海洋放线菌XS904分类鉴定及其发酵液抑菌活性的研究
第39卷 第5期 海 洋 与 湖 沼
Vol.39, No.5 2008年
9月
OCEANOLOGIA ET LIMNOLOGIA SINICA
Sep., 2008
* 浙江省自然科学基金资助项目，402038号。杨文鸽，博士，教授，E-mail ：yangwenge@https://www.360docs.net/doc/1212912401.html, 收稿日期: 2007-08-17, 收修改稿日期: 2007-10-25
海洋放线菌XS904分类鉴定及其发酵液
抑菌活性的研究*
杨文鸽1 楼乔明2 徐大伦1 孙爱飞1 潘云娣3
(1. 应用海洋生物技术教育部重点实验室 宁波大学生命科学与生物工程学院 宁波 315211; 2. 中国海洋大学食品科学与工
程学院 青岛 266003; 3. 宁波出入境检验检疫局 宁波 315012)
提要 采用形态观察、培养特征、生理生化鉴定以及16S rDNA 序列分析方法, 对从宁波海域滩涂泥样中筛选到的一株放线菌XS904进行分类鉴定, 同时对XS904菌株发酵液的抑菌活性和抑菌物质的理化性质进行了研究。结果表明, XS904菌株为链霉菌属灰浅红链霉菌(Streptomyces griseorubens )的变种; 经液体培养, XS904菌株发酵液对革兰氏阳性细菌有显著的抑菌活性, 对金黄色葡萄球菌的最小抑制浓度为0.78%; pH 纸色谱和捷克八溶剂系统纸层析结果显示发酵液中的抑菌活性物质为一类中等极性的碱性抗生素, 易溶于三氯甲烷, 对温度较敏感, 在酸性和中性条件下稳定。 关键词 海洋放线菌, XS904, 分类鉴定, 发酵液, 抑菌活性 中图分类号 Q93
放线菌是抗生素等制药工业最重要的微生物资源之一。自Waksman(1943)从灰色链霉菌提取出链霉素以来, 在放线菌中已发现和分离到4000多种抗生素, 如链霉素、土霉素、卡那霉素、井冈霉素等已广泛应用于临床治疗和农业生产。当前开发研究陆栖放线菌已相当深入, 从陆栖放线菌发现新的活性物质的几率正逐渐下降, 因此从海洋微生物资源中寻找新型微生物药物成为研究的必然趋势(Adinarayana et al , 2007; Janos, 2005; Maskey et al , 2004)。据不完全统计, 自20世纪70年代东京微生物化学研究所从海洋放线菌Chainia sp.分离到抗生素SS-228Y 以来, 从海洋放线菌中发现结构新颖具有强生理活性的物质已达100多个, 其中90%以上产生于放线菌中的链霉菌属(林永成等, 2003)。源于链霉菌的新生理活性物质不断被发现, 新链霉菌的分离、鉴定和活性物质的筛选已成为微生物来源新药筛选工作的重要课题(Muramatsu et al , 2004; 徐平等, 2005)。
本实验室从宁波海域滩涂泥样中筛选到一株海洋放线菌XS904, 经多次传代培养证实该菌株具有稳定的生理特性。本文作者在形态观察、生理生化特征
试验以及16S rDNA 序列相似性比较的基础上对XS904菌株进行分类鉴定, 同时对该菌株发酵液的抑菌活性进行研究, 旨为海洋放线菌的开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株XS904 分离自宁波象山港海域滩涂海泥中。
1.1.2 供试菌 青霉(Penicillium sp.), 根霉(Rhizopus sp.), 曲霉(Aspergillus niger ), 啤酒酵母(Saccharomyces carlsbergensis ), 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ), 枯草杆菌(Bacillus subtilis ), 大肠杆菌(Escherichia coli )。以上供试菌均由本院微生物实验室提供。
1.1.3 培养基 ① 改良高氏一号培养基：可溶性淀粉20g, KNO 3 1g, NaCl 0.5g, K 2HPO 4 0.5g, MgSO 4 0.5g, FeSO 4 0.01g, 琼脂15—20g, 海水晶30g, 蒸馏水1000ml, pH7.2—7.4, 121℃灭菌20min 。② 黄豆粉培养基：可溶性淀粉20g, 黄豆粉15g, 葡萄糖5g, 酵
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母膏2.5g, CaCO3 1g, 海水晶30g, 蒸馏水1000ml, pH 7.5—8.0, 121℃灭菌20min。
1.1.4主要试剂和仪器溶菌酶购自上海生工生物工程技术服务有限公司, PCR试剂盒购自大连TAKARA生物技术有限公司。Eiko HCP-2临界点干燥仪(日立公司), Eiko IB-5离子溅射仪(日立公司), Stereoscan 260扫描电镜(日立公司), PCR仪(美国Eppenderf公司)。
1.2菌株XS904的初步鉴定
1.2.1形态观察XS904菌株利用插片法(钱存柔等, 1999)培养10—20d后, 利用Novel光学显微镜进行形态观察; 同时取出插片, 用2.5%戊二醛固定12h, 再用1%锇酸固定6h, 经各级乙醇脱水, 乙酰异戊酯置换, CO2临界点干燥, 喷金镀膜, 扫描电镜观察菌体形态特征。
1.2.2培养特征与生理生化特性研究依据《链霉菌鉴定手册》(中国科学院微生物研究所放线菌分类组, 1975)和《放线菌分类基础》(阮继生, 1977)中推荐的常用微生物鉴定方法, 观察并记录菌株的培养特征与生理生化特性。
1.316S rDNA PCR扩增
1.3.1菌体总DNA的提取参照Hopwood等(1985)方法提取菌体总DNA。
1.3.2 16S rDNA PCR扩增正向引物PA(对应于
E. coli的16S rDNA 5′端8—27f位核苷酸)：5′- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′; 反向引物PB(对应于E. coli的16S rDNA 5′端1523—1504r位核苷酸)：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。
PCR扩增条件：以热启动方式进行扩增, 94℃预变性5min; 加Taq酶后94℃变性1min, 53℃退火1min, 72℃延伸3min, 共30个循环; 最后72℃延伸5min。
1.3.3 16S rDNA PCR扩增产物的纯化及测序由上海英骏生物技术有限公司协助完成。
1.4系统进化树的构建和分析
将所得到的16S rDNA序列用BLAST软件在GenBank数据库中进行相似性搜索, 选取同源性较高的16S rDNA序列作为参比对象, 用MEGA3.1软件进行多序列比对, 根据Kimura-2参数法计算进化距离, 并采用邻接法(Neighbor-Joining)构建系统进化树。
1.5XS904菌株发酵及发酵液预处理
菌种经斜面活化后, 将孢子用无菌水洗下, 孢子悬液接种于黄豆粉培养基, 28℃、160r/min摇床培养5d; 发酵结束后, 经减压抽滤, 上清液于－20℃保存备用。
1.6XS904菌株发酵液抑菌活性测定
抑菌圈直径测定：采用滤纸片法(林鹏等, 2005), 取6mm无菌滤纸片, 加入5ml发酵液, 贴于带菌培养基上, 以黄豆粉培养基作对照, 细菌37℃培养1d, 真菌37℃培养2d, 十字交叉法测量抑菌圈直径。
最小抑菌浓度测定：以原发酵液浓度为100%, 用3%海水晶溶液进行倍比稀释2、4、8、16倍后浓度分别为50%、25%、12.5%、6.25%, 依次类推。滤纸片法测定不同浓度发酵液的抑菌情况。
发酵液抑菌活性物质对温度和pH的稳定性测定(邵彦坡等, 2007)：取发酵液30ml分别在30—100℃水浴中放置30min, 冰浴冷却至室温, 测定不同温度处理后发酵液的抑菌情况; 取发酵液30ml, 用稀酸或稀碱将pH分别调至3.0—10.0, 静置24h后, 调至原始pH, 测定不同pH处理后发酵液的抑菌情况。1.7发酵液抑菌活性成分极性分析
用等体积的三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯对发酵液进行萃取, 搅拌4h后于分液漏斗中静置过夜, 分别取水相、有机相进行抑菌活性测定。
1.8发酵液抑菌活性成分纸层析分析
1.8.1pH纸层析(刘姝等, 2007) 取9条滤纸条(10mm×160mm), 分别用pH
2.2、pH
3.0—10.0的缓冲溶液处理, 干燥后点上发酵液样品, 用水饱和的乙酸乙酯溶剂进行上行展层, 之后将滤纸条晾干进行生物显影。
