胰岛细胞特异性敲除基因appl1小鼠模型的制备

尊敬的《上海医学》编辑老师：

您好！首先非常感谢您及评审专家对我们文章的审修，目前已按照修改意见进行了修改，以下是对修改意见的具体答复，希望回答专家的问题，谢谢。

1.“胰岛细胞特异性敲除APPL1基因”和“β细胞APPL1特异性敲除APPL1基因”这两种表达方法应该统一；

在文章中已做修改。

2.从图3可以看出，β细胞APPL1敲除小鼠脂肪组织APPL1的表达显著高于野生型，原因何在?

正如文章所提及，我们收集APPL1flox/flox和β-APPL1KO两组小鼠多例样本，western结果并未发现APPL1蛋白水平表达的脂肪组织中有统计学差异，为了消除之前结果容易给人的误解，我们另外选择两组实验数据来作为结果图。

3.该研究目的是建立β细胞APPL1基因敲除小鼠模型，因此在表型分析方面应多关注β细胞功能，至少要提供血胰岛素水平方面的数据，而不是仅仅提供血糖数据。

这个意见提得很好，事实上我们研究组已经研究了APPL1flox/flox和β-APPL1KO小鼠的空腹血胰岛素水平差异，这部分内容我在文章的方法和结果中也已作了修改和补充。

4.如可以请引用《上海医学》杂志和《中国实用内科杂志》的参考文献各一条

在文章中我已做补充。

此致

敬礼

李晓雯

2015.1．30

胰岛细胞特异性敲除基因APPL1小鼠模型的制备

李晓雯1 李羚1林紫薇1 孙赟1 陈辰2王琛1* 贾伟平1

【摘要】目的制备转接蛋白APPL1胰岛细胞特异性敲除小鼠模型。方法采用基因剔除打靶技术，囊胚显微注射法制备嵌合小鼠，利用Cre-loxp系统繁育APPL1胰岛特异性敲除小鼠。Western blot检测APPL1蛋白表达水平。结果成功制备胰岛细胞特异性敲除基因APPL1小鼠模型，与APPL1flox/flox小鼠相比，胰岛细胞特异性敲除基因APPL1并不影响小鼠体重，空腹血糖以及空腹胰岛素水平，western blot从蛋白水平印证敲除小鼠胰岛中的APPL1蛋白无表达。结论胰岛细胞特异性敲除基因APPL1小鼠模型制备成功，为探讨APPL1在胰岛中的功能提供研究工具。

【关键词】APPL1；胰岛；条件性敲除

Establishment of APPL1 conditional knock out model in mice islet LI Xiaowen1, LI Ling1,

LIN Zeiwei1, SUN Yun1, CHEN Chen2 , WANG Chen1*, JIA Weiping1.

1Shanghai Jiao Tong University Affiliated Sixth People’s Hospital, Shanghai Diabetes Institute, Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus, Shanghai 200233, China

2 Shanghai Research Center for Model Organisms, Shanghai 201210, China Corresponding author: WANG Chen, wangchen@https://www.360docs.net/doc/086778288.html,

【Abstract】Objective To discuss the method of APPL1 knock out mouse model in islet. Methods Mouse embryonic stem (ES) cells were targeted knockout of APPL1 by the homologous recombination vector, and screened .The APPL1-knockout embryonic stem cells were microinjected into blastula of C57BL/6J mice.F1 hybrid mice were bred to obtain mouse aggregation chimeras. The conditional KO mice were generated by cross-breeding APPL1 floxed mice with mice expressing Cre in islets. Western blot was conducted to measure protein expression. Results Mice with conditional APPL1 knockout (KO) in islets were generated. Compared with APPL1flox/flox mice, APPL1 conditional knockout in islets does not affect the mice weight, fasting plasma glucose and fasting insulin levels, no APPL1 protein expression was found in APPL1 KO mice islets with western blot. Conclusions The conditional APPL1-knockout mouse model is successfully established, it lays a foundation for study APPL1 function in mouse islets.

【Key words】APPL1; islet; conditional knockout

2型糖尿病是一种复杂的慢性代谢性疾病，对公共健康造成严重威胁，是由胰岛素抵抗和β细胞受损/死亡造成胰岛素分泌缺乏共同作用而引起的一种进展性疾病[1]。近年研究表明，脂肪细胞因子对糖尿病的发病起着重要作用，其中脂联素(Adiponectin)因其可增加胰岛素敏感性、降低胰岛素抵抗、增加胰岛β细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌[2, 3]，在2型糖尿病的发生和发展中可能起重要作用，因而引起了极大的关注并成为研究热点。脂联素通过脂联素受体发挥作用，2006

年[4]报道APPL1 (Adaptor protein containing PH domain, PTB domain and Leucine zipper motif 1)可与脂联素受体1（Adiponectin receptor-1，adipoR1）结合，介导脂联素信号传导，该发现为药物干预提供了一个潜在靶点[5]。遗传研究结果显示，APPL1基因单核苷酸多态性位点rs4640525和rs3806622的变异与中国人2型糖尿

病患者肥胖发病风险有关[6]。为了从生物整体水平上来探讨脂联素-APPL1传导系统在胰岛素抵抗发生和发展中的作用以及APPL1对胰岛β细胞功能的影响，本研究利用Cre-LoxP 系统介导技术及RIP-Cre转基因小鼠在胰岛细胞中特异性表达特点, 建立胰岛细胞特异性APPL1基因敲除小鼠。

1材料与方法

1.1实验动物

所有实验小鼠饲养于上海市第六人民医院实验动物中心SPF级动物室，小鼠自由进食消毒颗粒饲料（上海斯莱克公司），及饮用消毒水，室温控制于23±1℃，湿度56％，12 h间隔照明，定期紫外线消毒与通风。实验和操作程序经所在单位的动物实验伦理委员会审核通过（实验动物合格证号：SYXK（沪）2008-0052）。对照组和APPL1基因敲除纯合子小鼠于8-12周龄测定体重，空腹血糖采用ACCU-CHEK血糖仪（美国罗氏公司）检测，空腹胰岛素水平用ELISA药盒测定（瑞典Mercodia公司）。分离上述小鼠的胰岛，脂肪组织于-80℃冻存备用。

1.2APPL1flox/+小鼠建立及鉴定

APPL1flox/+小鼠模型在上海南方模式生物研究中心[SYXK(沪) 2008-0035]制备，具体为基因剔除打靶载体构建、胚胎干细胞（Embryonic stem cells, ES）基

因打靶、囊胚显微注射法制备嵌合小鼠、嵌合小鼠与野生型C57BL/6J雌性小鼠繁殖后代灰色小鼠（APPL1flox/+）。APPL1基因含有22个外显子，本研究LoxP 插入位点在第5外显子两端。RIP-Cre转基因小鼠购自南京大学模式动物研究所[许可证编号：SYXK(苏)2010-0003]。

