生物量碳氮测定方法(熏蒸提取法)
一、土壤微生物生物量碳测定方法（熏蒸提取－碳自动仪器法）
1、试剂配制
去乙醇氯仿制备：普通氯仿试剂一般含有少量乙醇作为稳定剂，使用前需除去。将氯仿试剂按1 : 2（v : v）的比例与去离子水或蒸馏水一起放入分液漏斗中，充分摇动1min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。得到的无乙醇氯仿加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。纯化后的氯仿置于暗色试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存（Williamss等，1995）。注意氯仿具有致癌作用，必须在通风橱中进行操作。
硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= 0.5mol L-1]：87.12分析纯硫酸钾，溶于1L去离子水。
六偏磷酸钠溶液[ρ( NaPO3)6 = 5g 100ml-1，pH2.0]：50.0g分析纯六偏磷酸钠缓慢加入盛有800ml 去离子水的烧杯中（注意：六偏磷酸钠溶解速度很慢，且易粘于烧杯底部结块，加热易使烧杯破裂），缓慢加热（或置于超声波水浴器中）至完全溶化，用分析纯浓磷酸调节至pH2.0，冷却后定容至1L。
过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2g 100ml-1]：20.0g分析纯过硫酸钾溶于去离子水，定容至1L，避光存放，使用期最多为7d。
磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100ml-1]：37ml 85%分析纯浓磷酸（H3PO4，ρ= 1.70g ml-1）与188ml 去离子水混合。
邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（C6H4CO2HCO2K）= 1000mg C L-1]：2.1254g分析纯邻苯二甲酸氢钾（称量前105℃烘2～3h），溶于去离子水，定容至1L。
2、仪器设备
土壤筛（孔经2mm）、真空干燥器（直径22cm）、水泵抽真空装置（图6–1）或无油真空泵、pH–自动滴定仪、塑料桶（带螺旋盖可密封，体积50L）、可密封螺纹广口塑料瓶（容积1.1L）、高温真空绝缘酯（MIST–3）、烧杯（25、50、80ml）。碳–自动分析仪（Phoenix 8000）、容量瓶（100ml）、样品瓶（40ml）。
1–真空干燥器，2–装土壤烧杯，3–装氯仿烧杯4–磨口三通活塞5–真空表
6–缓冲瓶7–抽真空管8–增压泵9–控制开关10–进水口11–出水口
（图6–1 土壤熏蒸抽真空装置）
3、操作步骤
（1）土样前处理
新鲜土样应立即进行前处理或保存于4℃冰箱中。测定前先仔细除去土样中可见的植物残体（如根、茎和叶）及土壤动物（如蚯蚓等），过筛（孔径< 2mm）并混匀。如土样过湿，应在室内适当风干至土样含水量约为田间持水量（Water-holding capacity，WHC）的40%（以手感湿润疏松但不
结块为宜），风干过程中应经常翻动，以避免局部干燥。如土样过于干燥，用去离子水调节含水量至田间持水量的40%。将土样置于密封的塑料桶内，在25℃下预培养7～15d，桶内有适量水以保持相对湿度为100%，并在桶内放一小杯1mol L-1 NaOH溶液以吸收产生的CO2。
土壤田间持水量的测定按Shaw（1958）方法改进。在漏斗下端连接一带夹子的橡胶管，漏斗内放一层玻璃纤维，取50g土样于漏斗中，夹紧橡胶管，加入50ml水，保持30min。再打开夹子使多余的水流入量筒，30min后测定流出的水量，同时测定土壤湿度，计算土壤田间持水量。
（2）熏蒸
称取经前处理相当于50.0g烘干基的新鲜土样3份，置于80ml烧杯中。将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有去乙醇氯仿（约2/3烧杯）的烧杯2～3只，烧杯内放入少量经浓盐酸溶液浸泡过夜后洗涤烘干的瓷片（0.5mm大小，防瀑沸），或放入抗瀑沸的颗粒，同时放入一小烧杯稀NaOH溶液以吸收熏蒸期间释放出来的CO2，干燥器底部还应加入少量水以保持湿度。按图6–1装置抽真空，也可采用无油真空泵（如DOA-P181-BN型真空/正压泵），真空度控制在–0.07Mpa以下，使氯仿剧烈沸腾3～5min。关闭真空干燥器阀门，在25℃暗室放置24h。熏蒸结束打开干燥器阀门时应听到空气进入的声音，否则为熏蒸不彻底，应重做。
取出氯仿（氯仿到回贮存瓶，可再使用）和稀NaOH溶液的烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（–0.07Mpa；5～6次，每次3min）直到土壤无氯仿味为止。每次抽真空后，最好完全打开干燥器，以加快去氯仿的速度。熏蒸的同时，另称取等量的土样3份，置于另一干燥器中但不熏蒸，作为对照土样。
（3）提取
将熏蒸土样无损地转移到200ml聚乙烯塑料瓶中，加入100ml 0.5mol L-1 K2SO4（土水比为1 : 4；w : v），振荡30min（300r min-1），用中速定量滤纸过滤于125ml塑料瓶中。熏蒸开始的同时，另称取等量的3份土样于200ml聚乙烯提取塑料瓶中，直接加入100ml 0.5mol L-1 K2SO4提取；另外作3个空白。提取液应立即分析，或在–18℃下保存。
注意提取液保存时间过长（>20h），会导致有机碳的测定结果下降。低温（–18℃）下保存的土壤提取液，解冻后会出现一些白色沉淀（CaSO4或K2SO4结晶），对有机碳测定没有影响（Brookes 等，1985），不必除去，但取样前应充分摇匀。
（4）测定
取10ml土壤提取液于40ml样品瓶中（注意解冻的提取液在取样前应彻底混匀），加入10ml六偏磷酸钠溶液（pH2.0），于碳–自动分析仪（Phoenix 8000）上测定有机碳含量。
工作曲线：分别吸取0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml浓度为1000mg C L-1邻苯二甲酸氢钾标准溶液于100ml容量瓶中，去离子水定容，即得0、20、40、60、80、100mg C L-1系列标准碳溶液，按上述方法测定。
（5）结果计算
土壤微生物生物量碳：B C = E C / k EC
式中：E C为熏蒸与不熏蒸土样的差值；k EC为转换系数，取值0.45（Wu等，1990）。
二、土壤微生物生物量氮测定方法（熏蒸提取－全氮测定法）
1、试剂配制
去乙醇氯仿：同上。
硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= 0.5mol L-1]：同上。
硫酸铜溶液[c（CuSO4）= 0.19mol L-1]：30.324g分析纯硫酸铜溶于去离子水，定容至1L。
氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 10mol L-1]：400g分析纯氢氧化钠溶于去离子水，定容至1L。
氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 4mol L-1]：160g分析纯氢氧化钠溶于去离子水，定容至1L，抽滤（0.45μm微孔滤膜）。
指示剂贮存液：0.500g氨混合指示剂溶于5.0ml 0.01mol L-1 NaOH和5.0ml 95%乙醇混合液，用去离子水定容至100ml。该贮存液使用期为1个月。
指示剂溶液：10ml指示剂贮存液用去离子水稀释至500ml，抽滤（0.45μm微孔滤膜）。注意：该溶液应使用的前1天配制，最多可使用1周。
氯化铵标准贮存液[ρ（NH4Cl）= 1000μg N ml-1]：3.8190g分析纯氯化铵（称量前105℃烘2～3h）溶于去离子水，并定容至1L。该贮存液在4℃下可稳定保存数月。
氯化铵标准溶液[ρ（NH4Cl）= 50μg N ml-1]：10ml 1000μg N ml-1氯化铵贮存液用去离子水稀释至200ml。该溶液最多保存7d。
2、仪器设备
流动注射氮分析仪（FIAStar5000）或定氮仪、pH自动滴定仪、真空抽滤瓶，微孔膜（<0.45μm）、容量瓶（100ml）、其他仪器设备同上。
3、操作步骤
（1）土样前处理、熏蒸和提取
同上。
（2）消化
取15.0ml上述提取液于250ml消化管中，加入0.3ml 0.19mol L-1硫酸铜溶液、5ml分析纯浓硫酸、及少量防瀑沸的颗粒物，混合液消化变清后再回流3h。
（3）消化液中氮测定
消化液冷却后，用去离子水洗涤转移到100ml容量瓶中，至体积大约为70ml；待冷却后缓慢加入10ml 10mol L-1NaOH溶液中和部分H2SO4，边加边充分混匀，以免因局部碱浓度过高而引起NH3的挥发损失，冷却后用去离子水定容至100ml。溶液中NH4+含量采用流动注射氮分析仪（FIAStar5000）测定。采用40μl样品圈，KTN扩散膜（耐强酸和强碱），载液为去离子水，试剂Ⅰ为4mol L-1 NaOH 溶液，试剂Ⅱ为指示剂溶液。
标准工作溶液制备：分别取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml 50μg N ml-1氯化铵标准溶液于100ml容量瓶中，再分别用去离子水洗涤转移1个空白消化液于容量瓶中，其余操作步骤同样液。用去离子水定容至100ml，即得浓度分别为0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5μg N ml-1系列氯化铵标准工作溶液，同上测定。其他具体操作参见仪器使用说明。
（4）结果计算
土壤微生物生物量氮：B N = E N / k EN
式中：E N 为熏蒸与不熏蒸土样的差值；k EN为转换系数，取值0.45（Jenkinson，1988；Brookes等，1985b）。
微生物生物量碳氮:
土壤微生物生物量碳：B C = E C / k EC
式中：E C为熏蒸与不熏蒸土样的差值；k EC为转换系数，取值0.45
其中：E C1=(TOC值-CK)*{浸提液体积+湿土重*含水量/(1+含水量)}/{湿土重/(1+含水量)}
=(TOC值-CK)*{浸提液体积*(1+含水量)+湿土重*含水量}/湿土重
含水量=水重/干土重
E C1为熏蒸或不熏蒸土样中每g干土中的碳含量
土壤微生物生物量氮：B N = E N / k EN
式中：E N 为熏蒸与不熏蒸土样的差值；k EN为转换系数，取值0.45
其中：E N’=FIA值-CK)*{浸提液体积+湿土重*含水量/(1+含水量)}*（定容体积/消化液体积）/{湿
土重/(1+含水量)}=(FIA值-CK)*{浸提液体积*(1+含水量)+湿土重*含水量}*（定容体积/消化液体积）/湿土重
含水量=水重/干土重
E N’熏蒸或不熏蒸土样中每g干土中的氮含量
土壤微生物生物量的测定方法
土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法） 基本原理 新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生 物生物量碳，用一定体积的LK 2SO 4 溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微 生物生物量碳含量。根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。 实验仪器 自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。 实验试剂 1）无乙醇氯仿（CHCL 3 ）； 2）L硫酸钾溶液：称取87g K 2SO 4 溶于1L蒸馏水中 3）工作曲线的配制：用L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、 70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。（其实一般情况下， 仪器会自带的标曲，一般不用自己做的） 操作步骤 土壤的前处理（过筛和水分调节略） 熏蒸 称取新鲜（相当于干土，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO 2 ，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。 抽真空处理 熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完
全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。（注意：熏蒸后不可久放，应该快速浸提）※ 浸提过滤 从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，加入40ml L硫酸钾溶液（土水比为1:4，考虑到土样的原因，此部分熏蒸和不熏蒸土均为4g，即，4g土：16ml的硫酸钾溶液，当然这个加入量要根据TOC仪器的进入量决定）300r/min振荡30min，用中速定量滤纸过滤。同时作3个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或—20℃冷冻保存（但使用前需解冻摇匀）（注意这部分很重要，有研究结果表明：提取液如果不立即分析，请保存在—20℃，否则将影响浸提液的效果，其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，建议使用那种一次性塑料注射器，配一个的滤头，一个才1元）。 TOC仪器测定 吸取上述土壤提取液10ul（这个要根据仪器自己的性能决定，但是一般情况下，在测定土壤滤液时候，要对其进行稀释，如果不稀释，一方面超过原来仪器的标曲，另一方面可能堵塞仪器。）注入自动总有机碳（TOC）分析仪上，测定提取液有机碳含量。由于总有机碳分析仪型号较多，不同的型号则操作程序存在较大差异，这里以本实验室使用的有机碳分析仪（Shimadzu Model TOC---500,JAPAN）为例。 计算 SMBC=(E C CHCL3—E C CK)*TOC仪器的稀释倍数*原来的水土比/ 2 土壤微生物生物量氮（茚三酮比色法） 土壤微生物生物氮一般占土壤全氮的2%—7%，是土壤中有机—无机态氮转化的一个重要环节，关于土壤微生物氮的测定常见的熏蒸浸提法有两种，一是全氮测定法，另一个是茚三酮比色法，如下 基本原理（茚三酮比色法）