1.8.2捷克八溶剂系统纸层析(周德庆, 1980) 取8条滤纸条(10mm×160mm), 点样后分别在8种展层溶剂中层析, 5% Na2SO4处理, 晾干后进行生物显影。捷克八溶剂系统编号如下：1号水饱和的正丁醇; 2号水饱和的正丁醇, 内含2%对甲基苯磺酸; 3号正丁醇 : 乙酸 : 水= 2 : 1 : 1; 4号水饱和的正丁醇, 内含2%六氢吡啶; 5号正丁醇饱和的0.5mol/L磷酸缓冲溶液(pH 7.0); 6号正丁醇饱和的水, 内含2%对甲基苯磺酸; 7号苯 : 甲醇 = 4 : 1, 所用滤纸先用0.5mol/L磷酸缓冲溶液(pH 7.0)处理后晾干; 8号甲醇：水(内含3% NaCl) = 3 : 1。
2结果与分析
2.1菌株鉴定
2.1.1形态特征在改良高氏一号培养基上, XS904菌株生长良好, 菌落表面呈粉绒状凸起, 并带
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有明显褶皱; 菌落最初为白色, 随后慢慢变成灰色或灰白色。该菌株气生菌丝发育良好, 成熟后生成孢子丝, 孢子丝直至螺旋状; 基内菌丝丰富, 多分支, 不断裂(图1)。电镜扫描结果显示XS904菌株孢子链长, 分化为孢子, 孢子圆形至卵圆形, 表面有粗刺(图2)。
图1 菌株XS904的光学显微镜照片(400×)
Fig.1 Optical micrograph (400×) of strain XS904
图2 菌株XS904的扫描电镜图
Fig.2 Scanning electron micrograph of strain XS904
2.1.2培养特征利用不同的培养基培养, XS904菌株除在酪氨酸琼脂培养基上长势一般外, 大部分合成培养基上生长良好。XS904菌株均不产生可溶性色素, 所产的气生菌丝与基内菌丝的颜色不同, 具体结果见表1。
2.1.3生理生化特性XS904菌株能使明胶液化、淀粉水解、纤维素水解、牛奶凝固而不胨化; 不产生硫化氢、不还原硝酸盐; 可利用葡萄糖、果糖、木糖、甘露糖、肌醇、蔗糖、甘油、半乳糖作为碳源生长, 不能利用鼠李糖、棉子糖、阿拉伯糖、天冬氨酸。
2.1.4 16S rDNA全序列的相似性比较和系统发育分析菌株XS904的16S rDNA序列长度为1490bp,
表1菌株XS904的培养特征
Tab.1 The cultural characteristics of strain XS904 培养基生长情况气丝颜色基丝颜色
葡萄糖
酵母琼脂
好白色黄色伊莫松较好白色桔黄色酪氨酸琼脂一般灰白色乳白色
蔗糖察氏好橄榄绿色淡黄色
燕麦粉琼脂较好微绿灰乳白色
无机盐淀粉较好浅绿灰色乳白色
营养琼脂较好乳白色淡黄色NCBI的序列登记号为：DQ826592。将所测序列与GenBank数据库中的相关菌种进行比较, 构建以16S rDNA全序列为基础的系统发育树, 结果如图3所示。从系统进化树状图可以看出, XS904属于链霉菌科(Streptomycetaceae)的链霉菌属(Streptomyces)。由16S rDNA序列相似性分析结果看, XS904与其最近邻的链霉菌属灰浅红链霉菌(Streptomyces griseorubens)同源性为98.52%, 但两者在培养特征方面有一定的差异, XS904菌株的气生菌丝以灰白、灰绿为主, 基内菌丝以乳白、淡黄为主; 而灰浅红链霉菌的气生菌丝以烬灰色为主, 基内菌丝以褐粉色为主。一般情况下, 16S rDNA序列同源性为98%以上的可以认为是新菌株, 96%—97%的可以认为是新种, 93%—95%的可以认为是新属(任世英等, 2006), 综合形态学特征、培养特征、生理生化特征等在内的多相分类结果, 认为XS904菌株为链霉菌属灰浅红链霉菌的变种。
2.2XS904菌株发酵液抗菌谱
滤纸片法结果显示XS904菌株发酵液对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌有很显著的抑制作用, 抑菌圈直径均达到20mm以上, 抑菌圈边缘清晰; 但对大肠杆菌、根霉、青霉、曲霉、啤酒酵母没有抑菌效果。进一步采用管碟法和抑制菌丝生长速率(刘姝等, 2007)法进行测定, 发现XS904发酵液对大肠杆菌和根霉等真菌仍没有明显抑菌效果。说明发酵液中活性物质主要对革兰氏阳性细菌有抑菌作用, 为一类抗革兰氏阳性菌抗生素, 因此选择金黄色葡萄球菌作为下一步实验的指示菌。
2.3XS904菌株发酵液最小抑菌浓度
原发酵液倍比稀释后得到一系列不同浓度的发酵液, 采用滤纸片法测定不同浓度发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果, 结果见表2。
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图3 依据16S rDNA 序列同源性构建的XS904与相关菌株系统进化树
Fig.3 Phylogenetic tree of XS904 and its related strains, based on 16S rDNA sequence of homology
表2 不同浓度发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌作用
Tab.2 The antibacterial activity of different metabolite concentrations against Staphylococcus aureus
发酵液浓度(%)
100 50 25 12.5 6.25 3.13 1.56 0.78 0.39
抑菌圈直径(mm) 21.99±0.50 20.00±0.49 17.02±0.4514.89±0.3512.73±0.4410.95±0.498.66±0.30 7.25±0.19
6.00±0.00
从表2可知, XS904发酵液对金黄色葡萄球菌的抑制作用随着发酵液浓度的降低而逐渐减弱; 当发酵液浓度为0.78%时, 对金黄色葡萄球菌仍具有抑菌效果; 但稀释至0.39%时, 无抑菌圈。因此发酵液对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为原发酵液浓度的0.78%, 即对发酵液进行了128倍稀释。
2.4 温度和pH 对XS904菌株发酵液抑菌活性的影响
由表3可以看出, 发酵液经不同温度(30—100℃)处理后, 其抑菌圈直径随处理温度上升呈现明显的下降趋势, 由30℃处理后的22.32mm 下降到100℃处理后的11.52mm, 说明发酵液中活性物质对温度的耐受性较弱。而经不同pH(3.0—10.0)处理后, 其抑菌圈直径变化幅度不大, 随处理pH 的上升略有下降, 表
明活性物质对pH 的耐受性较强; 相比之下, 在酸性条件下处理后发酵液的抑菌圈较大, 初步认为pH 对活性物质溶解性有影响。在酸性条件下, 活性物质以离子形式存在, 溶解性较强; 碱性条件时, 以分子形式存在, 溶解性降低, 由此推断活性物质可能是一类碱性抗生素。
2.5 XS904菌株发酵液抑菌活性物质的极性测定
由表4可见, 发酵液用等倍体积的三氯甲烷、乙酸乙酯处理后, 抑菌活性物质主要集中在三氯甲烷有机相和乙酸乙酯水相, 说明活性物质易溶于三氯甲烷, 不易溶于乙酸乙酯; 而石油醚处理后, 其有机相无抑菌性, 说明活性物质不溶于石油醚。结果表明XS904发酵液中的抑菌活性物质为一类中等极性的
表3 温度和pH 对XS904菌株发酵液抑菌活性的影响
Tab.3 The effect of temperature and pH on the antibacterial activity of XS904 strain metabolite
处理温度(℃)
30 40 50 60 70 80 90 100
抑菌圈直径(mm) 22.32±0.59
21.25±0.46 21.00±0.53
17.98±0.43
15.01±0.68
14.10±0.36 13.87±0.27 11.52±0.21
处理pH
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0 10.0
抑菌圈直径(mm) 23.15±0.46
23.32±0.73 22.76±0.54
21.68±0.39
20.13±0.28
20.06±0.61 19.88±0.52 19.45±0.71
5期杨文鸽等: 海洋放线菌XS904分类鉴定及其发酵液抑菌活性的研究 473
抗生素。
2.6XS904菌株发酵液抑菌活性物质的纸层析
