常用DNA分子标记类型和特点
常用DNA分子标记类型和特点
依据对DNA多态性的检测手段，DNA标记可分为四大类：
第一类为基于DNA．DNA杂交的DNA标记。主要有限制性片段长度多态性标记（RFLP）、可变数目串联重复序列标记(VNTR)、单链构象多态性RFLP(SSCP．RFLP）等；
第二类为基于PCR的DNA标记。主要有随机扩增多态性DNA（RAPD)，简单重复序列DNA
标记(SSR)，测定序列标签位点(STS)，表达序列标签(EST)，测序的扩增区段（SCAR)；
第三类为基于PCR与限制性酶切技术结合的DNA标记。主要有两种，一种是扩增片段艮度多态性（AFLP)，第二种是酶解扩增多态顺序(CAPS）;
第四类为基于单核苷酸多态性的DNA标记.主要是单核苷酸酸多态性(SNP）.
各类常用分子标记的特点和应用如下:
DNA标记技术
DNA标记技术 1遗传标记概述 遗传标记是指可以明确反映遗传多态性的生物特征。在经典遗传学中，遗传多态性是指等位基因的变异。在现代遗传学中，遗传多态性是指基因组中任何座位上的相对差异。遗传标记可以帮助人们更好地研究生物的遗传与变异规律。在遗传学研究中遗传标记主要应用于连锁分析、基因定位、遗传作图及基因转移等。在作物育种中通常将与育种目标性状紧密连锁的遗传标记用来对目标性状进行追踪选择。在现代分子育种研究中，遗传标记的应用已成为基因定位和辅助选择的主要手段。 2遗传标记的发展 19世纪后半叶，孟德尔（G.Ｊ. Mendel）以豌豆为材料，发现了生物遗传的分离规律和独立分配规律，即著名的孟德尔定律。1910年以后，摩尔根将孟德尔“遗传因子”的行为与染色体的行为结合起来进行研究，证实了“遗传因子”是染色体上占有一定位置的实体，由此导致了细胞遗传学的诞生。1941年，美国遗传学家G. W. Beadle和生化学家E. L. Tatum通过研究红色面包霉的生化突变型，对一系列营养缺陷型进行遗传分析，提出了“一个基因一个酶”的假说，创立了生化遗传学。1953年，J. D. Watson和F. H. C. Crick提出了DNA分子结构的双螺旋模型，宣布了分子遗传学时代的到来。1980年，人类遗传学家D.R.L. Botstein 等首先提出了DNA限制性片段长度多态性（RFLP）可以作为遗传标记的思想，开创了直接应用DNA多态性发展遗传标记的新阶段。1985年，DNA多聚酶链式反应(PCR)技术的诞生，使直接体外扩增DNA以检测其多态性成为可能。1990年，J.G.K. Williams等和J. Welsh等两个研究小组应用PCR技术同时发展了一种新的RAPD分子标记。随后，基于PCR技术的新型分子标记不断涌现。 3遗传标记的种类 3．1形态标记 形态标记是指那些能够明确显示遗传多态性的外观性状，如株高、穗形、粒色或芒毛等的相对差异。典型的形态标记用肉眼即可识别和观察。广义的形态标记还包括那些借助简单测试即可识别的某些性状如生理特性、生殖特性、抗病虫性等。由自发突变或物理化学诱变均可获得具有特定形态特征的遗传标记材料。 形态标记基因的染色体定位最初是通过经典的二点、三点测验进行的。通过判断不同性状间的遗传是否符合独立分配规律，来确定控制这些性状的基因是否连锁。采用这种方法把相互连锁在一起的基因定为一个连锁群，并与染色体相对应，以性状间重组率作为这些基因在染色体上的相对距离，并确定其毗邻关系。1910年，摩尔根领导的实验室根据对果蝇六个形态性状的分析，发现了连锁遗
分子标记技术的类型原理及应用
分子标记 1.分子标记技术及其定义 1974年,Grozdicker等人在鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时, 利用限制性内切酶酶解后得到的DNA片段的差异, 首创了DNA分子标记。所谓分子标记是根据基因组DNA存在丰富的多态性而发展起来的可直接反映生物个体在DNA水平上的差异的一类新型的遗传标记,它是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后最为可靠的遗传标记技术。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质分子。通常所说的分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记。分子标记技术本质上都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映基因组之间差异。 2.分子标记技术的类型 分子标记从它诞生之日起, 就引起了生物科学家极大的兴趣,在经历了短短几十年的迅猛发展后, 分子标记技术日趋成熟, 现已出现的分子标记技术有几十种, 部分分子标记技术所属类型如下。 2.1 建立在Southern杂交基础上的分子标记技术 (1) RFLP ( Rest rict ion Fragment Length Polymorphism)限制性内切酶片段长度多态性标记； (2) CISH ( Chromosome In Situ Hybridization) 染色体原位杂交。 2.2 以重复序列为基础的分子标记技术 (1) ( Satellite DNA ) 卫星DNA； (2) ( Minisatellite DNA ) 小卫星DNA; (3) SSR( Simple Sequence Repeat ) 简单序列重复, 即微卫星DNA。 2.3 以PCR为基础的分子标记技术 (1) RAPD ( Randomly Amplif ied Polymorphic DNA ) 随机扩增多态性DNA； (2) AFLP( Amplif ied Fragment Length Polymorphism) 扩增片段长度多态性； (3) SSCP( Single Strand Conformation Polymorphism) 单链构象多态性； (4) cDNA-AFLP( cDNA- AmplifiedFragment Length Polymorphism) cDNA -扩增片段长度多态性； (5) TRAP( Target Region Amplified Polymorphism) 靶位区域扩增多态性； (6) SCAR ( Sequence Char acterized Amplified Region) 序列特征化扩增区域； (7) SRAP ( Sequencerelated Amplified Polymorphism) 相关序列扩增多态性。 2.4以mRNA为基础的分子标记技术
