鸡胚尿囊腔接种(单孔接种)SOP
鸡胚尿囊腔接种（单孔接种）操作规程
一、目的：使鸡胚尿囊腔接种规范化。
二、使用范围：适用于鸡胚尿囊腔接种工序。
三、责任者：鸡胚尿囊腔接种操作员。
四、内容：
1 准备工作
1.1 人员着装：操作人员按要求穿工作服、戴帽子、戴口罩、戴手套。
1.2 确认物品：签字笔、记录表、10日龄鸡胚、医用胶带、封孔胶、75%酒精棉、无菌棉
花、4%碘酒、毛笔、打孔器、直镊、1mL一次性无菌注射器（带针）、接种液、含冰容器、打火机、酒精灯、止血钳、危废缸、垃圾桶。
1.3 确认胚蛋全部照检画好气室标记线，气室朝上摆放，检查胚蛋外观完整无破损。
1.4 消毒：用75%酒精棉擦拭操作台面、手部，注意更换酒精棉，用过的酒精棉扔危废缸。
2 鸡胚消毒
2.1 碘酒消毒：用毛笔蘸取4%碘酒并沥干，对胚蛋气室标记处上0.2-0.3cm接种部位逐一
消毒，消毒面积为大拇指盖大小，消毒顺序从左到右、从上到下。
2.2 脱碘：用止血钳夹取75%酒精棉脱碘，脱碘顺序从左到右、从上到下；每15枚蛋胚更
换一个酒精棉，用过的酒精棉扔危废缸。
3 打孔：从不锈钢灭菌盒中取出打孔器，去掉锡箔纸，在蛋胚气室消毒处轻轻打一小孔，
注意打孔力度，防止打破，打孔顺序从左到右、从上到下。
4 接种
4.1 操作前摇匀种毒液，将种毒液放入含冰容器中；
4.2 用75%酒精棉消毒种毒瓶塞，用过的酒精棉扔危废缸；
4.3 取1mL一次性注射器，确认外包装完好后，取出注射器，注意拧紧针头与针筒连接处，
将注射器针帽取下，将接种液瓶倾斜60°，将针头插入接种液瓶塞中央部位，确保接种瓶内液体完全没过针头，抽取病毒液1.2mL，注意缓慢抽取以减少气泡产生；将注射器针头朝上直立，用手指轻弹气泡部位，待气泡上移到注射器顶端时，用75%酒精棉包住针头慢慢排尽气泡，确保病毒液保持在刻度线上，注意不要将种毒液溅到桌面或蛋胚上，用过的酒精棉扔危废缸。
4.4 沿打孔处垂直进针，注入种毒液，每胚0.1mL接种量，接种顺序从左到右、从上到下，
注意注毒时应缓慢推进，避免种毒接后溢出。（此操作否定项：每溢出一枚扣5分，超过3枚则此项操作为零分）
5 封孔：按从下到上、从右到左的顺序将封孔胶滴到打孔处。如发现产生气泡应重新封孔。
6 标记：在已标记接毒名称、批号的标签上填写接种日期、接种数量、接种人，贴在蛋盘明显处。
7 记录：按操作顺序填写记录。
8 清场：将含毒用具放入不锈钢托盘中，清洁、消毒台面，将危废缸内的垃圾放入危废垃圾桶。
鸡胚尿囊腔接种(单孔接种)SOP
鸡胚尿囊腔接种（单孔接种）操作规程 一、目的：使鸡胚尿囊腔接种规范化。 二、使用范围：适用于鸡胚尿囊腔接种工序。 三、责任者：鸡胚尿囊腔接种操作员。 四、内容： 1 准备工作 1.1 人员着装：操作人员按要求穿工作服、戴帽子、戴口罩、戴手套。 1.2 确认物品：签字笔、记录表、10日龄鸡胚、医用胶带、封孔胶、75%酒精棉、无菌棉 花、4%碘酒、毛笔、打孔器、直镊、1mL一次性无菌注射器（带针）、接种液、含冰容器、打火机、酒精灯、止血钳、危废缸、垃圾桶。 1.3 确认胚蛋全部照检画好气室标记线，气室朝上摆放，检查胚蛋外观完整无破损。 1.4 消毒：用75%酒精棉擦拭操作台面、手部，注意更换酒精棉，用过的酒精棉扔危废缸。 2 鸡胚消毒 2.1 碘酒消毒：用毛笔蘸取4%碘酒并沥干，对胚蛋气室标记处上0.2-0.3cm接种部位逐一 消毒，消毒面积为大拇指盖大小，消毒顺序从左到右、从上到下。 