XS904菌株所产活性物质的pH纸层析结果见表5。抑菌活性物质的迁移率(rate of flow, Rf)值随着pH 的增大而上升, 最大值在碱性部分。参照经典的各类抗生素纸色谱图, 初步推定XS904菌株所产的活性物质为一种碱性抗素, 这与pH对发酵液抑菌活性的影响分析结果一致。
XS904菌株所产的抑菌活性物质在捷克八溶剂系统中的纸层析结果如表6, 活性物质在8种展层溶剂系统中均有较大的Rf值, 并且Rf值呈现出中间高两端略有下降的趋势。参照经典的各类抗生素纸色谱图(周德庆, 1980), 发现其与典型的六大类抗生素差别较大, 具体为何种抗生素有待于进一步研究。
表4有机溶剂萃取XS904发酵液的抑菌活性物质
Tab.4 Extraction of active substance in XS904 strain metabolite with different organic solvents
氯仿乙酸乙酯石油醚有机溶剂
水相有机相水相有机相水相有机相
抑菌圈直径(mm) 12.83±0.42 23.45±0.69 22.73±0.51 12.10±0.39 21.65±0.48 6.00±0.00
表5XS904菌株发酵液抑菌活性物质的pH纸层析结果
Tab.5 pH paper chromatography of antibacterial substance in XS904 strain metabolite
pH 2.2 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 Rf0.02±0.00 0.02±0.00 0.06±0.00 0.21±0.020.52±0.040.98±0.020.97±0.00 0.93±0.05 0.95±0.00
表6XS904菌株发酵液抑菌活性物质的捷克八溶剂系统层析结果
Tab.6 Jack's Eight Solvent System chromatography of antibacterial substance in XS904 strain metabolite
溶剂号 1 2 3 4 5 6 7 8 Rf0.70±0.04 0.76±0.04 0.82±0.030.85±0.030.81±0.040.84±0.02 0.84±0.03 0.63±0.03
3结语
从天然资源中寻找活性物质代替化学农药和使用天然抗菌化合物保护作物已成为当前研究的重点。放线菌资源在天然资源中占相当大的比例, 其活性产物抗生素是微生物农药的重要来源之一。本实验室以从宁波海域滩涂泥样分离得到的链霉菌XS904为研究对象, 经菌种鉴定, 包括形态和培养特征、生理生化试验以及16S rDNA序列的同源性比较, 初步判定XS904为灰浅红链霉菌的变种; 其发酵液对革兰氏阳性细菌具有显著的抑制作用, 纸层析鉴定抑菌活性物质是一类中等极性的碱性抗生素, 为进一步分离提纯及结构鉴定提供了参考。
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IDENTIFICATION OF MARINE ACTINOMYCES XS904 AND THE ANTIMICROBIAL
ACTIVITY OF ITS METABOLITE
YANG Wen-Ge1, LOU Qiao-Ming2, XU Da-Lun1, SUN Ai-Fei1, PAN Yun-Di3
(1. Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology, Ministry of Education, Faculty of Life Science and Biotechnology, Ningbo
University, Ningbo, 315211; 2. College of Food Science and Technology, Ocean University of China, Qingdao, 266003;
3. Ningbo Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Ningbo, 315012)
Abstract In searching for natural antibiotic resources, an actinomyces strain XS904 was discovered from marine mud flats in Ningbo, China. Based on the results of morphological, physiological-biochemical characteristics and 16S rDNA analysis, strain XS904 was identified as a variable species of Streptomyces griseorubens. Strain XS904 grew well on most tested media, producing abundant aerial and vegetative hyphae. However, the strain did not excrete dissoluble pigments. The spore chains of the strain XS904 were long-spiral, and the surface of spores was thorny and rugose. The vegetative hyphae had many branches without fragmentation. The metabolite of strain XS904 showed a strong inhibition against Gram-positive bacteria. The minimum inhibitory concentration of metabolite against Staphylococcus aureus was 0.78%. The results of Jack’s eight solvent system chromatography and pH paper chromatography of the fermentation extracts from strain XS904 showed that the main active components was a type of basic antibiotic. It has medium polarity, sensitive to temperature, and stable under acid and neural conditions but easily dissolved in chloroform.
Key words Marine actinomyces, XS904, Classification and identification, Metabolite, Antimicrobial activity
放线菌
土壤中放线菌的提取与分离 环境科学与工程学院 环工13实验班杨健3130206323 【摘要】:放线菌是一类主要呈菌丝状生长和以孢子繁殖的陆生性较强大的原 核生物。因在固体培养基上呈辐射状生长而得名。大多数有发达的分枝菌丝。菌丝纤细，宽度近于杆状细菌，约0.5～1微米。可分为：营养菌丝，又称基质菌丝，主要功能是吸收营养物质，有的可产生不同的色素，是菌种鉴定的重要依据；气生菌丝，叠生于营养菌丝上，又称二级菌丝。放线菌[1] 是一群革兰氏阳性、含量( >55% ) 的细菌。放线菌因菌落呈放线状而的得名。它是一个原核生物类群，在自然界中分布很广，主要以孢子繁殖，其次是断裂生殖。与一般细菌一样，多为腐生，少数寄生。从土壤中提取放线菌主要用高氏一号培养基进行培养。 【关键词】：原核微生物，高氏一号，革兰氏阳性，孢子等。 