遗传学中的分子标记技术
遗传学中的分子标记技术 遗传学是研究遗传现象的一门学科，而分子标记技术则是其中 的一个重要领域。它不仅可以帮助我们研究物种间的遗传联系， 还可以应用于医学和农业领域，为人们的生活带来更多便利和进步。本文将介绍遗传学中的分子标记技术，探讨其在实践中的应 用以及未来的发展方向。 一、分子标记技术简介 分子标记技术是利用分子水平的遗传标记对个体、品系或群体 进行鉴别、分类、分子配对等分析的一种技术。目前常用的几种 分子标记技术包括限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多 态性（RAPD）、序列标记位点（SSR）和单核苷酸多态性（SNP）等。 RFLP技术是一种基于DNA序列限制性切割位点的分析方法。 通过将基因组DNA切成不同的长度片段，然后对这些片段进行电 泳分离，最后通过DNA探针的帮助确定特定位点的DNA序列。RAPD技术则是一种无需事先知道DNA序列的技术，通过使用随 机序列的寡核苷酸为引物进行PCR扩增，经过电泳分离后可以得 到特定长度的DNA条带。SSR技术则是利用序列中重复核苷酸序
列的多态性，选取特定的序列扩增后进行电泳分离，得到条带后可以确定所研究物种基因组的遗传变异情况。SNP技术则是一种最新的分子标记技术，它是基于单核苷酸变异位点的方法，通过测量单个碱基的点突变来分析遗传多样性。 二、分子标记技术的应用 1.遗传分析 分子标记技术在遗传学研究中可以用于基因型鉴定、亲缘关系分析、遗传多样性评估等方面。例如，利用SSR技术可以分析豆科作物的遗传多样性，帮助育种学家定位有用的基因，并加速豆科作物的育种进程。另外，RFLP技术还可以用于协助医学领域的DNA指纹分析，对于识别罪犯身份、证明亲子关系等方面都有巨大贡献。 2.病理学研究 在病理学研究中，分子标记技术可以用于检测各种疾病的基因突变、表达谱的差异、重要调节基因的变化等。例如，SNP技术
dna分子标记技术概述
dna分子标记技术概述 DNA分子标记技术是一种基于DNA序列的分析方法，可以用来研究 生物体的遗传变异和基因表达。它是现代分子生物学和遗传学研究的 重要工具之一，被广泛应用于农业、医学、生态学等领域。 DNA分子标记技术的基本原理是利用DNA序列的差异性，通过特定 的方法将其转化为可检测的标记，然后利用这些标记来分析不同生物 体之间的遗传关系和基因表达差异。常用的DNA分子标记技术包括PCR-RFLP、RAPD、AFLP、SSR、SNP等。 PCR-RFLP是一种利用PCR扩增DNA片段后，通过酶切鉴定其长度 差异的方法。RAPD是一种利用随机引物扩增DNA片段后，通过其长度和数量的差异来分析不同生物体之间的遗传关系的方法。AFLP是一种利用限制性内切酶和连接酶对DNA片段进行特异性扩增的方法。SSR是一种利用特定的引物扩增含有重复序列的DNA片段的方法。SNP是一种利用单核苷酸多态性来分析不同生物体之间的遗传关系和 基因表达差异的方法。 DNA分子标记技术具有高度的灵敏性、准确性和可重复性，可以用来研究不同生物体之间的遗传关系、基因表达差异、基因型鉴定等问题。它在农业领域的应用主要包括品种鉴定、遗传多样性分析、杂交种育
种等方面。在医学领域，DNA分子标记技术可以用来研究遗传疾病的发生机制、基因诊断、药物反应等问题。在生态学领域，DNA分子标记技术可以用来研究物种多样性、种群遗传结构、生态系统功能等问题。 总之，DNA分子标记技术是一种重要的分子生物学和遗传学研究工具，具有广泛的应用前景。随着技术的不断发展和完善，它将在更多领域 发挥重要作用，为人类的生产和生活带来更多的福利。
分子标记种类及概述
分子标记概述 遗传标记主要有四种类型: 形态标记（morphological marker）、细胞标记（cytological markers）、生化标记（Biochemical marker）和分子标记（molecular marker）。分子标记是其中非常重要的一种，他是以个体间遗传物质核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA 水平遗传多态性的直接的反映。 早在1923年，Sax等就提出利用微效基因与主基因的紧密连锁，对微效基因进行选择的设想。但由于形态标记数目有限，而且许多标记对育种家来说是不利性状，因而难以广泛应用。细胞标记主要依靠染色体核型和带型，数目有限。同工酶标记在过去的二、三十年中得到了广泛的发展与应用。作为基因表达的产物，其结构上的多样性在一定的程度上能反映生物DNA组成上的差异和生物遗传多样性。但由于其为基因表达加工后的产物，仅是DNA 全部多态性的一部分，而且其特异性易受环境条件和发育时期的影响；此外同工酶标记的数量有限，不能满足育种需要。近年来，分子生物学的发展为植物遗传标记提供了一种基于DNA变异的新技术手段，即分子标记技术。 与其它标记方法相比，分子标记具有无比的优越性。它直接以DNA形式出现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境的限制，不存在表达与否的问题；数量极多，基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；多态性高，利用大量引物、探针可完成覆盖基因组的分析；表现为中性，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；许多标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利，能够鉴别出纯合的基因型与杂合的基因型，提供完整的遗传信息。