乳酸菌菌种的分离筛选方法解读
乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。
通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。
乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类
时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。
嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无
鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。
乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。
乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。
培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。
乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。
一.筛选方法：
1.溶钙圈法：
利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。
其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。
筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养
48h→挑选产生溶钙圈的菌落反复在MRS培养基上划线→挑起单菌落染色，经镜检确认为纯种→挑选革兰氏阳性单菌落→试管穿刺4℃冰箱保存。
2.溴甲酚绿指示剂法：
培养基：MRS培养基（含溴甲酚绿酒精溶液）
筛选过程：同上，不同之处是稀释涂布后长出菌落，挑取使溴甲酚绿变色的菌落。
二.菌种的分离筛选
1.培养基：
★1.1麦芽汁碳酸钙培养基：麦芽汁（10BX）1L 预先灭菌碳酸钙5-10g/L PH 自然（分离用）
★★1.2牛肉膏 10g/L 蛋白胨 10g/L 酵母膏 10g/L 番茄汁200g/L 葡萄糖10g/L 吐温0.05% CaCO315-20g/L 溴甲酚绿 0.01% PH6.0-6.5（分离用）
★1.3番茄汁碳酸钙培养基：
酵母膏 7.5 g/L 葡萄糖 10 g/L 番茄汁100mL 蛋白胨7.5g/L KH2PO4 2.0 g/L 吐温 0.5 mL PH 6.0-6.5 （分离用）
1.4葡萄糖 20g/L 酵母膏 10g/L PH 6.0-6.5
1.5蛋白胨 8- 10 g/L 酵母膏 3- 5g/L 葡萄糖 13- 15g/L KH2PO4 1.5-
2.0g/L
MgSO
4 0.3-0.
5 g/L MnSO
4
0.2-0.25g/L NaAC 3.0-5.0g/L PH 5.5-6.5
1.6蛋白胨 0.8- 1.0g/L 糖蜜 3.0-5.0g/L 酵母膏 3-5g/L 玉米浆0.5- 1.0g/L KH2PO4 0.1- 0.3g/L MgSO
4
0.3-0.5g/L NaC13-5g/L 葡萄糖 8-10g/L
PH5.5-6.5 （发酵或种子培养基）
★★1.7 MRS培养基（分离培养计数用）
蛋白胨 10.0g、牛肉膏 10.0g、酵母膏 5.0g、柠檬酸氢二铵 2.0g、
葡萄糖 20.0g、吐温 80 1.0mL、乙酸钠 5.0g、磷酸氢二钾 2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰 0.25g、琼脂 18.0g、蒸馏水1L, pH 6.5。（分离培养基），当MRS培养基冷却至45～50℃时,加入已灭菌的碳酸钙, 充分混匀,倒平板。
1.8 BCP培养基（溴甲酚紫培养基）
乳糖5.0g 蛋白胨 5.0g 酵母膏 3.0g 0.5℅溴甲酚紫10ml 自来水1000ml
pH6.5-7.0 （分离用）
1.9 BCG牛乳营养琼脂：脱脂奶粉10g，溶于50ml水中，加入1.6℅溴甲酚绿酒
精溶液0.07ml，0.075Mpa 20min。另取琼脂2.0g，溶于50ml水中，加酵母膏
1.0g溶解后调pH6.5-6.8，0.1 Mpa 20min.趁热在无菌操作下两者混合均匀，
倒平板，37℃培养24h，检查是否有杂菌。
2.分离筛选：
2.1富集培养：取1.0g（1.0ml）于无菌细口瓶中，加入无菌麦芽汁液体培养液于瓶口处，密闭，25-32℃培养48h。若培养基表内出现绢丝波纹物，镜检杆状，革兰氏阳性，初步定为乳酸菌。以同样方法转接2-3次，接种量3-5℅.
2.2菌种分离纯化：
溶钙圈法：
富集菌液或样品适当稀释至10-7，混菌法分离，先加入10-12ml MRS培养基或麦芽汁培养基，凝固后再注入4-5ml水琼脂培养基，制成厌氧环境，30℃或37℃培养2-3天（温度低时间稍长），可出现针头状或圆形稍扁菌落，周围形成透明圈。挑取透明圈大，培养基变黄的菌落，反复划线纯化2-3次，所得单菌落编号，经镜检后，疑似乳酸菌落接种于MRS培养基培养后保存备用。或接入液体培养基中，25-32℃培养24-48h，然后穿刺于MRS培养基或麦芽汁碳酸钙半固体培养基中，25-32℃培养48h保存备用。
2.3性能测定：
乳酸菌定性试验：
不同条件下的产酸速率试验：将分离菌种接种于MRS液体培养基中25℃ 37℃温度下培养测不同菌株不同温度的pH。
方法1.吸取发酵液10ml，注入空试管中，加入10℅硫酸1.0ml，在加入2.0
℅高锰酸钾约1.0ml，此时乳酸转化成乙醛。取滤纸一条，在含氨的硝酸银
溶液中浸湿，横搭在试管口上，将试管徐徐加热至沸腾，使乙醛挥发，若管口滤纸变黑，证明有乳酸生成。
方法2.纸层析法：展开剂为正丁醇：甲醇：水=80：15：5，毛细血管吸取发酵液，多次点样于新华滤纸上，1.5℅标准乳酸为对照，平衡2小时后进行层析，3℅溴甲酚蓝显色计算Rf值。
产酸量测定：5.0ml发酵液于150ml三角瓶中，加中性蒸馏水10-20ml，酚酞指示剂2滴，用0.1mol/l氢氧化钠滴定至微红色。
醋酸量（g/100mL）= 氢氧化钠摩尔浓度.Vx90.08x10-3 /样品毫升数 x100
同时，进行单因素试验，分别考察醋酸速度，耐高温，耐酒精度，耐低酸度等主要生产性能，选择优势菌株。