【Abstrat】：Actinomycetes is a kind of main assumes the hypha growth and to spore reproductive land was more powerful prokaryotes. Named after the deep in radiating growth on solid medium. Most have developed branch hyphae. Hyphae slender, width to rod-shaped bacteria, about 0.5 ~ 1 micron. Can be divided into: vegetative hyphae, also known as the substrate mycelium, main function is to absorb nutrients, some can produce different colors, is important basis of species identification; Aerial hyphae, fold, was born in the vegetative hyphae, also known as secondary hyphae. Actinomycetes [1] is a group of gram positive bacteria, content (> 55%). Actinomycetes by colony is put a line of its name. It is a prokaryotic organisms, is widely distributed in nature, mainly by spore reproduction, followed by rupture of reproduction. As the common bacteria, and more for saprophytic, a few stray. Extracted from the soil actinomycetes mainly use high's number one medium for culture. 【Key words】: procaryote microbiology, coates, number one gram positive, spores, etc. 引言 放线菌在自然界分布广泛，主要以孢子或菌丝状态存在于土壤、空气和水中，尤其是含水量低、有机物丰富、呈中性或微碱性的土壤中数量最多。放线菌只是形态上的分类，属于细菌界放线菌门。土壤特有的泥腥味，主要是放线菌的代谢产物所致。本次实验所取的放线菌都来自于土壤,用高氏一号培养基进行对土壤放线菌的分离和培养。一、高氏一号合成培养基的制备
放线菌分类-完整
一、酸微菌亚纲(Acidimicrobidae) 1 酸微菌目(Acidimicrobiales) 酸微菌亚目(Acidimicrobineae) 酸微菌科(Acidimicrobiaceae) 酸微菌属(Acidimicrobium) 典型种：氧化亚铁微酸菌（Acdimicrobium ferrooxidans） 二、红色杆菌亚纲(Rubrobacteridae) 1 红色杆菌目(Rubrobacterales) 红色杆菌亚目(Rubrobacterineae) 红色杆菌科(Rubrobacteraceae) 红色杆菌属(Rubrobacter) 2 土壤红杆菌目（Solirubrobacterales） 土壤红杆菌科（Solirubrobacteraceae） 扩展杆菌科（Patulibacteraceae） 康奈斯氏杆菌科（Conexibacteraceae）
康奈斯氏杆菌属(Conexibacter) 3 嗜热油菌目（Thermoleophilales） 嗜热油菌科（Thermoleophilacceae） 嗜热油菌属（Thermoleophilum） 三、红蝽杆菌亚纲（Coriobacteride） 1 红蝽杆菌目（Coriobacteriales） 红蝽杆菌科（Coriobacteriaceae） 红蝽杆菌属（Coriobacterium） 阿托波菌属（Atopobium） 扣林氏菌属（Collinsella） 神秘杆菌属(Cryptobacterium) 反硝化杆菌属(Denitrobacterium) 伊格尔兹氏菌属(Eggerthella) 欧陆森氏菌属(Olsenella) 斯莱克氏菌属(Slackia) 非消化糖杆菌属(Asccharobacter） 肠杆菌属（Enterorhabdus） 戈登氏杆菌属（Gordonibacter） 类伊格尔兹氏菌属（Paraeggerthella） 四、腈基降解菌亚纲（Nitriliruptoride）
实验十二___土壤中产抗生素放线菌的分离纯化
实验十二土壤中产抗生素放线菌的分离纯化 实验目的： 1、从土壤中分离产抗生素的放线菌。 2、抗生素产生菌的抗菌谱测定。 3、掌握微生物的基本操作。 实验原理： 放线菌是一类呈菌丝状生长，主要以孢子繁殖，革兰染色为阳性的单细胞原核微生物，是细菌中的一种特殊类型。放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，目前广泛应用的抗生素约70%是各种放线菌所产生。 许多临床应用的抗生素均由土壤中分离的放线菌产生。微生物大量存在与土壤中，其中包括细菌、放线菌和真菌等，采用选择性培养基可分离土壤中的放线菌。产抗生素的放线菌经液体培养后，其分泌的抗生素存在于离心所得的上清液中，可采用微生物的抑菌试验进行检测，从而筛选到所需的抗生素产生菌。 实验材料： 1、土壤菜园土。 2、实验菌金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的8h培养物。 3、培养基淀粉琼脂和淀粉液体培养基。 4、其它 10％的酚、牛津杯、灭菌生理盐水、接种环、无菌涂棒、酒精灯、无菌吸管等。 实验方法： 一、土壤中放线菌的分离 1、配制淀粉培养基 配方一淀粉琼脂培养基（高氏培养基） 可溶性淀粉 2克；硝酸钾 0.1克；磷酸氢二钾 0.05克；氯化钠 0.05克；硫酸镁 0.05克；硫酸亚铁 0.001克；琼脂 2克水 100毫升先把淀粉放在烧杯里，用5毫升水调成糊状后，倒入95毫升水，搅匀后加入其他药品，使它溶解。加热到煮沸时加入琼脂，不停搅拌，待琼脂完全溶解后，补足失水。调整pH值到7.2～7.4，分装后灭菌，备用。 配方二面粉琼脂培养基 面粉 60克；琼脂 20克；水 1000毫升 把面粉用水调成糊状，加水到500毫升，放在文火上煮30分钟。另取500毫升水，放入琼脂，加热煮沸到溶解后，把两液调匀，补充水分，调整pH值到7.4，分装，灭菌，备用。 2、土壤悬液梯度稀释 （1）将5.0g土壤加入到50ml灭菌的生理盐水中，震荡10min制备土壤悬液。（2）用无菌吸管吸取1ml土壤悬液，加入到9ml灭菌的生理盐水中10倍稀释。
(新)放线菌抗生素的发酵及目的产物的提取实验报告
放线菌抗生素的发酵及目的产物的提取 一、实验目的 1、熟悉掌握土壤中分离抗生素及培养方法 2、了解和掌握种子制备和摇瓶发酵技术和方法 3、了解抗生素发酵的一般规律和代谢调控理论 4、了解小型发酵罐的基本结构 5、熟悉掌握小型发酵罐的使用方法和保养 6.掌握抗生素生物效价测定的原理和方法； 7. 掌握管碟法测定抗生素生物效价相关的操作方法。 8.掌握放线菌次级代谢物的初步纯化及牛津杯实验的基 本原理和操作技术 二、实验原理 ①发酵罐是进行液体发酵的特殊设备。生产上使用的发酵罐容积大，均用钢板或不锈钢板制成；供实验室使用的小型发酵罐，其容积可从约lL至数百升或稍大些。一般来说，5L以下是用耐压玻璃制作罐体，5L以上用不锈钢板或钢板制作罐体。发酵罐配备有控制器和各种电极，可以自动地调控试验所需要的培养条件，是微生物学、遗传工程、医药工业等科学研究所必需的设备。 ②抗生素（antibiotics）是由微生物（包括细菌、真菌、放线
菌属）或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。现临床常用的抗生素有转基因工程菌培养液液中提取物以及用化学方法合成或半合成的化合物。 ③放线菌发酵结束后，次级代谢物可能与菌体结合，工业上常采用草酸或磷酸等酸化剂处理，释放与菌体结合的次级代谢物，并采用加热发酵液70 ℃，2 min使蛋白凝固，所得酸性滤液，在经碱处理，进一步去除蛋白。 抗生素的效价常采用微生物学方法测定，它是利用抗生素对特定的微生物具有抗菌活性的原理来测定抗生素效价的方法，如管碟法。管碟法是目前抗生素效价测定的国际通用方法，我国药典也采用此法。管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价。管碟法的基本原理是在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管（内径6.0±0.l mm，外径8.0±0.l mm，高10±0. lmm），管内放人标准品和检品的溶液，经16~18小时恒温培养，当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈。根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系，比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价。
