病毒接种鸡胚步骤
流感病毒鸡胚接种
材料：9-11龄鸡胚、孵蛋箱、照蛋器、开卵钻、石蜡、注射器、碘酒、70%酒精、镊子、二级生物安全柜等。
方法：
1 照蛋：⑴避开鸡胚及主动脉，找寻两血管间隙划线（最佳点）⑵划线在血管之间⑶标记蛋时不要太靠近气室处，因后面去壳时可能敲掉，导致标记不见
2 开孔：⑴开孔前先用75%酒精擦一下，由下而上或由上至下一遍即可，不可反复擦⑵开孔勿太大（太大不易封住，且易染菌）
3 注射：⑴针头45度斜插入孔中，至针头尾部到达蛋壳⑵注射后不要用力过大，抽出时不要过快⑶一针插入鸡胚，不要在里面搅拌
注：⑴握病毒管时不要握底部，易使病毒失活，融化时最好冰上融化，或流水冲洗⑵吸取液体时先混匀
尿囊腔接种：照检后画出气室边界和胎位，在胚胎面与气室交界处边缘约1mm处并避开血管做一标记，此即为注射点。在点及周围用75%酒精消毒，并用钻蛋机钻开一个约2mm长小口，勿损伤壳膜。用注射器注入流感病毒0.1-0.2ml，然后用石蜡溶化封口，置33-35度孵箱培养。每日照检鸡胚一次，于接种后24h 内死亡者为非特异性死亡应弃去。
甲型流感一般培养44-48h收获，而乙型流感病毒培养72h后进行收获。如病毒用冷冻干燥标本进行传代，无论甲型还是乙型均培养72h后才进行收获
收获前鸡胚须置4度冰箱6h或过夜，但不能置时间过长，过长会引起散黄。如急于收获亦可置-20度冰箱1h左右，但不能过长，过长会引起鸡胚结冰，再融化时卵黄膜就破碎，卵黄就流出。预冷的目的是：将鸡胚冻死使血液凝固，避免收获时流出红细胞并同尿液或羊水里的病毒发生凝集，造成病毒滴度下降。
收获时，用75%酒精消毒气室部卵壳，用消毒镊子轻轻敲碎气室部卵壳并取走之，再用另一无菌镊子撕去气室部壳膜，然后用无菌吸管通过绒毛尿囊膜进入尿囊腔，吸取尿囊液，置试管内4度或低温保存待用。
P3规范：⑴做有毒物需穿两件衣，⑵物从物流走，人从人流过，⑶所有沾毒东西都装2层塑料袋，密封，灭菌。
实训八 病毒的鸡胚接种技术
实训八病毒的鸡胚接种技术 目的要求掌握鸡胚培养病毒的接毒和收毒方法，明确鸡胚培养病毒的应用。 仪器及材料受精卵、恒温箱、照蛋器、接种箱、蛋架、一次性注射器（1～5ml）、中号镊子、眼科剪和镊子、毛细吸管、橡皮乳头、灭菌平皿、试管、吸管、酒精灯、试管架、胶布、蜡、锥子、锉、煮沸消毒器、消毒剂（5%碘酊棉、75%酒精棉、5%石炭酸或3%来苏儿）、新城疫Ⅰ系或Ⅳ系疫苗。 方法与步骤（实验视频六） （一）鸡胚的选择和和孵化应选择健康无病鸡群或SPF鸡群的新鲜受精蛋。为便于照蛋观察，以来航鸡蛋或其他白壳蛋为好。用孵化箱孵化，要注意温度、湿度和翻蛋。孵化最低温度为36℃，一般为37.5℃，相对湿度为60%。每日最少翻蛋3次。 发育正常的鸡胚照蛋时可见清晰的血管及鸡胚的活动。不同的接种材料需不同的接种途径（见图2-4），不同的接种途径需选用不同日龄的鸡胚。卵黄囊接种，用6～8日龄鸡胚；绒毛尿囊膜接种，用9～13日龄的鸡胚；绒毛尿囊腔接种，用9～12日龄的鸡胚；血管注射，用12～13日龄的鸡胚；羊膜腔和脑内注射，用10日龄的鸡胚。 （二）接种前的准备 病毒材料的处理怀疑污染细菌的液体材料，加抗生素（青霉素1000IU和链霉素1000μg/ml）置室温1h或4℃冰箱12～24h，高速离心，取上清液，或经细菌滤器滤过除菌。如为患病动物组织，应剪碎、匀浆、离心后取上清液，必要时加抗生素处理或过滤除菌。若用新城疫Ⅰ系或Ⅳ系疫苗，则无菌操作用生理盐水将其稀释100倍。 照蛋以铅笔划出气室、胚胎位置及接种的位置，标明胚龄及日期气室朝上立于蛋架上。尿囊腔接种选9～12日龄的鸡胚，接种部位可选择在气室中心或远离胚胎侧气室边缘，避开大血管。 （三）鸡胚的接种（以新城疫病毒的绒毛尿囊腔接种为例）在接种部位先后用5%碘酊棉及75%酒精棉消毒，然后用灭菌锥子打一小孔，一次性1ml注射器吸取新城疫病毒液垂直或稍斜插入气室,刺入尿囊，向尿囊腔内注入0.1～0.3ml。注射后,用熔化的蜡封孔，置温箱中直立孵化3～7d。孵化期间，每6h照蛋一次，观察胚胎存活情况。