常见的微生物检测方法
常见的微生物检测 方法
摘要：微生物的检测，无论在理论研究还是在生产实践中都具有重要的意义，本文分生长量测定法，微生物计数法，生理指标法和商业化快速微生物检测简要介绍了利用微生物重量，体积，大小，生理代谢物等指标的二十余种常见的检测方法，简要介绍了这些方法的原理，应用范围和优缺点。 概述： 一个微生物细胞在合适的外界条件下，不断的吸收营养物质，并按自己的代谢方式进行新陈代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用，则其原生质的总量（重量，体积，大小）就不断增加，于是出现了个体的生长现象。如果这是一种平衡生长，即各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，从而引起个体数目的增加，这时，原有的个体已经发展成一个群体。随着群体中各个个体的进一步生长，就引起了这一群体的生长，这可从其体积、重量、密度或浓度作指标来衡量。微生物的生长不同于其它生物的生长，微生物的个体生长在科研上有一定困难，一般情况下也没有实际意义。微生物是以量取胜的，因此，微生物的生长一般指群体的扩增。微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。因此生长繁殖情况就可作为研究各种生理生化和遗传等问题的重要指标，同
时，微生物在生产实践上的各种应用或是对致病，霉腐微生物的防治都和她们的生长抑制紧密相关。因此有必要介绍一下微生物生长情况的检测方法。既然生长意味着原生质含量的增加，因此测定的方法也都直接或间接的以次为根据，而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。微生物生长的衡量，能够从其重量，体积，密度，浓度，做指标来进行衡量。 生长量测定法 体积测量法：又称测菌丝浓度法。 经过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液（如10毫升）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间（如5分钟）和转速（如5000 rpm），离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为（10-v）/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。 称干重法：
土壤微生物量碳测定方法
土壤微生物量碳测定方法及应用 土壤微生物量碳（Soil microbial biomass）不仅对土壤有机质和养分的循环起着主要作用，同时是一个重要活性养分库，直接调控着土壤养分（如氮、磷和硫等）的保持和释放及其植物有效性。近40年来，土壤微生物生物量的研究已成为土壤学研究热点之一。由于土壤微生物的碳含量通常是恒定的，因此采用土壤微生物碳(Microbial biomass carbon, Bc)来表示土壤微生物生物量的大小。测定土壤微生物碳的主要方法为熏蒸培养法（Fumigation-incubation, FI）和熏蒸提取法（Fumigation-extraction, FE）。 熏蒸提取法（FE法） 由于熏蒸培养法测定土壤微生物量碳不仅需要较长的时间而且不适合于强酸性土壤、加 入新鲜有机底物的土壤以及水田土壤。Voroney (1983)发现熏蒸土壤用0.5mol·L-1K 2SO 4 提取 液提取的碳量与生物微生物量有很好的相关性。Vance等(1987)建立了熏蒸提取法测定土壤 微生物碳的基本方法：该方法用0.5mol·L-1K 2SO 4 提取剂（水土比1：4）直接提取熏蒸和不熏 蒸土壤，提取液中有机碳含量用重铬酸钾氧化法测定；以熏蒸与不熏蒸土壤提取的有机碳增 加量除以转换系数K EC (取值0.38)来计算土壤微生物碳。 Wu等（1990）通过采用熏蒸培养法和熏蒸提取法比较研究，建立了熏蒸提取——碳自动一起法测定土壤微生物碳。该方法大幅度提高提取液中有机碳的测定速度和测定结果的准确度。 林启美等（1999）对熏蒸提取-重铬酸钾氧化法中提取液的水土比以及氧化剂进行了改进，以提高该方法的测定结果的重复性和准确性。 对于熏蒸提取法测定土壤微生物生物碳的转换系数K EC 的取值，有很多研究进行了大量的 研究。测定K EC 值的实验方法有：直接法（加入培养微生物、用14C底物标记土壤微生物）和间接法（与熏蒸培养法、显微镜观测法、ATP法及底物诱导呼吸法比较）。提取液中有机碳的 测定方法不同（如氧化法和仪器法），那么转换系数K EC 取值也不同，如采用氧化法和一起法 K EC 值分别为0.38（Vance等，1987）和0.45（Wu等，1990）。不同类型土壤（表层）的K EC 值有较大不同，其值变化为0.20-0.50（Sparling等，1988，1990；Bremer等，1990）。Dictor 等（1998）研究表明同一土壤剖面中不同浓度土层土壤的转换系数K EC 有较大的差异，从表层 0-20cm土壤的K EC 为0.41，逐步降低到180-220cm土壤的K EC 为0.31。 一、基本原理 熏蒸提取法测定微生物碳的基本原理是：氯仿熏蒸土壤时由于微生物的细胞膜被氯仿破 坏而杀死，微生物中部分组分成分特别是细胞质在酶的作用下自溶和转化为K 2SO 4 溶液可提取 成分（Joergensen,1996）。采用重铬酸钾氧化法或碳-自动分析仪器法测定提取液中的碳含量，以熏蒸与不熏蒸土壤中提取碳增量除以转换系数K EC 来估计土壤微生物碳。 二、试剂配制 （1）硫酸钾提取剂（0.5mol·L-1）：取871.25g分析纯硫酸钾溶解于蒸馏水中，定溶至10L。 由于硫酸钾较难溶解，配制时可用20L塑料桶密闭后置于苗床上（60-100rev·min-1）12小时即可完全溶解。 （2） 0.2 mol·L-1（1/6K 2Cr 2 O 7 ）标准溶液：称取130℃烘2-3小时的K 2 Cr 2 O 7 （分析纯）9.806g 于1L大烧杯中，加去离子水使其溶解，定溶至1L。K 2Cr 2 O 7 较难溶解，可加热加快其溶 解。 （3） 0.1000 mol·L-1（1/6K 2Cr 2 O 7 ）标准溶液：取经130℃烘2-3小时的分析纯重铬酸钾4.903g， 用蒸馏水溶解并定溶至1L。
微生物细胞大小地测定方法