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。 分子标记的概念有广义和狭义之分。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不同分子形式）。狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。 理想的分子标记必须达以下几个要求：(1) 具有高的多态性；(2) 共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3) 能明确辨别等位基因；(4) 遍布整个基因组；(5) 除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6) 选择中性(即无基因多效性)；(7) 检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)；(8) 开发成本和使用成本尽量低廉；(9) 在实验室和实验室间重复性好(便于数据交换)。但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以所有要求。 分子标记种类 利用分子标记技术分析生物个体之间DNA序列差别并用于作图的研究始于1980年。经过十几年的发展，现在的DNA标记技术已有几十种，主要有一下几大类。
分子标记特点和应用
分子标记技术方法和他们特点 1、限制性片段长度多态性标记分析(Re striction Fragment Length Polymorphism，RFLP)—RFLP RFLP技术的是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA 片段的大小。因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变(新产生和去除酶切位点) 和一段DNA 的重新组织(如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化) 等均可的产生 RFLP技术特点： RFLP技术优点： ①结果稳定，重复性好，特别是PCR-RFLP（CAPS）由于是特定引物扩增，退火温度高，因而假阳性低，可靠性更高。 ②是一种共显性标记，可区分纯合体与杂合体，数据多态信息量大，不受显隐性关系、环境条件、发展阶段及组织部位影响。 ③RFLP标记广泛存在于生物体内，不受组织、环境和发育阶段的影响，具有个体、种、属及各种各层次水平的特异性。 ④核基因组的RFLP标记表现为孟德尔的共显性遗传，而细胞质基因组的RFLP一般表现为母性遗传。 RFLP技术缺点： ①分析所需DNA量较大，分析速度慢。 ②步骤较多，周期长，技术复杂，费用高。 ③检测多态性水平过分依赖限制性内切酶，使多态性降低，对DNA质量要求高。 ④检测中需放射性物质，限制了广泛应用。 ⑤对于线粒体DNA而言，因为其进化速度快，影响种以上水平的RFLP分析的准确性。但是种以上水平影响很小。 2.随机扩增多态性DNA技术（Random Amplified Polymorphism DNA）—RAPD 以单一的随机引物(一般为10个碱基)利用PCR技术随机扩增未知序列的基因组DNA获得的DNA片段长度变异。它是利用随机引物通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。 RAPD技术特点： RAPD优点： ①无种属特异性,一套RAPD引物可以应用于任意一种生物的研究，具有广泛和通用的特点。 ②适合于自动化分析。操作技术简单，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术，省工省力和工作进度快。 ③不需制备探针、杂交等程序，引物价格低，成本较低。 ④.DNA用量少，允许快速、简单地分离基因组DNA。 ⑤不受环境、发育、数量性状遗传等影响，能够客观地提示供应材料之间DNA的差异。RAPD缺点： ①是一种显性标记，用于二倍体生物时，区别纯合子和杂合子的困难性会引入统计分析。 ②.稳定性较差，在某些情况下，实验结果不能重复，结果可靠性低。 ③该技术的使用因生物种类而定。在细菌中，其因是单倍体，又是无性繁殖，所以RAPD标记技术很有用。 3任意引物.PCR标记技术（Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction）-AP—PCR AP—PCR分析中，所使用的引物较长(10－50 bp) ， PCR反应分为两个阶段，首先寡核
分子标记辅助选择
第十七章分子标记辅助选择育种 分子标记：以DNA多态性为基础的遗传标记 分子标记的特点：1、遗传多态性高；2、在基因组中大量存在且均匀分布；3、稳定性、重现性好；4、信息量大，分析效率高 第一节分子标记的类型及原理 一、分子标记的类型 1、以DNA-DNA杂交为基础的DNA标记技术：限制性片段长度多态性标记，简称RFLP标记；可变数目串联重复序列标记，简称VNTR标记；原位杂交，简称ISH 2、基于PCR的DNA标记：1）单引物PCR标记；2）双引物选择性扩增的PCR标记；3）通过克隆、测序来构建特殊双引物的PCR标记。 3、基于PCR与限制性内切酶技术相结合的DNA标记。