双相电泳简易操作指南

目录

第一章样品制备 2

1.1 一般性原则 2

1.2 样品制备程序 3 1.

2.1 培养细胞样品处理方法 3

1.2.2 组织样品处理方法 3

1.2.3文献报道较多的裂解液配方 4

第二章第一向等电聚焦（IEF） 7

2.1 IPG胶条的水化和电泳 7

2.1.1 仪器 7

2.1.2 试剂 7

2.1.3 实验步骤 7

2.2 IPG胶条的平衡 9

2.2.1 仪器 10

2.2.2 试剂 10

2.2.3 实验步骤 10

第三章第二向SDS电泳 12

3.1 垂直SDS-PAGE 12

3.1.1 溶液 12

3.1.2 灌胶步骤 12

3.1.3 电泳步骤 14

第四章 2-DE胶蛋白质点的检测 15

4.1 考马斯亮兰染色 15

4.1.1 经典的考马斯亮兰染色程序 15

4.1.2 Neuhoff胶体考染法 15

4.1.3 热考马斯亮兰染色及二次染色法 16

4.2 硝酸银染色 16

Appendix I Troubleshooting 18

Appendix II Solutions 23

2DE分析流程：

样品制备（Sample preparation）

固相pH梯度胶条的水化（IPG strip rehydration）

第一向等电聚焦（IEF）

第一向胶条的平衡（ IPG strip equilibration）

第二向SDS电泳（SDS-PAGE）

检测染色（Detection/Staining）

第一章样品制备（Sample Preparation）

1.1一般性原则：

样品制备是双向电泳中最为关键的一步，这一步处理的好坏将直接影响2-DE结果。目前并没有一个通用的制备方法，尽管处理方法是多种多样，但都遵循几个基本的原则：1）尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；2）减少对蛋白质的人为修饰；3）破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。

根据这一原则，样品制备需要四种主要的试剂：离液剂(chaotropes),主要包括尿素（Urea）和硫脲（thiourea）；表面活性剂（sufactants），也称去垢剂，早期常使用NP-40、TritonX-100等非离子去垢剂，近几年较多的改用如CHAPS与Zwittergent系列等双性离子去垢剂；还原剂（reducing agents），最常用的是二硫苏糖醇（DTT），也有用二硫赤藓糖醇（DTE）以及磷酸三丁酯（TBP）等。当然，也可以选择性的加入Tris-base,蛋白酶抑制剂（如EDTA、PMSF or Protease inhibitor cocktails）以及核酸酶。

样品的来源不同，其裂解的缓冲液也各不相同。通过不同试剂的合理组合，以达到对样品蛋白的最大抽提。在对样品蛋白质提取的过程中，必须考虑到去除影响蛋白质可溶性和2DE重复性的物质，比如核酸、脂、多糖等大分子以及盐类小分子。大分子的存在会阻塞凝胶孔径，盐浓度过高会降低等电聚焦的电压，甚至会损坏IPG胶条；这样都会造成2-DE的失败。样品制备的失败很难通过后续工作的完善或改进获得补偿。

核酸的去除可采用超声或核酸酶处理，超声处理应控制好条件，并防

止产生泡沫；而加入的外源核酸酶则会出现在最终的2D胶上。脂类和多糖都可以通过超速离心除去。透析可以降低盐浓度，但时间太长；也可以采取凝胶过滤或沉淀/重悬法脱盐，但会造成蛋白质的部分损失。

因此，处理方法必须根据不同的样品、所处的状态以及实验目的和要求来进行选择。

1.2样品制备程序：

1.2.1培养细胞（culture cell）样品处理方法：

培养动物组织细胞由于没有细胞壁，因此可以将细胞收集下来，直接加入裂解缓冲液（Lysis buffer）抽提总蛋白。裂解缓冲液有多种配方，本实验室主要采用如下成份：

(A) 7M Urea，2M Thiourea，4％（w/v）CHAPS，40mM Tris-Base，40mM DTT，2％ Pharmalyte pH 3-10.