3.菌株鉴定：
3.1菌落形态：
3.2菌体形态：（革兰氏染色观察）染色镜检：杆状阳性。
3.3乳酸菌运动性检测：半固体穿刺法
3.4生理生化：
3.3.1生化试验：产过氧化氢，产硫化氢，葡萄糖产生，硝酸盐还原，产生吲哚，甲基红，明胶液化，需氧，精氨酸，糖发酵试验。
3.3.2生理试验：
乳酸菌产酸能力曲线：将筛选的乳酸菌接种于MRS液体培养基中，25-32℃培养48h，间隔4-6h测定发酵液pH。
食盐对乳酸菌的影响：在MRS液体培养基中，添加0.0℅ 2.0℅ 4.0℅ 6.0℅氯化钠，菌种分别接种于培养基中，32℃培养48h，测定OD值。
溴甲酚绿指示剂法：
原理：溴甲酚绿指示剂在酸性环境中呈黄色，碱性环境呈蓝色，分离培养基配制后PH为6.8，加入溴甲酚绿指示剂呈蓝绿色，产酸后菌落周围变成黄色，较容易鉴别。
培养基：BCG牛乳营养琼脂
初筛：将样品富集液梯度稀释，适温培养，平板上出现扁平的黄色菌落及周围培养基也为黄色初定为乳酸菌。
复筛：将典型菌落转接脱脂乳发酵管，若凝固，无气泡，呈酸性，镜检细胞杆状或链球状，革兰氏染色阳性，连续传代若干次培养，挑选出3-4h能凝固的乳管保存备用。
注：1.乳酸菌筛选常在几种培养基同时进行：
分别在麦芽汁碳酸钙培养基，番茄汁碳酸钙培养基，BCP培养基（溴甲酚紫培养基）同时进行混菌划线或涂布培养（放厌氧袋），分别25℃ 37℃培养48h。
菌落观察：平板表面形成浅色（黄色或白色）小菌落。麦芽汁碳酸钙培养基表面，菌落周围形成透明圈，BCP培养基（溴甲酚紫培养基）周围使紫色的培养基形成黄色包围圈。
触酶反应：厌氧菌一般无触酶（过氧化氢酶），用滴管滴加3.0℅过氧化氢于菌落上，若无气泡产生，证明该菌为触酶阴性。
将各种特征菌落分别接入斜面，培养后保存，进一步生理生化试验，以鉴定分别何种乳酸菌。
2.菌落鉴定：半固体或双平板琼脂利于乳酸菌的生长，菌落出现早。
2.1菌落形态观察：乳白色边缘不整齐，稍呈半球状凸起，实心菌落。
个体形态：半透明细杆状链状排列，大量时呈发丝状堆积。初步认为乳杆菌。
2.2生化鉴定：在吲哚试验中，加入菌种试管无任何变化，为阴性反应。说明该菌不具有分解色氨酸产生吲哚的能力。明胶液化淀粉水解氢氧化钾试验均为阴性，说明此菌为乳酸菌。（过氧化氢酶还原硝酸盐）
糖发酵试验：发酵果糖半乳糖葡萄糖乳糖产酸为阳性反应，其余麦芽糖蔗糖棉子糖鼠李糖产酸为阴性反应。根据手册第九版判断此种乳酸菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种。（纤维二糖甘露醇山梨醇七叶苷水杨苷）
2.3乳酸菌生长曲线pH-t测定结果：
三.几种乳酸菌筛选举例
1.嗜热链球菌：样品来源：市售酸奶培养基：M17改良培养基，培养温度：42℃，需氧情况：兼性厌氧，筛选方法：常规的稀释涂布和划线分离
2.保加利亚乳杆菌：样品来源：市售酸奶，培养基：牛肉浸膏 1.5％，酵母浸膏0.5％，葡萄糖
3.0％，柠檬酸三铵 0.2％，七水硫酸镁 0.02％，琼脂 1.5％，pH 5.1。培养温度：42℃，需氧情况：兼性厌氧，筛选方法：常规的稀释涂布和划线分离法。
3.双歧杆菌：样品来源：婴儿新鲜粪便，培养基：MRS培养基、NPNL培养基、TYP培养基、 PTYG培养基，培养温度：37℃，需氧情况：严格厌氧，筛选方法：常规的稀释涂布和划线分离法。
读书的好处
1、行万里路，读万卷书。
2、书山有路勤为径，学海无涯苦作舟。
3、读书破万卷，下笔如有神。
4、我所学到的任何有价值的知识都是由自学中得来的。——达尔文
5、少壮不努力，老大徒悲伤。
6、黑发不知勤学早，白首方悔读书迟。——颜真卿
7、宝剑锋从磨砺出，梅花香自苦寒来。
8、读书要三到：心到、眼到、口到
9、玉不琢、不成器，人不学、不知义。
10、一日无书，百事荒废。——陈寿
11、书是人类进步的阶梯。
12、一日不读口生，一日不写手生。
13、我扑在书上，就像饥饿的人扑在面包上。——高尔基
14、书到用时方恨少、事非经过不知难。——陆游
15、读一本好书，就如同和一个高尚的人在交谈——歌德
16、读一切好书，就是和许多高尚的人谈话。——笛卡儿
17、学习永远不晚。——高尔基
18、少而好学，如日出之阳；壮而好学，如日中之光；志而好学，如炳烛之光。——刘向
19、学而不思则惘，思而不学则殆。——孔子
20、读书给人以快乐、给人以光彩、给人以才干。——培根
乳酸菌菌种的分离筛选方法
乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类 时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。 嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无 鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。 乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。 乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。 培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。 乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。 一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养
乳酸菌菌种的分离筛选办法
精心整理 乳酸菌菌种的分离筛选方法 乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 时，SL 培养基、MS 对乳酸菌无害。一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH 。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养48h →挑选产生溶