弃去接种后24h内死亡的鸡胚，24h以后死亡的鸡胚应置0～4℃冰箱中冷藏4h或过夜（气室朝上直立），一定时间内不能致死的鸡胚也放冰箱冻死。 （四）鸡胚材料的收获原则上接种什么部位，收获什么部位。 绒毛尿囊腔接种新城疫病毒时，一般收获尿囊液和羊水。将鸡胚取出，无菌操作轻轻敲打并揭去气室顶部蛋壳及壳膜，形成直径1.5～2.0cm的开口。用灭菌镊子夹起并撕开或用眼科剪剪开气室中央的绒毛尿囊膜，然后用灭菌吸管从破口处吸取尿囊液，注入灭菌青霉素瓶或试管内。然后破羊膜收获羊水，收获的尿囊液和羊水应清亮，浑浊说明有细菌污染。收获的病毒经无菌检验合格者冷冻保存。用具消毒处理，鸡胚置消毒液中浸泡过夜或高压灭菌，然后弃掉。 注意事项鸡胚接种需严格的无菌操作，以减少污染。操作时应细心，以免引起鸡胚的损伤。病毒培养时应保持恒定的适宜条件，收毒结束，注意用具、环境的消毒处理。 思考题：1．病毒的鸡胚接种途径有哪些？分别选用多大日龄的鸡胚？ 2．收集病毒时，为什么要弃掉24h以内死亡的鸡胚？ 1
鸡胚尿囊腔接种(单孔接种)SOP
鸡胚尿囊腔接种（单孔接种）操作规程 一、目的：使鸡胚尿囊腔接种规范化。 二、使用范围：适用于鸡胚尿囊腔接种工序。 三、责任者：鸡胚尿囊腔接种操作员。 四、内容： 1 准备工作 1.1 人员着装：操作人员按要求穿工作服、戴帽子、戴口罩、戴手套。 1.2 确认物品：签字笔、记录表、10日龄鸡胚、医用胶带、封孔胶、75%酒精棉、无菌棉 花、4%碘酒、毛笔、打孔器、直镊、1mL一次性无菌注射器（带针）、接种液、含冰容器、打火机、酒精灯、止血钳、危废缸、垃圾桶。 1.3 确认胚蛋全部照检画好气室标记线，气室朝上摆放，检查胚蛋外观完整无破损。 1.4 消毒：用75%酒精棉擦拭操作台面、手部，注意更换酒精棉，用过的酒精棉扔危废缸。 2 鸡胚消毒 2.1 碘酒消毒：用毛笔蘸取4%碘酒并沥干，对胚蛋气室标记处上0.2-0.3cm接种部位逐一 消毒，消毒面积为大拇指盖大小，消毒顺序从左到右、从上到下。 2.2 脱碘：用止血钳夹取75%酒精棉脱碘，脱碘顺序从左到右、从上到下；每15枚蛋胚更 换一个酒精棉，用过的酒精棉扔危废缸。 3 打孔：从不锈钢灭菌盒中取出打孔器，去掉锡箔纸，在蛋胚气室消毒处轻轻打一小孔， 注意打孔力度，防止打破，打孔顺序从左到右、从上到下。 4 接种 4.1 操作前摇匀种毒液，将种毒液放入含冰容器中； 4.2 用75%酒精棉消毒种毒瓶塞，用过的酒精棉扔危废缸； 4.3 取1mL一次性注射器，确认外包装完好后，取出注射器，注意拧紧针头与针筒连接处， 将注射器针帽取下，将接种液瓶倾斜60°，将针头插入接种液瓶塞中央部位，确保接种瓶内液体完全没过针头，抽取病毒液1.2mL，注意缓慢抽取以减少气泡产生；将注射器针头朝上直立，用手指轻弹气泡部位，待气泡上移到注射器顶端时，用75%酒精棉包住针头慢慢排尽气泡，确保病毒液保持在刻度线上，注意不要将种毒液溅到桌面或蛋胚上，用过的酒精棉扔危废缸。 4.4 沿打孔处垂直进针，注入种毒液，每胚0.1mL接种量，接种顺序从左到右、从上到下， 注意注毒时应缓慢推进，避免种毒接后溢出。（此操作否定项：每溢出一枚扣5分，超过3枚则此项操作为零分） 5 封孔：按从下到上、从右到左的顺序将封孔胶滴到打孔处。如发现产生气泡应重新封孔。
鸡胚孵化实验指导
动物组织胚胎学综合性实验 鸡胚孵化实验指导 李玉谷编 华南农业大学兽医学院 二零零三年十二月
动物组织胚胎学综合性实验 鸡胚孵化实验指导 李玉谷编写 张媛整理 李楚宣审校
1 综合性实验 目录 实验一受精蛋的鉴别及孵化前的准备工作 (2) 实验二1天龄胚 (3) 实验三2天龄胚 (3) 实验四3天龄胚 (4) 实验五4天龄胚 (4) 实验六5天龄胚 (5) 实验七6天龄胚 (5) 实验八7天龄胚 (6) 实验九8天龄胚 (6) 实验十9天龄胚 (7) 实验十一10天龄胚 (7) 实验十二11天龄胚 (8) 实验十三12天龄胚 (8) 实验十四13天龄胚 (9) 实验十五14天龄胚 (9) 实验十六15天龄胚 (10) 实验十七16天龄胚 (10) 实验十八17天龄胚 (11) 实验十九18天龄胚 (12) 实验二十19天龄胚 (12) 实验二十一20天龄胚 (13) 实验二十二21天龄胚 (13) 胚胎位置的鉴定 (14) 胚胎发育的主要特征 (15) 鸡蛋孵化与鸡胚发育的口诀 (17) 雏鸡雌雄鉴别 (18) 附表1 (21) 附表2 (22)