1.3小鼠鉴定

小鼠尾DNA 提取剪取4周龄小鼠尾端于1.5 ml EP管，经蛋白酶K（美国Merck公司）和裂解液裂解过夜后，次日震荡后离心，留上清加入无水乙醇后析出DNA，留沉淀，室温晾干后取适量ddH2O溶解，室温放置1h待完全溶解后4℃保存待用。

PCR扩增及电泳PCR管中先后加入PCR 预混液（上海天根公司）、DNA，引物以及ddH2O，混匀后上机。在梯度PCR仪（美国ABI 公司）设定相应PCR条件进行扩增。取适量PCR 产物，加入PCR上样缓冲液，混匀后加入电泳槽的样品孔内。接通电源，恒压250V。根据指示剂泳动的位置判断是否终止电泳。

Cre小鼠的鉴定方法同既往研究所述[7]。APPL1flox/flox小鼠的鉴定上游引物序列为：5’-TTTAAAAGTTTTAGTCTGGGCATGG-3’，下游引物为：

5’-CTCCCATAGCATTTCAATCTGTAAT-3’。APPL1flox/flox小鼠与RIP-Cre转基因PCR结果示Cre阳性，且APPL1为杂合子的小鼠留用，记为APPL1+/-/RIP-Cre+。然后用其与APPL1flox/flox小鼠交配获得的子代经提取尾部DNA，PCR筛选出胰岛细胞特异性敲除APPL1纯合子小鼠，记为β-APPL1KO鼠。

1.4Western blot 检测

胰岛细胞和脂肪组织用裂解液提取蛋白定量，取一定量蛋白质在10% SDS-PAGE凝胶上电泳分离，然后转移到硝酸纤维素膜上，转膜后5%脱脂牛奶封闭1h[8]，分别用APPL1抗体（1：1000稀释）和β-actin抗体（1：1000）孵育过夜。显影采用Termo Pierce ECL发光试剂盒，曝光利用LAS4000化学发光成像分析系统进行。β-actin和APPL1抗体均购自Cell signaling Technology公司。

1.5统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。计量资料用均数±标准误（x± sx），

2组间比较采用独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 APPL1flox/flox小鼠的繁殖及鉴定

APPL1flox/+小鼠之间交配成功保种并获得APPL1纯合子(APPL1flox/flox) 小鼠，其基因组示意图及鉴定策略见图1。鉴于APPL1flox/flox小鼠的基因型2条染色体都带有两端含2个LoxP序列，因此，PCR仅扩增得到1条879bp左右的条带（图2）。APPL1flox/+小鼠则扩增出685bp和879bp两条带。对照小鼠PCR仅扩增出一条685bp的条带（图2）。

2.2 胰岛细胞中敲除APPL1基因小鼠的繁殖及鉴定

APPL1flox/flox小鼠与RIP-Cre小鼠交配可以获得APPL1基因敲除的杂合子小鼠，其与APPL1flox/flox小鼠交配，下代繁育出APPL1flox/flox、APPL1flox/+、APPL1基因敲除的杂合子小鼠以及APPL1基因敲除的纯合子小鼠（β-APPL1KO）。为增加β-APPL1KO的产出，之后用β-APPL1KO小鼠和APPL1flox/flox小鼠回交，即获得1:1的β-APPL1KO和APPL1flox/flox 。

2.3 胰岛细胞中敲除APPL1基因小鼠的表型分析

分别取APPL1flox/flox和β-APPL1KO小鼠的胰岛，用Western-blot方法分析，图3可见APPL1flox/flox小鼠有APPL1表达，而β-APPL1KO小鼠无表达。而对于脂肪组织来说无论是APPL1flox/flox还是β-APPL1KO来源均有APPL1蛋白的表达。

为了精确的观察APPL1基因条件性敲除对小鼠基本表型的影响，我们分别取8，10，12周龄小鼠对其进行体重测量，发现与APPL1flox/flox组小鼠相比，APPL1敲除小鼠体重略低，但其差异并无明显统计学意义。此外，8和10周龄小鼠空腹血糖以及10周空腹胰岛素，两组间也无明显差异（图4）。

讨论

本研究将含APPL1打靶载体的质粒显微注射到胚胎干细胞中，随后转到小鼠体内形成嵌合体，并利用RIP-Cre系统介导的位点特异性重组技术经繁殖保种最终获得在胰岛细胞特异性敲除APPL1的小鼠模型，经western blot检测从蛋白水平

鉴定该模型成功建立。

条件性基因敲除技术是在特定的发育时期或特定的组织和器官中使某个基

因失活，从而用于研究感兴趣基因在某时间段或某特定组织和器官中的生理病理功能。广义上的全身敲除某基因的基因打靶技术尽管克服了经受精卵原核显微注射技术引起的，诸如外源基因随机整突变，往往引起严重的发育缺陷或胎儿死亡，不利于在发育后期阶段基因功能的分析[9]。以Cre-LoxP系统与基因打靶技术相结合的条件性基因打靶克服了上述的局限[10-12]。当然，与传统的完全性基因敲除技术相比，条件性基因敲除技术也有其缺点：建立模型所需的步骤更为复杂，花费的时间更长。

目前，条件性敲除小鼠模型已经越来越广泛的应用于糖尿病分子机制研究领域[13-15]，但APPL1的胰岛特异性敲除模型未见报道。APPL1是近年发现的一种细胞内转接蛋白，其由709个氨基酸组成，人APPL1基因定位在染色体3p14.3-21.1，全长45.6 kb，包含22个外显子及21个内含子，在人体骨骼肌、卵巢、胰腺、心脏中APPL1蛋白表达最为丰富[16]。APPL1具有多个功能结构域，包含羧基端的磷酸酪氨酸结合（PTB phosphotyrosine binding）结构、PH（Pleckstrin homology）结构域和氨基端的BAR（Binamphiphysin-Rvs）结构域，其通过自身功能结构域与近14种蛋白相互作用，包括膜受体和信号分子，参与细胞生存、增殖和凋亡等各种信号转导通路[17]。目前，对APPL1在细胞内的作用尚未完全知晓。RIP (rat insulin promoter) 是大鼠β细胞特异的胰岛素启动子[18,19],通过它可以实现Cre特异性的在胰岛细胞中表达，进而在Cre重组酶的作用下[20]切除两个LoxP位点之间的APPL1第5外显子，达到在胰岛细胞中特异性敲除APPL1的目的。

