谷胱甘肽过氧化物酶

本科生毕业论文（设计）
题 姓 学 专 班 学
目: 名: 院: 业: 级: 号:
谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）对灵芝生长发育中 的活性氧物质（ROS）的改变及理化性的质影响 于南 生命科学学院 生物科学 生物科学 101 班 13210101 师亮 职称: 讲师
指导教师:
2013 年 5 月 20 日 南京农业大学教务处制
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摘要 .......................................................................................................... 错误！未定义书签。 关键词 ...................................................................................................... 错误！未定义书签。 Abstract ................................................................................................... 错误！未定义书签。 Key words ................................................................................................ 错误！未定义书签。 引言 .......................................................................................................... 错误！未定义书签。 1 材料与方法 ........................................................................................ 错误！未定义书签。 1．1 材料 ....................................................................................... 错误！未定义书签。 1．1．1 菌种 .......................................................................... 错误！未定义书签。 1．1．2 CYM 培养基 ............................................................ 错误！未定义书签。 1．1．3 PDA 固体培养基 ..................................................... 错误！未定义书签。 1．1．4 试剂 .......................................................................... 错误！未定义书签。 1．1．5 主要仪器设备 .......................................................... 错误！未定义书签。 1．2 实验方法 ............................................................................... 错误！未定义书签。 1．2．1 ROS 的测定 ............................................................. 错误！未定义书签。 1．2．2 NBT 测定 ................................................................. 错误！未定义书签。 1．2．3 DAB 染色 ................................................................. 错误！未定义书签。 1．2．4 菌株对氧化物耐受性的检测 .................................. 错误！未定义书签。 1．2．5 胞内 Ca2+的荧光检测 .............................................. 错误！未定义书签。 1．2．6 三萜的测定 .............................................................. 错误！未定义书签。 1．2．7 菌丝分叉检测 .......................................................... 错误！未定义书签。 2 结果与分析 ........................................................................................ 错误！未定义书签。 2．1 GPX 沉默转化子胞内 ROS 含量上升 ......................... 错误！未定义书签。 2．2 NBT 染色显示 GPX 沉默转化子胞内超氧根离子含量上升错误！