是“M、、、、、、、、、＊”，partial CDS的读码是相应的AA ②在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。 二、抗原决定簇的预测 1、原理： 蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。一般抗原决定簇是由6－12 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。 2、选择原则： （1）、亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的。
原核表达综述
[Merck推荐]原核表达秘笈之宿主菌株选择指南 在原核蛋白表达过程中，选择构建一个合适原核表达体系需要综合考虑3大因素：表达载体、宿主菌株、表达诱导条件,以获得最满意的表达效果。 事实上，在平时的实验中，最容易被忽视的就是宿主菌的选择——多数人会直接选择自己实验室曾经用过的表达菌株，或者是载体配套的菌株，而不去追究原因——即使表达结果不佳，大多在表达条件和载体上找原因，也不会考究菌株的选择是否适合。 作为原核表达的宿主，对外源基因的表达会产生一定的影响，是勿庸置疑的。每一个宿主细胞都像一个微观的小工厂，按照细胞固有的程序完成“你给它们安排的生产任务”——因为很难亲眼观察微观世界中表达是如何进行的，当出现问题时，我们需要经验判断问题所在。宿主细胞对原核表达可能会产生哪些影响呢？ 知其然还要知其所以然。比如，菌株内源的蛋白酶过多，可能会造成外源表达产物的不稳定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。堪称经典的BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺陷型，也是我们非常熟悉的表达菌株。大名鼎鼎的BL21(DE3)融源菌则是添加T7聚合酶基因，为T7表达系统而设计。 真核细胞偏爱的密码子和原核系统有不同，因此，在用原核系统表达真核基因的时候，真核基因中的一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子，从而导致表达效率和表达水平很低。改造基因是比较麻烦的做法，Rosetta 2系列就是更好的选择——这种携带pRARE2质粒的BL21衍生菌，补充大肠杆菌缺乏的七种（AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA 及CGG）稀有密码子对应的 tRNA，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。（已经携带有氯霉素抗性质粒） 当要表达的蛋白质需要形成二硫键以形成正确的折叠时，可以选择K–12衍生菌Origami 2系列，thioredoxin reductase (trxB) 和glutathione
原核表达 操作
蛋白质的表达、分离、纯化实验 标签： 蛋白质 表达 分离 纯化 蛋白质表达、分离、纯化可以：（1）探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理；（2）供作结构与功能的研究；（3）作为催化剂、营养剂等。 详细 实验方法 原核表达法 实验方法原理 携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在 37℃，IPTG 诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA ）使镍离子（Ni 2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC ）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。 实验材料 大肠杆菌BL21 试剂、试剂盒 LB 液体培养基氨苄青霉素Washing BufferElution BufferIPTG 蒸馏水胰蛋白胨酵母粉氯化钠 仪器、耗材 摇床离心机层析柱离心管移液枪枪头盒烧杯玻璃棒 实验步骤 一、试剂准备 1. LB 液体培养基：Trytone 10 g ， yeast extract 5 g ，NaCl 10 g ，用蒸馏水配至1000 mL 。 2. 氨苄青霉素：100 mg/mL 。 3. 上样缓冲液：100 mM NaH 2PO 4，10 mM Tris ，8M Urea ，10 mM 2-ME ， pH8.0。 4. Washing Buffer ：100 mM NaH 2PO 4，10 mM Tris ，8 M Urea ，pH6.3。 5. Elution Buffer ：100 mM NaH 2PO 4，10 mMTris ，8M Urea ， 500 mM
原核细胞表达纯化实验设计
原核生物分离纯化实验设计 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件： （1）选择标志的编码序列； （2）可控转录的启动子； （3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)； （4）一个多限制酶切位点接头； （5）宿主体内自主复制的序列。 原核表达一般程序如下： 获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测 操作步骤 （一）获得目的基因 1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。 2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 （二）构建重组表达载体 1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。 （三）获得含重组表达质粒的表达菌种 1、将连接产物转化大肠杆菌BL21，根据重组载体的标志（抗Ampr）作筛选，挑取单克隆，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。 （四）诱导表达 1、挑取含重组质粒的菌体涂板，挑单克隆至5ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃过夜培养。 2、按1∶50比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的300ml培养瓶中, 37℃震荡培养至OD600≌0.4-1.0（最好0.6，大约需3hr）。 3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM作为实验组,两组继续37℃震荡培养3hr。 4、收菌，离心12000g×30s收获沉淀，每毫升菌液按50ulPBS重悬，加入1%TritonX-100（v/v）,β-巯基乙醇（v/v）。PMSF（终浓度1mM）； 一下步骤在冰上操作： 5、超声破碎菌体，15000g，10min离心取上清，在上清中加入适量GST-beads，轻轻晃动令