微生物细胞大小测定 一、实验目的 了解目镜测微尺和镜台测微尺的构造和使用原理，掌握微生物细胞大小的测定方法。 二、实验原理 微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小，只能在显微镜下来测量。 用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。 目镜测微尺（图-1 ）是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50 等分，或把10 mm长度刻成 100 等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上( 此处正好与物镜放大的中间像重叠) 来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际 表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正， 以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小方格所代表的相对长度。 镜台测微尺（图20-2 ）是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将lmm 等分为 100 格，每格长 l0 μ m（即 0.0lmm ），是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将镜台测微尺放在载物台上， 图 1 目镜测微尺图2镜台测微尺 由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野， 镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真 实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺 每格所代表的长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大 倍数下测量微生物大小。 即 三、实验器材 1．活材料：酿酒酵母( Saccharomyces cerevisiae) 、枯草杆菌(Baccillus subtilis) 染色标本片。 2．器材：显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、擦镜纸。 四、实验方法 1．目镜测微尺的校正把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板 上，把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微 尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重叠，再 使两尺的“ 0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度，计数两重合刻度 之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。因为镜台测微尺的刻度每格长l0 μ m，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。
凯氏定氮法：土壤微生物量氮测定
土壤微生物量氮的测定方法 1.试剂配制： (1)混合催化剂：按照硫酸钾：五水硫酸铜：硒粉=100：10：1，称取硫酸钾100g、 五水硫酸铜10g、硒粉1g。均匀混合后研细,贮于瓶中。 (2)密度为1.84浓硫酸。 (3)40%氢氧化钠：称400g氢氧化钠于烧杯中，加蒸馏水600ml，搅拌使之全部溶 解定容至1L。 (4)2%硼酸溶液：称20g硼酸溶于1000ml水中，再加入20ml混合指示剂。（按体 积比100:2加入混合指示剂） (5)混合指示剂：称取溴甲酚绿0.5g和甲基红0.1克,溶解在100ml95%的乙醇中, 用稀氢氧化钠或盐酸调节使之呈淡紫色，此溶液pH应为4.5。 (6)0.01mol的盐酸标准溶液：取比重1.19的浓盐酸0.84ml，用蒸馏水稀释至 1000ml，用基准物质标定之。 (7)0.5M K2SO4溶液：称取K2SO4 87.165g溶解于蒸馏水中，搅拌溶解，（可加 热）定容至1L。 (8)去乙醇氯仿的配制：在通风柜中，量取100毫升氯仿至500毫升的分液漏斗 中，加入200毫升的蒸馏水，加塞，上下振荡10下，打开塞子放气，而后加塞再振荡10下，反复3次，将分液漏斗置于铁架台上，静止溶液分层，打开分液漏斗下端的阀，将下层溶液（氯仿）放入200毫升的烧杯中，将剩余的溶液倒入水槽，用自来水冲洗。再将烧杯中的氯仿倒入分液漏斗中，反复3次。将精制后的氯仿倒入棕色瓶中，加入无水分析纯的CaCl2 10g，置于暗处保存。 2.试验步骤：。 （1）制样：称取新鲜土壤（30.0g）于放置烧杯中，加约等于田间持水量60%水在25℃下培养7~15d。取15.0g土于烧杯，置于真空干燥器中，同时内放一装有用100ml精制氯仿的小烧杯，密封真空干燥器，密封好的真空干燥器连到真空泵上，抽真空至氯仿沸腾5分钟，静置5分钟，再抽滤5分钟，同样操作三次。干燥器放入25℃培养箱中24小时后，抽真空15-30分钟以除尽土壤吸附的氯仿。按照土：0.5M K2SO4=1:4(烘干土算，一般就是湿土：0.5M K2SO4=1：2)，加入0.5M K2SO4溶液（空白直接称取15.0g土，加同样比例0.5M K2SO4溶液）震荡30分钟，过滤。 （2）测定：滤液要是不及时测定，需立即在-15℃以下保存，此滤液可用于微生物碳氮的测定。微生物碳测定只吸取2ml，采用重铬酸钾-硫酸亚铁滴定法测定。微生物氮吸取滤液10ml于消化管中，加入2g催化剂，在再加5ml浓硫酸，管口放一弯颈小漏斗，将消化管置于通风橱内远红外消煮炉的加热孔中。打开消煮炉上的所有加热开关进行消化，加热至微沸，关闭高档开关，继续加热。消煮至
生物量测定方法
生物量测定方法1树木生物量测定方法 1.1树木生物量的组成 一木树的生物量可以分为地下及地上两部分，地下部分是指树根系的生物量（WR）；地上部分主要包括树干生物量（WS）、枝生物量（WB）和叶生物量（WL）。在生物量的测定中，除称量各部分生物量的干重量外，有时还要计算它们占全树总生物量干重的百分数，此百分数称为分配比。树干占地上部分的分配比最大（一般为65～70%），而枝叶部分的分配比约各占15%左右。 与材积测定相比，生物量测定的对象更为复杂，测定的部分也多，因而使得生物量的测定工作即复杂又困难。但是树木生物量与树木胸径、树高等测树因子之间也有着密切的关系，这些关系也为树木生物量测定提供了依据。在树木生物量测定中，树冠量的大小与形状对枝、叶量的多少有着显著的影响，因此，在实际工作中，要研究反映冠形和冠量的因子，常用的因子有冠长率、树冠圆满度、树冠投影比等因子，这些因子的意义如下： ⑴冠长率是冠长与树高之比 ⑵树冠圆满度是冠幅与冠长之比。用以表明树冠的圆满程度，此值愈大愈圆满，反之而树冠狭长。 ⑶树冠投影比是冠幅与胸径之比。用以表明树木营养面积的相对大小，此值愈大则树木占有的相对空间愈大。 上述这些因子在枝叶生物量测定、估计及分析比较中起着较大的辅助作用。而且，这些因子与胸径、树高等测树因子之间有着密切的相关关系，这为利用测树因子直接估测树木生物量提供了依据。 1.2树木生物量鲜重和干重的测定 树体在自然状态下含水时的重量称为鲜重，它是砍伐后立即称量的重量。干燥后去掉结晶水的重量称为干重。在外业中只能测得树木的鲜重，然后采用各种方法将鲜重换算为干重，最常用的换算方法是计算树木的干重比（），即， 而（11-8） 式中可用取样测定获得。 （1）树干干重的测定方法 ①木材密度法