研究发现，APPL1在多种组织中发挥重要作用：在骨骼肌中过表达APPL1可以显著提高AMPK及p38MAPK的磷酸化水平，从而促进骨骼肌的葡萄糖摄取、脂肪酸氧化，调节糖脂代谢[4]；敲除脂肪细胞中APPL1可以抑制Akt磷酸化、降低葡萄糖摄取和GLUT4的功能[21]。在肝脏中，APPLl表达上调可增强胰岛素介导的Akt激活并且通过抑制糖异生作用可提高肝脏对胰岛素的敏感性[22]。此外，我们的研究发现，APPL1在大鼠，小鼠和人的胰腺及胰岛细胞中也大量表达。观察APPL1全身敲除小鼠显示，葡萄糖耐量和葡萄糖刺激的胰岛素分泌较对照小鼠明

显降低，在胰岛细胞过表达APPL1可降低高葡萄糖和炎症因子导致的细胞凋亡，并增加葡萄糖刺激的胰岛素释放。表明APPL1对高糖和炎症因子诱导的胰岛β细胞损伤具有保护作用，可降低β细胞凋亡并改善胰岛细胞功能。提示APPL1在2型糖尿病发病中可能起重要作用[23,24]。

上述研究结果基于APPL1全身敲除小鼠水平或是胰岛β细胞系水平，如前所述，APPL1在多种组织中参与调控代谢和胰岛素敏感性，所以利用全身敲除的动物模型来探明APPL1对胰岛细胞的影响及分子机制并不能排除胰岛细胞外的组织对实验结果叠加的影响，为此，建立胰岛细胞特异性APPL1敲除模型显得尤为重要。

总之，本研究利用特异性重组技术，在RIP-Cre系统首次建立胰岛细胞特异性APPL1敲除的小鼠模型，该模型的建立为后续研究APPL1在胰岛细胞中的作用提供了良好的模型，为临床2型糖尿病的治疗开发了新的研究工具。

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野生型

Loxp Loxp

插入loxp序列后

P 1 2 3 4 5 6 7 20 21 22

敲除后

P 1 2 3 4 6 7 20 21 22

在外显子5两端分别插入loxp序列并经过Cre重组酶剪切导致APPL1基因敲除

图1. APPL1条件性敲除基因组示意图

M123456

1-4：APPL1flox/flox (879bp)；5：APPL1flox/+ (879bp，685bp)；6：WT (685bp) M：DNA分子量标准

图2. APPL1flox/+小鼠后代的PCR电泳鉴定结果

APPL1β-Actin APPL1

β-Actin B

A ：胰岛组织；

B ：脂肪组织

图3. APPL1在胰岛和脂肪组织中的蛋白表达

81012APPL1 flox/flox

102030W e i g h t (g )A

F a s t i n g i n s u

l i n (n g /m l )C APPL1 flox/flox KO 0246B l o o d g l u c o s e (m m o l /l )B

APPL1 flox/flox KO

A ：APPL1条件性敲除小鼠与对照组的体重；

B ： APPL1条件性敲除小鼠与对照组的空腹血糖；

C ：空腹胰岛素水平。

图4. APPL1条件性敲除对小鼠基本表型的影响

基因敲除小鼠的制作方法

.. 一、常规基因敲除鼠（Conventional Knockout）常规基因敲除是通过基因打靶，把需要敲除的基因的几个重要的外显子或者功能区域用Neo Cassette 替换掉。这样的小鼠其全身所有的组织和细胞中都不表达该基因产物。此类基因敲除鼠一般用于研究某个基因在对小鼠全身生理病理的影响，而且这个基因没有胚胎致死性。二、条件性基因敲除小鼠（Conditional Knockout）条件性基因敲除小鼠是通过基因打靶，把两个loxP 位点放到目的基因一个或几个重要的外显子的两边。该小鼠和表达Cre酶小鼠杂交之前，其目的基因表达完全正常。当和组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后，可以在特定的组织或细胞中敲除该基因，而该基因在其他组织或细胞表达正常。条件性基因敲除鼠适用范围为：（1）该基因有胚胎致死性；（2）用于研究该基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能。三、基因敲入小鼠（Knockin）基因敲入小鼠是通过基因打靶，把目的基因序列敲入到小鼠的相应基因位点，使用小鼠的表达调控元件指导目的基因表达。此类基因敲入鼠一般用于药物的筛选，信号通路的研究等。获得嵌合体及之后品系纯化详细流程：基因敲除其他方法：一、ZFN技术制作基因敲除鼠 ZFN能够识别并结合指定的基因序列位点，并高效精确地切断。随后细胞利用天然的DNA 修复过程来实现DNA的插入、删除和修改，这样研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑。这在过去是无法想象的，传统的基因敲除技术依赖细胞内自然发生的同源重组，其效率只有百万分之一，而ZFN的基因敲除效率能达到10%。利用这些技术进行小鼠基因的定点敲除和敲入，可以把时间从一年缩短到几个月。这项技术中设计特异性的ZFN是最关键的环节，目前研究者采用计算生物学方法设计高特异性的ZFN，但ZFN的脱靶（off target），也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。也正因为这个原因，利用ZFN技术进行小鼠的基因修饰还无法完全取代传统技术。二、TALEN技术制作基因敲除鼠 TALEN 技术是一种崭新的分子生物学工具。科学家发现，来自一种植物细菌的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的，它克服了ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的灵活性，使基因操作变得更加简单方便。然而同样因为脱靶的问题，利用TALEN技术进行小鼠的基因修饰仍然无法取代传统技术。 ;.

胰岛细胞特异性敲除基因appl1小鼠模型的制备

尊敬的《上海医学》编辑老师：您好！首先非常感谢您及评审专家对我们文章的审修，目前已按照修改意见进行了修改，以下是对修改意见的具体答复，希望回答专家的问题，谢谢。 1.“胰岛细胞特异性敲除APPL1基因”和“β细胞APPL1特异性敲除APPL1基因”这两种表达方法应该统一；在文章中已做修改。 2.从图3可以看出，β细胞APPL1敲除小鼠脂肪组织APPL1的表达显著高于野生型，原因何在? 正如文章所提及，我们收集APPL1flox/flox和β-APPL1KO两组小鼠多例样本，western结果并未发现APPL1蛋白水平表达的脂肪组织中有统计学差异，为了消除之前结果容易给人的误解，我们另外选择两组实验数据来作为结果图。 3.该研究目的是建立β细胞APPL1基因敲除小鼠模型，因此在表型分析方面应多关注β细胞功能，至少要提供血胰岛素水平方面的数据，而不是仅仅提供血糖数据。这个意见提得很好，事实上我们研究组已经研究了APPL1flox/flox和β-APPL1KO小鼠的空腹血胰岛素水平差异，这部分内容我在文章的方法和结果中也已作了修改和补充。 4.如可以请引用《上海医学》杂志和《中国实用内科杂志》的参考文献各一条在文章中我已做补充。此致敬礼李晓雯 2015.1．30