分为两类：限制性酶切片段的选择性扩增，如AFLP；PCR扩增片段的限制性酶切，如CAPs 4、基于单核苷多态性的DNA标记：单核苷酸多态性，简称SNP 二、主要分子标记 1、RFLP（Restriction Fragment Length po1ymorpams）限制性片段长度多态性 1980，Bostein用限制性内切酶酶切不同个体的基因组DNA后，含有与探针序列同源的酶切片段在长度上的差异。（1）RFLP标记的原理 基因组DNA序列上的变化：碱基替换、插入、缺失或重复造成某种限制性内切酶（restriction enzymes ）酶切位点的增加或丧失以及内切酶酶切位点间DNA片段变化 （1）RFLP标记的分析步骤 （2）RFLP分析探针 单拷贝或寡拷贝 探针来源：cDNA克隆；基因组克隆（Random Genome）；PCR克隆 （3）RFLP标记的特点 优点：①数目几乎无限；②共显性；③可以利用现有探针，具有种族特异性；④RFLP标记遍及全基因组；⑥重复性好缺点：成本较高;一个探针只能产生一个多态位点；需要许多克隆探针；所需DNA量大(5～15μg)；易造成环境污染 2、RAPD（Random Amplification Polymorphism DNA）随机扩增多态性DNA 1990,Williams通过PCR扩增染色体组DNA所获得的长度不同的多态性DNA片段。 如随机排列的寡聚脱氧核苷酸单链引物（10个核苷酸）。 PCR，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） Mullis等(1985)PCR反应：变性、复性、延伸。特异性取决于引物与模板DNA结合的特异性。 RAPD与经典的PCR反应的区别：①引物；②反应条件；③扩增产物 AP-PCR（Arbitrarily primed polymerase chain reaction)：任意引物PCR；引物长度与一般PCR反应中的引物相当；开始阶段退火温度较低 DAF（DNA amplification fingerprinting）：DNA扩增指纹；引物长度比RAPD更短，为5～8个核苷酸；DAF复性和延伸常用同一种温度 （2）RAPD标记的特点 优点：1）可检测未知序列的基因组DNA；2）引物无种族特异性；3）RAPD技术简单；4）单个引物可产生几个多态位点；5）通过克隆测序可转化成SCAR（特异序列扩增区域标记）； 缺点：1）再现性差；2）显性遗传；3）存在共迁移问题 3、AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphisms）扩增片段长度多态性 1993，Zabeau marc和V os pieter是对限制性酶切片段的选择性扩增。 （1）AFLP标记的原理：基因组的DNA进行双酶切；人工接头连接；PCR反应的引物；凝胶电泳 限制性酶：酶切频率较高的限制性酶（frequent cutter），产生易于扩增基因组DNA。酶切频率较低的限制性酶（rare cutter），限制扩增模板DNA片段的数量。 AFLP扩增数量由酶切频率较低的限制酶在基因组中的酶切位点数量决定。 AFLP分析的基本步骤：1）限制性核酸酶双酶切基因组DNA；2）DNA片段两端连接上特定的接头；3）选择扩增；4）聚丙烯酰胺凝胶电泳；5）凝胶转移，干胶处理；6）自显影；（荧光标记、银染）
分子标记技术简介
分子标记技术简介 分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。 分子标记的概念有广义和狭义之分。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。 理想的分子标记必须达以下几个要求：(1) 具有高的多态性；(2) 共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3) 能明确辨别等位基因；(4) 遍布整个基因组；(5) 除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6) 选择中性(即无基因多效性)；(7) 检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)；(8) 开发成本和使用成本尽量低廉；(9) 在实验室内和实验室间重复性好(便于数据交换)。但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以所有要求。
【分子标记的种类】 一、基于分子杂交技术的分子标记技术 此类标记技术是利用限制性内切酶解及凝胶电泳分离不同的生物DNA 分子，然后用经标记的特异 DNA 探针与之进行杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示 DNA 的多态性。 ①限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP) 1974年Grodzicker等创立了限制性片段长度多态性(RFLP)技术，它是一种以DNA—DNA杂交为基础的第一代遗传标记。RFLP基本原理：利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。 RFLP的等位基因其有共显性特点。RFLP标记位点数量不受限制，通常可检测到的基因座位数为1—4个。RFLP技术也存在一些缺陷，主要是克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难；另外，实验操作较繁锁，检测周期长，成本费用也很高。自RFLP问世以来，已经在基因定位及分型、遗传连锁图谱的构建、疾病的基因诊断等研究中仍得到了广泛的应用。
DNA分子标记及其优缺点