钙圈的菌落反复在MRS培养基上划线→挑起单菌落染色，经镜检确认为纯种→挑选革兰氏阳性单菌落→试管穿刺4℃冰箱保存。 2.溴甲酚绿指示剂法： 培养基：MRS培养基（含溴甲酚绿酒精溶液） 筛选过程：同上，不同之处是稀释涂布后长出菌落，挑取使溴甲酚绿变色的菌落。 二.菌种的分离筛选 1.培养基： ★1.1麦芽汁碳酸钙培养基：麦芽汁（10BX）1L预先灭菌碳酸钙5-10g/LPH自然（分离用） ★★1.2吐温 ★1.3 酵母膏（分离用） 1.4 1.5 MgSO 4 1.6 ★★1.7 蛋白胨 葡萄糖、琼 脂18.0g 酸钙, 1.8BCP 乳糖5.0g蛋白胨5.0g酵母膏3.0g0.5℅溴甲酚紫10ml自来水1000ml pH6.5-7.0（分离用） 1.9BCG牛乳营养琼脂：脱脂奶粉10g，溶于50ml水中，加入1.6℅溴甲酚绿酒 精溶液0.07ml，0.075Mpa20min。另取琼脂2.0g，溶于50ml水中，加酵母膏 1.0g溶解后调pH6.5-6.8，0.1Mpa20min.趁热在无菌操作下两者混合均匀， 倒平板，37℃培养24h，检查是否有杂菌。
微生物菌种的分离和纯化方法
从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1、用固体培养基分离和纯化 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。1.1 稀释倒平板法 首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。 1.2 涂布平板法 因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，
菌种筛选方法 (2)
菌种筛选方法 在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。初筛的手段应尽可能快速、简单。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标,测得的数据要能够反映将来的生产水平。 1 从菌体形态变异分析有时，有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性，这就能很容易地将变异菌株筛选出来。尽管相当多的突变菌株并不存在这种相关性，但是在筛选工作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。当然，这种鉴别方法只能用于初筛。有人曾统计过3,484个产维生素B2的阿舒假囊酵母(Eremoth ecium ashbyii)的变异菌落，发现高产菌株的菌落形态有以下特点：菌落直径呈中等大小（8-10毫米），凡过大或过小者均为低产菌株；色泽深黄色，凡浅黄或白色者皆属低产菌株。又如，在灰黄霉素产生菌荨麻青霉(Penicillium urticae)的育种中，曾发现菌落的棕红色变深者往往产量有所提高，而在赤霉素生产菌藤仓赤霉（Gibberell a fujikuroi）中，却发现菌落的紫色加深者产量反而下降。 2 平皿快速检测法平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的
"形态"变化。具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等，见图。这些方法较粗放，一般只能定性或半定量用，常只用于初筛，但它们可以大大提高筛选的效率。它的缺点是由于培养平皿上种种条件与摇瓶培养，尤其是发酵罐深层液体培养时的条件有很大的差别，有时会造成两者的结果不一致。图平皿快速检测法示意图平皿快速检测法操作时应将培养的菌体充分分散，形成单菌落，以避免多菌落混杂一起，引起"形态"大小测定的偏差。 1) 纸片培养显色法将饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片搁于培养皿中，用牛津杯架空，下放小团浸有3%甘油的脱脂棉以保湿，将待筛选的菌悬液稀释后接种到滤纸上，保温培养形成分散的单菌落，菌落周围将会产生对应的颜色变化。从指示剂变色圈与菌落直径之比可以了解菌株的相对产量性状。指示剂可以是酸碱指示剂也可以是能与特定产物反应产生颜色的化合物。 2) 变色圈法将指示剂直接掺入固体培养基中，进行待筛选菌悬液的单菌落培养，或喷洒在已培养成分散单菌落的固体培养基表面，在菌落周围形成变色圈。如在含淀粉的平皿中涂布一定浓度的产淀粉酶菌株的菌悬液，使其呈单菌落，然后喷上稀碘液，发生显色反应。变色圈越大，说明菌落产酶的能力越强。而从变色圈的颜色又可粗略判断水解产物的情况。 3) 透明圈法在固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成浑浊、不透明的培养基背景。将待筛选在菌落周围就
乳酸菌菌种分离筛选方法
乳酸菌菌种的分离筛选方法 乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类 时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。 嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无 鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。 乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状， 一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。 乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。 培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。 乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常 添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。 一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸， 以维持培养基的PH。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养
营养缺陷型菌株的筛选