土壤微生物测定方法 (2)
土壤微生物测定 土壤微生物活性表示土壤中整个微生物群落或其中的一些特殊种群状态,可以反映自然或农田生态系统的微小变化。土壤微生物活性的表征量有:微生物量、Ｃ／Ｎ、土壤呼吸强度与纤维呼吸强度、微生物区系、磷酸酶活性、酶活性等。 测定指标: 1、土壤微生物量(Ｍiｅｒoｂia lBiomａｓｓ,MＢ) 能代表参与调控土壤能量与养分循环以及有机物质转化相对应微生物的数量,一般指土壤中体积小于５Χ１０3um3的生物总量。它与土壤有机质含量密切相关。 目前,熏蒸法就是使用最广泛的一种测定土壤微生物量的方法阎,它就是将待测土壤经药剂熏蒸后,土壤中微生物被杀死,被杀死的微生物体被新加人原土样的微生物分解(矿化)而放出CＯ2,根据释放出的CO２:的量与微生物体矿化率常数Kc可计算出该土样微生物中的碳量。因此碳量的大小就反映了微生物量的大小。 此外,还有平板计(通过显微镜直接计数)、成份分析法、底物诱导呼吸法、熏蒸培养法(测定油污染土壤中的微生物量—碳。受土壤水分状况影响较大,不适用强酸性土壤及刚施用过大量有机肥的土壤等)、熏蒸提取法等,均可用来测定土壤微生物量。 熏蒸提取-容量分析法 操作步骤: (1)土壤前处理与熏蒸 (2)提取 将熏蒸土壤无损地转移到２０0mL聚乙烯塑料瓶中,加入１00mＬ0、5mol·L－１K2SO4(图水比为１:4;w:v),振荡3０ｍiｎ(3０0ｒｅv·min-1),用中速定量滤纸过滤于12５mL 塑料瓶中。熏蒸开始的同时,另称取等量的3份土壤于20０ｍL聚乙烯塑料瓶中,直接加入100mｌL0、5mol·L-1Ｋ2ＳO４提取;另作3个无土壤空白。提取液应立即分析。 (3)测定 吸取10ｍL上述土壤提取液于150mL消化管(24mmх295mｍ)中,准确加入10mL0、018 mｏｌ·L－1K2Cｒ２O7—12ｍol·L－1H2SＯ4溶液,加入2～３玻璃珠或瓷片,混匀后置于１75±1℃磷酸浴中煮沸１０min(放入消化管前,磷酸浴温度应调至１７9℃,放入后温度恰好为１７5℃)。冷却后无损地转移至１5０mL三角瓶中,用去离子水洗涤消化管３~5次使溶液体积约为80mL,加入一滴邻菲罗啉指示剂,用０、05mol·L-1硫酸亚铁标准溶液滴定,溶液颜色由橙黄色变为蓝色,再变为红棕色,即为滴定终点。 (４)结果计算
生物量碳氮测定方法(熏蒸提取法)
一、土壤微生物生物量碳测定方法（熏蒸提取－碳自动仪器法） 1、试剂配制 去乙醇氯仿制备：普通氯仿试剂一般含有少量乙醇作为稳定剂，使用前需除去。将氯仿试剂按1 : 2（v : v）的比例与去离子水或蒸馏水一起放入分液漏斗中，充分摇动1min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。得到的无乙醇氯仿加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。纯化后的氯仿置于暗色试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存（Williamss等，1995）。注意氯仿具有致癌作用，必须在通风橱中进行操作。 硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= 0.5mol L-1]：87.12分析纯硫酸钾，溶于1L去离子水。 六偏磷酸钠溶液[ρ( NaPO3)6 = 5g 100ml-1，pH2.0]：50.0g分析纯六偏磷酸钠缓慢加入盛有800ml 去离子水的烧杯中（注意：六偏磷酸钠溶解速度很慢，且易粘于烧杯底部结块，加热易使烧杯破裂），缓慢加热（或置于超声波水浴器中）至完全溶化，用分析纯浓磷酸调节至pH2.0，冷却后定容至1L。 过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2g 100ml-1]：20.0g分析纯过硫酸钾溶于去离子水，定容至1L，避光存放，使用期最多为7d。 磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100ml-1]：37ml 85%分析纯浓磷酸（H3PO4，ρ= 1.70g ml-1）与188ml 去离子水混合。 邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（C6H4CO2HCO2K）= 1000mg C L-1]：2.1254g分析纯邻苯二甲酸氢钾（称量前105℃烘2～3h），溶于去离子水，定容至1L。 2、仪器设备 土壤筛（孔经2mm）、真空干燥器（直径22cm）、水泵抽真空装置（图6–1）或无油真空泵、pH–自动滴定仪、塑料桶（带螺旋盖可密封，体积50L）、可密封螺纹广口塑料瓶（容积1.1L）、高温真空绝缘酯（MIST–3）、烧杯（25、50、80ml）。碳–自动分析仪（Phoenix 8000）、容量瓶（100ml）、样品瓶（40ml）。 1–真空干燥器，2–装土壤烧杯，3–装氯仿烧杯4–磨口三通活塞5–真空表 6–缓冲瓶7–抽真空管8–增压泵9–控制开关10–进水口11–出水口 （图6–1 土壤熏蒸抽真空装置） 3、操作步骤 （1）土样前处理 新鲜土样应立即进行前处理或保存于4℃冰箱中。测定前先仔细除去土样中可见的植物残体（如根、茎和叶）及土壤动物（如蚯蚓等），过筛（孔径< 2mm）并混匀。如土样过湿，应在室内适当风干至土样含水量约为田间持水量（Water-holding capacity，WHC）的40%（以手感湿润疏松但不
生物量测定方法