原核表达操作步骤及注意事项
原核表达操作步骤及注意事项 时间：2010-03-03 14:05:01 来源：作者：点击：1046次 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点： 易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件： （1）选择标志的编码序列； （2）可控转录的启动子； （3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)； （4）一个多限制酶切位点接头； （5）宿主体自主复制的序列。 原核表达一般程序如下： 获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测 一、试剂准备 1、LB培养基。 2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中，0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。 二、操作步骤 （一）获得目的基因 1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。 2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 （二）构建重组表达载体 1、载体酶切：将表达质粒用限制性切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
原核表达
pET原核表达金标准（转） pET, 原核, 表达 转自网络 pET，原核表达金标准（转） pET 载体中，目标基因克隆到T7 噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供T7 RNA 聚合酶来诱导表达。Novagen 的pET 系统不断扩大，提供了用于表达的新技术和选择，目前共包括36 种载体类型、15 种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。 优点 ?是原核蛋白表达引用最多的系统 ?在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低 ?真正的调节表达水平的“变阻器”控制 ?提供各种不同融合标签和表达系统配置 ?可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌?许多载体以LIC 载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆PCR 产物 ?许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化 阳性pFORCE TM 克隆系统具有高效克隆PCR 产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。 pET 系统概述 pET 系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。根据最初由Studier 等开发的T7 启动子驱动系统，Novagen 的pET 系统已用于表达成千上万种不同蛋白。 控制基础表达水平
pET 系统提供6 种载体- 宿主菌组合，能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白，所以进行优化选择是必要的。 宿主菌株 质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌（λDE3 溶原菌）中表达目标蛋白。在λDE3 溶原菌中，T7 RNA 聚合酶基因由lacUV5 启动子控制。未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。而宿主菌带有pLysS 和pLyE 时调控会更严紧。pLys 质粒编码T7 溶菌酶，它是T7 RNA 聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未诱导细胞中转录目标基因的能力。pLysS 宿主菌产生低量T7 溶菌酶，而pLysE 宿主菌产生更多酶，因此是最严紧控制的λDE3 溶原菌。 有11 种不同DE3 溶原化宿主菌。使用最广泛的为BL21 及其衍生菌株，它的优点在于缺失lon 和ompT 蛋白酶。B834 菌株为甲硫氨酸营养缺陷型，因此可用35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记。BLR 为recA - 衍生菌株，改善了质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列的目标质粒。两个硫氧还蛋白还原酶( trxB ) 突变菌株(AD494,BL21 trxB ) ，有利于大肠杆菌胞浆中二硫键形成。Origami TM 和OrigamiB 菌株为trxB/gor 双突变，这两个酶是主要还原途径的关键酶。Origami 和OrigamiB 宿主菌的主要优点是能形成正确折迭的含有二硫键的蛋白。新的Rosetta TM 菌株补充了四种大肠杆菌稀有密码子的tRNA ，改善了由于密码子使用频率不同而引起的一些真核蛋白低表达。其它菌株背景包括K-12 菌株HMS174 和NovaBlue ，象BLR 一样为recA - 。这些菌株可稳定表达其产物可能导致DE3 噬菌体丢失的某些目标基因。由于存在F 附加体编码的高亲和力lacIq 阻遏蛋白，NovaBlue 为一个有用的严紧型宿主菌。此外，Novagen 提供了λDE3 溶原化试剂盒，用于制备其它遗传背景的新表达宿主菌。表达高毒性基因或制备新的λDE3 溶原菌的另一替代方法是通过l CE6 感染提供T7 RNA 聚合酶。虽然不如用IPTG 诱导λDE3 溶原菌方便，这种策略也被优先用于一些应用中。
原核表达的详细步骤