DNA分子标记种类及相应的优缺点 摘要：对RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR 等常用的DNA 分子标记技术以及其他几种新兴的标记技术( SNP、EST 等) 的原理、特点进行了综述,并对各自的优缺点进行了探讨。 关键词：DNA分子标记优缺点 分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种较为理想的遗传标记形式,它以蛋白质、核酸分子的突变为基础,检测生物遗传结构与其变异。分子标记技术从本质上讲,都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映生物个体之间的差异。每一种分子标记都有其自身的特点和特定的应用范围,但就一般意义而言,DNA 分子标记与形态标记和生化标记等相比,具有许多独特的优点: ①不受组织类别、发育阶段等影响。植株的任何组织在任何发育时期均可用于分析。②不受环境影响。因为环境只影响基因表达(转录与翻译) ,而不改变基因结构即DNA 的核苷酸序列。③标记数量多,遍及整个基因组。④多态性高,自然存在许多等位变异。⑤有许多标记表现为共显性,能够鉴别纯合基因型和杂合基因型, 提供完整的遗传信息。⑥DNA 分子标记技术简单、快速、易于自动化。⑦提取的DNA 样品,在适宜条件下可长期保存,这对于进行追溯性或仲裁性鉴定非常有利。因此,DNA 分子标记可以弥补和克服在形态学鉴定及同工酶、蛋白电泳鉴定中的许多缺陷和难题,因而在品种鉴定方面展示了广阔的应用前景。 1. 1 第1 代分子标记 1.1. 1 RFLP 标记技术。1980 年Botesin提出的限制性片段长度多态性 (Restriction fragment length polymorphisms ,RFLP) 可以作为遗传标记,开创了直接应用DNA 多态性的新阶段,是最早应用的分子标记技术。RFLP 是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA 片段的大小,反映DNA 分子上不同酶切位点的分布情况,因此DNA 序列上的微小变化,甚至1 个核苷酸的变化,也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生, 导致酶切片段长度的变化。 优点：RFLP 标记的等位基因具有共显性的特点,结果稳定可靠,重复性好,特别 适应于构建遗传连锁图。 缺点：在进行RFLP 分析时,需要该位点的DNA片段做探针,用放射性同位素及核 酸杂交技术,既不安全又不易自动化。另外,RFLP 对DNA 多态性检出的灵敏度不高,RFLP 连锁图上还有很多大的空间区。 1.1. 2 RAPD 标记技术。为了克服RFLP 技术上的缺点,Williams等于1990 年建立了随机扩增多态DNA (Randomamplified polymorphic DNA ,RAPD) 技术,由于其独特的检测DNA 多态性的方式使得RAPD 技术很快渗透于基因研究的各个领域。RAPD 是建立于PCR 基础之上的分子标记技术,基本原理是利用一个随机引物(8～10 个碱基) 通过PCR 反应非定点地扩增DNA 片段,然后用凝胶电泳分
分子标记及其应用研究的新进展
分子标记及其应用研究的新进展随着物种数量的快速增加和物种之间的关系逐渐复杂化，如何 有效的鉴定、分类和研究这些生物体的特征成为了生物学研究的 重要课题之一。分子标记是一种基于生物分子形态和功能的标志物，其具有分子生物学特征，能够反映整个生物体系发育历史上 的关系和演变过程，因此是现代生物学研究中不可或缺的工具。 本文将探讨分子标记研究的新进展以及其在生物学研究中的应用。 一、分子标记的种类和常用分类方法 分子标记种类多样，其中常用的包括基因序列、蛋白质序列、 核酸序列、微卫星等，还有DNA指纹技术、DNA芯片技术、 SNP鉴定技术等。在分类上，主要可分为分型标记和基因标记两类。 分型标记用于确定物种之间遗传性状的差异，常用的分型标记 包括RAPD（随机扩增多态性DNA）、AFLP（扩增片段长度多态性）、SSR（微卫星）、ISSR（插入缺失扩增多态性序列）、SRAP（序列相关的扩增片段）等，它们以拟南芥、玉米、大麦、 水稻等植物物种为主要研究对象。
而基因标记则是指那些能够显式或隐式的遗传的分子标记，例 如限制性片段长度多态性（RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphism）、单序列重复（SSR, Simple Sequence Repeats）以 及单核苷酸多态性（SNP, Single Nucleotide Polymorphism）等标记。 二、分子标记进展 1. SSR标记 在遗传关系的研究中，SSR标记是最常用的分子标记之一。其 具有高度多态性、遗传稳定性，能够反映出物种内、群体间的遗 传多样性，已具有广泛的应用价值。 最新的SSR标记研究显示，SSR标记可以不仅用于物种之间及 个体群体的遗传差异的鉴定，还可以用于自然选择以及人为选择 在作物、畜禽和人类之间的比较研究。SSR标记也可以在生态学、遗传学、生物多样性以及系统学研究中起到不可替代的作用。 2. SNPs标记
常用DNA分子标记类型和特点
常用DNA分子标记类型和特点 DNA分子标记是一种广泛应用于生物学研究和诊断领域的技术，用于 识别、检测和定量目标DNA序列。常见的DNA分子标记类型包括荧光染料、酶和放射性同位素等。每种标记类型都具有其独特的特点和应用场景。 荧光染料是DNA分子标记中最常用的类型之一、它们通过在DNA分子 上附着荧光染料，使其在荧光显微镜下可见。荧光染料具有多种颜色和化 学性质，可用于多重标记和多个目标的同时检测。其主要特点包括： 1.高灵敏度：每个荧光染料分子都有较强的荧光信号，因此可以在微 量样品中进行检测。 2.高选择性：荧光染料可以针对目标DNA序列进行选择性标记，从而 实现目标分子的准确检测。 3.高兼容性：荧光染料可以与不同的DNA分析方法兼容，如凝胶电泳、荧光定量PCR等。 酶也是常用的DNA分子标记类型之一、通过将酶与DNA标记物结合， 可以通过酶的催化反应产生可定量的信号。常用的酶标记包括辣根过氧化 物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。其主要特点包括： 1.高灵敏度：酶催化反应可以在大量酶底物的参与下放大信号，从而 提高检测的灵敏度。 2.稳定性：酶标记的DNA可以在各种条件下稳定存在，并且可以长期 保存。 3.可视性：酶催化反应可以产生可见的颜色或发光信号，从而直观地 观察到标记物。