胰岛细胞特异性敲除基因APPL1小鼠模型的制备李晓雯1 李羚1林紫薇1 孙赟1 陈辰2王琛1* 贾伟平1 【摘要】目的制备转接蛋白APPL1胰岛细胞特异性敲除小鼠模型。方法采用基因剔除打靶技术，囊胚显微注射法制备嵌合小鼠，利用Cre-loxp系统繁育APPL1胰岛特异性敲除小鼠。Western blot检测APPL1蛋白表达水平。结果成功制备胰岛细胞特异性敲除基因APPL1小鼠模型，与APPL1flox/flox小鼠相比，胰岛细胞特异性敲除基因APPL1并不影响小鼠体重，空腹血糖以及空腹胰岛素水平，western blot从蛋白水平印证敲除小鼠胰岛中的APPL1蛋白无表达。结论胰岛细胞特异性敲除基因APPL1小鼠模型制备成功，为探讨APPL1在胰岛中的功能提供研究工具。【关键词】APPL1；胰岛；条件性敲除 Establishment of APPL1 conditional knock out model in mice islet LI Xiaowen1, LI Ling1, LIN Zeiwei1, SUN Yun1, CHEN Chen2 , WANG Chen1*, JIA Weiping1. 1Shanghai Jiao Tong University Affiliated Sixth People’s Hospital, Shanghai Diabetes Institute, Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus, Shanghai 200233, China 2 Shanghai Research Center for Model Organisms, Shanghai 201210, China Corresponding author: WANG Chen, wangchen@https://www.360docs.net/doc/086778288.html, 【Abstract】Objective To discuss the method of APPL1 knock out mouse model in islet. Methods Mouse embryonic stem (ES) cells were targeted knockout of APPL1 by the homologous recombination vector, and screened .The APPL1-knockout embryonic stem cells were microinjected into blastula of C57BL/6J mice.F1 hybrid mice were bred to obtain mouse aggregation chimeras. The conditional KO mice were generated by cross-breeding APPL1 floxed mice with mice expressing Cre in islets. Western blot was conducted to measure protein expression. Results Mice with conditional APPL1 knockout (KO) in islets were generated. Compared with APPL1flox/flox mice, APPL1 conditional knockout in islets does not affect the mice weight, fasting plasma glucose and fasting insulin levels, no APPL1 protein expression was found in APPL1 KO mice islets with western blot. Conclusions The conditional APPL1-knockout mouse model is successfully established, it lays a foundation for study APPL1 function in mouse islets. 【Key words】APPL1; islet; conditional knockout

骨质疏松常见模型

骨质疏松常见模型 1. 概念：骨质疏松症是一种以骨量降低、骨微细结构破坏、骨强度下降，导致骨脆性增加，易发生骨折（骨折风险性增加）为特征的全身性骨骼疾病。 2. 临床表现：腰背部疼痛，体长缩短，驼背及发生骨折。 3. 按严重程度分：骨质疏松的发生程度包括低骨量、骨质疏松症和骨质疏松性骨折。依次程度增加。 4. 现代医学将骨质疏松症分为原发性、继发性、特发性骨质疏松症三大类。原发性骨质疏松症（primary osteoporosis ，POP），因年龄所致的体内性激素突然减少及生理性退行性改变所致。分为Ⅰ型绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis ，POMP ）和Ⅱ型老年性骨质疏松症。继发性骨质疏松症，由疾病或药物因素诱发，疾病如内分泌代谢病（糖尿病、甲状腺功能亢进症）、肾脏疾病、肝脏疾病等，药物诱发如长期大剂量的肝素、免疫抑制剂、抗癫痫病药、糖皮质激素的应用。而特发性骨质疏松症，一般伴有遗传疾病史，女性多见，妇女哺乳期和妊娠期的骨质疏松症往往也列为此类现代医学的研究 1. 发病机制：主要机制是因为衰老、体内性激素减少、药物和某些疾病等因素导致骨吸收和骨形成平衡失调，骨矿物质和有机质等比例丢失，导致骨量减少和骨质疏松，进而引发骨折，为全身性代谢性骨病。总的来说，是由遗传、激素、营养、失用、年龄、生活习惯及免疫学等方面多种因素交互影响的结果。 2. 诊断与治疗：① 诊断：依靠临床表现、骨量的测定、骨密度（bone mineral density ，BMD ）及骨转化生化指标等，其中以骨量测定最为重要。临床上采用采用BMD 测量作为诊断、与测量骨质疏松症骨折风险、监测自然病程以及评价药物干预疗效的最佳定量指标。临床上测量BMD 的方法有双能X 线吸收测定法（DXA ）、外周双能X 线吸收测定法（pDXA ）、定量计算机断层照相术（QCT）及定量骨超声（QUS）等，其中DXA 测量值是目前国际学术界公认的临床骨质疏松症诊断的“金标准” 。②治疗：除了加强锻炼、改变不良生活习惯等，主要还是要依靠药物治疗。药物干预破骨细胞和成骨细胞的功能，防止骨丢失，增加骨量。1.骨吸收抑制剂，常见的有二膦酸盐、雌激素类药物和降钙素等。此类药物对已经丢失骨量的恢复的作用不明显，雌激素类药物有诱发子宫内膜癌的危险。2.骨形成促进剂，常见的有氟化物、甲状旁腺激素、活性维生素D3 等。这些药物可刺激成骨细胞分化成熟，促进骨基质分泌和矿化，增加骨量。目前公认的骨形成促进剂是甲状旁腺激素。3.骨矿化促进剂，钙剂和维生素D 等，这类药物科促进骨基质矿化，减少矿物质流失单独使用钙剂是没有治疗骨质疏松症的作用，必须配合骨形成促进剂或骨吸抑制剂。