原核表达详细步骤 Part I 选择表达的目的基因 一、 基因序列 1. 得到靶基因DNA (cDNA)序列，有几种方式寻找正确的读码顺序： ① 利用生物信息学在NCBI 上blast 同源基因，找到同源蛋白，再在DNA 的ORF 中找到正确的读码。 ② 实验方法，即得到蛋白，进行测序，然后在 DNA 上找到正确的读码。 ③ 利用mRNA 的特征，找到启动子，编码区，终止子。在编码区中找到翻译 起始密码子与终止密码子(cDNA 。 2. 注意事项： ① 区别ORF 和CDS>ORF 一般在DNA 上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和 终止密码子；CDS 可以是DNA 上的定义，也可以是mRNA 上的定义，分为complete CDS 和partial CDS 是从第一个核酸开始读，连续读下去， complete CDS 读码是 “M、、、、、、、、、* ”，Partial CDS 的读码是相应的 AA ② 在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。 二、 抗原决定簇的预测 1、 原理： 蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。 一般抗原决定簇 是由6- 12氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列(蛋白质一级结构) 组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物， 用来免疫动物具有更强的抗原性。只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会 暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的， 如果用来检 测天然蛋白，可能会有假阳性。做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对 抗的抗原 决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。 选择原则： 亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的。 处于结构表面：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。 有弹性：许多已知的抗原决 定簇是在自由活动区域。所以一般来说蛋白 端及C 端是很好的抗原决定簇区域。 2、 (1) (2) (3) 质的 N 3、选定抗原决定簇的步骤： (1) 预测：如软件预测DNAstar(Protean)预测，Dnaman 。在线网站预测(and ) (2) 选定：接近 N 、C 端；选取在此区间内，(Antigenic Index) Jameson-wolf 抗原决定簇选正分高处；(Hydrophilicity plot) Kyte-Doolittle 预测亲水性强的区 域。同时符合以上3点的区域较好(命名为多肽片断 A)。 注：如果设计的多肽是跨膜蛋白，请尽量回避选择蛋白的跨膜区，即头端信号肽 所在的区域 (3) NCBI( BlastP)比对：将多肽片断A 放入blastp 进行同源性比对。如果制 备某一动物种属的抗体，该区必须与该动物的氨基酸序列没有较高的同源性。 注：这一步往往容易漏掉，所以学会应用生物信息学，可以减少走弯路！ ！！ (4) 抗原合成： ① 原核表达： ② 化学合成：需要做化学偶联增强多肽稳定性。 多肽的纯度越纯越好，一般> 80% 就完全可以了。合成5-10 mg 就可以了。
原核表达
Ni Sepharose 6 Fast Flow, 25 ml Storage Conditions 4 to 30°C, 20% Ethanol Base matrix: 250-400 cm/h, 100 kPa, XK 50/60 column, bed height 25 cm Pressure/Flow Specification Average Particle Size 90 μm Metal Ion Capacity ~15 μmol Ni2?/ml medium Chemical Stability Stable in commonly used aqueous buffers - 0.1 M HCl, 0.1 M NaOH, 8 M urea1) pH Stability 2-142) Cleaning-in-Place (CIP) pH Stability Working 3-123) Range Approx. 40 mg histidine-tagged protein Binding Capacity/ml Chromatography Medium BioProcess Medium Yes 3)Ni2?-stripped medium. Licensing For licensing information, see the Licensing Statements page in the About Us section. PMSF 英文全称：Phenylmethanesulfonyl fluoride 中文名称：苯甲基磺酰氟 分子式：C7H7FO2S 分子量：174.19 CAS号：[329-98-6] PubChem号：4784 使用介绍： 1）抑制丝氨酸蛋白酶（如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，凝血酶）和巯基蛋白酶（如木瓜蛋白酶）； 2）10mg/ml溶于异丙醇（或无水乙醇）中； 3）在室温可保存一年,一般保存在-20度或4度.； 4）工作浓度：17~174ug/ml（0.1~1mM），储存液浓度为100或200mM；
原核表达及纯化总结教学提纲
原核表达及纯化总结
His标签重组蛋白大量表达及纯化 一筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化DH5α鉴定 表达载体和目的片段的连接一般为10μL连接体系，此步转化方法如下：取100μL DH5α感受态细胞，加入到10μL连接产物体系中 ↓ 冰上放置30min ↓ 42℃准确热激90秒 ↓ 冰上放置3min ↓ 加入300μL无Amp+ 的LB培养基，37℃ 100rpm/min振荡培养1h ↓ 将400μL菌液全部涂LB平板（含Amp+）水平放置30 min待菌液完全 吸收后， 在37℃温箱中倒置培养过夜（12~16 h），直至出现单菌落。 2 阳性克隆的PCR鉴定方法如下 挑取单菌落于200μL含Amp+LB培养基中（用2.0的离心管），摇床200rpm/min，37℃培养4h，待菌液浑浊后，取1μL做菌液PCR鉴定。 PCR扩增体系如下： 取1 μL菌液作为模板 反应体系如下： 模板 1 μL 10×PCR反应缓冲液（含Mg2+） 2 μL
dNTP(2.5 mmol/L/each) 1.6 μL 上游引物（10 μmol/L） 1 μL 下游引物（10 μmol/L） 1 μL Taq酶（5 U/μL）0.3 μL ddH2O 13.1μL Total 20 μL 条件： 94℃预变性 10min 94℃变性 45s 50℃退火 45s 72℃延伸 1min，30个循环的扩增反应 72℃延伸 10 min 4℃∞ 1%琼脂糖凝胶电泳检测： 电泳上样时：Marker DL2000上样3μL 样品（1μL loadingbuffer +6μL PCR产物混匀上样） 100V，20min；紫外透射仪检测，出现目的带的对应菌落为阳性克隆。 （注意：记得保存菌种） 3 阳性克隆质粒抽提 取阳性克隆菌液200μL，加3ml含Amp+ LB液体培养基，37℃ 200rpm/min 培养3-4h，待菌液浑浊后，进行质粒抽提。 质粒抽提方法如下： 取1.5mL菌液于1.5mL离心管中 ↓ 12000rpm离心30s，弃上清 ↓