放射性同位素是DNA分子标记的传统方式之一、通过将放射性同位素 与DNA标记物结合，可以通过放射性测量来定量目标DNA序列。 1.高灵敏度：放射性测量可以实现非常低浓度目标DNA的检测。 2.高特异性：放射性同位素标记DNA具有非常高的特异性，可以准确 检测目标序列。 3.长期保存：放射性同位素标记的DNA可以长期保存，方便未来的回 溯和再分析。 虽然放射性同位素标记具有较高的灵敏度和特异性，但其使用需要特 殊的设备和技术，并且存在较高的辐射风险，因此在现代实验室中较少使用。 总结而言，DNA分子标记在生物学研究和诊断中起着至关重要的作用。不同类型的DNA标记具有各自的特点和应用场景，研究人员可以根据实验 需求选择合适的标记方式，以便实现高灵敏度、高特异性和可视化的目标DNA检测。
品种真实性和纯度的分子标记鉴定简介
品种真实性和纯度的分子标记鉴定 1.DNA分子标记技术的原理及特点 DNA分子标记技术又称DNA指纹技术。用于作物品种鉴定的DNA分子标记技术，其基本原理是直接对品种DNA的多态性即DNA碱基顺序的差异进行分析，根据不同品种的特定DNA指纹图谱的差异来进行品种鉴定。该技术的应用，使品种纯度测定由形态、生化指标进入了基因水平的测定。其检测对象是种子的DNA片段（基因），没有器官的特异性，也不受环境的影响，有很高的准确性、稳定性和重复性。 2.DNA分子标记技术的分类 目前，用于作物品种鉴定的DNA分子标记技术主要有随机扩增多态性DNA （简称RAPD）、简单重复序列（简称SSR）和扩增片段长度多态性（简称AFLP ）等。 （1）RAPD RAPD是利用随机核苷酸序列作为引物，扩增基因组DNA的随机片段，再用随机片段的多态性作为品种的遗传标记。由于不同作物和品种的基因组DNA序列有很大的差异，复制特定DNA序列所需的引物也不一样。同一引物可使某一品种的DNA片段得到扩增，但对另一品种则不能诱导复制，因此，只要将待定引物诱导复制的特定DNA片段进行多聚酶链式反应（简称PCR）扩增，再经过琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，得到多态性的DNA谱带，就能鉴别不同的品种。目前RAPD已经在玉米、小麦、大麦、花生、水稻、大豆、棉花、甘薯、一些蔬菜和果树等作物上得到研究和应用。RAPD 分析方法具有操作简单，经济快捷，DNA用量较少，灵敏度高，且省去了使用放射性同位素等优点。缺点一是由于扩增的随机性，每一个引物只能检测基因组的有限区域，有些引物不能区分亲缘关系很近的自交系所配成的杂交种，必须利用几个引物才能区分；二是RAPD属于显性标记，不能区分杂合型和纯合型，而且RAPD检测分析受条件的影响很大。 （2）AFLP AFLP是通过选择性扩增基因组DNA的酶切片段而产生多态性。选择性扩增是通过在的引物3′末端加上选择性核苷酸而实现的。通过改变选择性核苷酸的数目，就可以预先决定所要扩增的片段的数目。目前AFLP已应用于大豆、水稻、玉米、棉花等作物。AFLP可以分析基因组较大的作物，具有多态性好、重复性好、准确性高等优点。其缺点是需要放射性同位素标记、较高的试验操作技能、高精密的仪器设备，因此很难在作物品种鉴定中普及应用。 （3）SSR SSR即简单重复序列又称微卫星DNA，是一类由几个核苷酸（一般为1~5个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。每个座位上重复单位的数目及
分子标记
分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。 与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有： ①大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利； ②基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的； ③在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析； ④分子标记揭示来自DNA的变异，表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁； ⑤检测手段简单、迅速。 随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。 分子标记的概念有广义和狭义之分。 广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。 狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。 理想的分子标记必须达以下几个要求：(1) 具有高的多态性；(2)共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3) 能明确辨别等位基因；(4) 遍布整个基因组； (5)除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6) 选择中性(即无基因多效性)；(7)检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)；(8) 开发成本和使用成本尽量低廉； (9)在实验室内和实验室间重复性好(便于数据交换)。