大鼠二型糖尿病造模方法

大鼠二型糖尿病造模方法 Prepared on 22 November 2020

大鼠2型糖尿病模型建立方法讨论专业：药理班级：六班姓名：刘畅学号：150517 摘要：据国际糖尿病联合会（InternationalDiabetesFederation，IDF）估计，现在全球约%的成年人患有糖尿病。到2035年，该病患者人数预计会上升至亿。在2013年，全球约有亿成年人患有糖尿病，中国的糖尿病患者人数居全球之首，调查统计人数为亿。糖尿病导致约510万人死亡，平均大约每6秒钟就有1人死于糖尿病。2012年1月9日，中国健康教育中心公布的“中国慢病监测及糖尿病专题调查”结果显示，我国18岁及以上居民糖尿病患病率为2。6%，60岁以上老年人患病率高达%。因此，为治疗糖尿病建立简单、稳定、经济的动物模型非常重要。因2型糖尿病患者人数占糖尿病患病人数的90%以上，本文主要综合讨论高糖高脂饲料联合链脲佐菌素大鼠2型糖尿病模型的建立方法和注意事项。得出结果为：使用体重在190g~240g之间的雄性SD大鼠，通过连续两次腹腔注射小剂量链脲佐菌素并辅以去抗氧化剂处理，合理饲养并通过尾静脉采血方法建立的2型糖尿病模型较理想。关键词：2型糖尿病，SD大鼠模型，链脲佐菌素STZ，糖尿病（diabetes）是一种以胰岛素分泌缺陷和胰岛素作用不足所致的以高血糖为特征的葡萄糖、蛋白质、脂质代谢紊乱的综合征，基本治疗方案包括饮食治疗、运动治疗、药物治疗、糖尿病监测及糖尿病教育。病因主要有遗传因素、病毒感染、肥胖等，临床表现为“三多一少”即多尿、多饮、多食和体重减轻。长期的高血糖最终会引起很多严重的并发症，包括心脑血管疾病、糖尿病神经病变、糖尿病视网膜病变，糖尿病肾病、糖尿病足、感染、糖尿病酮症酸中毒、高渗性昏迷等[1]。糖尿病分为1型糖尿病（Type1diabetes）和2型糖尿病（Type2diabetes）两种，1型患者因自身免疫β细胞破坏所致，每日胰岛素分泌量非常少，空腹基值及糖刺激后峰值均明显低于正常值，表现为绝对分泌不足。2型糖尿病细分为两类：体重正常患者胰岛素分泌量低于正常人，糖刺激后峰值低并且延迟出现；肥胖糖尿病人胰岛素分泌量大于正常人，空腹基值和糖刺激后高峰明显高于正常人，但延迟出现，因此，表现为相对性胰岛素分泌不足且释放反应迟钝。胰岛素分泌不足的原因可能为：遗传因素、自身免疫、胰岛素拮抗。糖尿病患者中约有90%～95%属于2型糖尿病。 2型糖尿病，即非胰岛素依赖型糖尿病（non-insulin-dependentdiabetesmellitus，NIDDM），根据体重可分为肥胖和不出现肥胖两

2型糖尿病动物模型的建立

内容提要糖尿病是一类由遗传、环境、免疫等因素引起的以高血糖为特征的代谢性疾病。近年来发病率显著上升，2003年国际糖尿病联盟(IDF)报告全球糖尿病病人已超过1.94亿，预计到2025年这个数字将增加近一倍(3.33亿)。其中2型糖尿病的发生，在国外占整个糖尿病比例的85%~95%以上，而国内则更高，达98%以上。因此，建立比较理想的2型糖尿病动物模型对于糖尿病防治药物的研究具有十分重要的意义。本研究采用先高脂喂养实验动物一段时间再给予链脲佐菌素(STZ)的方法建立糖尿病动物模型。研究结果表明：高脂喂养SD大鼠28天后一次性腹腔注射链脲佐菌素 40mg/kg，可以建立稳定的具有高血脂和胰岛素抵抗为特征的2型糖尿病大鼠模型；高脂喂养ICR小鼠21天后一次性腹腔注射链脲佐菌素100mg/kg，可以建立稳定的具有高血脂和胰岛素抵抗为特征的2型糖尿病小鼠模型；在链脲佐菌素和高脂饮食协同作用下可肝脏、肾脏和胸腺等器官指数发生改变；综合分析用大鼠比用小鼠建立糖尿病动物模型更有优势。因此，本研究已经成功建立了2型糖尿病动物模型，并且筛选出最佳的实验动物。关键词：糖尿病；动物模型；大鼠；小鼠；链脲佐菌素；血糖；胰岛素

英文缩写 DM糖尿病 NIDDM非胰岛素依赖性糖尿病IDDM胰岛素依赖性糖尿病STZ链脲佐菌素 TC总胆固醇 TG甘油三酯 LDL低密度脂蛋白 HDL高密度脂蛋白 ip腹腔注射 iv静脉注射 sc皮下注射 IR胰岛素抵抗 INS胰岛素敏感指数 GFR肾小球滤过率 Ccr肌酸清除率 ESRD终末期肾病 DN糖尿病肾病 DR 糖尿病性视网膜并发症SCH 慢性持续性高血糖症IDF 国际糖尿病联盟

骨质疏松动物模型

骨质疏松的动物模型骨质疏松症是以骨量减少及骨组织微观结构为特征的一种全身性骨骼疾病，伴有骨的脆性增加、易于发生骨折。骨质疏松症是目前世界上发病率、死亡率和医疗保健消耗较大的疾病之一。骨质疏松起病隐袭，一旦发现，多已发展到一定程度。随年龄增加，骨丢失和骨折发生率明显增加。骨质疏松性骨折可发生在任何部位，但以椎骨、腕部和髋部多见。髋部骨折最为严重，多需手术处理，且患者常合并慢性疾病，如高血压、心血管、慢性呼吸道阻塞疾病及糖尿病等，导致医疗费用和死亡率增加，一部分患者日常生活不能完全独立，年平均生活质量下降。女性由于峰骨量较低及绝经后雌激素水平下降，发病率较男性为高。近年来随着社会老龄化，人口寿命的延长，女性绝经后生存年限约占一生的1/3，据估计，从1990－2025，欧洲50岁以上妇女将增加30％－40％。男性预计增加更快，可达50％。在同一时期内，北美预期将增加83％。亚非绝对增加数将为更为明显。在1990年全世界仅髋部骨折达130－170万，预期到2025年为200万，甚至更多［1］。骨质疏松症已成为全世界范围的严重的社会和经济问题。骨质疏松症的预防和治疗已成为一个多学科的、当前研究最活跃的课题之一。建立理想的骨质疏松症的动物模型是对治疗和预防骨质疏松症新药的体内过程、药物代谢动力学、药效学和影响药物作用因素的基础。随着对骨质疏松症的研究的不断深入，认为骨质疏松症的发生与遗传、营养、生活习惯、激素、运动、机械负荷和多种细胞因子有关。对骨质疏松症的动物模型提出了严格的要求。Rodgers等指出理想的动物模型应有三个特点：（1）方便性（Convenience）：动物购来容易，价格低廉，实验操作易行。（2）关联性（Relevance）：与人体条件比较相似，得到的信息能转化为人体的规律。（3）适宜性（Appropriateness）：为研究某一特定问题，最好用特定的动物模型模拟人体［2］。骨质疏松症的动物模型涉及动物的选择和复制的方法等方面，本文就此将国内外的有关进展进行综述。复制骨质疏松模型的动物选择用于骨质疏松症模型动物模型首先应该考虑的是模型应与人类骨质疏松的临床症状及组织行为相似，但某些动物模型在各个方面完全与人类骨质疏松症的临床表现一致是很困难的，因此动物模型侧重与表现其某一阶段、某些症状或一些病理生理变化，作为观察特定阶段和指征的病理模型。美国骨质疏松药物研究指南（美国－FDA）认为目前没有一种动物模型能模拟人类骨质疏松的所有特征。已有报道用小鼠，大鼠、兔、羊、猴等复制骨质疏松模型［3］。灵