鸡胚的孵化 2 实验一受精蛋的鉴别及孵化前的准备工作 一、受精蛋的鉴别 1．检查并区分鸡的受精蛋与未受精蛋。 2．试将几个受精蛋的胚盘完整地转移到培养皿上观察，描绘其典型情况。二、孵化前的准备工作 1．调整孵化器的温度与湿度。 （1）温度：最适孵化温度为37.8℃（100℉）。整批入孵可采取前高后低的原则，孵化的1~5天以38.2℃为宜，6~10天38℃，11~15天37.8℃，16~19天37.6℃，20~21天37.3℃。 （2）湿度：一般为40%~70%。整批入孵时可采取“两头高、中间低的原则”。孵化初期（1~7天），50%~60%；孵化后期（10~18天），50%~55%；出雏期（19~20天），70%左右。 2．取出几个蛋进行透照。 3．放蛋种蛋应大头朝上，小头朝下，不能平放，更不能小头朝上孵化。核准孵化器的温度与湿度，记录放蛋的日期和时刻。 注意：孵化过程既要注意温度、湿度，也要做好通风和翻蛋工作（一般每天翻6~8次；翻蛋角度以水平位置前俯后仰各45度为宜；翻蛋时动作要轻、稳、慢）。 蛋的构造 1．胶护膜2．蛋壳3．蛋黄膜4．系带层浓蛋白5．内壳膜6．气室7．外壳膜8．系带9．浓蛋白10．内稀蛋白11．外稀蛋白12．蛋黄心13．深色蛋黄14．浅色蛋黄15．胚珠或胚盘
病毒接种鸡胚步骤
流感病毒鸡胚接种 材料：9-11龄鸡胚、孵蛋箱、照蛋器、开卵钻、石蜡、注射器、碘酒、70%酒精、镊子、二级生物安全柜等。 方法： 1 照蛋：⑴避开鸡胚及主动脉，找寻两血管间隙划线（最佳点）⑵划线在血管之间⑶标记蛋时不要太靠近气室处，因后面去壳时可能敲掉，导致标记不见 2 开孔：⑴开孔前先用75%酒精擦一下，由下而上或由上至下一遍即可，不可反复擦⑵开孔勿太大（太大不易封住，且易染菌） 3 注射：⑴针头45度斜插入孔中，至针头尾部到达蛋壳⑵注射后不要用力过大，抽出时不要过快⑶一针插入鸡胚，不要在里面搅拌 注：⑴握病毒管时不要握底部，易使病毒失活，融化时最好冰上融化，或流水冲洗⑵吸取液体时先混匀 尿囊腔接种：照检后画出气室边界和胎位，在胚胎面与气室交界处边缘约1mm处并避开血管做一标记，此即为注射点。在点及周围用75%酒精消毒，并用钻蛋机钻开一个约2mm长小口，勿损伤壳膜。用注射器注入流感病毒0.1-0.2ml，然后用石蜡溶化封口，置33-35度孵箱培养。每日照检鸡胚一次，于接种后24h 内死亡者为非特异性死亡应弃去。 甲型流感一般培养44-48h收获，而乙型流感病毒培养72h后进行收获。如病毒用冷冻干燥标本进行传代，无论甲型还是乙型均培养72h后才进行收获 收获前鸡胚须置4度冰箱6h或过夜，但不能置时间过长，过长会引起散黄。如急于收获亦可置-20度冰箱1h左右，但不能过长，过长会引起鸡胚结冰，再融化时卵黄膜就破碎，卵黄就流出。预冷的目的是：将鸡胚冻死使血液凝固，避免收获时流出红细胞并同尿液或羊水里的病毒发生凝集，造成病毒滴度下降。 收获时，用75%酒精消毒气室部卵壳，用消毒镊子轻轻敲碎气室部卵壳并取走之，再用另一无菌镊子撕去气室部壳膜，然后用无菌吸管通过绒毛尿囊膜进入尿囊腔，吸取尿囊液，置试管内4度或低温保存待用。 P3规范：⑴做有毒物需穿两件衣，⑵物从物流走，人从人流过，⑶所有沾毒东西都装2层塑料袋，密封，灭菌。
鸡胚培养