放线菌的分离与筛选方法
放线菌的分离与筛选方法放线菌介于细菌和丝状真菌的一类丝状原核生物，多为腐生，少数寄生。腐生型在自然界物质循环中起着重要作用。放线菌突出特性产生抗菌素，常以孢子或菌丝状态存在，以土壤最多，常存在肥土农田土中性或偏碱性土壤中。 1.拮抗放线菌的筛选方法： 1.1平板划线法： 待测菌株与检测病原菌通用培养基制成平板，在平板中央划线接种待测菌株，28-30℃ 3-5d，将病原菌垂直方向划线于待测菌生长线的两侧，不能与待测菌相连，在37℃ 24h取出观察。如果待测菌株对病原菌有抑制活性，病原菌靠近待测菌的一端生长会受到待测菌抑制产生抑菌带。可根据抑菌带的长短来判断待测菌活性强弱。选择抑制活性强的复筛。 1.2抑菌圈法或十字交叉法：常用的初筛方法 将待测菌接种于平板，长出成熟菌落后，用打孔器将供试病原菌苔打成直径5-6mm小菌块，并将其移入到病原菌平板培养基中，将待测菌与病原菌呈十字交叉排列，即病原菌在中央，待测菌置于病原菌的四周，培养3-4d。若有抑菌活性在待测菌周围形成一个没有生长病原菌抑菌圈。若菌块厚度大小一致的，抑菌圈的大小可直观反应待测菌抑菌活性的强弱。 1.3纸片法或生长速率法： 主要测定发酵液的抑菌活性，即将相同灭菌后的圆形滤纸片放于待测
发酵液中，取出并黏贴在接种有病原菌的平板培养基，培养后观察有 无抑菌圈或抑菌圈的大小。 2.放线菌分离与筛选. 2.1培养基； 2.1.1改良高1号：可溶性淀粉20g/L KH2PO40.5g/L NaC10.5g/L MgSO40.2-0.5g/L KNO3 1g/L FeSO40.01g/L 重铬酸钾（3%） 3.3mL/L PH7.2-7.4（分离保存用）每100ml培养基加入1ml0.1℅的FeSO4溶液。 2.1.2淀粉培养基和秸秆腐解物培养基 2.1.3拮抗试验培养基：高1号牛蛋 PDA改良培养基加3g牛肉膏2.2抑菌剂的选择：有效降低细菌真菌的数量，细菌扩散真菌蔓延速 度迅速。 重铬酸钾50-75ug/ml(150ug/ml为宜)或另添加1-2ug/ml青霉素，可 显著抑制细菌和真菌生长，不影响放线菌的数量和种类。 2.3靶标菌：枯草杆菌大肠杆菌金黄葡萄球菌八联球菌变形 杆菌 2.4放线菌分离与筛选 2.4.1传统的分离筛选思路； 以对某些如病原菌或杂草，昆虫为靶标的抑制和杀灭效果为标准筛选 产生活性物质的放线菌，即筛选拮抗放线菌。 初筛：将分离得到菌株进行真对靶标抑制活性筛选。 优点：较早知道是否筛选到拮抗菌株，筛选范围广。缺点：方法粗放，
简化版第3章-信号的分类与描述
第3章 信号的描述方法
3.1 信号的分类 3.2 信号的时域描述 3.3信号的频域描述 3.4 随机信号的描述
在工程和科学研究中，经常要对许多客观存在的物体 或物理过程进行观测，就是为了获取有关研究对象状态 与运动等特征方面的信息。
被研究对象的信息量往往是非常丰富的，测试工作是按 一定的目的和要求，获取信号中感兴趣的、有限的某些特 定信息，而不是全部信息。
为了达到测试目的，需要研究信号的各种描述方式， 本章介绍信号基本的时域和频域描述方法。
3.1 信号的分类
信号按数学关系、取值特征、能量功率等，可以分为： 确定性信号和非确定性信号 连续信号和离散信号 能量信号和功率信号
3.1.1 分类方法一：确定性信号和随机信号
1.确定性信号：能用明确的数学关系式或图像表达
的信号称为确定性信号。
x(t)
m
A
x(t)
k
0
t
0
x (t ) A cos(
k m
t
0
)
u周期信号：经过一段时间间隔重复出现的信号，无
始无终（时域无穷）。典型的如正（余）弦信号。
数学表达：
x(t) x(t nT0 )
(n 1, 2, )
T0 = 2 / 0 =1/ f0 (0 k / m)
周期：满足上式的最小T 值。
频率：周期的倒数，f = 1/T，单位：（Hz 赫兹）
圆频率/角频率：频率乘以2 f, 即 =2 f =2 /T
实际应用中，n 通常取为正整数。
放线菌属的分类及描述
放线菌手册汇编 放线菌科概述Actinomycetaceae 描述：放线菌科是由Buchanan 在1918年创立的该科的一般特征是：革兰氏染色阳性，分支，偏直条状，大多数成员是属于球杆状或者类球形。细胞长度一般小于0.5μm,平均长度在1.7μm 到2,9μm 之间。群落可能形成丝状体形成类似菌丝体的外形，但是大多数菌落不分枝，而且主要是白色或者灰色，有一些特殊的菌 落会形成深红色、淡红色、棕色、 粉色、淡粉或淡黄色。 现在该科根据16s RNA 的核酸序 列划分出包括五个不同的属： Actinomyces,Actionobaculum,Arca nobacterium,Aobiluncus,Aaribacul um. 放线霉菌属Actinomyces 该属包括的种有 A. bovis A. bowdenii A. canis A. cardiffensis A. catuli A. coleocanis A. dentalis A. denticolens A. europaeus Figure 1Scanning electron micrograph of Actinomyces israelii
A. funkei A. georgiae A. gerencseriae A. graevenitzii A. hongkongensis A. hordeovulneris A. howellii A. humiferus A. hyovaginalis A. israelii A. marimammalium A. meyeri A. naeslundii A. nasicola A. neuii A. odontolyticus A. oricola A. radicidentis A. radingae A. slackii A. streptomycini A. suimastitidis A. suis A. turicensis A. urogenitalis A. vaccimaxillae A. viscosus 一、Actinomyces bovis Actinomyces bovis is a gram-positive, rod-shaped bacterium of the genus Actinomyces. It is the causative agent of Lumpy jaw in cattle, and occasionally causes infections in humans History Actinomyces bovis was first described in 1877 by C. O. Harz, as a microbe within the jaw tissue of cows with lumpy jaw. It was thought to be identical to Actinomyces israelii until 1940, when D. Erikson showed these to be two separate organisms.
放线菌抗生素的发酵及目的产物的提取实验报告
放线菌抗生素得发酵及目得产物得提取 一、实验目得 1、熟悉掌握土壤中分离抗生素及培养方法 2、了解与掌握种子制备与摇瓶发酵技术与方法 3、了解抗生素发酵得一般规律与代谢调控理论 ４、了解小型发酵罐得基本结构 ５、熟悉掌握小型发酵罐得使用方法与保养 6。掌握抗生素生物效价测定得原理与方法; 7. 掌握管碟法测定抗生素生物效价相关得操作方法、 8、掌握放线菌次级代谢物得初步纯化及牛津杯实验得基本原理与操作技术 二、实验原理 ①发酵罐就是进行液体发酵得特殊设备。生产上使用得发酵罐容积大,均用钢板或不锈钢板制成;供实验室使用得小型发酵罐,其容积可从约lＬ至数百升或稍大些。一般来说,5L以下就是用耐压玻璃制作罐体,5L以上用不锈钢板或钢板制作罐体。发酵罐配备有控制器与各种电极,可以自动地调控试验所需要得培养条件,就是微生物学、遗传工程、医药工业等科学研究所必需得设备、 ②抗生素(antibｉotics)就是由微生物(包括细菌、真菌、放线菌属)或高等动植物在生活过程中所产生得具有抗病原体或其它活性得一类次级代谢产物,能干扰其她生活细胞发育功能得化学物质。现临床常用得抗生素有转基因工程菌培养液液中提取物以及用化学
