具有抗南方水稻黑条矮缩病活性的药物小分子与水稻体内防御基因及

摘要 (1)

Abstract (2)

前言 (6)

第一章文献综述 (8)

1.1 病程相关蛋白 (8)

1.1.1病程相关蛋白的产生、定义和诱导因素 (8)

1.1.2病程相关蛋白的物理特性、分类和功能 (8)

1.1.3 PR-1蛋白 (9)

1.1.4病程相关蛋白与抗病性之间的关系 (11)

1.2 南方水稻黑条矮缩病 (12)

1.3小分子与蛋白相互作用研究进展 (13)

1.3.1荧光光谱法 (13)

1.3.2 ITC (14)

1.4结语 (15)

第二章论文设计及研究路线 (17)

2.1 研究目的和意义 (17)

2.2 拟解决的主要问题 (17)

2.3 研究内容 (18)

2.3.1感染SRBSDV水稻毒株的获得 (18)

2.3.2 PR-1a基因的表达调控 (18)

2.3.3重组质粒的构建 (18)

2.3.4 PR-1a蛋白的表达与纯化 (18)

2.3.5药物小分子与PR-1a蛋白的相互作用 (18)

2.4 技术路线 (19)

第三章材料与方法 (19)

3.1 实验材料 (20)

3.1.1 供试毒源和虫源 (20)

3.1.2 引物 (20)

3.1.3 载体和菌株 (20)

3.1.4 供试化合物 (20)

3.1.5 实验试剂 (21)

3.1.5 实验仪器设备 (22)

3.1.6 主要溶液的配制方法 (23)

3.2 实验方法与步骤 (24)

3.2.1 感染SRBSDV水稻毒源的扩增 (24)

3.2.2 活体实验 (24)

3.2.3 水稻样本RNA的提取 (24)

3.2.4 反转录 (25)

3.2.5 水稻带毒情况的检测 (26)

3.2.6 荧光定量PCR (26)

3.2.7 PR-1a目的基因片段的扩增与回收 (27)

3.2.8 pGEX-6P-1 质粒DNA 和目的DNA 片段的酶切 (28)

3.2.9重组质粒的构建及鉴定 (31)

3.2.10 PR-1a蛋白的小试表达 (32)

3.2.11 PR-1a蛋白的大量表达 (34)

3.2.12 PR-1a蛋白的纯化 (35)

3.2.13 PR-1a蛋白与药物小分子的相互作用 (37)

第四章结果与讨论 (39)

4.1 水稻总RNA的纯度检测 (39)

4.2 水稻带毒情况的检测 (39)

4.3 毒氟磷和宁南霉素诱导水稻体内PR-1a基因的表达研究 (40)

4.4 PR-1a基因片段的扩增 (42)

4.5 质粒pGEX-6P-1的提取及检测 (43)

4.6 重组质粒pGEX-6P-1-PR-1a的构建及验证 (44)

4.6.1重组质粒的构建 (44)

4.6.2重组质粒的验证 (44)

4.7 重组质粒pGEX-6P-1-PR-1a的小试表达 (46)

4.8 重组质粒pGEX-6P-1-PR-1a的大量表达 (47)

4.9 PR-1a蛋白的纯化 (48)

4.9.1 PR-1a蛋白的变性 (48)

4.9.2 PR-1a蛋白的MS鉴定 (49)

4.9.3 PR-1a蛋白的复性 (49)

4.9.4 PR-1a蛋白的定量 (50)

4.10 PR-1a蛋白与抗病毒剂的相互作用研究 (51)

4.10.1 荧光滴定 (51)

4.10.2 ITC (52)

第五章结论 (55)

5.1 主要结论 (55)

5.2本文创新之处 (56)

5.3 本文的不足之处 (56)

致谢 (57)

参考文献 (58)

附录 (63)

课题来源 (63)

论文发表情况 (63)

原创性声明 (64)

摘要

植物受外界刺激后，PR-1a基因能被大量地诱导表达，PR-1a基因表达量的变化与植物的抗病性密切相关，说明PR-1a基因在植物抗病过程中起着非常重要的作用。在感染烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus, TMV) 的烟草上喷施毒氟磷和宁南霉素，能使PR-1a基因的表达量上调，从而诱导烟草产生抗病性。田间药效试验发现，毒氟磷和宁南霉素具有一定的抗南方水稻黑条矮缩病病毒(Southern rice black streaked dwarf virus, SRBSDV) 的活性，毒氟磷和宁南霉素是否也是通过调控PR-1a基因表达量的变化而诱导水稻产生抗病性还未见报道。病程相关蛋白(Pathogenesis-related proteins, PRs) 是一类水溶性蛋白，其中PR-1a 蛋白是植物抗病过程中的关键蛋白，研究PR-1a蛋白与抗病毒剂之间的相互作用具有重要的意义。

本论文采用荧光定量PCR的方法研究了不同时间条件下毒氟磷和宁南霉素对感SRBSDV水稻体内PR-1a基因表达量的影响；采用原核表达的方法，诱导表达了PR-1a蛋白，对PR-1a蛋白进行了变性，纯化和复性，并用高分辨质谱鉴定了PR-1a蛋白；采用荧光光谱法和等温滴定量热法(Isothermal titration calorimetry, ITC) 研究了宁南霉素、香菇多糖、毒氟磷、GUJHZX-039、GUJHZX-023和GUJHZX-027等抗病毒剂与PR-1a蛋白之间的相互作用。

研究结果表明，毒氟磷和宁南霉素能诱导PR-1a基因表达上调，且毒氟磷诱导PR-1a基因表达上调的能力比宁南霉素强。第1 d和第3 d时，PR-1a基因的表达量上升，这是因为这时水稻受药剂和病毒的双重刺激，但在第5 d的时候，表达量又下降，这是因为药剂抑制了部分病毒的扩增，第7 d的时候表达量又上升，这是因为药剂的药效降低，未被抑制的病毒又开始扩增，使PR-1a基因的表达量又出现上调的趋势。荧光滴定和ITC的数据结果表明，毒氟磷和PR-1a蛋白的结合力较强，GUJHZX-023次之，GUJHZX-039很弱，宁南霉素、香菇多糖和GUJHZX-027与PR-1a蛋白之间没有结合。

关键词：PR-1a蛋白；抗病毒剂；原核表达；等温滴定量热法；荧光滴定；

荧光定量PCR

中图分类号：S435.111.1