未定义书签。 2．3 DAB 染色显示 GPX 沉默转化子胞内 H2O2 含量下降...... 错误！未定义书签。 2．4 GPX 沉默转化子的菌株对氧化性物质的耐受力下降 ...... 错误！未定义书签。 2．5 GPX 沉默转化子胞内 Ca2+的含量下降 .............................. 错误！未定义书签。 2．6 GPX 沉默转化子菌株的三萜含量下降： .......................... 错误！未定义书签。 2．7 GPX 沉默转化子菌丝的分叉数减少 .................................. 错误！未定义书签。 3 讨论 .................................................................................................... 错误！未定义书签。 致谢 .......................................................................................................... 错误！未定义书签。 参考文献 .................................................................................................. 错误！未定义书签。
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谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）对灵芝生长发育中的活性氧物质 （ROS）的改变及理化性的质影响
生物科学 101 指导教师 于南 师亮
摘要：谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。
ROS 是需氧细胞在代谢过程中产生一系列活性氧簇,包括：O2-、H2O2 及 HO2、OH- 等。 生物体为了减少过氧化物质对机体的伤害，会通过 GPX 基因来调控体内过氧化物质的 含量。本次试验就是通过 GPXi（沉默）后测定真菌 ROS 信号通路中相关理化性质的改 变例如：ROS 的含量；ROS 调控的钙离子浓度等变化；菌株耐氧能力的改变。
关键词：GPXi；ROS；Ca2+；三萜；分叉
The influence of Glutathione peroxidase (GPX) on reactive oxygen species (ROS) and the physical and chemical properties change during the growth and development of ganoderma lucidum
Student Majoring in Biology Tutor Shi Liang Yu Nan
Abstract：Glutathione peroxidase (GPX) an important peroxide decomposition enzyme that is widely exist in organic cells. ROS is a series reactive oxygen species in the process of metabolism, which produced by Aerobic cells, including: O2 -, H2O2 , HO2 and OH-. In order to reduce the body damage caused by peroxide material the organism adjusts the content of ROS by controlling Glutathione peroxidase (GPX). Our experiments test the change of the fungal ROS signal pathway and the change of physical and chemical properties by making the GPX gene silent, such as the content of ROS, Calcium ions concentration and the tolerant ability to oxidizing substances. Key words: GPXi; ROS; Ca2+ concentration; Ganoderic acids; bifurcation
引言灵芝是非常珍贵的药用真菌，性微温，气特殊，味微苦涩。始载于汉代《神农 本草经》 ，被认为能“益心气，安精魂，补肝益气，坚筋骨”，列为上品。 《本草纲目》认 [i] 为灵芝有“滋补强壮，延年益寿”“利关节，治耳聋”等功效 。2000 年出版的《中华人民 共和国药典》收载灵芝（赤芝、紫芝）子实体为法定中药材，药典中规定的中药材是赤 芝或紫芝的干燥子实体[2]。同年，灵芝作为 10 种中草药之一也被收载于美国出版的《美 国草药药典和治疗概要》中，灵芝在国内和国际医药学界的地位可见一斑。 灵芝在分类系统上是隶属于真菌门(Eumycota)，担子菌亚门(Basidiomycotina)，层担 子 菌 纲 (Hymenomycetes) ， 无 隔 担 子 菌 亚 纲 (Holobasidiomycetidae) ， 非 褶 菌 目 (Aphyllophorales)，灵芝菌科(Ganodermataceae)，灵芝属(Eanoderma)[3]。 灵芝中含有多种有效化学成分，包括灵芝多糖、三萜化合物、核苷化合物和生物碱 类化合物等，其中三萜类化合物由于其广泛的药理活性已受到普遍关注，研究表明灵芝 中三萜化合物具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗 HIV、抗组织胺释放、保肝护肝等作用[4] 谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。在