方法合成或半合成得化合物。 ③放线菌发酵结束后,次级代谢物可能与菌体结合,工业上常采用草酸或磷酸等酸化剂处理,释放与菌体结合得次级代谢物,并采用加热发酵液７0 ℃,2 min使蛋白凝固,所得酸性滤液,在经碱处理,进一步去除蛋白、 抗生素得效价常采用微生物学方法测定,它就是利用抗生素对特定得微生物具有抗菌活性得原理来测定抗生素效价得方法,如管碟法。管碟法就是目前抗生素效价测定得国际通用方法,我国药典也采用此法。管碟法就是根据抗生素在琼脂平板培养基中得扩散渗透作用,比较标准品与检品两者对试验菌得抑菌圈大小来测定供试品得效价。管碟法得基本原理就是在含有高度敏感性试验菌得琼脂平板上放置小钢管(内径6。０±0、ｌ mm,外径8、0±０。ｌ mm,高10±０。ｌｍｍ),管内放人标准品与检品得溶液,经16～１8小时恒温培养,当抗生素在菌层培养基中扩散时,会形成抗生素浓度由高到低得自然梯度,即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此,当抗生素浓度达到或高于MIＣ(最低抑制浓度)时,试验菌就被抑制而不能繁殖,从而呈现透明得无菌生长得区域,常呈圆形,称为抑菌圈。根据扩散定律得推导,抗生素总量得对数值与抑菌圈直径得平方成线性关系,比较抗生素标准品与检品得抑菌圈大小,可计算出抗生素得效价、 常用得管碟法有:一剂量法、二剂量法、三剂量法。后二法已经列入药典。二剂量法系将抗生素标准品与供试品各稀释成一定浓度比例(2:1或4:１)得两种溶液,在同一平板上比较其抗药活性,再根据
放线菌抑菌圈实验
放线菌主要分布在土壤中（主要是链霉菌），其数量仅次于细菌。一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 仪器 本项目研究所用主要仪器为：高压蒸汽灭菌锅，生化培养箱，分析天平，电热恒温鼓风干燥箱，微波炉，空气恒温震荡器。 1.1.2 试剂 NaOH，乙醇，10%酚等。 1.1.3 菌种 本实验所用指示菌为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)。 1.1.4 培养基 （1）高氏I号培养基（g/L）[3]：可溶性淀粉 20；NaCl 0.5；KNO3 1；K2HPO4?3H2O 0.5；MgSO4?7H2O 0,01；FeSO4?7H2O 0.5；琼脂粉15-25，加去离子水至1L, pH7.4-7.6。121℃,灭菌20min。 （2）牛肉膏-蛋白胨培养基（g/L）[3]：牛肉膏3；蛋白胨10；NaCl5；琼脂粉15-20，加去离子水至1L,pH7.0-7.2。121℃,灭菌20min。 （3）发酵培养基（g/L）[4]：蔗糖45；黄豆粉25；KH2PO4 0.2；NaCl 1；NaSO4 0.1；FeSO40.01；CaCO3 3；加去离子水至1L，pH7.2。121℃，灭菌 20min。 1.2 方法 1.2.1采土样 选取有机质丰富、通气性良好的、偏碱性的土壤，（pH 7.0-7.5）。用小产挖取地表下5-25cm 的土壤5g。
1.2.2放线菌的筛选 （1）土壤悬浊液梯度稀释：将5.0g土壤加入到50ml无菌水中，震荡10min制备土壤悬液；用无菌吸管吸取1ml土壤悬液，加入到9ml无菌水中作10倍稀释；按1:10稀释至10-3、10-4、10-5 [3]。 （2）倒平板：取6套无菌平皿，在皿底贴上标签，注明土壤稀释液的稀释度（10-3、10-4、10-5，每个稀释度做两个培养皿）。然后在融化并冷却至50℃左右的高氏I号培养基加入10％的酚数滴，混合均匀；在每个培养皿中倒15-20ml左右，待冷凝备用[3]。 （3）涂布：用1ml无菌吸管分别精确地吸取10-3、10-4、10-5的稀释菌液1ml，对号放入编好号的无菌培养皿中，每一浓度对应两个平板。用无菌涂布棒（从浓度小的开始）将加入平板培养基上的土壤稀释液在整个平板表面涂匀 [3]。 （4）培养：接种完毕，将平皿放入28℃培养箱中培养7天，观察平皿上放线菌菌落生长情况[3]。 （5）平板划线分离纯化：挑取培养7天后的平皿上的单个放线菌菌落，在淀粉琼脂平皿上进行三区划线法一次分离纯化，28℃培养7天。若不纯，则如上方法进一步分离纯化，直至纯培养为止，并观察放线菌菌落特征[3,4]。 1.2.3 鉴定菌种 制作装片，镜检，观察菌落特征，判断是否属于放线菌。 1.2.4产抗生素放线菌的筛选 （1）初筛：配制高氏I号液体培养基，分装于8个250mL的三角烧瓶中，每瓶50ml；鉴定出的菌株接种于高氏I号液体培养基中，于28℃，160r/min振荡培养7天。 （2）抑菌实验：配制牛肉膏蛋白胨培养基，分别倒15ml于12个培养皿中，冷却后作下层平板，将三种指示菌菌悬液和牛肉膏-蛋白胨培养液混匀后倒上层平板，并在其上放入牛津杯，在牛津杯中分别加入经离心（4000rmp，15min）的供试菌培养液0.1ml，于28℃培养24小时，观察抑菌圈情况，并测量其直径[5.6]。 （3）复筛：配制发酵培养基，分装于6个250ml三角烧瓶中。将初筛到的放线菌培养液以6%的接种量转接入装有50ml初始发酵培养基的250ml三角摇瓶中，于28℃，160r/min培养4天【5】，得发酵液。
土壤中放线菌的筛选即其抗菌谱的测定实验论文
实验论文 土壤中产抗生素放线菌的筛选及抗菌谱的测定作者：天奇666666 2017 年06 月
目录 摘要 (3) 1、引言 (4) 2、实验材料与方法 (4) 2.1材料 (4) 2.1.1 土壤样品 (4) 2.1.2 培养基 (4) 2.2 实验方法及步骤 (5) 2.2.1 放线菌的分离及最佳土壤稀释浓度的选择 (5) 2.2.2放线菌纯化培养 (5) 2.2.3 保存备用菌株 (5) 2.2.4 供试菌液配置 (5) 2.2.5进行拮抗试验 (5) 3、实验结果与分析 (6) 3.1实验结果表（表二） (6) 3.2实验照片 (6) 3.3实验结果分析 (7) 4、结论与讨论 (7) 4.1结论 (7) 4.2讨论 (7) 5、参考文献 (8)
摘要 本次实验选取了学校八个采样点进行采样，通过土壤悬液稀释进行固体培养基涂布培养，分离纯化出对其他微生物有拮抗作用的放线菌，使用牛肉膏蛋白胨固体培养基和PDA培养基进行抗菌谱测定。本次实验以双管齐下的方式分别进行主实验与次实验，保证了实验重复性并极大节省了时间，实验过程分两批进行，主实验通过培养细菌与真菌菌液，涂布牛肉膏蛋白胨固体培养基平板分离出了五珠无拮抗作用的放线菌，次试验通过点接的PDA培养基的方式分离出一株对枯草芽孢杆菌有抗性而对黑曲霉有轻微抗性的放线菌菌珠。 关键词：土壤、放线菌、拮抗作用
1、引言 土壤----作为生物生存一种基本的资源，其中蕴藏着巨大的微生物资源，特 别是以能产生多样的次级代谢产物而著称的放线菌，研究土壤沉积微生物，不仅 可以发现新的放线菌资源，同时也可能发现新型活性产物，在医药、食品、化工、环保等行业意义巨大。 放线菌是具有巨大实用价值的一类微生物, 目前从微生物中发现的大约 8 000 种生物活性物质中, 近 70 % 是由放线菌产生的。放线菌是一群革兰氏阳性、高( G + C) mol% 含量( >55% ) 的细菌。放线菌因菌落呈放线状而的得名。它是 一个原核生物类群，在自然界中分布很广，主要以孢子繁殖，其次是断裂生殖。与一般细菌一样，多为腐生，少数寄生。 2、实验材料与方法 2.1材料 2.1.1 土壤样品 理工大西校区西门附近校区内随机取8个采样点,采样点的选择以农田土壤、经 常疏松的的种植土壤以及含有机质较为丰富的为主。 2.1.2 培养基 高氏合成一号培养基：溶液与试剂、可溶性淀粉、NaCI、KNO3 、K2 HPO4 3H2 O MgSO4 ．7 H2 O 、FeSO4 ．7 H2 O，琼脂，1mol/LNaOH, 1mol/LHCI。 仪器与其他用具：试管，锥形瓶，烧杯，量筒，玻璃棒，培养基分装器，天平，高压蒸汽灭菌器，PH试纸，棉花，牛皮纸，麻绳，纱布等 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏、蛋白胨、NaCl PDA培养基：新鲜土豆；琼脂；葡萄糖、电磁炉；锅（带盖）；漏勺；刀、烧杯 纱布；玻璃棒；天平；称量纸；蒸馏水 2.1.3 供试菌种
放线菌