生物量测定方法 1树木生物量测定方法 1.1树木生物量的组成 一木树的生物量可以分为地下及地上两部分，地下部分是指树根系的生物量（WR）；地上部分主要包括树干生物量（WS）、枝生物量（WB）和叶生物量（WL）。在生物量的测定中，除称量各部分生物量的干重量外，有时还要计算它们占全树总生物量干重的百分数，此百分数称为分配比。树干占地上部分的分配比最大（一般为65～70%），而枝叶部分的分配比约各占15%左右。 与材积测定相比，生物量测定的对象更为复杂，测定的部分也多，因而使得生物量的测定工作即复杂又困难。但是树木生物量与树木胸径、树高等测树因子之间也有着密切的关系，这些关系也为树木生物量测定提供了依据。在树木生物量测定中，树冠量的大小与形状对枝、叶量的多少有着显著的影响，因此，在实际工作中，要研究反映冠形和冠量的因子，常用的因子有冠长率、树冠圆满度、树冠投影比等因子，这些因子的意义如下： ⑴冠长率是冠长与树高之比 ⑵树冠圆满度是冠幅与冠长之比。用以表明树冠的圆满程度，此值愈大愈圆满，反之而树冠狭长。 ⑶树冠投影比是冠幅与胸径之比。用以表明树木营养面积的相对大小，此值愈大则树木占有的相对空间愈大。 上述这些因子在枝叶生物量测定、估计及分析比较中起着较大的辅助作用。而且，这些因子与胸径、树高等测树因子之间有着密切的相关关系，这为利用测树因子直接估测树木生物量提供了依据。 1.2树木生物量鲜重和干重的测定 树体在自然状态下含水时的重量称为鲜重，它是砍伐后立即称量的重量。干燥后去掉结晶水的重量称为干重。在外业中只能测得树木的鲜重，然后采用各种方法将鲜重换算为干重，最常用的换算方法是计算树木的干重比（），即， 而（11-8） 式中可用取样测定获得。 （1）树干干重的测定方法 ①木材密度法
土壤微生物生物量的测定方法氯仿熏蒸
. 土壤微生物生物量的测定方法 1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法） 1.1 基本原理 新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LKSO溶液提取土壤，借用有机碳自动分析42仪测定微生物生物量碳含量。根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换 系数（K），从而计算土壤微生物生物量碳。EC1.2 实验仪器 自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干 燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL）；32）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g KSO溶于1L蒸馏水中423）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、 70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。（其实一般情况下， 仪器会自带的标曲，一般不用自己做的） 1.4 操作步骤 1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略） 1.4.2 熏蒸 称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO，干燥器底部加入少量2水以保持容器湿度。盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分 钟。关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。 1.4.2 抽真空处理 熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完1 / 7 . 全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不※（注意：熏蒸后不可久放，应该快速浸提）熏蒸对照处理。 1.4.4 浸提过滤聚乙烯
土壤可溶性有机氮,硝态氮,铵态氮和微生物量氮测定
土壤可溶性有机氮、硝态氮、铵态氮、微生物量氮最方便最简单的测定方法 1.母液制样：称取新鲜土壤（30.0g）于放置烧杯中，加约等于田间持水量60%水在25℃下培养7~15d。取15.0g土于烧杯，置于真空干燥器中，同时内放一装有用100ml精制氯仿的小烧杯，密封真空干燥器，密封好的真空干燥器连到真空泵上，抽真空至氯仿沸腾5分钟，静置5分钟，再抽滤5分钟，同样操作三次。干燥器放入25℃培养箱中24小时后，抽真空15-30分钟以除尽土壤吸附的氯仿。按照土：0.5M K2SO4=1:4(烘干土算，一般就是湿土：0.5M K2SO4=1：2)，加入0.5M K2SO4溶液（未熏蒸为空白直接称取15.0g土，加同样比例0.5M K2SO4溶液）震荡30分钟，过滤。其中熏蒸后的土壤过滤液为A母液，未熏蒸的土壤过滤液为B母液。母液要是不及时测定，需立即在-15℃以下保存 2.测定 可溶性有机氮=可溶性全氮-（铵态氮+硝态氮） 要是有流动分析仪器还有TOC的话可以利用A母液测得碳氮减去B母液的碳氮含量根据公式计算得出微生物碳氮，可以用B母液测的铵态氮、硝态氮和可溶性全氮，是很方便的。 以下的是用传统的方法测定以上指标，经过852个土壤样品试验结果还是很好的。
土壤可溶性全氮测定 氧化剂:将6g NaOH 和30g K2S2O8溶于蒸馏水中并定容至1 L(K2S2O8 比较难溶，在低于60℃得瑟水浴中溶解，高于60℃配置的溶液至其氧化性失效，NaOH制成溶液，致其温度达到常温后与K2S2O8 溶液混合定容至1L) 测定：移取A母液10ml至消化试管，加入10ml氧化剂，水浴中加热，温度升高到120℃后保持90min，使用紫外分光光度计测定A220和A275，空白需加入1ml氧化剂并同时作水浴处理。（Tips：农化上母液与氧化剂各取25ml，此处取其比例为1:1。） 标准曲线：0.7218g硝酸钾溶于水中，转入1000ml容量瓶中定容摇匀，制得浓度为100mg/L的氮标准贮存液。稀释10倍即为10mg/L 的氮标准溶液。吸取氮标准溶液（梯度为0ml，1ml，2ml，3ml，4ml，5ml，6ml；对应浓度分别为0 mg/L，0.02 mg/L，0.04 mg/L，0.06 mg/L，0.08 mg/L，0.10 mg/L，0.12mg/L）于50ml容量瓶中，各加入1ml 氧化剂并定容，得氮的标准系列，与样品同样消煮测定A220和A275。以A（A= A220-A275）为纵标，氮浓度为横标绘制标准曲线。 硝态氮测定1 注：硝态氮测定1仅适合于农田土壤，腐殖质含量比较低的土壤，森林土壤和腐殖质含量比较高的土壤不适用，因为森林土壤和腐殖质高的土壤有腐植酸的颜色，干扰比色可采用硝态氮测定2进行测定
土壤微生物生物量的测定方 法(氯仿熏蒸)
土壤微生物生物量的测定方法 1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理 新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。 1.2 实验仪器 自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。 1.3 实验试剂 1）无乙醇氯仿（CHCL3）； 2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中 3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、 70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的） 1.4 操作步骤 1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略） 1.4.2 熏蒸 称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。盖上真空干燥器盖子，