2.2 脱碘：用止血钳夹取75%酒精棉脱碘，脱碘顺序从左到右、从上到下；每15枚蛋胚更 换一个酒精棉，用过的酒精棉扔危废缸。 3 打孔：从不锈钢灭菌盒中取出打孔器，去掉锡箔纸，在蛋胚气室消毒处轻轻打一小孔， 注意打孔力度，防止打破，打孔顺序从左到右、从上到下。 4 接种 4.1 操作前摇匀种毒液，将种毒液放入含冰容器中； 4.2 用75%酒精棉消毒种毒瓶塞，用过的酒精棉扔危废缸； 4.3 取1mL一次性注射器，确认外包装完好后，取出注射器，注意拧紧针头与针筒连接处， 将注射器针帽取下，将接种液瓶倾斜60°，将针头插入接种液瓶塞中央部位，确保接种瓶内液体完全没过针头，抽取病毒液1.2mL，注意缓慢抽取以减少气泡产生；将注射器针头朝上直立，用手指轻弹气泡部位，待气泡上移到注射器顶端时，用75%酒精棉包住针头慢慢排尽气泡，确保病毒液保持在刻度线上，注意不要将种毒液溅到桌面或蛋胚上，用过的酒精棉扔危废缸。 4.4 沿打孔处垂直进针，注入种毒液，每胚0.1mL接种量，接种顺序从左到右、从上到下， 注意注毒时应缓慢推进，避免种毒接后溢出。（此操作否定项：每溢出一枚扣5分，超过3枚则此项操作为零分） 5 封孔：按从下到上、从右到左的顺序将封孔胶滴到打孔处。如发现产生气泡应重新封孔。
实训八 病毒的鸡胚接种技术
实训八病毒的鸡胚接种技术 目的要求掌握鸡胚培养病毒的接毒和收毒方法，明确鸡胚培养病毒的应用。 仪器及材料受精卵、恒温箱、照蛋器、接种箱、蛋架、一次性注射器（1～5ml）、中号镊子、眼科剪和镊子、毛细吸管、橡皮乳头、灭菌平皿、试管、吸管、酒精灯、试管架、胶布、蜡、锥子、锉、煮沸消毒器、消毒剂（5%碘酊棉、75%酒精棉、5%石炭酸或3%来苏儿）、新城疫Ⅰ系或Ⅳ系疫苗。 方法与步骤（实验视频六） （一）鸡胚的选择和和孵化应选择健康无病鸡群或SPF鸡群的新鲜受精蛋。为便于照蛋观察，以来航鸡蛋或其他白壳蛋为好。用孵化箱孵化，要注意温度、湿度和翻蛋。孵化最低温度为36℃，一般为37.5℃，相对湿度为60%。每日最少翻蛋3次。 发育正常的鸡胚照蛋时可见清晰的血管及鸡胚的活动。不同的接种材料需不同的接种途径（见图2-4），不同的接种途径需选用不同日龄的鸡胚。卵黄囊接种，用6～8日龄鸡胚；绒毛尿囊膜接种，用9～13日龄的鸡胚；绒毛尿囊腔接种，用9～12日龄的鸡胚；血管注射，用12～13日龄的鸡胚；羊膜腔和脑内注射，用10日龄的鸡胚。 （二）接种前的准备 病毒材料的处理怀疑污染细菌的液体材料，加抗生素（青霉素1000IU和链霉素1000μg/ml）置室温1h或4℃冰箱12～24h，高速离心，取上清液，或经细菌滤器滤过除菌。如为患病动物组织，应剪碎、匀浆、离心后取上清液，必要时加抗生素处理或过滤除菌。若用新城疫Ⅰ系或Ⅳ系疫苗，则无菌操作用生理盐水将其稀释100倍。 照蛋以铅笔划出气室、胚胎位置及接种的位置，标明胚龄及日期气室朝上立于蛋架上。尿囊腔接种选9～12日龄的鸡胚，接种部位可选择在气室中心或远离胚胎侧气室边缘，避开大血管。 （三）鸡胚的接种（以新城疫病毒的绒毛尿囊腔接种为例）在接种部位先后用5%碘酊棉及75%酒精棉消毒，然后用灭菌锥子打一小孔，一次性1ml注射器吸取新城疫病毒液垂直或稍斜插入气室,刺入尿囊，向尿囊腔内注入0.1～0.3ml。注射后,用熔化的蜡封孔，置温箱中直立孵化3～7d。孵化期间，每6h照蛋一次，观察胚胎存活情况。