营养缺陷型菌株的筛选 采用辐射，化学试剂等因素处理细菌，以提高其变异几率，关键步骤是进行营养缺陷型微生物的筛选工作，营养缺陷型是指通过诱变产生的，由于发生了丧失某酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的突变株。营养缺陷型的筛选与鉴定涉及下列几种培养基：基本培养基（MM，符号为[-]）是指仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需的最低成分的合成培养基。完全培养基(CM，符号为[+])是指可满足某种微生物的一切营养缺陷型菌株的营养需要的天然或半合成培养基。补充培养基（SM，符号为[A]或[B]等）是指在基本培养基中添加某种营养物质以满足该营养物质缺陷型菌株生长需求的合成或半合成培养基。 营养缺陷型菌株不仅在生产中可直接作发酵生产核苷酸、氨基酸等中间产物的生产菌，而且在科学实验中也是研究代谢途径的好材料和研究杂交、转化、转导、原生质融合等遗传规律必不可少的遗传标记菌种。 营养缺陷型的筛选一般要经过诱变、淘汰野生型、检出和鉴定营养缺陷型四个环节。现分述如下： 第一步，诱变剂处理：与上述一般诱变处理相同。
第二步，淘汰野生型：在诱变后的存活个体中，营养缺陷型的比例一般较低。通过以下的抗生素法或菌丝过滤法就可淘汰为数众多的野生型菌株即浓缩了营养缺陷型。 抗生素法有青霉素法和制霉菌素法等数种。青霉素法适用于细菌，青霉素能抑制细菌细胞壁的生物合成，杀死正在繁殖的野生型细菌，但无法杀死正处于休止状态的营养缺陷型细菌。制霉菌素法则适合于真菌，制霉菌素可与真菌细胞膜上的甾醇作用，从而引起膜的损伤，也是只能杀死生长繁殖着的酵母菌或霉菌。在基本培养基中加入抗生素，野生型生长被杀死，营养缺陷型不能在基本培养基中生长而被保留下来。 菌丝过滤法适用于进行丝状生长的真菌和放线菌。其原理是：在基本培养基中，野生型菌株的孢子能发芽成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能。通过过滤就可除去大部分野生型，保留下营养缺陷型。 第三步，检出缺陷型：具体方法很多。用一个培养皿即可检出的，有夹层培养法和限量补充培养法；在不同培养皿上分别进行对照和检出的，有逐个检出法和影印接种法。可根据实验要求和实验室具体条件加以选用。现分别介绍如下：
菌种的筛选和分离
工业微生物菌种得分离与筛选 来源:青岛海博 一、微生物工业对菌种得要求 (一)、微生物工业得生产水平由三个要素决定:生产菌种得性能、发酵及提纯工艺条件、生产设备。其中生产菌种得性能就是最重要得因素。 (二)、微生物工业对菌种得要求就是: (１)菌株高产,在较短得时间内发酵产生大量发酵产物得能力; (２)在发酵过程中不产生或少产生与目标产品相近得副产品及其她产物; (3)生长繁殖能力强,较强得生长速率,产孢子得菌种应该具有较强得产孢子能力; (4)能够高效地将原理转化为产品; (５)能利用广泛得原材料,并对发酵原料成分得波动敏感性小; (６)对需要添加得前体物质有耐受能力,并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用; (7)在发酵过程中产生得泡沫要少; (8)具有抗噬菌体得能力; (9)遗传稳定性, 二、工业用微生物菌种得来源及选育 (一)微生物菌种得来源 一般通过以下几个途径收集菌种、采集样品与分离筛选: (1)就是根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买; (２)从大自然中采集样品分离; (3)从一些发酵制品中分离筛选目得菌株、 当前发酵工业所用菌种总趋势就是从野生菌转向变异菌,自然选用转向代谢育种,从诱发基因突变转向基因重组得定向育种。 (二)微生物工业菌种得分离 1、野生菌株得分离、筛选过程 (１)新菌种分离与筛选得步骤 菌种分离得流程如下: 标本采集→标本材料得预处理→富集培养→菌种初筛→菌种复筛→性能鉴定→菌种保藏 ①采样 采样季节:以温度适中,雨量不多得秋初为好。 采土方式:在选好适当地点后,用小铲子除去表土,取离地面5—1５cm处得土约10g,盛入清洁得牛皮纸袋或塑料袋中,扎好,标记,记录采样时间、地点、环境条件等,以备查考。为了使土样中微生物得数量与类型尽少变化,宜将样品逐步分批寄回,以便及时分离、 ②标本预处理 ④纯种分离:采用划线分离法、稀释分离法等纯化方法获取单菌落、 ⑤高产菌株得筛选:这一步就是采用与生产相近得培养基与培养条件,通过三角瓶得容量进行小型发酵试验,获得适合于工业生产用菌种。还要对菌种进行发酵性能测定,
菌种筛选方法
常用的菌种的筛选方法如下： （1）施加选择性压力分离法 主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、氮源等，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微生物生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到使目的菌种占优势。而得以快速分离纯化的目的。如可以控制培养时的氧，可将好氧微生物和厌氧微生物分开；通过控制温度，可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开；控制pH，可将嗜酸、嗜碱微生物分离等。在分离培养基中也可以加入不同的抗生素或试剂来增加选择性。如在分离放线菌和细菌时，可加入抗真菌抗生素；分离真菌时，可加入抗细菌药物。 （2）随机分离方法 有些微生物的产物对筛选没有直接的选择性指示作用，因此常采用随机分离方法分离。 A、抗生素产生菌的分离抗生素产生菌的分离常用抑菌圈法。实验必须用工具菌：采用抗生素的敏感菌，传统上常用金黄色葡萄球菌和枯草杆菌。 B、抗肿瘤药物产生菌的分离抗肿瘤药物产生菌的分离常用方法：生化诱导法、SOS生色检测法、DNA修复能力突变株。原理是利用DNA的损伤，微生物发生突变。B1、生化诱导法：将大肠杆菌的lacZ基因连接在λ噬菌体的PL启动子下，当DNA损伤时，诱发λ阻遏物CI分解，PL启动子启动lacZ基因转录，测定表达的?-半乳糖苷酶活性，来检测药物的存在。B2、SOS生色检测法：利用当DNA损伤时，可活化yecA蛋白，进而分解噬菌体的阻遏蛋白，再引起sifA基因启动lacZ基因转录，测定表达的?-半乳糖苷酶活性，来检测药物的存在。 C、生长因子产生菌的分离以氨基酸产生菌为例，介绍筛选方法。首先将待试菌接入加了抗真菌的化合物（如亚胺环己酮）的分离培养基中生长，然后采用影印法，将菌落复印到能支持氨基酸产生菌生长的培养基中，培养2-3天后，用紫外线杀司长好的菌落，再往此平板上面铺一层相应营养缺陷型菌株菌悬液，培养16小时后，被杀死的氨基酸产生菌的菌落周围应有一检测菌的生长圈。 （3）目的微生物分离 A、根据形态筛选突变株 B、根据平板菌落生化反应筛选变株透明圈法、呈色圈法、抑菌圈法、浑浊圈法等。①透明圈法：在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊。能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。该法在分离水解酶产生菌时采用较多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶产生菌都会在含有底物的选择性培养基平板上形成肉眼可见的透明圈。在分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用透明圈法进行初筛。在选择性培养