鸡胚培养 前言：鸡胚培养法是用来培养某些对鸡胚敏感的动物病毒的一种培养方法，用牛痘病毒（vaccinia virus）和鸡新城疫病毒（Newcastle-disease virus）接种鸡胚。牛痘病毒适宜于在绒毛尿囊膜上生长，经培养后，产生肉眼可见的白色痘疱样病变，似小结节或白色小片云翳状。鸡新城疫病毒适宜接种在尿囊腔和羊膜腔内，生长后，鸡胚全身皮肤出现出血点，以脑后最显著。 基本原理 鸡胚培养法是用来培养某些对鸡胚敏感的动物病毒的一种培养方法，此方法可用以进行多种病毒的分离、培养，毒力的滴定，中和试验以及抗原和疫苗的制备等。 鸡胚培养的技术比组织培养容易成功，也比接种动物的动物来源容易，无饲养管理及隔离等的特殊要求，且鸡胚一般无病毒隐性感染，同时它的敏感范围很广，多种病毒均能适应，因此，是常用的一种培养动物病毒的方法。 器材 牛痘病毒液，鸡新城疫病毒液； 白壳受精卵（自产出后不超过10天，以5天以内的卵为最好）； 孵卵器，检卵灯，齿钻，磨壳器，钢针，蛋座木架，注射器，2．5%碘酒，70%酒精，镊子，剪刀，封蜡（固体石蜡加 1/4凡士林，溶化），灭菌培养皿，灭菌盖玻片等。 操作步骤 1．准备蛋胚 孵育前的鸡卵先用清水以布洗净，再用干布擦干，放入孵卵器内进行孵育（37℃，相对湿度是45—60%），孵育三日后，鸡卵每日翻动1—2次。孵至第4日，用检卵灯观察鸡胚发育情况，未受精卵，只见模糊的卵黄黑影，不见鸡胚的形迹，这种鸡卵应淘汰。活胚可看到清晰的血管和鸡胚的暗影，比较大一些的可
以看见胚动，随后每日观察一次，将胚动呆滞或没有运动的、血管昏暗模糊者，即可能是已死或将死的鸡胚，要随时加以淘汰。生长良好的蛋胚一直孵育到接种前，具体胚龄视所拟培养的病毒种类和接种途径而定。 2．接种 1）绒毛尿囊膜接种 （a）将孵育10—12天的蛋胚放在检卵灯上，用铅笔勾出气室与胚胎略近气室端的绒毛尿囊膜发育得好的地方。（b）用碘酒消毒气室顶端与绒毛尿囊膜记号处，并用磨壳器或齿钻在记号处的卵壳上磨开一三角形或正方形（每边约5—6mm）的小窗，不可弄破下面的壳膜。在气室顶端钻一小孔。 （c）用小镊子轻轻揭去所开小窗处的卵壳，露出壳下的壳膜，在壳膜上滴一滴生理盐水，用针尖小心地划破壳膜，但注意切勿伤及紧贴在下面的绒毛屑囊膜，此时生理盐水自破口处流至绒毛屑囊膜，以利两膜分离。 （d）用针尖刺破气室小孔处的壳膜，再用橡皮乳头吸出气室内的空气，使绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室 （e）用注射器通过窗口的壳膜窗孔滴 0．05— 0．1ml牛痘病毒液于绒毛尿囊膜上。 （f）在卵壳的窗口周围涂上半凝固的石蜡，作成堤状，立即盖上消毒盖玻片。也可用揭下的卵壳封口，则将卵壳盖上，接缝处涂以石蜡，但石蜡不能过热，以免流入卵内。将鸡卵始终保持人工气室在上方的位置进行37℃培养，48—96小时观察结果。 ⑵尿囊腔接种 用孵育10—12天的蛋胚，因这时尿囊液积存得最多。 （a）将蛋胚在检卵灯上照视，用铅笔画出气室与胚胎位置，并在绒毛尿囊膜血管较少的地方作记号。 （b）将蛋胚竖放在蛋座木架上，钝端向上。用碘酒消毒气室蛋壳，并用钢针在记号处钻一小孔。 （c）用带18mm长针头的1ml注射器吸取鸡新城疫病毒液，针头刺入孔内，经绒毛尿囊膜入尿囊腔，注入0．1ml病毒液（图Ⅻ-5）。 （d）用石蜡封孔后于37℃孵卵器孵育72小时。
鸡胚培养和细胞培养
第一节 鸡胚接种 一、鸡胚的结构 鸡胚是正在发育的活的机体，组织分化程度低，细胞代谢旺盛，适于许多人类和动物病毒的生长增殖，是常用的病毒分离培养方法之一（衣原体、立克次体的分离亦用鸡胚）。目前，鸡胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、疱疹病毒及脑炎病毒，尤其在禽类病毒的研究上应用较多。可用于病毒的分离、鉴定，抗原和疫苗制备，以及病毒性质的研究等。虽然随着组织培养技术的不断发展，不少病毒已不再用鸡胚来分离培养，但对某些病毒来说，鸡胚仍是一种不可缺少的培养手段。鸡胚培养的优点是，来源充足，价格低廉，操作简单，无需特殊设备或条件，易感病毒谱较广，对接种的病毒不产生抗体等。当然，鸡胚培养也有其缺点，即除痘斑和鸡胚死亡是特异性感染指征外，多需用第二试验系统来测定病毒存在与否；非SPF鸡胚，亦可能含有对某些家禽病毒的母源抗体，甚至还可能带有鸡白痢沙门氏菌、霉形体、鸡白血病等病毒。