弃去接种后24h内死亡的鸡胚，24h以后死亡的鸡胚应置0～4℃冰箱中冷藏4h或过夜（气室朝上直立），一定时间内不能致死的鸡胚也放冰箱冻死。 （四）鸡胚材料的收获原则上接种什么部位，收获什么部位。 绒毛尿囊腔接种新城疫病毒时，一般收获尿囊液和羊水。将鸡胚取出，无菌操作轻轻敲打并揭去气室顶部蛋壳及壳膜，形成直径1.5～2.0cm的开口。用灭菌镊子夹起并撕开或用眼科剪剪开气室中央的绒毛尿囊膜，然后用灭菌吸管从破口处吸取尿囊液，注入灭菌青霉素瓶或试管内。然后破羊膜收获羊水，收获的尿囊液和羊水应清亮，浑浊说明有细菌污染。收获的病毒经无菌检验合格者冷冻保存。用具消毒处理，鸡胚置消毒液中浸泡过夜或高压灭菌，然后弃掉。 注意事项鸡胚接种需严格的无菌操作，以减少污染。操作时应细心，以免引起鸡胚的损伤。病毒培养时应保持恒定的适宜条件，收毒结束，注意用具、环境的消毒处理。 思考题：1．病毒的鸡胚接种途径有哪些？分别选用多大日龄的鸡胚？ 2．收集病毒时，为什么要弃掉24h以内死亡的鸡胚？ 1
病毒接种鸡胚步骤
流感病毒鸡胚接种 材料：9-11龄鸡胚、孵蛋箱、照蛋器、开卵钻、石蜡、注射器、碘酒、70%酒精、镊子、二级生物安全柜等。 方法： 1 照蛋：⑴避开鸡胚及主动脉，找寻两血管间隙划线（最佳点）⑵划线在血管之间⑶标记蛋时不要太靠近气室处，因后面去壳时可能敲掉，导致标记不见 2 开孔：⑴开孔前先用75%酒精擦一下，由下而上或由上至下一遍即可，不可反复擦⑵开孔勿太大（太大不易封住，且易染菌） 3 注射：⑴针头45度斜插入孔中，至针头尾部到达蛋壳⑵注射后不要用力过大，抽出时不要过快⑶一针插入鸡胚，不要在里面搅拌 注：⑴握病毒管时不要握底部，易使病毒失活，融化时最好冰上融化，或流水冲洗⑵吸取液体时先混匀 尿囊腔接种：照检后画出气室边界和胎位，在胚胎面与气室交界处边缘约1mm处并避开血管做一标记，此即为注射点。在点及周围用75%酒精消毒，并用钻蛋机钻开一个约2mm长小口，勿损伤壳膜。用注射器注入流感病毒0.1-0.2ml，然后用石蜡溶化封口，置33-35度孵箱培养。每日照检鸡胚一次，于接种后24h 内死亡者为非特异性死亡应弃去。 甲型流感一般培养44-48h收获，而乙型流感病毒培养72h后进行收获。如病毒用冷冻干燥标本进行传代，无论甲型还是乙型均培养72h后才进行收获 收获前鸡胚须置4度冰箱6h或过夜，但不能置时间过长，过长会引起散黄。如急于收获亦可置-20度冰箱1h左右，但不能过长，过长会引起鸡胚结冰，再融化时卵黄膜就破碎，卵黄就流出。预冷的目的是：将鸡胚冻死使血液凝固，避免收获时流出红细胞并同尿液或羊水里的病毒发生凝集，造成病毒滴度下降。 收获时，用75%酒精消毒气室部卵壳，用消毒镊子轻轻敲碎气室部卵壳并取走之，再用另一无菌镊子撕去气室部壳膜，然后用无菌吸管通过绒毛尿囊膜进入尿囊腔，吸取尿囊液，置试管内4度或低温保存待用。 P3规范：⑴做有毒物需穿两件衣，⑵物从物流走，人从人流过，⑶所有沾毒东西都装2层塑料袋，密封，灭菌。
病毒的鸡胚接种