但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以所有要求。 【分子标记的种类】 一、基于分子杂交技术的分子标记技术 此类标记技术是利用限制性内切酶解及凝胶电泳分离不同的生物DNA 分子，然后用经标记的特异DNA 探针与之进行杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示DNA 的多态性。 ①限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP) 1974年Grodzicker等创立了限制性片段长度多态性(RFLP)技术，它是一种以DNA—DNA杂交为基础的第一代遗传标记。RFLP基本原理：利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。 RFLP的等位基因其有共显性特点。RFLP标记位点数量不受限制，通常可检测到的基因座位数为1—4个。RFLP技术也存在一些缺陷，主要是克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难；另外，实验操作较繁锁，检测周期长，成本费用也很高。自RFLP问世以来，已经在基因定位及分型、遗传连锁图谱的构建、疾病的基因诊断等研究中仍得到了广泛的应用。
分子标记技术的种类
分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础，DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交为核心, 其代表性技术为RFLP；第二类以PCR技术为核心，如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等；第三类以DNA序列(mRNA或单核苷酸多态性)为核心，其代表性技术为EST标记、SNP标记等。理想的分子标记应达到以下的要求：①具有高的多态性；②共显性遗传；③能够明确辨别等位基因；④分布于整个基因组中；⑤选择中性(即无基因多效性)；⑥检测手段简单、快速；⑦开发成本和使用成本尽量低廉；⑧在实验室内和实验室间重复性好。目前，没有任何一种分子标记均满足以上的要求，它们均具 有各自的优点和不足。其特点比较见表一。 1限制性内切酶片段长度多态性标记（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）1974年，Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时，发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了差异，由此首创了第一代DNA分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。其原理是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成)，利用限制性内切酶酶解基因组DNA时，会产生长度不同的DNA酶切片段，通过凝胶电泳将 DNA片段按各自的长度分开，通过Southern印迹法，将这些大小不同的DNA片段转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，再用经同位素或地高辛标记的探针与膜上的酶切片段分子杂交，最后通过放射性自显影显示杂交带，即检出限制性片段长度多态性。进行 RFLP时，酶切要彻底，注意内切酶的选择，对于亲缘关系很近的物种，可增加内切酶的使用种类。目前RFLP 的使用领域很广泛，其具有以下优点：①RFLP标记源于基因组DNA的自身变异，理论上可覆盖整个基因组，能提供丰富的遗传信息；②标记不受组织、环境和发育阶段的影响；③呈共显性，即杂交时等位DNA片段均呈现带，能区分纯合基因型和杂合基因型，F2表现出 1∶2∶1的孟德尔分离定律[3]，提供标记座位完全的遗传信息；④由于限制性内切酶的专一性使结果稳定可靠，重复性好。其缺点是：①操作繁琐，费时；②酶切后的DNA质量要求高；③使用放射性同位素进行分子杂交，有危险性等。 2随机扩增多态性DNA标记 (Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD) 20世纪80年代，基于PCR技术的第二代分子标记技术诞生并迅速发展起来。1990年，Williams 等发表了一种不需预先知道DNA序列信息的检测核苷酸序列多态性的方法，即随机扩增多态性DNA标记(RAPD)。其原理是以碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链(8-10bp)为引物，以组织中分离出来的基因组DNA为模板进行扩增。随机引物在基因组DNA序列上有其特定结合位点，一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物的数量和大小发生改变，表现出多态性。用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，溴化乙锭染色后可在紫外光下显现出基因组相应区域DNA的多态性。与RFLP相比，RAPD方便易行，DNA用量少，设备要求简单，不需DNA探针，设计引物也不需要预先进行序列分析，不依赖于种属特异性和基因组的结构；合成一套引物可以用于不同生物基因组分析，用一个引物就可扩增出许多片段，并且不需使用同位素，安全性好。但因为引物较短导致退火温度较低，易产生错配，故实验的稳定性和重复性差，且为显性标记，不能区分纯合子和杂合子。 RAPD 标记技术利用单引物扩增多个基因位点使其在一定程度上对反应条件敏感，这会限制其应用。将RAPD-PCR变成经典的PCR可克服此限制，即设计更长的引物。1993年，Paran提出的序列特征化扩增区域标记(Sequenced Characterized Amplified Region，SCAR)即为以经典PCR为基础的分子标记技术[1]。SCAR标记技术通过对产生的RAPD片段克隆和测序，设计一对互补于原来