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动物细胞中 GPX 的活性中心是硒半胱氨酸，其活力大小可以反映机体硒水平。但在真 菌细胞中关于 GPX 的这方面还不清楚。但可以确定的是它能使有毒的过氧化物 ROS 还 原成无毒的羟基化合物，从而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害。 ROS 是需氧细胞在代谢过程中产生一系列活性氧簇,包括：O2-、H2O2 、HO2、OH-。 低浓度的 ROS 可以促进转录因子的激活以及对细胞增殖、分化有积极作用。但是中、 高浓度的 ROS 通过细胞氧化应激反应诱导细胞凋亡甚至导致其坏死。生物体为了减少 ROS 对机体的损害会利用多种物质将其分解，而谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）就是其中 之一。 而 ROS 对生物体的影响还不止于此。已有研究表明，ROS 的积累可以影响 Ca2+的 含量[5]。研究发现，在动物细胞中 ROS 能够与钙信号通路进行互作，激活钙通道，增加 钙离子向胞内的流入进而影响钙信号传递。其中，钙离子作为生物体内重要的第二信使 参与多种生物学功能。但是此类调控机制在真菌是否依然适用却有待考证。但可以确定 的是，Ca2+的含量可以影响三萜的含量[6]。此类调控在细菌、真菌、植物的抗逆及促进 次级代谢产物积累方面都发挥了重要作用[8-10]。 本课题从检测 GPX 沉默菌株中胞内 ROS 的含量和钙离子含量以及 GPX 沉默菌株对 氧化性物质的耐受能力等几方面来研究 GPX 对 ROS 的影响。
1 材料与方法
1．1 材料 菌种
1．1．1
将南京农业大学生命科学院应用真菌实验室保藏的菌种 G20，URA3，GPXi1(G1)， GPXi3(G3)，GPXi4(G4)，GPXi5(G5)，GPXi7(G7)，GPXi9(G9)，GPXi10(G10)， GPXi11(G11)。 1．1．2 CYM 培养基
1％麦芽糖，2％的葡萄糖，0.2％酵母提取物，0.2％蛋白胨，0.05％MgSO4.7H2O， 0.46％KH2PO4。 1．1．3 PDA 固体培养基 去皮土豆 200g （切块煮沸 30min， 8 层纱布过滤取滤汁） ， 葡萄糖 20g， 定容至 1000mL， 加入 2%琼脂，高压灭菌 30min 后使用。 1．1．4 试剂
冰醋酸、高氯酸、香兰素、95%乙醇、无水乙醇、荧光增白剂、NBT、DBA。 1．1．5 主要仪器设备
分光光度计、烘箱、分析天平、天平、超声波清洗仪、摇床、28 ℃ 恒温培养箱、无 菌超净台、高压蒸汽灭菌锅、小型种子打碎机、恒温水浴锅等。 1．2 实验方法
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1．2．1
ROS 的测定
将南京农业大学生命科学院应用真菌实验室保存菌种 G20,，URA3，G1，G3，G4， G5，G7，G9，G10，G11 接种到 CYM 固体培养基上。将盖玻片灭菌后斜插入菌丝生长 的培养基中，待菌丝爬到盖玻片，在载坡片上滴上 DCFH-DA 染料菌丝染色 20min，在 荧光显微镜下观察并拍照。 1．2．2 NBT 测定
取适量 CYM 液体培养基中培养好的菌丝球于培养皿中，在培养皿中加入适量的 NBT 染液轻轻摇匀使之充分浸没菌菌丝球。在光照下染色2h 后观察不同菌种的菌菌丝 球边缘染色情况并拍照比较。 1．2．3 DAB 染色
将 CYM 液体培养基中培养好的菌丝球于培养皿中， 在培养皿中加入适量的 DAB 染 液轻轻摇匀使之充分浸没菌丝球。 在光照下染色8h 后观察不同菌种的菌落染色情况并拍 照比较。 1．2．4 菌株对氧化物耐受性的检测
将每一种菌株分别接种到加入 VK3和 KO2的 PDA 平板上并设置一组对照，在培养 箱中培养3-4天后取出。比较同一菌株的菌落在不同培养基上的形态差异并拍照记录。 测量菌落的直径大小并记录。 1．2．5 胞内 Ca2+的荧光检测
将南京农业大学生命科学院应用真菌实验室保存菌种 G20，URA3，G1，G3，G4， G5，G7，G9，G10，G11接种到 CYM 固体培养基上。将盖玻片灭菌后斜插入菌丝生长 的培养基中， 待菌丝爬到盖玻片， 将长有菌丝的盖玻片取下， 载玻片中间地上 Fluo-3AM 染料，盖上盖玻片，分别在4° C 和37° C 下染色1h。置于荧光显微镜观察并拍照。 1．2．6 三萜的测定