病毒的鸡胚接种 教学目标 使学生掌握病毒的鸡胚接种方法和收获方法。 材料准备 1.器材温箱、照蛋器、蛋架、超净工作台、1 mL注射器、20～27 号针头、镊子、酒精灯、灭菌吸管、灭菌滴管、灭菌青霉素瓶、铅笔、透明胶纸等。 2.种毒新城疫病毒悬液。 3.受精卵健康鸡群的受精卵，无母源抗体，产后10 d之内5 d最佳。 4.其他石蜡，质量分数为2.5%的碘酊及质量分数为75%的酒精棉球。 方法步骤 （一）鸡卵的保存、孵育及检卵 1.保存孵育前，保存在4.5～20 ℃的室温内，以10 ℃左右最佳，最多不能超过10 d。 2.孵育先将温箱调节温度为37.3～37.8 ℃，湿度45%～60%。将鸡卵孵入后，每日翻卵2～3次。 3.检卵孵后第4~6 d，用照蛋器检查发育情况，检出未受精及死亡鸡胚。鸡胚的生长情况分为以下几类： （1）未受精 4 ~6d后仅见模糊的卵黄黑影，无鸡胚迹象。 （2）生活鸡胚 4~6 d后可见到清晰的血管小团，内有鸡胚暗影，较大的鸡胚可见胚动。 （3）濒死或死亡鸡胚鸡胚活动呆滞或不能主动运动，血管昏暗或断折沉落。 （4）作标记将待接种的鸡胚取出，在照蛋器上照视，划出气室范围，并在鸡胚黑影，或绒毛尿囊膜发育中心等处，按接种途径要求标出记号。 （二）各种途径的鸡胚接种方法 1.尿囊腔接种 （1）接种方法孵育9～11日龄的鸡胚（实图6-20），经照视后，划出气室及胚胎位置，标明胚龄及日期，气室朝上立于卵架上。在气室中心或远离胚胎侧
气室边缘先后用碘酊棉球及酒精棉球消毒。以钢锥在气室的中央或侧边打一小孔，针头沿孔垂直或稍斜插入气室，进入尿囊，向尿囊腔内注入0.1～0.3 mL 新城疫病毒悬液，拔出针头,用融化的石蜡封孔，直立孵化（实图6-21）。孵化期间，每晚照蛋，观察胚胎存活情况。弃去接种后24 h 内死亡的鸡胚。 （2）收获方法 收获时间须视病毒的种类而定。新城疫病毒在接种后24～48 h 即可收获病毒。收获前将鸡胚置于0～4 ℃冰箱中冷藏4 h 或过夜，使血管收缩，以免解剖时出血。气室朝上立于卵架上，无菌操作轻轻敲打并揭去气室顶部蛋壳，形成直径为1.5～2.0 cm 的开口。用灭菌镊子夹起并撕开气室中央的绒毛尿囊膜，然后用吸管从破口处吸取尿囊液，每胚可得5～6 mL ，贮于无菌小瓶内，无菌检验后，冰冻保存，做种毒或试验之用。 （3）消毒 将用过的镊子、注射器等放入煮沸锅消毒5 min ，取出后擦干包好，高压灭菌待用。卵壳、鸡胚等置于消毒液中浸泡过夜，然后弃掉。无菌室内用紫外线灯消毒30 min 。 2.卵黄囊接种法 （1）接种方法 选用6～8日龄鸡胚，划出气室和胚胎位置，垂直放置在固定的卵架上，用碘酊及酒精棉消毒气室端，在气室的中央打一小孔，针头沿小孔垂直刺入约3 cm ，向卵黄囊内注入0.1～0.5 mL 病毒液。拔出针头,用融化的石蜡封孔，直立孵化3～7 d （实图6-22）。孵化期间，每晚照蛋，观察胚胎存活情况。弃去接种后24 h 内死亡的鸡胚。 （2）收获方法 将濒死或死亡鸡胚气室部用碘酊及酒精棉消毒，直立于卵架上，无菌操作轻轻敲打并揭去气室顶部蛋壳。用另一无菌镊子撕开绒毛尿囊膜，夹起鸡胚，切断卵黄带，置于无菌双碟内。如收获鸡胚，则除去双眼、爪及嘴，置于无菌小瓶中保存；如收获卵黄囊，则用镊子将绒毛尿囊膜与卵黄囊分开，将后者贮于无菌小瓶中。收获的鸡胚或卵黄囊，经无菌检验后，放置-25 ℃冰箱冷冻保存。 实图6-20鸡胚的结构 实图6-21尿囊腔接种
鸡胚尿囊腔接种(单孔接种)记录