品种分子鉴定
品种分子鉴定 随着基因技术的不断发展和应用，品种分子鉴定成为了现代生物学和农业领域的重要研究方向。品种分子鉴定是指通过对目标物种的基因组DNA进行分析，从而确定其品种或亲缘关系。相比传统的形态学鉴定方法，品种分子鉴定具有快速、准确、可靠、高通量等优点，因此被广泛应用于种质资源保护、新品种选育、品种纯度检测、品种鉴定等领域。 品种分子鉴定的基本原理是基于分子标记的遗传多态性。分子标记是指DNA序列中存在的特定片段，通过PCR扩增和电泳分离等技术，可以检测到不同物种或不同品种之间的遗传多态性。常用的分子标记包括限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性DNA（RAPD）、序列特异性扩增片段（SSR）等。这些分子标记可以用于分析DNA的遗传多样性和基因型，从而确定物种或品种的亲缘关系。 在品种分子鉴定中，首先需要收集样本。样本的选择应该具有代表性，包括不同地理区域、不同生长环境、不同年份等，以确保样本的多样性和充分性。样本的处理包括DNA提取和纯化，基因组DNA的提取和纯化是品种分子鉴定的关键步骤。常用的DNA提取方法包括CTAB法、酚/氯仿法、商业提取试剂盒等。DNA提取后，需要进行DNA 质量和浓度的检测，确保DNA的完整性和纯度。 接下来是分子标记的选择和PCR扩增。分子标记的选择应该根据样本的特点和研究目的进行选择。PCR扩增是品种分子鉴定的关键步骤，PCR反应的优化是保证扩增效率和特异性的重要因素。PCR扩增
后，需要进行电泳分离和可视化。电泳分离可以将PCR扩增的DNA片段根据大小进行分离，不同品种之间的DNA片段长度不同，从而可以进行品种分子鉴定。可视化可以通过染色剂、放射性标记等方式进行，常用的染色剂包括乙溴化乙锭（EtBr）、SYBR Green等。 品种分子鉴定的结果分析可以通过多种方法进行，包括聚类分析、主成分分析、遗传距离分析等。聚类分析可以将不同品种之间的遗传距离进行分组，从而确定品种的亲缘关系。主成分分析可以将多个分子标记的遗传多样性进行综合分析，从而确定品种的遗传背景。遗传距离分析可以通过计算不同品种之间的遗传距离，从而确定品种之间的相似性和差异性。 品种分子鉴定的应用广泛，包括种质资源保护、新品种选育、品种纯度检测、品种鉴定等领域。种质资源保护是指对植物、动物等生物种质资源进行保护和利用，品种分子鉴定可以帮助确定种质资源的遗传多样性和亲缘关系。新品种选育是指通过杂交等方法培育新的优良品种，品种分子鉴定可以帮助确定新品种的亲缘关系和遗传背景。品种纯度检测是指对种子、幼苗等进行品种纯度检测，品种分子鉴定可以帮助确定品种的纯度和杂种程度。品种鉴定是指对市场上的植物、动物等进行品种鉴定，品种分子鉴定可以帮助鉴定物种和品种的真实性。 总之，品种分子鉴定是现代生物学和农业领域的重要研究方向，具有快速、准确、可靠、高通量等优点。品种分子鉴定的基本原理是基于分子标记的遗传多态性，需要对样本进行DNA提取和PCR扩增等
常用DNA分子标记类型及特点
常用 DNA 分子标记种类和特点 依照对 DNA 多态性的检测手段，DNA 标记可分为四大类： 第一类为基于DNA．DNA 杂交的 DNA 标记。主要有限制性片段长度多态性标记(RFLP)、可变数量串通重复序列标记(VNTR)、单链构象多态性 RFLP(SSCP． RFLP)等； 第二类为基于PCR的 DNA 标记。主要有随机扩增添态性DNA(RAPD)，简单重复序列DNA 标记 (SSR)，测定序列标签位点(STS)，表达序列标签(EST)，测序的扩增区段(SCAR)； 第三类为基于PCR与限制性酶切技术结合的DNA 标记。主要有两种，一种是扩增片段艮度多态性(AFLP)，第二种是酶解扩增添态序次(CAPS)； 第四类为基于单核苷酸多态性的DNA 标记。主若是单核苷酸酸多态性(SNP)。 各样常用分子标记的特点和应用以下： 标记名称引物设计方法 RAPD以几个随机寡核苷酸 (常用 10 个 )为引物 RFLP以单拷贝或低拷贝的 DNA 克隆 (基因组 DNA 或 cDNA)作探针特点应用 简略、易行、矫捷、遗传资源保存、遗传 安全性好、 DNA 用多样性研究、种质资 量少，能快速进行源判断、遗传资源分 基因多态性研究，类、品种纯度判断、 但重复性较差遗传图谱的成立、突 变检测、基因标记和 基因组比较 共显性、信息完品种鉴别和品系纯 整、牢固性、重复度判断、分子标记连 性好锁图谱成立、基因定 位、种质判断和遗传 背景解析、遗传多样 性解析 多态性原因 多态性是由于引 物与不同样区段的 同源序列结合， 产生不同样的DNA 产物 多态性主要足由 于限制性内切酶 酶切位点或位点 间DNA 序列中 单碱基的代替、 DNA 片段的插 SSR两端序列较保守， SSR 引物依照与微卫星重复 序两端的特定短序列设 计，用来扩增重复序列 自己，从而揭穿微卫星 的多态性。共显性、信息完 满、牢固性重复性 好，操作简单 生物遗传作图、基因 定位、集体遗传研 究、个体间亲缘关系 判断 入、缺失、易位 和倒位等引起 多态性是由于 SSR 座位的基本 单元重复次数的 小同而形成 SNP DNA 测序中碱基的峰 高和面积变化，已有 DNA 序列比较，设计 特定地域 DNA片段的 特异 PCR引物，扩增 相虑 DNA片段并进 行序列比较 AFLP用两种能产生黏性末 端的限制性内切酶将 基因组 DNA切割成分SNP 的数量极其 丰 富，并且可以进 行自动化检 不需要起初知道 DNA 序列信息的情 况下就可以同 适应于复杂性状的遗 传解析、引起集体差 其他基因鉴别 成立高密度的遗传 连锁图， DNA 指纹 图谱成立 多态性足由于单 个核苷酸的变异 所引起 多态性是由于酶 切位 点和以后的选择