其他常用的裂解缓冲液如下：

(B) 9.5M urea, 2%(w/v) CHAPS, 0.8%(w/v) Phamarlyte pH3-10, 1%(w/v) DTT and 5mM Pefabloc proteinase inhibitor;

(C) 加入0.3-1% SDS在95o C煮样品5mins，冷却后加入至少5倍体积的（A）或（B）裂解液。

总蛋白抽提程序：

（1）培养细胞的收集；

（2）用磷酸缓冲液（PBS）洗细胞3次（室温，1000g，各2min）；（3）将细胞分装到1.5ml Eppendof管中，吸干残留的PBS；

（4）加入裂解缓冲液（1.5x106个细胞大约加入100μL裂解液），在室温振荡1h，使其充分溶解；

（5）4o C，40,000g，离心1h；

（6）吸取上清并用Brandford法定量蛋白，然后分装至Eppendof管里保存在-78o C备用。

1.2.2组织样品处理方法：

对大多数从动物或植物组织里提取总蛋白质而言，同样没有一种通用的程序。但遵循的原则基本相同。下面列出一种对植物树叶总蛋白的方法。

三氯醋酸－丙酮沉淀法（TCA/acetone precipitation）提取植物树叶总蛋白程序：

（1）在液氮中研碎叶片；

（2）悬浮于含10％三氯醋酸（TCA）和0.07%β-巯基乙醇(可用DTT

替代)的丙酮溶液在－20o C的冰浴；

（3）让蛋白质沉淀过夜然后离心（4o C，40,000g, 1h），弃上清；

（4）重悬沉淀浮于含0.07%β-巯基乙醇的冰预冷丙酮溶液里；

（5）离心（4o C，40,000g, 1h）后真空干燥沉淀；

（6）用（A）或（B）裂解液溶解沉淀，离心（4o C，40,000g, 1h）。（7）Brandford法定量蛋白，然后分装至Eppendof管里保存在-78o C 备用。

超速离心法：

（1）取材；

（2）用研钵在液氮冷冻条件下将样品研成粉末，每1g样品加入0.5ml裂解液，使用组织匀浆器匀浆30 s；

（3）组织悬液15℃，10 000×g离心10 min；

（4）上清液4℃，150 000×g超速离心45 min；

（5）小心避开上层漂浮的脂质层，吸取离心上清6℃ 40,000g再次离心50 min；（6）取离心上清。Bradford法定量，分装后置–75℃保存。

1.2.3 文献报道较多的裂解液配方

Lysis buffer A

(9 M urea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease

inhibitors)

Final concentration Amount

9 M 10.8 g

Urea (FW 60.06,

Sigma, >99.5%)

CHAPS (FW 614.89,

4% (w/v) 0.8 g

Sigma, >98%

Ultrapure H2O to 20 ml

prepare fresh or store in aliquots at –20℃

A cocktail of protease

inhibitors

DTT(FW 154.25, Promega) 1% 13 μL/200 μL Lysis

buffer (15.5×stock),

-20℃

Lysis buffer B

(7 M urea, 2 M thiourea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of

protease inhibitors)

Lysis buffer C

40 mM Tris-base (pH 9.5) in ultrapure H2O

Lysis buffer D

(8 M urea, 4% CHAPS, 40 mM Tris(base), 40 ml)

Final concentration Amount Urea (FW 60.06) 8 M 9.6 g

CHAPS 4% (w/v) 0.8 g

Tris base (FW 121.1)

Ultrapure H2O to 20 ml prepare fresh or store in aliquots at –20℃

A cocktail of protease

inhibitors

DTT (FW 154.25, Promega) 1% 13 μL/200 μL Lysis

buffer (15.5×stock),

-20℃

Lysis buffer E

(5 M urea, 2 M thiourea, 2% SB 3-10, 2% CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)