因此，用鸡胚分离培养病毒时，必须考虑这些问题。原则上应使用非免疫蛋来孵鸡胚，最好用SPF鸡胚。 一般说来，孵育至8-14天的鸡胚最有利于病毒的生长，因为此阶段鸡胚发育日趋完善，各种脏器均已形成，已能经受接种物的适当刺激，同时胚胎细胞幼嫩，骨胳不健全，还未长出羽毛，很利于病毒在胚胎中增殖，同时也有利于收获高滴度的病毒，14天以后，胚胎骨骼硬化，胚皮表面羽毛渐生，已不便感染病毒，特别是已不利于收获病毒材料。在操作鸡胚时）一定要注意到这一点。 孵育至21天左右，羊水和尿囊液已全部被胚胎吸收，一部分卵黄陷入胚胎腹部，另一部分则仍留在体外，胚胎已发育成小鸡，破壳而出。鸡胚的基本结构如图，从图中可以看出，鸡胚的最外层为石灰质的卵壳，上有气孔供气体交换，卵壳之下为壳膜，很易与卵壳分离，其功能是使气体分子与胚胎内的液体分子在内外进行交换，因此在孵育时需要有一定的湿度和空气。如果湿度太低，鸡胚就容易脱水、引起鸡胚死亡。气流不通，鸡胚缺氧，同样会造成鸡胚死亡。鸡胚的钝头（俗称“大头”），是气室，其功能是呼吸和调节胚内压力。壳膜之下为血管丰富的绒毛尿囊膜，其外层为绒毛膜，系外胚层形成，内层为尿囊膜，系内胚层形成，两膜所夹为中胚层。由于胚胎的肺发育不完善，此时绒毛尿囊膜代行胚胎呼吸器官的作用，气体的交换是在绒毛尿囊膜的血管内通过卵壳进行的。尿囊腔是胚胎的排泄器官，内含的尿囊液初为透明液体，成分极类似于生理盐水溶液，以后则尿酸盐含量增高。尿囊液量在11-13日龄时最高，平均达6毫升左右。 羊膜是胚胎的最内层包被，系外胚层和中胚层形成，羊膜腔内含羊水，胚胎浸于其中，羊水在起初是单纯的生理盐水溶液，以后蛋白质含量增加。羊水量在8-15日龄时最高，平均约为1毫升左右。附着于胚胎上的是卵黄囊，其膜系由内胚层和中胚层形成，内包卵黄，是胚胎发育的养料。卵的尖端（俗称“小头”） 是卵白，是胚胎发育晚期的养料
病毒的鸡胚接种
病毒的鸡胚接种 教学目标 使学生掌握病毒的鸡胚接种方法和收获方法。 材料准备 1.器材温箱、照蛋器、蛋架、超净工作台、1 mL注射器、20～27 号针头、镊子、酒精灯、灭菌吸管、灭菌滴管、灭菌青霉素瓶、铅笔、透明胶纸等。 2.种毒新城疫病毒悬液。 3.受精卵健康鸡群的受精卵，无母源抗体，产后10 d之内5 d最佳。 4.其他石蜡，质量分数为2.5%的碘酊及质量分数为75%的酒精棉球。 方法步骤 （一）鸡卵的保存、孵育及检卵 1.保存孵育前，保存在4.5～20 ℃的室温内，以10 ℃左右最佳，最多不能超过10 d。 2.孵育先将温箱调节温度为37.3～37.8 ℃，湿度45%～60%。将鸡卵孵入后，每日翻卵2～3次。 3.检卵孵后第4~6 d，用照蛋器检查发育情况，检出未受精及死亡鸡胚。鸡胚的生长情况分为以下几类： （1）未受精 4 ~6d后仅见模糊的卵黄黑影，无鸡胚迹象。 （2）生活鸡胚 4~6 d后可见到清晰的血管小团，内有鸡胚暗影，较大的鸡胚可见胚动。 （3）濒死或死亡鸡胚鸡胚活动呆滞或不能主动运动，血管昏暗或断折沉落。 （4）作标记将待接种的鸡胚取出，在照蛋器上照视，划出气室范围，并在鸡胚黑影，或绒毛尿囊膜发育中心等处，按接种途径要求标出记号。 （二）各种途径的鸡胚接种方法 1.尿囊腔接种 （1）接种方法孵育9～11日龄的鸡胚（实图6-20），经照视后，划出气室及胚胎位置，标明胚龄及日期，气室朝上立于卵架上。在气室中心或远离胚胎侧