（1）将 CYM 固体培养基上的菌株分别接种至对应的液体 CYM 培养基震荡培养7天， 收集菌丝，置于60° C 烘箱过夜烘干至恒重，次日将其研磨成粉状装于1.5 mL 离心管中。 （2） 精密称取烘干的样品0.2 g， 用95%乙醇浸泡样品， 并定容至10 mL， 超声波破壁2 h， 每20 min 摇动一次，取1 mL 于1.5mL 离心管，于4000 rpm 的离心机上离心10 min，取上 清备用。 （3）空白制备：精密吸取0.1 mL 蒸馏水于10 mL 具塞试管中。 （4）样品的测定：精密吸取上清0.1 mL 于10 mL 具塞试管中，加香草醛0.2 mL，高氯 酸0.5 mL，加盖振荡混匀，于60 ° C 水浴中保温20 min，此时预热分光光度计，取出后迅 速用冰水冷却（10 min） ；之后加入5 mL 冰醋酸，加盖振荡混匀，然后于550 nm 处测吸 光值。
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（5）计算公式：W = CV1/MV2 × 100% C （μg）从标准曲线上查得样品分解液的三萜含量 V1（mL）样品定容体积 V2（mL）比色测定时所称取的浅样分解液体积 M（g）样品质量 W（%）灵芝三萜含量 1．2．7 菌丝分叉检测
将南京农业大学生命科学院应用真菌实验室保存菌种 G20，URA3，G1，G3，G4， G5，G7，G9，G10，G11 接种到 CYM 固体培养基上。将盖玻片灭菌后斜插入菌丝生长 的培养基中，待菌丝爬到盖玻片，将长有菌丝的盖玻片取下，载玻片中间地上荧光增白 剂染料，盖上盖玻片，染色 20min。置于荧光显微镜观察并记录分叉。
2 结果与分析
2．1 GPX 沉默转化子胞内 ROS 含量上升 将菌株接种在 CYM 培养基中， 在接种后四天观察活性氧的积累情况。 使用 DCFH-DA 染料染色。DCFH-DA 是一种过氧化氢的荧光探针，染色后在荧光显微镜下检测菌丝亮 度的差别，绿色荧光染色表明了活性氧的积累，亮度越高表明 ROS 含量越高。通过观 察可知，在荧光下经过基因沉默的各个菌种的亮度明显高于未经沉默的 G20和 URA3 （CK） 。说明 GPXi 菌株 ROS 含量高于 G20与 URA3（CK)，也就说明 GPX 沉默后胞内 ROS 含量会上升。
图1
灵芝菌丝细胞质中 ROS 的荧光检测
2．2
NBT 染色显示 GPX 沉默转化子胞内超氧根离子含量上升
NBT 染料是对超氧根离子（O2-）染色，经过 NBT 染色过后的菌丝球颜色越深就说 明超氧根离子含量越高。如图所示，沉默后的菌株的菌丝球明显比 G20、URA3（CK） 的菌丝球颜色颜色深，即说明 GPX 沉默转化子胞内超氧根离子含量上升。
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图2
NBT 染色后灵芝菌丝球的颜色变化情况
2．3 DAB 染色显示 GPX 沉默转化子胞内 H2O2含量下降 DAB 染料是对菌丝中的 H2O2染色， 染色后菌丝球颜色的深浅反映了 H2O2含量的高低。 如图所示，G20、URA3（CK）菌丝球的颜色明显比沉默后的菌株的菌丝球颜色深，即 说明其 H2O2含量高于 GPX 沉默后的菌株。
图3
DBA 染色后灵芝菌丝球的颜色变化情况
2．4 GPX 沉默转化子的菌株对氧化性物质的耐受力下降 VK3和 KO2是两种氧化性很强的物质。将实验菌株分别接种至加入这两种物质的 PDA 培养基中培养四天后取出。 判断菌株对氧化性物质的耐受力可以通过观察菌落的直 径大小来判定。如图所示，可以看出加入 VK3的培养基中的菌落直径与 CK 培养基中菌 落的直径变化并没有显著差异。但是加入 KO2的培养基中的菌落直径则明显变小，而且 GPXi 菌株菌落直径明显小于 G20和 URA3（CK） ，即说明 GPX 沉默转化子的菌株对氧
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化性物质的耐受性下降。
图4
CK 平板中菌落的大小
图5
加入 VK3后菌落直径的变化情况
图6
加入 KO2后菌落直径的变化情况
如图7所示，Y 轴为菌丝的相对生长速率（%） ，也就是 CK 培养基中菌株的直径与 对应 VK3培养基中菌株菌丝直径之差与 CK 菌株直径的比值。 通过数据软件处理分析发 现不同培养基培养的菌株之间差异不显著。但是与 G20相比 G4，G5，G9，G10，G11 （P<0.01）差异极显著，G3, G7(P<0.05)差异显著。
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图7
VK3对菌株相对生长速率的影响 （* P<0.05；** P<0.01）
如图8所示，通过数据分析软件分析可以得以看到，G1, G3, G4, G5, G9（P<0.01）差 极显著，G7, G11（P<0.05）差异显著。即说明 GPX 沉默后的菌株对氧的耐受性降低。
图8
KO2对菌丝相对生长速率的影响 （* P<0.05；** P<0.01）
2．5
GPX 沉默转化子胞内 Ca 的含量下降
2+
胞内钙离子含量检测用钙离子荧光探针 Fluo-3AM 法测定。Fluo-3 AM 是一种可以 穿透细胞膜的荧光染料。绿色荧光显示了细胞溶质中游离的钙离子，荧光亮度越高说明 钙离子含量越高。如图所示。GPX 沉默的各个菌种的亮度明显暗于 G20和 URA3(CK)。 这就说明 GPX 沉默菌株细胞内 Ca2+含量少于 G20和 URA3(CK)，也就说明了 GPX 基因 的沉默会使细胞内 Ca2+含量下降。
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图9