菌种的筛选和分离
工业微生物菌种的分离与筛选 来源：青岛海博 一、微生物工业对菌种的要求 (一)、微生物工业的生产水平由三个要素决定：生产菌种的性能、发酵及提纯工艺条件、生产设备。其中生产菌种的性能是最重要的因素。 （二）、微生物工业对菌种的要求是： （1）菌株高产，在较短的时间内发酵产生大量发酵产物的能力; （2）在发酵过程中不产生或少产生与目标产品相近的副产品及其他产物; （3）生长繁殖能力强，较强的生长速率，产孢子的菌种应该具有较强的产孢子能力; （4）能够高效地将原理转化为产品; （5）能利用广泛的原材料，并对发酵原料成分的波动敏感性小; （6）对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用; （7）在发酵过程中产生的泡沫要少; （8）具有抗噬菌体的能力；
（9）遗传稳定性， 二、工业用微生物菌种的来源及选育 （一）微生物菌种的来源 一般通过以下几个途径收集菌种、采集样品和分离筛选： （1）是根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买； （2）从大自然中采集样品分离； （3）从一些发酵制品中分离筛选目的菌株。 当前发酵工业所用菌种总趋势是从野生菌转向变异菌，自然选用转向代谢育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。 （二）微生物工业菌种的分离 1、野生菌株的分离、筛选过程 （1）新菌种分离与筛选的步骤 菌种分离的流程如下： 标本采集→标本材料的预处理→富集培养→菌种初筛→菌种复筛→性能鉴定→菌种保藏 ①采样 采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。 采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，
取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。 ②标本预处理 ④纯种分离：采用划线分离法、稀释分离法等纯化方法获取单菌落。 ⑤高产菌株的筛选：这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，获得适合于工业生产用菌种。还要对菌种进行发酵性能测定， ⑥毒性试验：据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。 2、菌种的分离方法 （1）施加选择性压力分离法 主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和 营养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、氮源等，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微
菌种的分离与培养
菌种的分离与培养 在自然界里，食用菌都不是单独存在的，而是和许多细菌、放射菌、霉菌等生活在一起的。所谓菌种分离，就是把这些和食用菌一起生活的杂菌分离出来，通过培养，获得纯的优良菌种。菌种分母种、原种、栽培种。 (一）母种的分离培养 食用菌母种的分离，可分为孢子分离法、组织分离法以及基内菌丝分离等。 1.孢子分离法 孢子分离法，是用食用菌的有性孢子或无性孢子萌发成菌丝，培养成菌种的方法。这种菌种生活力较强，但孢子个体之间有差异，且自然分化现象较严重，变异大，需经出菇试验才能在生产上应用。 （l）单孢分离法：是每次或每支试管只取一个担孢子，让它萌发成菌丝体来获得纯菌种的方法。蘑菇和草菇用单孢分离得到的菌丝，有结实能力，可采用此法分离生产纯菌种。单孢分离生产上较少采用，而且技术复杂，一般采用多孢分离法。 （2）多孢分离法：就是把许多孢子接种在同一培养基上，让它们萌发、自由交配来获得食用菌纯菌种的一种方法。具体操作方法，有以下几种：
①种菇孢子弹射法：选择个体健壮、朵形圆正，无病虫害、出菇均匀、高产稳产，适应性强的八九分成熟的种菇，切去大部分，菌柄用无菌水冲洗数遍后再用已灭菌的纱布或脱脂棉、滤纸吸干表面水分。在接种箱或无菌室内，把种菇的菌褶朝下用铁丝倒挂在玻璃漏斗下面，漏斗倒盖在培养皿上面；上端小孔用棉花塞住。培养皿放在一个铺有纱布的搪瓷盘上，静置12～20小时，菌褶上的孢子就会散落在培养皿内。形 成一层粉末状孢子印（平菇极淡紫色，蘑菇、草菇为褐色，香菇、金针菇孢子印白色）。用接种针沾取少量孢子在试管 中的琼脂外面或培养皿上划线接种。待孢子萌发，生成菌落时，选孢子萌发早、长势好的菌落进行试管培养。 还可用孢子采集器收集孢子。方法是选好种菇后，按上述程序，轻轻掀开玻璃钟罩，将种菇柄朝下插在孢子采收器的钢丝架上，放在培养皿正中央。随即盖好玻璃罩，用纱布将钟掌周围塞好。并在纱布上倒少许升汞或无菌水。移入20℃ 左右恒温箱培养。 ②褶上涂抹法：按无菌操作分离时；应选择成熟的种菇， 用接种针直接插入褶片之间，轻轻抹取褶片表面子实体尚未弹射的孢子，再在培养基上划线接种。 ③钩悬法：取成熟菌盖的几片菌褶或一小块耳片（黑木耳、毛木耳、白木耳〕，用无菌不锈钢丝（或铁丝、棉线等其他 悬挂材料）悬挂于三角瓶内的培养基的上方，勿使接触到培
酵母菌的分离筛选方法