气室边缘先后用碘酊棉球及酒精棉球消毒。以钢锥在气室的中央或侧边打一小孔，针头沿孔垂直或稍斜插入气室，进入尿囊，向尿囊腔内注入0.1～0.3 mL 新城疫病毒悬液，拔出针头,用融化的石蜡封孔，直立孵化（实图6-21）。孵化期间，每晚照蛋，观察胚胎存活情况。弃去接种后24 h 内死亡的鸡胚。 （2）收获方法 收获时间须视病毒的种类而定。新城疫病毒在接种后24～48 h 即可收获病毒。收获前将鸡胚置于0～4 ℃冰箱中冷藏4 h 或过夜，使血管收缩，以免解剖时出血。气室朝上立于卵架上，无菌操作轻轻敲打并揭去气室顶部蛋壳，形成直径为1.5～2.0 cm 的开口。用灭菌镊子夹起并撕开气室中央的绒毛尿囊膜，然后用吸管从破口处吸取尿囊液，每胚可得5～6 mL ，贮于无菌小瓶内，无菌检验后，冰冻保存，做种毒或试验之用。 （3）消毒 将用过的镊子、注射器等放入煮沸锅消毒5 min ，取出后擦干包好，高压灭菌待用。卵壳、鸡胚等置于消毒液中浸泡过夜，然后弃掉。无菌室内用紫外线灯消毒30 min 。 2.卵黄囊接种法 （1）接种方法 选用6～8日龄鸡胚，划出气室和胚胎位置，垂直放置在固定的卵架上，用碘酊及酒精棉消毒气室端，在气室的中央打一小孔，针头沿小孔垂直刺入约3 cm ，向卵黄囊内注入0.1～0.5 mL 病毒液。拔出针头,用融化的石蜡封孔，直立孵化3～7 d （实图6-22）。孵化期间，每晚照蛋，观察胚胎存活情况。弃去接种后24 h 内死亡的鸡胚。 （2）收获方法 将濒死或死亡鸡胚气室部用碘酊及酒精棉消毒，直立于卵架上，无菌操作轻轻敲打并揭去气室顶部蛋壳。用另一无菌镊子撕开绒毛尿囊膜，夹起鸡胚，切断卵黄带，置于无菌双碟内。如收获鸡胚，则除去双眼、爪及嘴，置于无菌小瓶中保存；如收获卵黄囊，则用镊子将绒毛尿囊膜与卵黄囊分开，将后者贮于无菌小瓶中。收获的鸡胚或卵黄囊，经无菌检验后，放置-25 ℃冰箱冷冻保存。 实图6-20鸡胚的结构 实图6-21尿囊腔接种
鸡胚尿囊腔接种(单孔接种)记录
鸡胚尿囊腔接种（单孔接种）操作记录 考生姓名：准考证号： 鸡胚接种物品准备 物品名称数量是否齐全物品名称数量是否齐全 签字笔1支含冰容器1个 记录表1张打孔器1把 10日龄鸡胚15枚1mL一次性注射器3个 标签纸1卷止血钳1把 封孔胶1瓶75%酒精棉1瓶 4%碘酒1瓶危废缸1个 毛笔1支不锈钢托盘1个 接种液1瓶利器桶1个 操作步骤及记录 1 准备工作 1.1 确认物品。 1.2 确认胚蛋全部照检画好气室标记线，气室朝上摆放，检查胚蛋外观完整无破损。 1.3 消毒：用75%酒精棉擦拭操作台面、手部，注意更换酒精棉，用过的酒精棉扔危废缸。 是否完成□ 2 鸡胚消毒 2.1 碘酒消毒：用毛笔蘸取4%碘酒并沥干，对胚蛋气室标记处上0.2-0.3cm接种部位逐一消毒，消毒 面积为大拇指盖大小，消毒顺序从左到右、从上到下。 2.2 脱碘：用止血钳夹取75%酒精棉脱碘，脱碘顺序从左到右、从上到下，用过的酒精棉扔危废缸。 是否完成□ 3 打孔：从不锈钢灭菌盒中取出打孔器，去掉锡箔纸，在蛋胚气室消毒处轻轻打一小孔，注意打孔力 度，防止打破，打孔顺序从左到右、从上到下。 是否完成□ 4 接种 4.1 操作前摇匀种毒液，将种毒液放入含冰容器中。 4.2 用75%酒精棉消毒种毒瓶塞，用过的酒精棉扔危废缸。 4.3 取1mL一次性注射器，抽取病毒液1.2mL，用75%酒精棉包住针头慢慢排尽气泡，确保病毒液保 持在刻度线上，注意不要将种毒液溅到桌面或蛋胚上，用过的酒精棉扔危废缸。 4.4 沿打孔处垂直进针，注入种毒液，每胚0.1mL接种量，接种顺序从左到右、从上到下，注意注毒 时应缓慢推进，避免种毒接后溢出。 是否完成□ 5 封孔：按从下到上、从右到左的顺序将封孔胶滴到打孔处。如发现产生气泡应重新封孔。 是否完成□ 6 标记：在已标记接毒名称、批号的标签上填写接种日期、接种数量、接种人，贴在蛋盘明显处。 是否完成□ 7 记录：按操作顺序填写记录。是否完成□ 8 清场：将含毒用具放入不锈钢托盘中，清洁、消毒台面，将危废缸内的垃圾放入危废垃圾桶。 是否完成□操作人签名：日期：年月日 备注： 1、物品准备齐全在□内画“√”，不齐全的在□内画“×”。 2、步骤完成的在□内画“√”，未完成的在□内画“×”。
病毒的鸡胚培养