基因敲除技术样本

基因敲除技术点击次数: 2605 发布日期: -5-25 来源: 本站仅供参考, 谢绝转载, 否则责任自负 1．概述: 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术, 是经过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。一般意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理, 用设计的同源片段替代靶基因片段, 从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展, 除了同源重组外, 新的原理和技术也逐渐被应用, 比较成功的有基因的插入突变和iRNA, 它们同样能够达到基因敲除的目的。2．实现基因敲除的多种原理和方法: 2．1．利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初, 胚胎干细胞( ES细胞) 分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年, 首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到 1987年, Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。直到现在, 运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。 2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1):

图1.基因同源重组法敲除靶基因的基本步骤 a．基因载体的构建: 把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因, TK 基因等)的载体上, 成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能, 因此一般设计为替换型载体。 b．ES 细胞的获得: 现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞, 最常见的是鼠, 而兔, 猪, 鸡等的胚胎干细胞也有使用。常见的鼠的种系是１２９及其杂合体, 因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向, 是基因敲除的理想实验动物。而其它遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。[2, 3] ｃ．同源重组: 将重组载体经过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中, 使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组, 将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中, 从而得以表示。一般地, 显微注射命中率较高, 但技术难度较大, 电穿孔命中率比显微注射低, 但便于使用。[4,5] ｄ．选择筛选已击中的细胞: 由于基因转移的同源重组自然发生率极低, 动物的重组概率为10－2～10-5, 植物的概率为10－4～10－5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。当前常见的方法是正负筛选法( PNS法) , 标记基因的特异位点表示法以及PCR法。其中应用最多的是PNS法。[6]

糖尿病小鼠模型的制备

、糖尿病的概念及分类糖尿病已成为全人类继恶性肿瘤和心脑血管病之后的严重威胁人类健康的第三大非传染性疾病。目前我国己成为世界第一糖尿病大国。糖尿病是一类由遗传、环境、免疫等因素引起的、具有明显异质性的慢性高血糖症及其并发症所组成的综合征，并非单一病因所引起的单一疾病（多原因引起的综合症）。糖尿病分为：i型糖尿病、n型糖尿病和其它特异性糖尿病。I型糖尿病即胰岛B细胞大量破坏，常导致胰岛素绝对性缺乏，以往称为胰岛素依赖型糖尿病、青年发病型糖尿病，“三多一少”症状明显。本型病因及发病是由于胰岛B细胞受到细胞介导性自身免疫性破坏。n型糖尿病由于胰岛素抵抗并胰岛素分泌不足所致，以高血糖高血脂为显著特点。以往称为非胰岛素依赖型糖尿病、成年发病型糖尿病，常伴有明显的遗传因素，但遗传机制尚未阐明。其它特异性糖尿病包括，B细胞功能的基因缺陷、胰岛素作用的基因缺陷、胰腺外分泌疾病、内分泌疾病、药物或化敏学制剂所致的糖尿病、感染、非常见型免疫介导性糖尿病以及有时并发糖尿病的其它遗传综合症。（糖尿病是无法根治的，现在随着人们生活水平的提高，饮食习惯，生活方式的改变糖尿病的发病率节节攀升，成为威胁人类健康的一大难题。人们曾经一度把糖尿病称为富贵病这也是有一定道理的。为了提高人们的生活质量，近几年对糖尿病的研究日益加深）二、糖尿病模型的建立近年来，随着国内外对糖尿病治疗药物研究的深入开展，建立比较理想的糖尿病动物模型显得尤为重要。目前常用的动物模型有实验性动物模型和自发性动物模型。自发性模型应用价值较高，但因价格昂贵，饲养、繁殖条件要求严格，而不能得到广泛应用。实验性模型则应用比较广泛，实验性糖尿病动物模型的建立，是用各种方法损伤动物胰脏或胰岛B细胞导致胰岛素的缺乏，或用化学药物对抗胰岛素作用，导致动物出现高血糖形成糖尿病。实验性糖尿病动物模型的建立主要有6种方法：胰腺切除法致糖尿病、免疫性糖尿病、激素性糖尿病、下丘脑损伤性糖尿病、化学性糖尿病、病毒性糖尿病。由于化学性糖尿病动物模型诱发简便、来源广，应用较广泛。目前多采用注射化学诱导剂（链脲佐菌素或四氧嘧啶）的方法，引起短时间内胰岛B细胞大量损害而诱发糖尿病动物模型的建立。 1糖尿病模型小鼠

骨质疏松常见模型(1)

骨质疏松常见模型 1.概念：骨质疏松症是一种以骨量降低、骨微细结构破坏、骨强度下降，导致骨脆性增加，易发生骨折（骨折风险性增加）为特征的全身性骨骼疾病。 2.临床表现：腰背部疼痛，体长缩短，驼背及发生骨折。 3.按严重程度分：骨质疏松的发生程度包括低骨量、骨质疏松症和骨质疏松性骨折。依次程度增加。 4.现代医学将骨质疏松症分为原发性、继发性、特发性骨质疏松症三大类。原发性骨质疏松症（primary osteoporosis，POP），因年龄所致的体内性激素突然减少及生理性退行性改变所致。分为Ⅰ型绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis，POMP）和Ⅰ型老年性骨质疏松症。继发性骨质疏松症，由疾病或药物因素诱发，疾病如内分泌代谢病（糖尿病、甲状腺功能亢进症）、肾脏疾病、肝脏疾病等，药物诱发如长期大剂量的肝素、免疫抑制剂、抗癫痫病药、糖皮质激素的应用。而特发性骨质疏松症，一般伴有遗传疾病史，女性多见，妇女哺乳期和妊娠期的骨质疏松症往往也列为此类现代医学的研究 1.发病机制：主要机制是因为衰老、体内性激素减少、药物和某些疾病等因素导致骨吸收和骨形成平衡失调，骨矿物质和有机质等比例丢失，导致骨量减少和骨质疏松，进而引发骨折，为全身性代谢性骨病。总的来说，是由遗传、激素、营养、失用、年龄、生活习惯及免疫学等方面多种因素交互影响的结果。 2.诊断与治疗：①诊断：依靠临床表现、骨量的测定、骨密度（bone mineral density， BMD）及骨转化生化指标等，其中以骨量测定最为重要。临床上采用采用BMD测量作为诊断、与测量骨质疏松症骨折风险、监测自然病程以及评价药物干预疗效的最佳定量指标。临床上测量BMD的方法有双能X线吸收测定法（DXA）、外周双能X线吸收测定法（pDXA）、定量计算机断层照相术（QCT）及定量骨超声（QUS）等，其中DXA测量值是目前国际学术界公认的临床骨质疏松症诊断的“金标准”。②治疗：除了加强锻炼、改变不良生活习惯等，主要还是要依靠药物治疗。药物干预破骨细胞和成骨细胞的功能，防止骨丢失，增加骨量。1.骨吸收抑制剂，常见的有二膦酸盐、雌激素类药物和降钙素等。此类药物对已经丢失骨量的恢复的作用不明显，雌激素类药物有诱发子宫内膜癌的危险。2.骨形成促进剂，常见的有氟化物、甲状旁腺激素、活性维生素D3等。这些药物可刺激成骨细胞分化成熟，促进骨基质分泌和矿化，增加骨量。目前公认的骨形成促进剂是甲状旁腺激素。3.骨矿化促进剂，钙剂和维生素D等，这类药物科促进骨基质矿化，减少矿物质流失。单独使用钙剂是没