酵母菌的分离筛选方法 酵母菌多数为腐生，一般生长在含糖较高，偏酸的环境中，在通气条 件下，液体培养比霉菌快。菌落与细菌相似，较大而厚，多数不透明， 菌落光滑湿润粘稠，乳白色，少数干皱，边缘整齐，呈红色或粉红色， 圆形椭圆卵形，液体培养基生长会生成沉淀或菌膜。 含高糖浓度（45%），分离蜂蜜酵母，球拟酵母属等嗜高渗透压的酵母。 1.培养基： 1.1葡萄糖50g/L 尿素1g/L （NH4）2SO41g/L KH2PO4 2.5g/L Na2HPO40.5g/L MgSO41g/L FeSO4 0.1g/L 酵母膏 0.5g/L 孟加 拉红 0.03g/L PH4.5-5.0 （富集用） ★1.2乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基：马铃薯200g/L 葡萄糖（霉菌用 蔗糖）20g/L 乳酸5ml马铃薯去皮切片200g，加水煮沸30min，纱 布过滤，补足蒸馏水1L，PH自然。（去掉乳酸可用于酵母菌和霉菌培 养用）（富集用） ★1.3麦芽汁培养基：1：4水60-65℃水浴3-4小时，4-6层纱布过 滤，可加一个蛋清加水20mL调均生泡沫，倒入糖化液中，煮沸过滤， 10-15波林，氯霉素0.1g/L PH6.0-6.4 121℃ 20min （分离保存用）灭菌后加入300u/ml硫酸链霉素（集菌用） ★1.4虎红（孟加拉红）培养基：蛋白胨5.0g/L 葡萄糖10g/L KH2PO41.0g/L MgSO40.5g/L 孟加拉红0.033g/L 氯霉素0.1g/L 琼 脂15g/L PH自然
（分离纯化用） ★1.5 豆芽汁培养基：黄豆芽100g/L 葡萄糖50g/L PH自然。100g 黄豆芽，加水煮沸30min，纱布过滤，补足蒸馏水1L 1.6察氏培养基：主要培养霉菌观察形态用 蔗糖30g/L 硝酸钠3g/L 磷酸氢二钾1g/L 氯化钾0.5g/L 硫酸镁0.5g/L 硫酸亚铁0.01g/L 琼脂15-20g/L 121℃ 20min PH自然一般分离黄酒酵母酒精酵母使用曲汁培养基，啤酒酵母用酒花麦汁培养基，葡萄酒酵母用葡萄汁培养基。 2.集菌：研究酵母菌生态和某种基物或样品中的酵母菌区系，一般不进行集菌，以免改变其中不同种类数量间的对比，将样品制成菌悬液按常规法分离。若从样品中分离特定种类时先集菌。集菌发酵力强菌株，加酸性含糖的培养基，酸性豆汁，必要时注入高浓度的酒精（13-17%），霉菌在液体中形成菌丝体，酵母不形成菌丝，25-28℃2-3d，遇到菌丝体用接种环挑去烧掉，去掉上清液，取沉淀酵母一至两环移植另一液体培养基中，集菌连续两至三次才能完成，要配合镜检。 实例：将待分离的样品10g（ml）放入90ml无菌水或生理盐水/150ml 三角瓶（玻璃珠），摇床振荡20-30min，取上清液接种于酸性培养液（乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基酸性麦芽汁或酸性豆芽汁）25-28℃2-3d，培养过程中若出现菌丝体跳出烧掉，集菌连续两至三次，培养液变成混浊，产生菌膜和沉淀物。镜检：美兰染液染色，活菌可还原美兰染液，菌体无色。
第三节 菌种分离
第三节菌种分离 第三节菌种分离菌种分离即是进行蘑菇菌丝的纯化过程，它是制种工作的重要环节，通俗讲是把蘑菇菌丝从自然界中单独分离出来进行纯培养，从而获得纯蘑菇菌丝生长的菌种。蘑菇菌种的分离方法有三种：即孢子分离、组织分离和基质菌丝分离法。 一、孢子分离法 蘑菇孢子分离法，是利用成熟子实体的有性担孢子能自动从子实体层中弹射出来的特征，在无菌条件下和适宜的培养基上，使孢子萌发成菌丝，获得纯种的一种方法。孢子分离可分为单孢分离和多孢分离法两种，由于是从有性担孢子（是指其细胞核已经地核配过程）分离纯菌丝体，因此生产上多采用多孢分离法来保持菌株的原有特性，而单孢分离法主要应用于菌株的筛选和杂交育种等工作，孢子分离主要分为两个步骤，首先是采集孢子，其次进行单孢或多孢子分离。（一）采集孢子 １、种菇的选择采集孢子首先要选好种菇即分离用的子实体。一般蘑菇种菇要求是第一潮菇，出菇较早，单生，个体健壮，特征典型的子实体，经过仔细的观察筛选后在菇床上做个记号，让种菇充分生长，直至即将破膜时将菇采摘进行孢子弹射。
２、孢子弹射收集种菇采收后可浸入0.1%升汞溶液中消毒约一分钟，用镊子取出后经无菌水冲洗数次，再用无菌滤纸把表面水吸干，或直接用75% 酒精棉球轻轻控拭菌盖及菌柄进行表面消毒。随后用无菌刀切掉多余菌柄（约留下 1.5-2cm即可），把菇直立，菇柄朝下插入铝线制作的支持物上，放入了先准备好铺有无菌滤纸条的平皿上，盖上钟罩（如图所示）。这套孢子收集装置需事先进行高压灭菌消毒。把装好子实体的孢子弹射收集器放在温度为15-20℃的室内,经24-48小时左右，可见到无菌滤纸上有褐色的蘑菇孢子印。在无菌操作下把收集到蘑菇孢子的滤纸条装入无菌的空试 管中，并在温度下进行真空干燥，之后放入冰箱可长期保存备用。 （二）孢子分离 １、多孢分离法即把多个孢接种在同一培养基上，让它们萌发共同生长交错在一起，从而获得纯种的一种方法，由于多个孢子间的种性互补，基本上可以保持亲本的稳定性，此法比较简易，在过去的蘑菇制种中应用较为普遍。 （１）斜面划线法：按无菌操作规程，用无菌接种环从收到孢子的滤纸条上沾取少量孢子，在PDA试管斜面培养基上自下而上划线，划线时勿用力，以免划破培养基表面，接种完毕，抽出接种种灼烧试管口，塞上棉塞，放置24℃恒温培养箱中培养，待孢子萌发后（一般约15-20天），挑选萌发快，
菌种的分离与筛选
一、微生物工业对菌种的要求 (一)、微生物工业的生产水平由三个要素决定：生产菌种的性能、发酵及提纯工艺条件、生 产设备。其中生产菌种的性能是最重要的因素。 （二）、微生物工业对菌种的要求是： （1）菌株高产，在较短的时间内发酵产生大量发酵产物的能力; （2）在发酵过程中不产生或少产生与目标产品相近的副产品及其他产物; （3）生长繁殖能力强，较强的生长速率，产孢子的菌种应该具有较强的产孢子能力; （4）能够高效地将原理转化为产品; （5）能利用广泛的原材料，并对发酵原料成分的波动敏感性小; （6）对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用; （7）在发酵过程中产生的泡沫要少; （8）具有抗噬菌体的能力； （9）遗传稳定性， 二、工业用微生物菌种的来源及选育 （一）微生物菌种的来源 一般通过以下几个途径收集菌种、采集样品和分离筛选： （1）是根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买； （2）从大自然中采集样品分离； （3）从一些发酵制品中分离筛选目的菌株。 当前发酵工业所用菌种总趋势是从野生菌转向变异菌，自然选用转向代谢育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。 （二）微生物工业菌种的分离 1、野生菌株的分离、筛选过程 （1）新菌种分离与筛选的步骤 菌种分离的流程如下： 标本采集→标本材料的预处理→富集培养→菌种初筛→ 菌种复筛→性能鉴定→ 菌种保藏①采样 采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。 采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。 为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。 ②标本预处理 ④纯种分离：采用划线分离法、稀释分离法等纯化方法获取单菌落。 ⑤高产菌株的筛选：这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行 小型发酵试验，获得适合于工业生产用菌种。还要对菌种进行发酵性能测定， ⑥毒性试验：据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆 菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。 2、菌种的分离方法 （1）施加选择性压力分离法 主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、氮源等，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微生物生长，而不利于其他 种类微生物的生存，以达到使目的菌种占优势．而得以快速分离纯化的目的。如可以控制培
土壤中枯草芽孢杆菌的分离和筛选
土壤中枯草芽孢杆菌的分离和筛选 2013023123刘倩倩 一、实验目的 1. 掌握枯草芽孢杆菌的分离筛选的基本原理，熟练掌握无菌接种技术、微生物分离筛选技术和微生物形态观察技术。 2. 了解枯草芽孢杆菌的分布、营养、生长等特点，以及它所具有的产淀粉酶的功能。根据这些特点进行分离和筛选，从而得到纯菌株。 二、实验原理 枯草芽抱杆菌属革兰氏阳性菌，芽抱0.6?0.9 X 1.0?1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。有的菌株是a -淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系。广泛分布在土壤及腐败的有机物中。选择含淀粉丰富的土壤为最佳，80 度的水浴处理样品1 小时，目的是杀死微生物营养体，残留芽胞。 利用稀释涂布法，在淀粉的培养基培养，培养1-3 天后，观察。然后，进行初筛与纯化，利用显微镜进行革兰氏染色，确认是否为枯草芽抱杆菌。再复筛，测定其淀粉酶活，最后确定菌株。 三、实验材料 （1）选择培养基 本次实验进行产淀粉酶的枯草芽抱杆菌的筛选，所以应选淀粉培养基。 配方：牛肉膏5.0g 蛋白胨10.0g 氯化钠5.0g 可溶性淀粉10.0g 琼脂20g 蒸馏水1000ml 调整pH 至7.2 配置时应先把淀粉用少量蒸馏水调成糊状，再加入到融化好的培养基中。 2）溶液或试剂
牛肉膏1.25g 蛋白胨2.5g 氯化钠1.25g 可溶性淀粉2.5g 琼脂5g 碘11 克，碘原液2 毫升，碘化钾42克，可溶性淀粉2 克，磷酸氢二钠45.23 克，柠檬酸8.068 克，氯化钴25 克，重铬酸钾3.34 克，100 毫升0.01NHCL。（3）仪器或其他用品 平板培养皿10 个、试管15 支、三角瓶2 个、烧杯3 个、称量纸、高压蒸汽灭菌锅、干燥箱、恒温培养箱、超净工作台、无菌涂布器、电热恒温水浴、500ml 量筒、显微镜、无菌吸管、无菌培养皿、无菌刻度吸管、酒精灯、记号笔、火柴、试管架、接种钩、滴管等。 四、实验步骤 倒平板f制备梯度稀释液f涂布f培养f初筛f复筛f纯化f保存 （1）实验前准备 制备淀粉培养基，无菌水，在121摄氏度下灭菌20min。倒平板。把接种工具，培养基，和其他用品全部在超净工作台上摆好，进行紫外线灭菌30min。 （2）制备土壤稀释液 取土样时最好选取如花坛等地方的土样，选好采样地点，产去表层5cm去 5-15cm处。用无菌器具规范采样几十克，装入无菌的塑料袋或纸袋中扎好，记录采样时间、地点、采样环境等以备考证。采样后应尽快分离。振摇约二十分钟，使土样与水充分混合，将细胞分散。放入盛有99ml 无菌水三角瓶中，常压80 度的水浴处理样品1 小时后，取出。 用一支1ml 无菌吸管从中吸取1ml 土壤悬液加入盛有9ml 无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml 加入另一盛有9ml 无菌水的试管中，混合均匀，以此类推，制成10-2 、10-3、10-4、10-5 不同稀释度的土壤溶液。 （3）涂布 将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10-3、10-4、10-5 三种稀释度，然后用无菌吸管分别由10-3 、10-4、10-5 三管土壤稀释液中各吸取0.2ml ，小
乳酸菌菌种的分离筛选方法修订稿
乳酸菌菌种的分离筛选 方法 WEIHUA system office room 【WEIHUA 16H-WEIHUA WEIHUA8Q8-
乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。 嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无 鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。 乳酸片球菌细胞呈球状，直径~μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。 乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。 培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。 乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。 一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。
菌株筛选方法