放线菌 放线菌是介于细菌与丝状真菌之间而又接近于细菌的一类丝状原核生物(有人认为它是细菌中的一类)，因菌落呈放射状而得名。1877年由合兹(Harz)首先发现一种寄生于牛体的厌气性牛型放线菌，从此便引用了Actinomyces这个属名，后来又发现了好气性腐生的种类，也叫放线菌。1984年，美国学者是瓦克斯曼(Waksman)把好气性腐生放线菌另立为链霉菌属，以与放线菌属相区别，而将厌气性寄生的种类仍保留原名--放线菌属(Actinomyces)。我国现在也采用此分类系统。苏联学者在拉西里尼科夫则将二者均归入放线菌属，这种系统只苏联和东欧一些国家采用。 放线菌多为腐生，少数寄生，与人类关系十分密切。腐生型在自然界物质循环中起着相当重要的作用，而寄生型可引起人、动物、植物的疾病。这些疾病可分为两大类，一类是放线菌病，由一些放线菌所引起，如马铃薯疮痂病、动物皮肤病、肺部感染、脑膜炎等；另一类为诺卡氏菌病，由诺卡氏菌引起的人畜疾病，如皮肤病、肺部感染、足菌病等。此外，放线菌具有特殊的土霉味，易使水和食品变味。有的能破坏棉毛织品、纸张等，给人类造成经济损失。只要掌握了有关放线菌的知识，充分了解其特性，就可控制、利用和改造它们，使之更好地为人类服务。 放线菌最突出的特性之一是能产生大量的、种类繁多的抗生素。人们在寻找、生产抗生素的过程中，逐步积累了有关放线菌的生态、形态、分类、生理特性及其代谢等方面的知识。据估计，全世界共发现4，000多种抗生素，其中绝大多数由放线菌产生。这是其他生物难以比拟的。抗生素是主要的化学疗剂，现在临床所用的抗生素种类占井冈霉素、庆丰霉素、我国用的菌肥"5406"也是由泾阳链霉菌制成；有的放线菌还用于生产维生素、酶制剂；此外，在甾体转化、石油脱蜡、烃类发酵、污水处理等方面也有应用。在理论研究中也有重要意义。因此，近30多年来，放线菌在微生物中特别受到重视。 一、放线菌的分布 放线菌常以孢子或菌丝状态极其广泛地存在于自然界。不论数量和种类，以土壤中最多。据测定，每克土壤可含数万乃至数百万个孢子，但受土壤性质、季节、作物种类等条件的影响。一般情况下，肥土较瘦土多，农田土比森林土多，中性或偏碱性土壤中也较多。土壤环境因子如有机质、水分、温度、通气状况等也影响其数量。它适宜在含水量较低的土壤内生长。而厩肥和堆肥中仅限于高温放线菌活动。放线菌所产生的代谢产物往往使土壤具有特殊的泥腥味。 河流和湖泊中，放线菌数量不多，大多为小单孢菌、游动放线菌和孢囊链霉菌，还有少数链霉菌。海洋中的放线菌多半来自土壤或生存在漂浮海面的藻体上。海水中还存在耐盐放线菌。 大气中也存在着大量的放线菌菌丝和孢子，它们并非原生的微生物区系，而是由于土壤、动植物、食品甚至衣物等表面均有大量的放线菌存在，由于它们耐干燥，常随尘埃、水滴，借助风力飞入大气所致。 食品上常常生长放线菌，尤其在比较干燥、温暖的条件下易于大量繁殖，使食品发出刺鼻的霉味。 健康动物，特别是反刍动物的肠道内有着大量的放线菌，它们可有是肠道内定居的微生物，堆肥中的高温放线菌可能来源于此。在动物和植物体表有大量的腐生性放线菌，偶尔也有寄生性放线菌存在。 了解放线菌的分布，对于进一步开发放线菌资源，发现和筛选新的抗生素，无疑是很重要的。
土壤中放线菌的采集、分离、培养、发酵及提取实验报告
土壤中放线菌的采集、分离、培养、发酵及提取 实验目的： 1、从土壤中分离产抗生素的放线菌 2、放线菌的培养 3、放线菌的发酵产生活性物质 4、放线菌产生的活性物质提取。 实验原理： 放线菌是一类呈菌丝状生长，主要以孢子繁殖。放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，目前广泛应用的抗生素约80%是各种放线菌所产生的。 许多临床应用的抗生素均由土壤中分离的放线菌产生。采用选择培养基可分离土壤中的放线菌。产抗生素的放线菌经液体培养后，其分泌的抗生素存在于离心所得的上清液中，可采用微生物的抑菌试验进行检测，从而筛选到所需的抗生素产生菌，并对其进一步培养，繁殖，发酵，最终提取我们所需的抗生素。 实验器材： 1、土壤 2、培养基：高氏一号培养基、种子培养基、发酵培养基 3、其他：重铬酸钾、培养皿、牛津杯、接种环、酒精灯，无菌涂棒、三角锥瓶、高压蒸汽灭菌锅、天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、试管、牛皮纸、线绳等。 实验步骤：
一、土壤放线菌株的采集 采集样品：选定取样点（最好是有机质含量高的菜地），按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等。 样品（土壤）处理：室温风干 二、土壤中放线菌的分离、培养 1、配制淀粉培养基 淀粉琼脂培养基（高氏培养基） 可溶性淀粉2g；硝酸钾0.1g；磷酸氢二钾0.05g；氯化钠0.05g；硫酸镁0.05g；硫酸亚铁0.001g；琼脂2g；水100ml. 先把淀粉放在烧杯里，用5ml水调成糊状后，倒入95ml水，搅匀后加入其他药品，使它溶解。加热到煮沸时加入琼脂，不停搅拌，待琼脂完全溶解后，补足失水。调整PH到7.2-7.4，分装后灭菌，备用。 2、土壤悬液梯度稀释 ①将5.0g土壤加入到50ml灭菌的生理盐水中，震荡10min制备土壤悬液。 ②用无菌吸管吸取1ml土壤悬液，加入到9ml灭菌的生理盐水中10倍稀释。 ③按1：:1稀释至10-3、10-4、10-5，将3块灭菌平板分别标记10-3、10-4、10-5 ，稀释过程应在无菌条件下进行。
主要的放线菌类型
主要的放线菌类型 放线菌是具有菌丝、以孢子进行繁殖、革兰氏染色阳性的一类原核微生物。因其具有分枝状菌丝、菌落形态与霉菌相似，过去曾认为放线菌是"介于细菌与真菌之间的微生物"。然而，用近代生物学技术所进行的研究结果表明，放线菌实际上是属于细菌范畴内的原核微生物，只不过其细胞形态为分枝状菌丝。从系统发育上看，放线菌（除高温放线菌外）与全部G+细菌一起同属于这一大分支中的高G+C/mol％（60-72）群。 多腔孢囊放线菌 这类放线菌包括嗜皮菌属、地嗜皮菌属和弗兰克氏菌属，其共同特征是：菌丝进行纵向和横向分裂，直接产生孢子，菌丝形成细胞群或孢子簇，细胞壁含有内消旋二氨基庚二酸(meso―Diaminopimelic acid,m―DAP)。嗜皮菌属（Dermatophilum）：菌丝在不同的平面上形成横隔，构成砖格状细胞堆，产生直角侧向分枝。寄生在哺乳动物体上，侵害未角质化的表皮，引起渗出性皮炎。弗兰克氏菌属（Frankia）：该属放线菌最显著的特征是能与非豆科木本植物共生固氮。在木麻黄和杨梅上可形成具有向上生长小根的根瘤；而在桤木、鼠李科和蔷薇科植物上形成的根瘤成簇，每簇由许多裂片状的小根瘤组成。在有隔、分枝的菌丝体顶端的泡囊柄上，形成泡囊，泡囊具有固氮功能。弗兰克氏菌属可利用的最适碳源是短链脂肪酸和有机酸，能利用吐温是该属独特的特征。 孢囊放线菌 这类放线菌以孢囊孢子进行繁殖为突出特征。孢子的分裂和排列方式用于区分不同的属。 （1）游动放线菌属（Actinoplanes） 孢囊球状、棒状或不规则状，产生圆形或近圆形具丛生鞭毛的游动孢子。多分布在腐烂植物和土壤中。 （2）指孢囊菌属（Dactylosporangium） 孢囊指状或棒状，其内可产生规则的球形孢子，排列成单一行列。16SrRNA 寡核苷酸编目表明该属在系统发育上与游动放线菌菌属、小单孢菌属的关系密切。 （3）游动单孢菌属（Planomonospora） 产生梭形、具周生鞭毛的游动孢子是该属的特征。多分布在温带和热带的土壤中。
细菌放线菌的观察与革兰氏染色实验报告
实验一：细菌、放线菌的形态 观察与革兰氏染色 姓名:陈虹邑 学号：200911233012 系别：生物科学与生物技术 班级：周二第一组 试验日期：2011年9月13日 同组成员：邢悦婷呼波
一、实验目的及意义 1、巩固油镜的使用; 2、掌握细菌形态观察的基本方法； 3、了解细菌的基本形态和结构。 4、了解革兰氏染色的原理； 5、初步掌握细菌涂片的方法； 6、掌握革兰氏染色的方法； 7、掌握放线菌的涂片方法； 8、观察基内菌丝、气生菌丝和孢子丝。 二、实验材料与方法 【实验材料】 菌种：溶血链球菌(Strptococcus haemolyticus),螺菌(Spirillum sp.) ,巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium), 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis), 普通变形菌(Proteus vulgaris), 丙酮丁酸梭菌(Clostridium acetotylicum), 褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum)等细菌永久装片，放线菌5406，金黄色葡萄球菌 （staphulococcus aureus），大肠杆菌（E. coli） 试剂：香柏油、无菌水、结晶紫、番红或沙黄、95%酒精、碘液 仪器及用具：显微镜、擦镜纸、吸水纸、小滴管，接种环、载玻片、盖玻片、酒精灯 【实验方法】 细菌的观察 1、在载玻片上滴一小滴水，用接种环，采用无菌操作，将细菌挑起，涂到载玻片 上，盖上盖玻片。 2、用显微镜对细菌进行活体观察。观察时先用低倍镜，再用高倍镜，有必要的话， 再用油镜观察。 3、观察细菌的永久装片，观察时先用低倍镜，再用高倍镜，有必要的话，再用油 镜观察，找到细菌的各种结构。