灵芝菌丝细胞质中 Ca2+的荧光检测
2．6
GPX 沉默转化子菌株的三萜含量下降：
对三萜测定数据进行分析，如图所示，G1，G3，G9（P<0.05）差异显著，而 G4和 G11（P<0.01）差异极显著。说明 GPXi 基因沉默后的灵芝三萜合成量明显低于 G20和 URA3（CK） ，也就说明了该基因影响了灵芝三萜的合成。
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*
GA content (mg/g)
20 15 10 5 0
* **
*
**
2．7
GPX 沉默转化子菌丝的分叉数减少
用荧光增白剂对菌丝染色在在荧光显微镜下拍照并观察，如图11所示，沉默菌株分 叉数明显少于野生型 G20和 URA3。
Px i1 G Px i3 G Px i4 G Px i G 9 Px i1 G 0 Px i1 1 U R A 3
图10 菌株三萜含量的检测 （* P<0.05；** P<0.01） 10
G
G
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图 11
灵芝菌丝的分叉荧光检测
为了检测菌丝分叉之间的距离， 本实验对每个菌株统计了50对菌丝分叉之间的距离。 Y 轴代表平均分叉距离，X 轴代表供试菌株，距离越小表示分叉越多。从图所示，GPX 沉默后的菌株平均分叉距离明显大于 G20和 URA3，而且经数据软件分析，G1，G7， G10，G11（P<0.05）差异极显著，G3，G4（P<0.01）差异显著。这就说明 GPX 沉默后 的菌株分叉数目减少。
图12
菌丝分叉的定量分析
(* P<0.05；** P<0.01)
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3 讨论
我们以实验室构建好的 GPX 基因沉默灵芝菌株和野生型灵芝菌株为材料， 经过无菌 操作分别接种到 CYM 固体培养基、CYM 液体培养基、PDA 固体培养基上来研究 GPX 沉默对灵芝菌株 ROS 的改变及相关理化性质的影响。 在本实验中，我们发现在 GPX 沉默以后，胞内总 ROS 含量会上升。这是由于 GPX 对 ROS 有降解的作用。当 GPX 沉默后，灵芝细胞内对 ROS 的降解能力会降低，就会 导致细胞内的 ROS 积上升。这与前人研究结果相符。 NBT 是对菌丝球超氧根离子染色，从实验结果可以看出，GPXi 菌株超氧根离子含 量高于 G20和 URA3。这是由于 H2O2和 O2-是灵芝 ROS 代谢途径的两个中间产物，而 GPX 的沉默会直接对 H2O2的代谢的其中一条途径发生阻断， 导致 H2O2积累。 O2-则是生 成 H2O2的底物，H2O2的积累会导致相关酶活力的下降，使底物 O2-含量升高。 DAB 是对菌丝球的 H2O2染色，从实验结果看出，GPXi 细胞中 H2O2含量少一些。 其结果与之前的报道有出入。这可能因为细胞中的 ROS 代谢是比较复杂的过程，据研 究，GPX 的沉默会直接对 H2O2的代谢的其中一条途径发生阻断，但 H2O2代谢还有其它 的途径。GPX 途径被阻断后，短时间内 H2O2的含量会暂时积累上升，而 H2O2含量上升 是否会加强其它的途径加强对 H2O2的分解，还需要我们的进一步研究。综合以上几点 可以说明在真菌细胞中 GPXi 会对 ROS 的含量造成影响。 用含有不同的氧化性物质（VK3、KO2）培养基培养菌株我们可以清楚地看到如下 结果。 对于加入 VK3的培养基培养出的菌株来说，虽然其菌落直径与 CK 培养基中的菌落 直径对比并没有什么区别， 但是从外形上观察可清楚的看出经过 VK3处理的菌落明显比 CK 疏松。至于 VK3是否会对菌株的生长产生影响还需要进一步实验说明。 用 KO2处理后的菌株可以明显的看出其菌落的直径减小。而且在处理组可以明显看 到 G20和 URA3（CK）的菌落直径明显大于 GPXi 菌株。这就说明了 GPXi 菌株对氧化 性物质的耐受性降低。 同具氧化性的这几种物质处理菌株但是却得到了不太相同的结果可能是由于这几种 物质的性质和结构不同。 对于 GPX、ROS、Ca2+之间的关系我从 Ca2+含量、菌丝分叉三萜含量，三个方面做 了实验得到了以下结果。 通过对细胞内三萜含量的检测我们可以看到 GPX 沉默后的三萜含量明显要低一些， 与已知三萜含量与 Ca2+含量是成正比报道相符。 已知，Ca2+含量与菌丝分叉数成反比。通过对菌丝分叉检测可以清楚地看到，经过 GPX 沉默后的菌株与 G20 和 URA3（CK）相比分叉明显减少。这与前人的报道有出入。 这可能是因为菌丝的分叉是由许多因素造成的，调节菌丝分叉可能出现其他的途径或者 方式，在现实验的条件下，钙离子对其影响不显著。 致谢 本次实验在生命科学学院的师亮老师和李晨旸师姐的悉心指导下进行。师老师为人 风趣幽默，知识渊博，做事严谨，一丝不苟。李晨旸师姐对有着雄厚的科研知识和严格
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的实验态度和熟练的实验技术。虽然平时都很忙但是还是给了我极大的鼓励与支持，耐 心的指导我的毕业实验。让基础较为薄弱的我的实验技能有了很大的提高。从论文选题 到搜集资料再到最终的实验，老师和师姐都事无巨细的给了我很大的支持与建议。在此 我要特别对你们表示深深的感谢。 参考文献：
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