糖尿病小鼠模型的制备

一、糖尿病的概念及分类糖尿病已成为全人类继恶性肿瘤和心脑血管病之后的严重威胁人类健康的第三大非传染性疾病。目前我国己成为世界第一糖尿病大国。糖尿病是一类由遗传、环境、免疫等因素引起的、具有明显异质性的慢性高血糖症及其并发症所组成的综合征，并非单一病因所引起的单一疾病(多原因引起的综合症）。糖尿病分为：Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病和其它特异性糖尿病。Ⅰ型糖尿病即胰岛β细胞大量破坏，常导致胰岛素绝对性缺乏，以往称为胰岛素依赖型糖尿病、青年发病型糖尿病，“三多一少”症状明显。本型病因及发病是由于胰岛β细胞受到细胞介导性自身免疫性破坏。Ⅱ型糖尿病由于胰岛素抵抗并胰岛素分泌不足所致，以高血糖高血脂为显著特点。以往称为非胰岛素依赖型糖尿病、成年发病型糖尿病，常伴有明显的遗传因素，但遗传机制尚未阐明。其它特异性糖尿病包括，β细胞功能的基因缺陷、胰岛素作用的基因缺陷、胰腺外分泌疾病、内分泌疾病、药物或化敏学制剂所致的糖尿病、感染、非常见型免疫介导性糖尿病以及有时并发糖尿病的其它遗传综合症。（糖尿病是无法根治的，现在随着人们生活水平的提高，饮食习惯，生活方式的改变糖尿病的发病率节节攀升，成为威胁人类健康的一大难题。人们曾经一度把糖尿病称为富贵病这也是有一定道理的。为了提高人们的生活质量，近几年对糖尿病的研究日益加深）二、糖尿病模型的建立近年来，随着国内外对糖尿病治疗药物研究的深入开展，建立比较理想的糖尿病动物模型显得尤为重要。目前常用的动物模型有实验性动物模型和自发性动物模型。自发性模型应用价值较高，但因价格昂贵，饲养、繁殖条件要求严格，而不能得到广泛应用。实验性模型则应用比较广泛，实验性糖尿病动物模型的建立，是用各种方法损伤动物胰脏或胰岛β细胞导致胰岛素的缺乏，或用化学药物对抗胰岛素作用，导致动物出现高血糖形成糖尿病。实验性糖尿病动物模型的建立主要有6种方法：胰腺切除法致糖尿病、免疫性糖尿病、激素性糖尿病、下丘脑损伤性糖尿病、化学性糖尿病、病毒性糖尿病。由于化学性糖尿病动物模型诱发简便、来源

骨碎补、淫羊藿配伍杜仲防治小鼠骨质疏松的疗效观察

骨碎补、淫羊藿配伍杜仲防治小鼠骨质疏松的疗效观察东北林业大学陈喜君张媛媛【摘要】目的研究骨碎补、淫羊藿和杜仲对实验性骨质疏松症小鼠骨代谢生化指标的影响。方法采用维甲酸灌胃造成小鼠实验性骨质疏松症模型，同时灌服高、中、低三种剂量的含有骨碎补、淫羊藿和杜仲的供试药，检测小鼠血清总碱性磷酸酶(AKP)、羟脯胺酸／肌酐值(HOP／Cr)、钙离子(Ca2+)、骨钙素(BGP)的变化。结果三个给供试药剂量组的血清总碱性磷酸酶含量与模型组相比均升高，血清骨钙素、羟脯胺酸／肌酐、血清钙离子与模型组相比均下降(P<0.01或 P<0.05)。结论骨碎补、淫羊藿与杜仲对维甲酸造成的小鼠骨质疏松症有一定的防治作用。【关键词】淫羊藿；骨碎补；杜仲；骨质疏松；维甲酸 Effect of the combination of three kinds of traditional Chinese medicines on osteoporosis mice 【Abstract】Objective To study the effects of epimedium koreanum ,davallia mariesil and eucommia ulmoides oliver on osteoporosis mice induced by retinoic acid．Methods The osteoporosis mice were induced by retinoic acid and then were fed with epimedium koreanum,davallia mariesil and eucommia ulmoides oliver．The biochemical markers in serum were observed．Results The data showed that the blood AKP were higher in mice treated with three total flavones than mice in model group，the blood HOP／Cr,BGP, Ca2+ were lower in treated mice than model group(P<0.01 or P<0.05)．Conclusion This study suggests that those three kinds of traditional Chinese medicines can effectively treat the osteoporosis mice induced by retinoic acid．【Key words】Epimedium koreanum；Davallia mariesil；Eucommia ulmoides oliver; Osteoporosis；Retinoic acid

骨质疏松症动物模型的研究进展

科研实践论文骨质疏松症动物模型构建的研究进展系（院）：生物科学与工程学院专业年级：食品质量与安全专业1102班学生姓名：王晓乐学号：1112034033 指导老师：郑红星完成时间：2013年5月21日

骨质疏松症动物模型构建的研究进展作者：王晓乐所在单位：（陕理工生物科学与工程学院食品质量与安全专业1102班，陕西汉中723000）指导老师：郑红星 [摘要] 近年常用于骨质疏松的模型动物有大鼠、小鼠、兔、犬、羊、猪等。以大鼠最为常用。用于制模的方法有年龄相关的骨丢失，去势模型,药物类模型，废用性骨质疏松模型，营养类模型等。其中以去势模型，特别是去卵巢动物模型最常用。骨质疏松动物模型的建立有手术切除卵巢、药物诱导、饮食限制和制动术等几种方法。也有将卵巢切除与其他方法结合应用以加快失骨的报道。 [关键字] 骨质疏松；动物模型；研究进展引言骨质疏松症是可能由于多种原因导致的骨密度和骨质量下降，骨微结构破坏，造成骨脆性增加，从而容易发生骨折的全身性骨病。用于骨质疏松症模型动物模型首先应该考虑的是模型应与人类骨质疏松的临床症状及组织行为相似，但某些动物模型在各个方面完全与人类骨质疏松症的临床表现一致是很困难的，因此动物模型侧重与表现其某一阶段、某些症状或一些病理生理变化，作为观察特定阶段和指征的病理模型。美国骨质疏松药物研究指南（美国－FDA）认为目前没有一种动物模型能模拟人类骨质疏松的所有特征。已有报道用小鼠，大鼠、兔、羊、猴等复制骨质疏松模型。 1实验动物 1.1 大鼠啮齿类动物如大鼠是迄今为止在OP研究中使用最广泛的实验动物，并且美国食品与药品管理局（FDA）也要求治疗OP的药物实验研究采用去卵巢大鼠和另一种非啮齿类动物模型（如狗、猪、羊、灵长目）进行实验。大鼠用于OP研究的优点是：（1）分布广，繁殖快，花费低，体积小，易于饲养和管理。（2）有明显的生长期和成年期，容易观察年龄对骨组织的影响。（3）骨骼系统解剖与人类有众多相似之处。（4）成年大鼠多个部位的松质骨骨量可在一段较长时期内保持稳定，这是研究松质骨重建的合适条件。（5）与人类相似的松质骨分