放线菌分类-完整讲课教案
放线菌分类-完整
放线菌分类 一、酸微菌亚纲(Acidimicrobidae) 1 酸微菌目(Acidimicrobiales) 酸微菌亚目(Acidimicrobineae) 酸微菌科(Acidimicrobiaceae) 酸微菌属(Acidimicrobium) 典型种：氧化亚铁微酸菌（Acdimicrobium ferrooxidans） 二、红色杆菌亚纲(Rubrobacteridae) 1 红色杆菌目(Rubrobacterales) 红色杆菌亚目(Rubrobacterineae) 红色杆菌科(Rubrobacteraceae) 红色杆菌属(Rubrobacter) 2 土壤红杆菌目（Solirubrobacterales） 土壤红杆菌科（Solirubrobacteraceae） 扩展杆菌科（Patulibacteraceae）
康奈斯氏杆菌科（Conexibacteraceae） 康奈斯氏杆菌属(Conexibacter) 3 嗜热油菌目（Thermoleophilales） 嗜热油菌科（Thermoleophilacceae） 嗜热油菌属（Thermoleophilum） 三、红蝽杆菌亚纲（Coriobacteride） 1 红蝽杆菌目（Coriobacteriales） 红蝽杆菌科（Coriobacteriaceae） 红蝽杆菌属（Coriobacterium） 阿托波菌属（Atopobium） 扣林氏菌属（Collinsella） 神秘杆菌属(Cryptobacterium) 反硝化杆菌属(Denitrobacterium) 伊格尔兹氏菌属(Eggerthella) 欧陆森氏菌属(Olsenella) 斯莱克氏菌属(Slackia) 非消化糖杆菌属(Asccharobacter） 肠杆菌属（Enterorhabdus） 戈登氏杆菌属（Gordonibacter） 类伊格尔兹氏菌属（Paraeggerthella）
放线菌形态及菌落特征的观察
实验三放线菌形态及菌落特征的观察 一、目的要求 掌握观察放线菌形态的基本方法，并观察放线菌的形态特征。 二、基本原理 和细菌的单染色一样，放线菌也可用石炭酸复红或碱性美蓝等染料着色后，在显微镜下观察其形态。放线菌的孢子丝形状和孢子排列情况是放线菌分类的重要依据，为了不打乱孢子的排列情况，常用印片染色法和胶带纸粘菌染色法进行制片观察。 放线菌是由不同长短的纤细的菌丝所形成的单细胞菌丝体。菌丝体分为两部分，即潜入培养基中的营养菌丝（或称基内菌丝）和生长在培养基表面的气生菌丝。有些气生菌丝分化成各种孢子丝，呈螺旋形、波浪形或分枝状等。孢子常呈圆形、椭圆形或杆形。气生菌丝及孢子的形状和颜色常作为分类的重要依据。 三、器材 1.活材料：放线菌培养物，酵母菌斜面培养物； 2.染色液：复红染色液（或结晶紫，美兰）； 3.器材：载玻片，胶带纸，小刀，接种环，吸水纸，擦镜纸，酒精灯，香柏油，乙醚-乙醇混合液，显微镜。 四、操作步骤 1．印片法：放线菌自然生长状态的观察 印片：取干净载玻片一块，用小刀切取放线菌培养体一块，放在载玻片上，用另一块载玻片对准菌块的气生菌丝轻轻按压，然后将载玻片垂直拿起。注意不要使培养体在玻片上滑动，否则会打乱孢子丝的自然形态； 微热固定：将印有放线菌的涂面朝上，通过酒精灯火焰2-3次加热固定； 染色:石炭酸复红染色1min； 水洗：水洗后晾干； 镜检：先用低倍镜后用高倍镜，最后用油镜观察孢子丝、孢子的形态及孢子排列情况。 2．胶带纸法 粘菌：用胶带纸在放线菌培养体上粘取菌体，注意，压取时从菌落边顺着菌体生长方向，避免从菌落上面压取，以免取得的全是孢子。 染色：将粘有菌体的胶带纸压在事先准备好的滴油染液的载玻片上。将多余染色液用滤纸吸掉。 镜检：同上。 五、实验报告 绘图说明你所观察到的放线菌的形态特征。
放线菌的抑菌试验
实验一放线菌的抑菌试验 一、实验目的 1、学习掌握放线菌所产抗生素抗菌谱的测定方法 2、掌握牛津杯法检测抗生素的原理及基本操作 3、掌握微生物实验的基本生物技术，无菌操作技术，培养基无 菌化处理（高温灭菌）、菌种纯化分离技术及纯种培养技术 等。 4、熟悉掌握高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、离心机等器材的使 用方法。 5、熟悉各种合成培养基的制备方法，熟练掌握涂平板、在培养 基接种等基本操作步骤。 二、实验原理 放线菌是重要的抗生素产生菌，放线菌所产生得抗生素，能抑制多种细菌的生长，故可用金黄色葡萄球菌（G+）和大 肠杆菌（G-）作指示菌鉴别放线菌，采用牛津杯法检测其所产 抗生素的抑菌活性大小。 三、实验材料及用具 1、菌种：A 放线菌，实验室老师给提供菌种 B指示菌，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌 2、用具：试管，平皿，涂棒，牛津杯，玻璃棒，高压蒸汽锅， 恒温摇床，恒温培养箱，镊子，移液器，超净工作台 四、培养基 1、高氏一号培养基：K2HPO4﹒3H2O 0.5g，可溶性淀粉 20g，KNO4 1g, MgSO4﹒7H2O 0.5g，FeSO4﹒7H2O 0.1g， NaCl 0.5g，H2O 1000ml。 2、种子培养基：葡萄糖5g，淀粉1.5g，酵母粉2.5g，CaC l2 0.1g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4﹒7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4﹒7H2O 0.01g，H2O 1000ml，pH 7.2-7.4 3、发酵培养基：黄豆饼粉 10.0g，淀粉30g，葡萄糖 50g， 酵母粉5g，玉米浆 15g，CaCl2 3.0g，H2O 1000ml，pH 7.0 4、LB培养基（液体）：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g， H2O 1000ml，pH 7.0 5、LB培养基（固体）：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g， 琼脂 16g，H2O 1000ml，pH 7.0 五、实验步骤 1、配制培养基：按培养基配方比例依次精确地称取各种药品 放入烧杯中，在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻 棒搅匀。加足所需的水，调节pH值，将配制好的培养基分
抑菌效果的检测方法
抑菌效果的检测方法：将抗生素菌株进行平板划线分离，长 出单菌落后，在421房间的超净工作台上找到直径7mm的 打孔器（只有一个，请大家不要拿到其它地方去！），用该打孔器在单菌落上打取菌落块，若菌落块卡在打孔器内，请用接种针挑出来，将菌落块以菌落面向上的方式放置在已经涂 布有金黄色葡萄球菌或大肠杆菌的平板上，培养48小时后测量抑菌圈的直径。 发帖者:徐耀波317生命科学学院 发布至:微生物学实验31700235fzkc200545401001 微生物学实验安排及自主实验要求 发帖位置: Tuesday, March 25, 2014 微生物学实验安排及自主实验要求 第6周：1.口腔微生物的染色观察与显微镜油镜的使用； 第7周：2.培养基的制备；3.高压蒸汽灭菌； 第8周：4.土壤中微生物的分离； 第9周：5.微生物菌落的观察；6. 微生物的分离纯化与菌种保存 第10周：7.细菌的革兰氏染色；8.放线菌装片的制作及观察； 第11周：9.酵母菌装片的制作及观察；10.霉菌装片的制作及观察；
第12周：11.酸奶的制作 第13周：12.水中大肠菌群的检测； 第12-14周：自主实验——抗生素产生菌的分离纯化及抗菌活性测定； 第15周：实验考核（无菌操作、制片、染色、油镜观察）； 各组提交自主实验项目总结报告，要求按照正式发表的科研论文进行写作；自主实验总结汇报。 要求：1.以一个班为单位，3~4人一组（即每张桌子上的同学分成两个自主实验小组 2.禁止选择以青霉为筛选目标的实验方案，各组自己查阅相 关资料然后设计实验方案主要包括样品的采集、所用的培养基配方、分离方法、鉴定的方法、活性测定的方法等方面； 各组长在第9周上实验课时将纸质实验方案提交给指导教师(实验方案请标明：2012级*班*组+组长姓名+联系电话+组员姓名） 发帖者:徐耀波317生命科学学院 发布至:微生物学实验31700235fzkc200545401001 自主实验预期目标及活性检测建议 发帖位置: Tuesday, March 25, 2014 抗生素产生菌的分离与抗菌活性检测