第二章餐厨垃圾堆肥产酶菌株筛选 2 材料与方法 2.1 材料 2.1.1 实验材料 1）筛选材料：HM菌剂（河南恒隆态生物工程股份有限公司）；EM菌剂（江西天意集团）；金宝贝菌剂（北京华夏康源科技有限公司）；群林发酵剂（广西北海群林生物工程有限公司）。 2）发酵材料：餐厨垃圾（购自贵州大学南校区学生食堂）；稻草（购自铜仁市，晒干后粉碎至5mm左右）。 2.1.2 主要药品及试剂 2.1.3 实验仪器 电子分析天平（EL-2005）西特传感技术有限公司 高速台式离心机（TGL-161）Thermo公司 冷冻离心机（2-16k）德国eppendorf公司 标准型净化工作台上海锦星科学仪器有限公司 低温冰箱〔BCD-108E）风华电器厂 超低温冰箱(Forma-6C ULT) Thermo公司 调温调湿箱（WS/08-01）重庆试验设备厂 干燥箱（101-2）上海实验仪器总厂 自动三重水蒸馏器（SZ-97）上海亚荣生化仪器厂 高压灭菌锅（GMSX-280）英国阿斯太欧（Astell）公司 循环水浴锅（RET7）Thermo公司 电热恒温培养箱（DH3600) 天津泰斯特仪器有限公司
恒温摇床（SKY-2102C) 上海苏坤实业有限公司 高速组织捣碎机（DS-1) 上海标本模型厂 磁力双向搅拌器（90-1）上海亚荣生化仪器厂 pH计 ACS交直流两用电子计价秤昆明金瑞克电子衡器有限公司 双金属温度计（WSS-411）天津市新华热工仪表有限公司 河北铁狮磨浆机械有限公司 秸秆揉丝饲料粉碎多用机 （9R-30) 紫外分光光度计 2.1.6 培养基 1）初筛培养基 （1）细菌培养基（%）：牛肉膏0.3；蛋白胨1.0；氯化钠0.5；琼脂粉2.0；pH7.2 （2）霉菌培养基（%）：磷酸二氢钾0.1；七水硫酸镁0.05；蛋白胨0.5；葡萄糖1.0；琼脂粉2.0；孟加拉红0.03；pH自然；链霉素30μg/m L （3）乳酸菌培养基（%）：蛋白胨1；牛肉膏1；酵母膏0.5；柠檬酸二铵0.2；葡萄糖2.0；吐温80 0.1；乙酸钠0.5；三水磷酸氢二钾0.2；七水硫酸镁0.058；七水硫酸锰0.025；琼脂粉2.0；pH6.2 （4）放线菌培养基（%）：可溶性淀粉2；氯化钠0.05；硝酸钾0.1；磷酸氢二钾0.05；七水硫酸镁0.05；七水硫酸亚铁0.001；重铬酸钾0.015；琼脂粉2.0；pH7.4；青霉素3μg/ml 2）复筛培养基 （1）产淀粉酶筛选培养基（%）：可溶性淀粉0.2；蛋白胨1.0；酵母膏0.5；磷酸氢二钾0.3；七水硫酸亚铁微量；七水硫酸镁微量；琼脂粉2.0；pH7.0 【陈秋红,孙梅,施大林,等.益生菌酪酸菌CB-7发酵培养基及培养条件的研究.科学试验与研究[J].2009,4:7-10,21】 （2）产脂肪酶筛选培养基（%）：硫酸铵0.1；磷酸氢二钾0.1；氯化钾0.05；七水硫酸镁0.01；橄榄油1.0；聚乙烯醇0.1；琼脂粉2.0；pH8.5 【刘敏,曹志军,焦艳芬,等. UHT 乳中产耐高温脂肪酶嗜冷菌的研究[J]. 内蒙古农业大学学报.2008,29(1):230-233】 （3）产纤维素酶筛选培养基（%）：七水硫酸镁0.01；羧甲基纤维素钠1.5；氯
菌种的分离与纯化
接种、分离纯化和培养技术 一、接种 将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。 １、接种工具和方法 在实验室或工厂实践中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。由于接种要求或方法的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之分。有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。（图３－３） 图３－３接种和分离工具 1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀 常用的接种方法有以下几种： １）划线接种这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。 ２）三点接种在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。除三点外，也有一点或多点进行接种的。 ３）穿刺接种在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。 ４）浇混接种该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45°C左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。
５）涂布接种与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。 ６）液体接种从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种。 ７）注射接种该法是用注射的方法将待接的微生物转接至活的生物体内，如人或其它动物中，常见的疫苗预防接种，就是用注射接种，接入人体，来预防某些疾病。 ８）活体接种活体接种是专门用于培养病毒或其它病原微生物的一种方法，因为病毒必须接种于活的生物体内才能生长繁殖。所用的活体可以是整个动物；也可以是某个离体活组织，例如猴肾等；也可以是发育的鸡胚。接种的方式是注射，也可以是拌料喂养。 ２、无菌操作 培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。 实验台面不论是什么材料，一律要求光滑、水平。光滑是便于用消毒剂擦洗；水平是倒琼脂培养基时利于培养皿内平板的厚度保持一致。在实验台上方，空气流动应缓慢，杂菌应尽量减少，其周围杂菌也应越少越好。为此，必须清扫室内，关闭实验室的门窗，并用消毒剂进行空气消毒处理，尽可能地减少杂菌的数量。 空气中的杂菌在气流小的情况下，随着灰尘落下，所以接种时，打开培养皿的时间应尽量短。用于接种的器具必须经干热或火焰等灭菌。接种环的火焰灭菌方法：通常接种环在火焰上充分烧红（接种柄，一边转动一边慢慢地来回通过火焰三次），冷却，先接触一下培养基，待接种环冷却到室温后，方可用它来挑取含菌材料或菌体，迅速地接种到新的培养基上。（图３－４）然后，将接种环从柄部至环端逐渐通过火焰灭菌，复原。不要直接烧环，以免残留在接种环上的菌体爆溅而污染空间。平板接种时，通常把平板的面倾斜，把培养皿的盖打开一小部分进行接种。在向培养皿内倒培养基或接种时，试管口或瓶壁外面不要接触底皿边，试管或瓶口应倾斜一下在火焰上通过。 图３－４斜面接种时的无菌操作