基因敲除小鼠技术共9页word资料

转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，并逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业一、技术介绍与研究进展转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。

二、同源重组技术原理基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies 于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图1所示：图1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图三、制作流程图2.基因敲除鼠制作过程示意图 1. Knockout载体设计与构建

小鼠糖尿病模型建立的实验设计

发育生物学课程设计北方民族大学小鼠糖尿病模型实验设计方案姓名：徐飞学号：20103465 生物技术102班

小鼠糖尿病模型实验设计方案徐飞（北方民族大学生物科学与技术学院，生物技术，20103465）【摘要】糖尿病是一种常见的具有遗传倾向的葡萄糖代谢和内分泌障碍,是由于绝对性或相对性胰岛素分泌不足引起的,近半个世纪来,糖尿病患病率和死亡率有明显上升趋势,在我国已成为继心血管疾病、肿瘤之后列第三位的常见病、多发病和慢性非传染性疾病。【关键词】糖尿病；动物模型；实验设计【Abstract】Diabetes mellitus is a common genetic glucose metabolic and endocrinal disturbance caused by insulindeficiency absolutely or relatively. In the last half century, diabetes has the increasing rates of morbidity and mortality, and has become the third common, frequently occurring and chronic noninfectious disease after cardiovascular disease and cancer. 【key words】Diabetes; Models, animal; Experimental design 引言糖尿病(diabetesmellitus,DM)属中医学“消渴”范畴,是以多饮、多食、多尿、身体消瘦,或尿浊、尿有甜味为特征的疾病。现代医学认为,糖尿病是一种由多种病因引起的慢性代谢性疾病,是由于体内胰岛素缺乏,或拮抗胰岛素的激素增高,或胰岛素在靶细胞内不能发挥正常生理作用而引起葡萄糖、蛋白质及脂质代谢紊乱的综合征。为探清糖尿病病因,建立理想的DM动物模型是十分必要的,动物模型也可以筛选降糖药物,可以为中医药治疗糖尿病提供实验依据。动物疾病模型主要用于实验生理学、实验病理学和实验治疗学（包括新药筛选）研究。人类疾病的发展十分复杂，以人本身作为实验对象来深入探讨疾病发生机制，推动医药学的发展来之缓慢，临床积累的经验不仅在时间和空间上都存在局限性，而且许多实验在道义上和方法上也受到限制。而借助于动物模型的间接研究，可以有意识地改变那些在自然条件下不可能或不易排除的因素，以便更准确地观察模型的实验结果并与人类疾病进行比较研究，有助于更方便，更有效地认识人类疾病的发生发展规律，研究防治措施。糖尿病模型的建立方法很多,如手术法、药物法、自发性DM、转基因动物法等。国外多

基于CRISPR Cas9技术基因敲除小鼠(Cas9-KO)的制作方法-2018-2-28

基于CRISPR Cas9技术基因敲除小鼠（Cas9-KO）的制作方法一、CRISPR/Cas9靶向基因敲除小鼠制作的基本技术原理：通过CRISPR/Cas9基因敲除技术，crRNA通过碱基配对与tracrRNA（trans-activating RNA）结合，形成双链RNA。这一tracrRNA:crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶标的特定位点剪切双链DNA。在与crRNA引导序列互补的位点，Cas9蛋白的HNH核酸酶结构域剪切互补链而Cas9 RuvC-like 结构域剪切非互补链，实现敲除目的基因的功能，制备基因敲除小鼠模型。二、具体步骤如下：一）模型制作策略制作：利用生物信息学手段(NCBI&IMPC&MGI)，分别仔细分析目的基因敲除后小鼠的生存能力及繁育能力，并结合邻近基因的影响，最终选择合适的敲除区域进行敲除方案的设计，出具相应的制作策略。二）载体的设计和构建：使用麻省理工学院的CRISPR Design工具（https://www.360docs.net/doc/086778288.html,/），依据中靶Score的高低及脱靶Score的高低设计一对长度为20bp的针对靶标DNA的寡聚核苷酸链序列用于制备sgRNA，并在该靶区域设计引物用于后续阳性小鼠的基因鉴定。 1、制备sgRNA的实验方法步骤： 1）线性化pUC57-GDNA-T7载体中提pUC57-GDNA-T7载体，用BsaI线性化过夜。胶回收保存备用。 2）引物退火及加磷酸将上下游引物（干粉）稀释，再进行引物退火及加磷酸。 3）连接&阳性菌落筛选

取步骤二中的加磷酸产物与线性化载体pUC57-GDNA-T7进行连接，该连接反应在干式恒温器中进行。对连接产物进行转化，涂板，37°C培养箱过夜培养。再用PCR&测序的方法筛选阳性克隆，再将测序正确的克隆进行甘油菌保种，-80°C保存备用 4）制备转录模板以构建好的sgRNA载体为模板进行PCR扩增，将PCR产物切胶回收，回收产物离心后倒掉上清留DNA沉淀，再溶解DNA。再吸1 μl测DNA浓度，浓度应介于300-500ng/μl，OD260/280介于1.8-2.0范围内。 5）最后进行sgRNA转录，将得到的sgRNA测浓度，跑电泳，分装保存。三）Cas9/sgRNA的显微注射：将转录好的Cas9 mRNA，sgRNA混合使用显微操作仪将混合物显微注射到小鼠受精卵的胞浆中，再将受精卵移植到假孕的母鼠子宫中，等待F0代小鼠出生。四）F0 小鼠的鉴定：在F0代小鼠出生后5-7天时，采用剪脚趾法标记小鼠，并将剪取鼠尾组织用在靶区域设计的引物进行鉴定，选取PCR阳性的样品进行测序。五）F0代小鼠的可遗传性检测：将PCR以及测序正确的F0代小鼠与野生型C57BL/6小鼠进行交配，产生F1代小鼠，依据F0代小鼠的鉴定方法对F1代小鼠进行鉴定，获得的阳性F1代杂合子小鼠即可稳定遗传。

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