病毒的鸡胚培养 一、目的要求 掌握鸡胚尿囊腔接种培养新城疫病毒的操作技术。 二、器材 1.鸡胚应选用健康鸡群的受精蛋，接种鸡的鸡胚应无母源抗体，以免影响病毒在胚胎中的增殖。实验用的鸡胚多采用9—10日龄的活胚。 2.接种材料新城疫I系疫苗 3.各种器械孵卵器、照蛋箱、蛋架、打孔器、1ml结核菌素注射器、41/2号注射针头、镊子、3%碘酊、75%酒精棉球、铅笔、酒精灯、剪刀、眼科镊子、灭菌的疫苗瓶、灭菌滴管和固体石蜡等。 三、内容和方法 （一）接种前的准备 1.鸡胚的准备 本实验选择9—10日龄的鸡胚，在照蛋时以铅笔勾划出气室，于气室稍下方胚胎活跃而血管明显的区域中，在血管之间的间隙划上记号，作为接种部位；用0、1%新洁尔灭把蛋壳搽洗干净并抹干，再以2%碘酊对接种部位进行消毒，用75%酒精再擦一遍，在接种定位出打孔，气室向上竖放于蛋架上。 2.病毒接种材料的准备 要分离培养的病毒材料应是无菌的，因此为达到材料无菌的目的，可在每ml接种物质中加青霉素和链霉素各100—500IU，置室温中1
小时或冰箱中12—24小时处理。或经滤器除菌。 （二）接种 绒毛尿囊腔内注射：用6号针头的1ml注射器吸取新城疫病毒材料，针头从已打好的小孔中向鸡胚方向插入0.5—-1cm,注入0、1ml （相当0、5羽份），再加氧化锌胶布贴封,再加融化的固体石蜡封口,放回孵化箱中进行孵化,每天翻蛋两次,照视一次.24小时内死亡的舍去。（三）收获 新城疫I系病毒材料，在接种24—48小时即可收获。收获前应将鸡胚置4度冰箱冷藏4小时或过夜，以免解剖时血管破裂。碘酒消毒蛋壳，用镊子去卵壳和尿囊膜，用吸头吸尿囊液于瓶内，可收集5-8ml，无菌检查，冰冻保存
实验五十 动物病毒的鸡胚培养
实验五十一动物病毒的鸡胚培养 三、器材 1．病毒痘苗病毒（Vaccinia virus），鸡新城疫病毒（Newcastle distase virus）。 2.仪器或其他用具孵卵器，检卵灯，齿钻，磨壳器，钢针，蛋座木架，注射器，2.5％碘酒，70％乙醇，镊子，剪刀，封蜡（固体石蜡加1／4凡士林，溶化），灭菌培养板，灭菌盖玻片等。 3.白壳受精卵（自产出后不超过10d，以5d以内的卵为最好）。 四、操作步骤 1．准备蛋胚 孵育前的鸡卵先用清水以布洗净，再用干布擦干，放入孵卵器内进行孵育（37℃，相对湿度是45%~60%），孵育3d后，鸡卵每日翻动1~2次。孵至第4d，用检卵灯观察鸡胚发育情况，未受精卵，只见模糊的卵黄黑影，不见鸡胚的形迹，这种鸡卵应淘汰。活胚可看到清晰的血管和鸡胚的暗影，比较大一些的可以看见胚动，随后每日观察一次，将胚动呆滞的或没有运动的、血管昏暗模糊者，即可能是已死或将死的鸡胚，要随时加以淘汰。生长良好的蛋胚一直孵育到接种前，具体胚龄视所拟培养的病毒种类和接种途径而定。 鸡卵孵化期间，箱内应保持新鲜空气流通，特别是孵化5~6d后，鸡胚发育加快，氧气需要量加大，空气供应不足，会导致鸡胚大量死亡。 2.接种 （1）绒毛尿囊膜接种 ①将孵育10~12d的蛋胚放到检卵灯上，用铅笔勾出其实与胚胎略近气室端的绒毛尿囊膜发育的好的地方。 ②用碘酒消毒气室顶端与绒毛尿囊膜记号处，并用磨壳器或齿钻在记号处的卵壳上磨开一三角形或正方形（每边约5~6mm）的小窗，不可弄破下面的壳膜。在气室顶端钻一小孔。 ③用小镊子轻轻揭去所开小窗处的卵壳，露出壳下的壳膜，在壳膜上滴一滴生理盐水，用针尖小心地划破壳膜，但注意切勿伤及紧贴在下面的绒毛尿囊膜，以利两膜分离。 ④用针刺破其实小孔处的壳膜，再用橡皮乳头吸出气室内的空气，是绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室（图Ⅻ—4）。 ⑤用注射器通过窗口的壳膜窗孔滴0.05~0.1ml痘苗病毒液于毛绒尿囊膜上。 ⑥在卵壳的窗口周围涂上半凝固的石蜡，作成堤状，立即盖上消毒盖玻片。也可用揭下的卵壳封口，则将卵壳盖上，接缝处涂以石蜡，但石蜡不能过热，以免流入卵内。将鸡卵始终保持人工气室在上方的位置进行37℃培养，48~96h观察结果。 温度对痘苗病毒病灶的形成影响显著，应严格控制培养温度在37℃，高于40℃的培养温度，鸡胚不能产生典型病灶。 （2）尿囊腔接种用孵育10~12d的蛋胚，因这是尿囊液积存得最多。 ①将蛋胚在检卵灯上照视，用铅笔画出其实与胚胎位置，并在绒毛尿囊膜血管较少的地方做记号。 ②将蛋胚竖放在蛋座木架上，钝端向上。用碘酒消毒气室蛋壳，并用钢针在记号处钻一小孔。 ③用带18mm长针头的1ml注射器吸取鸡新城疫病毒，针头刺入孔内，经绒毛尿囊膜入尿囊腔，注入0.1ml病毒液（图Ⅻ—5）。 ④用石蜡封孔后于37℃孵卵器孵育72h。 （3）羊膜腔接种 ①将孵育10~11d的蛋胚照视，画出气室范围并在胚胎最靠近卵壳的一侧做记号。 ②用碘酒消毒气室部位的蛋壳。用齿钻在气室顶端磨一三角形，每边约1cm的裂痕。注意