用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。 1.4.2 抽真空处理 熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。（注意：熏蒸后不 可久放，应该快速浸提）※ 1.4.4 浸提过滤 从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，加入40ml 0.5mol/L硫酸钾溶液（土水比为1:4，考虑到土样的原因，此部分熏蒸和不熏蒸土均为4g，即，4g土：16ml的硫酸钾溶液，当然这个加入量要根据TOC仪器的进入量决定）300r/min振荡 30min，用中速定量滤纸过滤。同时作3个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或—20℃冷冻保存（但使用前需解冻摇匀）（注意这部分很重要，有研究结果表明：提取液如果不立即分析，请保存在—20℃，否则将影响浸提液的效果，其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，建议使用那种一次性塑料注射器，配一个0.2um的滤头，一个才1元）。 1.4.5 TOC仪器测定 吸取上述土壤提取液10ul（这个要根据仪器自己的性能决定，但是一般情况下，在测定土壤滤液时候，要对其进行稀释，如果不稀释，一方面超过原来仪器的标曲，另一方面可能堵塞仪器。）注入自动总有机碳（TOC）分析仪上，测定提取液有机碳含量。由于总有机碳分析仪型号较多，不同的型号则操作程序存在较大差异，这里以本实验室使用的有机碳分析仪（Shimadzu Model TOC---500,JAPAN）为例。 1.5 计算
土壤微生物生物量的测定(滴定法)(精)
1. 土壤微生物生物量的测定 (滴定法 一、实验目的和内容 土壤微生物生物量是指土壤中体积小于5~10μm 3活的微生物总量, 是土壤有机质中最活跃的和最易变化的部分。耕地表层土壤中,土壤微生物量碳(Bc 一般占土壤有机碳总量的 3%左右,其变化可直接或间接地反映土壤耕作制度和微生物肥力的变化,并可以反映土壤污染的程度。近 30年来,国外许多学者对土壤微生物生物量的测定方法进行了比较系统的研究,但由于土壤微生物的多样性和复杂性,还没有发现一种简单、快速、准确、适应性广的方法。目前广泛应用的方法包括:氯仿熏蒸培养法(FI 、氯仿熏蒸浸提法(FE 、基质诱导呼吸法(SIR 、精氨酸诱导氨化法和三磷酸腺苷(A TP 法。 氯仿熏蒸浸提法(FE 的原理是:土壤经氯仿熏蒸处理,微生物被杀死,细胞破裂后, 细胞内容物释放到土壤中,导致土壤中的可提取碳、氨基酸、氮、磷和硫等大幅度增加。通过测定浸提液中全碳的含量可以计算土壤微生物生物量碳。 二、实验材料和用具 仪器:培养箱;真空干燥器;真空泵;往复式振荡机(速率 200次每 min ; 1L 广口玻璃瓶;定量滤纸;紫外分光光度计; LNK-872型消煮炉(江苏省宜兴市科教仪器研究所试剂: 1. 无乙醇氯仿:市售的氯仿都含有乙醇(作为稳定剂 ,使用前必须除去乙醇。方法为:量取 500ml 氯仿于 1000ml 分液漏斗中,加入 50ml 硫酸溶液[ρ(H2SO 4=5%], 充分摇匀, 弃除下层硫酸溶液, 如此进行 3次。再加入 50ml 去离子水, 同上摇匀, 弃去上部的水分,如此进行 5次。将下层的氯仿转移存放在棕色瓶中,并加入约 20g 无水 K 2CO 3,在冰箱的冷藏室中保存备用。 2. 硫酸钾溶液 [c(K2SO4=0.5mol·L -1]称取硫酸钾(K 2SO 4,化学纯 87.10g ,先溶于
微生物碳氮的测定方法——熏蒸提取法
二、土壤微生物量碳、氮的测定方法—熏蒸提取法 1．主题内容与适用范围 本方法采用氯仿熏蒸—提取测定土壤微生物量碳、氮，适用范围广，既适用于中性和微碱性土壤，也适用于强酸性土壤，并且适用于滞水土壤（如水稻土）和新施有机肥土壤。 2．方法提要 土样经氯仿熏蒸和未熏蒸两种不同处理后，用K 2SO 4 溶液浸提，提取液一部分用K 2 CrO 7 （重络酸钾）氧化法测定微生物量碳，另一部分用浓H 2SO 4 消煮、碱化蒸馏法测定微生 物量氮。 3．提取液的制备 3.1仪器、设备：抽气皿（真空干燥器）、无醇氯仿、抽气机、大铝盒、分析天平（感量： 0.01g）、小烧杯（50ml）、大塑料瓶（250ml）、大三角瓶（150ml）、40C的 冰箱、定量滤纸（15cm）、漏斗、保鲜膜 3.2试剂的制备：0.5 M K 2SO 4 溶液（化学纯）、 无醇氯仿（提纯方法：用1N H 2SO 4 溶液与氯仿(CHCl 3 三氯甲烷)按体积比2:1 于分液漏斗中振荡混匀，净置分离，共做3次；再用水代替硫酸与氯仿2:1 混匀，振荡分离，共5次，将提纯的氯仿放入到棕色试剂瓶中，加一勺无 水硫酸钠，保存） 3.3分析步骤： 3.3.1 称取12.50g鲜土(取土要准确、均匀，不要夹入有机残体)于大铝盒中。在抽气皿中放入盛有25ml无醇氯仿的小烧杯，小烧杯中放几张小纸片以便于观察沸腾。放入装土的大铝盒，连上抽气机，抽真空使氯仿沸腾5分钟，关紧活塞，关闭抽气机。包上黑布，置于阴暗处（250C）熏蒸24小时。到时间后，取出小烧杯后反复抽真空2~3次（每次5分钟），排除氯仿。 另称取一批同等重量的土放入大塑料瓶中，不做熏蒸处理，同样包上黑布，置于阴暗处24小时。 3.3.2 将步骤(3.1.1)中的两批土样转移到离心管中（红壤适宜离心管）。用注射器注入每 瓶50ml 0.5M K 2SO 4 溶液，盖紧瓶塞，振荡30分钟，离心5分钟后取出，用15ml定量滤纸 过滤到150ml大三角瓶中，应立即测定。如不立即测定，用保鲜膜封口（防止污染和挥发），保存在40C的冰箱中。 4．生物量碳的测定—K 2CrO 7 氧化法 4.1仪器、设备：DOC测定仪(冷凝装置4套、配套沸瓶装16个)、玻璃沸珠、1500W电炉两 个、变压器两个、滴定管（25ml） 4.2试剂的制备：蒸馏水、混合酸(浓硫酸:浓磷酸=2:1,分析纯) 、0.1000N K 2CrO 7 标准溶 液 邻菲罗啉指示剂、66.7mM（0.4 N）K 2CrO 7 溶液（19.6125g/L，分析纯） 0.02M (NH 4) 2 Fe(SO 4 ) 2 溶液：取15.69g/L溶于蒸馏水，用20ml浓硫酸（98%， 分析纯）酸化，而后定容至1L、4.3分析步骤： 4.3.1吸取2ml 0.4 N K 2CrO 7 溶液放入沸瓶，再吸15ml 混酸放入沸瓶，混合，加入等量的 玻璃球（约一小药匙，10个）。吸取步骤（3.2.2）中的过滤液8~10ml（根据含碳量多少而