鸡胚尿囊腔接种（单孔接种）操作记录 考生姓名：准考证号： 鸡胚接种物品准备 物品名称数量是否齐全物品名称数量是否齐全 签字笔1支含冰容器1个 记录表1张打孔器1把 10日龄鸡胚15枚1mL一次性注射器3个 标签纸1卷止血钳1把 封孔胶1瓶75%酒精棉1瓶 4%碘酒1瓶危废缸1个 毛笔1支不锈钢托盘1个 接种液1瓶利器桶1个 操作步骤及记录 1 准备工作 1.1 确认物品。 1.2 确认胚蛋全部照检画好气室标记线，气室朝上摆放，检查胚蛋外观完整无破损。 1.3 消毒：用75%酒精棉擦拭操作台面、手部，注意更换酒精棉，用过的酒精棉扔危废缸。 是否完成□ 2 鸡胚消毒 2.1 碘酒消毒：用毛笔蘸取4%碘酒并沥干，对胚蛋气室标记处上0.2-0.3cm接种部位逐一消毒，消毒 面积为大拇指盖大小，消毒顺序从左到右、从上到下。 2.2 脱碘：用止血钳夹取75%酒精棉脱碘，脱碘顺序从左到右、从上到下，用过的酒精棉扔危废缸。 是否完成□ 3 打孔：从不锈钢灭菌盒中取出打孔器，去掉锡箔纸，在蛋胚气室消毒处轻轻打一小孔，注意打孔力 度，防止打破，打孔顺序从左到右、从上到下。 是否完成□ 4 接种 4.1 操作前摇匀种毒液，将种毒液放入含冰容器中。 4.2 用75%酒精棉消毒种毒瓶塞，用过的酒精棉扔危废缸。 4.3 取1mL一次性注射器，抽取病毒液1.2mL，用75%酒精棉包住针头慢慢排尽气泡，确保病毒液保 持在刻度线上，注意不要将种毒液溅到桌面或蛋胚上，用过的酒精棉扔危废缸。 4.4 沿打孔处垂直进针，注入种毒液，每胚0.1mL接种量，接种顺序从左到右、从上到下，注意注毒 时应缓慢推进，避免种毒接后溢出。 是否完成□ 5 封孔：按从下到上、从右到左的顺序将封孔胶滴到打孔处。如发现产生气泡应重新封孔。 是否完成□ 6 标记：在已标记接毒名称、批号的标签上填写接种日期、接种数量、接种人，贴在蛋盘明显处。 是否完成□ 7 记录：按操作顺序填写记录。是否完成□ 8 清场：将含毒用具放入不锈钢托盘中，清洁、消毒台面，将危废缸内的垃圾放入危废垃圾桶。 是否完成□操作人签名：日期：年月日 备注： 1、物品准备齐全在□内画“√”，不齐全的在□内画“×”。 2、步骤完成的在□内画“√”，未完成的在□内画“×”。
病毒的鸡胚培养
病毒的鸡胚培养 一、目的要求 掌握鸡胚尿囊腔接种培养新城疫病毒的操作技术。 二、器材 1.鸡胚应选用健康鸡群的受精蛋，接种鸡的鸡胚应无母源抗体，以免影响病毒在胚胎中的增殖。实验用的鸡胚多采用9—10日龄的活胚。 2.接种材料新城疫I系疫苗 3.各种器械孵卵器、照蛋箱、蛋架、打孔器、1ml结核菌素注射器、41/2号注射针头、镊子、3%碘酊、75%酒精棉球、铅笔、酒精灯、剪刀、眼科镊子、灭菌的疫苗瓶、灭菌滴管和固体石蜡等。 三、内容和方法 （一）接种前的准备 1.鸡胚的准备 本实验选择9—10日龄的鸡胚，在照蛋时以铅笔勾划出气室，于气室稍下方胚胎活跃而血管明显的区域中，在血管之间的间隙划上记号，作为接种部位；用0、1%新洁尔灭把蛋壳搽洗干净并抹干，再以2%碘酊对接种部位进行消毒，用75%酒精再擦一遍，在接种定位出打孔，气室向上竖放于蛋架上。 2.病毒接种材料的准备 要分离培养的病毒材料应是无菌的，因此为达到材料无菌的目的，可在每ml接种物质中加青霉素和链霉素各100—500IU，置室温中1
小时或冰箱中12—24小时处理。或经滤器除菌。 （二）接种 绒毛尿囊腔内注射：用6号针头的1ml注射器吸取新城疫病毒材料，针头从已打好的小孔中向鸡胚方向插入0.5—-1cm,注入0、1ml （相当0、5羽份），再加氧化锌胶布贴封,再加融化的固体石蜡封口,放回孵化箱中进行孵化,每天翻蛋两次,照视一次.24小时内死亡的舍去。（三）收获 新城疫I系病毒材料，在接种24—48小时即可收获。收获前应将鸡胚置4度冰箱冷藏4小时或过夜，以免解剖时血管破裂。碘酒消毒蛋壳，用镊子去卵壳和尿囊膜，用吸头吸尿囊液于瓶内，可收集5-8ml，无菌检查，冰冻保存