鸡胚中和试验试验方案
鸡胚中和试验试验方案 试验原理：中和试验是应用抗体使相应抗原(毒素或病毒)的毒性或传染性消失的试验。本实验通过先测定鸡胚半数致死量，确定病毒的毒力效价，应用病毒的毒力效价测定血清的中和滴度，即中和指数。 仪器及试剂： 打孔器，孵化箱，移液器，注射器，培养箱，恒温水浴锅，冰箱，石蜡，生理盐水，病毒液，血清等。 试验方法： 一．鸡胚半数致死量的测定（LD50）： 1.9日龄鸡胚分为11组，每组5只鸡胚，其中一组作为对照组。 2.将病毒液按10-1~10-10做倍比稀释。 3.分别将倍比稀释的病毒液经尿囊腔接种到鸡胚中，每只注射0.2ml，对照组注射等量的生理盐水。 4.逐日观察每组鸡胚的死亡数，并作记录。 5.按Reed和Muench氏法计算鸡胚半数致死量LD50。 二．鸡胚中和试验 1.通过对鸡胚半数致死量的测定，选择病毒液的稀释度，用灭菌生理盐水将病毒稀释成每0.1ml含有100个LD50。 2.血清处理，对血清56℃水浴加温灭活，并作10倍倍比稀释，1010-1~10-10。
3.将病毒液分别于稀释血清等量混合，于37℃感作1h。 4.对鸡胚分组，分为12组，每组5只鸡胚，实验组10组，正常对照组，以及病毒对照组（100个LD50）。 5.对实验组每个稀释度接种5只鸡胚，每只0.2ml。正常对照组注射0.2ml生理盐水。病毒对照组接种0.2ml含有100个LD50的病毒液。 6.置于37℃孵化箱孵育144h，弃去24h内死亡的鸡胚，此后每6h 照蛋一次，及时将死亡鸡胚取出，至144h将鸡胚全部取出，并放置4℃保存。 7.逐日观察每组鸡胚的死亡数，并作记录。 8.按Reed和Muench氏法计算中和指数。
IBV的鸡胚培养
IBV的鸡胚接种和培养规程 一．实验材料 鸡胚：选用健康无病鸡群或ＳＰＦ鸡群的新鲜受精蛋，一般选白或浅色壳蛋，以便照蛋时清晰，孵化至９～１０日龄。 1.接种材料：ＩＢＶ病毒液或组织病样，需要保证无菌处理。 2.器械：孵化箱、照蛋灯、蛋架、锥子、１ｍｌ和２.５ｍｌ注射器、镊 子、２%碘酊、75%酒精棉球、铅笔、酒精灯、剪刀、灭菌的疫苗瓶、蜡烛、铜筛网、０.２２μｍ过滤器。 二、实验步骤 １、鸡胚的孵化 打扫孵育箱：清理孵育箱中的垃圾，换掉脏水，用０.１％的新洁尔清洗蛋架、擦拭孵育箱各处。用甲醛和高锰酸钾熏蒸消毒：甲醛毫升数与高锰酸钾克数之比为2:1。福尔马林30mL/立方米，高锰酸钾15克/立方米。先用少量温水将高锰酸钾在玻璃容器中溶解，再加入福尔马林，人即离开，密闭箱门。熏蒸12~24h后再开启箱门。 孵化：条件相对湿度６０％，温度３７.５℃，每日翻蛋至少３次。孵化３～４天，用照蛋器观察：发育正常的鸡胚，血管清晰主要的分枝明显且呈鲜红色，鸡胚可以活动；未受精的蛋及时检出，死胚固定一端不动，看不到血管或血管消散，应检出。 ２.病毒接种材料的处理 病毒液：怀疑污染细菌的病毒液，经过滤器无菌过滤 组织病样：剪碎→研磨→２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ→取上
清→过滤 ３.照蛋：以铅笔划出气室，胚胎头的位置 ４.打扫无菌间：地面拖干净，桌面用０.１％的新洁尔擦拭干净，紫外照射２０ｍｉｎ。 ５.打孔：以2%碘酊对接种部位进行消毒，用75%酒精再擦一遍，用锥子在酒精灯火焰灼烧消毒后，在气室下沿无血管处扎一小孔。 ６.接种：针头从气室下沿小孔处插入，深１.５ｃｍ，即已穿过了外壳膜且距离胚胎有半指距离，注射量约０.２ｍＬ。注射后以蜡封闭小孔，置孵育箱中直立孵育，6小时后可以横放，以便翻蛋。