生物测定方法
生长量测定法 体积测量法：又称测菌丝浓度法。 通过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液（如10毫升）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间（如5分钟）和转速（如5000 rpm），离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为（10-v）/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。 称干重法： 可用离心或过滤法测定。一般干重为湿重的10-20%。在离心法中，将一定体积待测培养液倒入离心管中，设定一定的离心时间和转速，进行离心，并用清水离心洗涤1-5次，进行干燥。干燥可用烘箱在105℃或100℃下烘干，或采用红外线烘干，也可在80℃或40℃下真空干燥，干燥后称重。如用过滤法，丝状真菌可用滤纸过滤，细菌可用醋酸纤维膜等滤膜过滤，过滤后用少量水洗涤，在40℃下进行真空干燥。称干重发法较为烦琐，通常获取的微生物产品为菌体时，常采用这种方法，如活性干酵母（activity dry yeast, ADY）,一些以微生物菌体为活性物质的饲
料和肥料。 比浊法： 微生物的生长引起培养物混浊度的增高。通过紫外分光光度计测定一定波长下的吸光值，判断微生物的生长状况。对某一培养物内的菌体生长作定时跟踪时，可采用一种特制的有侧臂的三角烧瓶。将侧臂插入光电比色计的比色座孔中，即可随时测定其生长情况，而不必取菌液。该法主要用于发酵工业菌体生长监测。如我所使用UNICO公司的紫外-可见分光光度计，在波长600nm 处用比色管定时测定发酵液的吸光光度值OD600，以此监控E.Coli的生长及诱导时间。 菌丝长度测量法： 对于丝状真菌和一些放线菌，可以在培养基上测定一定时间内菌丝生长的长度，或是利用一只一端开口并带有刻度的细玻璃管，到入合适的培养基，卧放，在开口的一端接种微生物，一段时间后记录其菌丝生长长度，借此衡量丝状微生物的生长。 微生物计数法 血球计数板法:
土壤微生物量碳氮测定方法
1.23.1 土壤微生物碳的测定——TOC-V CPH有机碳分析仪 一、方法原理 土壤有机碳的测量方法主要有两种，即氯仿熏蒸培养法和氯仿熏蒸—直接浸提法。 1．氯仿熏蒸培养法[1]：土壤经氯仿熏蒸后再进行培养，测定培养时间内熏蒸与未熏蒸处理所释放CO2之差来计算土壤生物量碳。 2．氯仿熏蒸直接浸提法[2]：土壤经氯仿熏蒸后直接浸提进行，测定浸提液中的碳含量，以熏蒸和不熏蒸土壤中总碳的差值为基础计算土壤微生物含碳量。 直接提取法与氯仿熏蒸培养法相比，直接提取法具有简单、快速、测定结果的重复性较好等优点。直接提取法测定土壤微生物量的碳的方法日趋成熟。现在氯仿熏蒸—K2SO4提取法已成为国内外最常用的测定土壤微生物碳的方法。本实验以氯仿熏蒸直接浸提法为例介绍土壤微生物量碳氮的浸提与测定。 二、主要仪器 振荡机、真空干燥器、真空泵、TOC-V CPH有机碳分析仪。 二、试剂 1．氯仿（去乙醇）：普通氯仿一般含有乙醇作为稳定剂，使用前要去除乙醇。将氯仿按照1︰2（v/v）的比例与蒸馏水一起放入分液漏斗中，充分振动，慢慢放出底部氯仿，重复3次。得到的无乙醇氯仿加入无水CaCl2，以除去氯仿中的水分。 2．0.5 mol·L-1 K2SO4浸提液：43.57g分析纯K2SO4定溶至1L。 四、操作步骤 称取过2mm筛的新鲜土样12.5g六份，置于小烧杯中。将其中三份小烧杯放入真空干燥器中，干燥器底部放3个烧杯，其中一个放氯仿，烧杯内放少许玻璃珠（防爆），另一个放水（保持湿度），再放一杯稀NaOH。抽真空时，使氯仿剧烈沸腾3-5 min，关掉真空干燥器阀门，在暗室放置24 h。熏蒸结束后，打开干燥器阀门，取出氯仿，在通风厨中使氯仿全部散尽。另三份土壤放入另一干燥器中，但不放氯仿。 将熏蒸的土样全部转移至150 mL三角瓶中，加入50mL 0.5 mol·L-1 K2SO4 (土水比为1:4)，振荡30min，过滤。未熏蒸土样操作相同，同时做空白。 五、结果计算 土壤微生物量碳 =（熏蒸土壤有机碳-未熏蒸土壤有机碳）/0.45 式中：0.45——将熏蒸提取法提取液的有机碳增量换算成土壤微生物生物量碳所采用的转换系数（kEc)。 一般量容法采用的kEc值为0.38，仪器分析法kEc 取值0.45。 六、注意事项 1．氯仿致癌，操作时应在通风厨中进行。 2．打开真空干燥器时，要听声音，如没空气进去的声音，试验需重做。 3．应注意试剂的厂家，有些厂家的K2SO4试剂不宜浸提土壤微生物量碳。 4．浸提液应立即用TOC-V CPH有机碳分析仪测定或在-18℃下保存。 1.23.2土壤微生物量氮的测定 一、方法原理 土壤微生物态氮是土样在CHCl3熏蒸后直接浸提氮含量，并进行测定，以熏蒸和不熏蒸
生物测定法
生物测定法 一．卵泡刺激素（FSH）生物检定法——幼大鼠卵巢增重法 1.实验材料及用具 1.1天平精度0.01mg 供试品称量用 精度0.1 mg 卵巢称重用 精度0. 1g 大鼠称重用 1.2实验用具注射器（1ml，精度0.01ml），吸管、移液管、烧杯、有塞玻璃瓶、玻璃棒、量筒、滤纸。 1.3手术用器械手术板、手术剪、直镊、眼科剪、眼科直镊、眼科弯镊。 1.4试剂氯化钠、牛血清白蛋白、氢氧化钠、绒促性素（HCG）。 2.溶液配制 2.1生理盐水称取氯化钠适量，加水配成0.9%的溶液。 2.2氢氧化钠溶液称取氢氧化钠适量，加水配成1mol/L氢氧化钠溶液。 2.3牛血清白蛋白生理盐水称取牛血清白蛋白适量，加入到生理盐水中，配成1mg/ml的牛血清白蛋白溶液，并用1mol/L氢氧化钠溶液调节值至7.2±0.2。 2.4溶媒称取已知效价的HCG（粉末原料或粉针均可）加入到牛血请白蛋白生理盐水种，混匀，配成20u/ml的溶液。 2.5标准品溶液 2.5.1取尿促性素标准品，放置至室温。割开安瓿（注意勿使内容物损失）立即用溶媒将内容物洗出按FSH的标示效价配成10u/ml或20u/ml标准品溶液，亦可直接配成相当于高剂量d s3浓度的溶液。 2.6标准品溶液的稀释 2.6.1根均动物品系、来源、季节按中国药典附录卵泡刺激素生物鉴定法的要求，选择标准品高、中、低3组剂量。一般高剂量为2～4u/ml，剂距r不得大于1：0.5。 2.6.2分别精密量取10u/ml或20u/ml标准品溶液适量，各精密加入一定量溶媒，配制成高、中、低三组标准品稀释液。 2.6.3稀释液至4～8℃保存，供3日内使用。 2.7供试品溶液 2.7.1按供试品FSH的标示效价或估计效价，同标准品溶液的配制。 2.7.1.1粉末放置至室温，迅速精密称取适量。将称得的毫克数，乘以标示单位数或估计效价，得总单位数。用溶媒配成10u/ml 或20u/ml的供试品溶液，亦可直接配成相当于高剂量d T3浓度的溶液。