Final conc. Amount

Urea 5 M 3.0 g

Thiourea (FW 76.12) 2 M 1.52 g

SB 3-10 (FW 307.5) 2% 0.2 g

CHAPS 2% 0.2 g

Ultrapure H2O to 10 ml

A cocktail of protease

inhibitors

DTT (FW 154.25, Promega) 1% 13 μL/200 μL Lysis

buffer (15.5×stock),

-20℃

Lysis buffer F

100 μL SDS sample solution (1% w/v SDS, 0.375 M Tris-HCl, pH 8.8, 50 mM DTT, 25% v/v glycerol

注：CA、蛋白酶抑制剂混合物和DTT在临用前加入。

广谱蛋白酶抑制剂混合物（如加tris可不用此混合物）

成分终浓度

蛋白酶抑制剂混合物PMSF 35 μg/ml or 1 mM

EDTA 0.3 mg/ml (1 mM)

抑肽素0.7 μg/ml

亮肽素0.5 μg/ml

其中C-F是分步法提取的4种裂解液配方, C适于提取水溶性蛋白，D是经典配方，E适于提取膜蛋白配方，F适于提取难溶的沉淀蛋白。

欲了解更详细的样品制备信息，可参考：

https://www.360docs.net/doc/2718591051.html,/ch2d/protocols/protocols.fm1.html.

第二章第一向等电聚焦（IEF）

双向电泳的第一向IEF电泳采用IPGphor，实验将变得很简单。IPGphor包括半导体温控系统(18°C-25°C)和程序化电源(8000V，

1.5mA)。可采用普通型胶条槽一步完成胶条的水化、上样和电泳，大大减少操作步骤。IPGphor一次可进行12个胶条槽的电泳(7, 11, 13 ，18 ，24cm)，因采用高电压(8000V)，可缩短聚焦时间。最新推出的通用型杯上样胶条槽因采用可移动的上样杯和电极，适合任何长度的IPG胶条，尤其适合极性等电点蛋白的分离。

2.1 IPG胶条的水化和电泳

2.1.1仪器：

IPGphor

2.1.2试剂：

水化液（8M尿素，2%CHAPS，15mM DTT和0.5%IPG缓冲液）: 水化液需当天新鲜配制(可配成储液分装-20度保存，但不可反复冻融)。

尿素溶液加热温度不能超过37?C，否则蛋白会发生氨甲酰化。

2.1.3实验步骤：

一. 加样品水化

1.用样品溶解缓冲液(9M尿素，4%CHAPS，2%IPG缓冲液，40mM DTT,40mM Tris-base)溶解样品。蛋白质上样浓度不要超过10mg/ml，否则会造成蛋白质的集聚或沉淀。

2.吸取适量(见表 2.1)含有样品的水化液放入标准型胶条槽中，为确保样品充分进入胶条中，不要加入过量的水化液。

表2.1IPG胶条所需水化液体积

*如果水化时加入样品，此体积是加入样品后的终体积

3.从酸性端（尖端）一侧剥去IPG胶条的保护膜，胶面朝下，先将IPG 胶条尖端(阳性端)朝标准型胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡，最后放下IPG胶条平端(阴极)，使水化液浸湿整个胶条，并确保胶条的两端与槽的两端的电极接触。

4.IPG胶条上覆盖适量 Immobiline DryStrip覆盖油，盖上盖子。

5.将标准型胶条槽的尖端背面电极与IPGphor仪器的阳极平台接触；胶条槽的平端背面电极与 IPGphor仪器的阴极平台接触。

6.设置IPGphor仪器运行参数：IPG胶条水化的电压，温度和时间；等电聚焦电泳时的梯度电压和温度。电泳参数见表2.2 。

表2.2 IPGphor 运行条件

低电压时水化，有利于高分子量蛋白进入胶中，并减少蛋白形成聚集体。

7.IPG胶条水化后可自动进行等电聚焦电泳。

8.暂时不进行第二向的IPG胶条可夹在两层塑料薄膜中于-80°C保存几个月。

注意：不推荐每条IPG胶条的电流超过50μA，因为这有可能产生过多的热量且有可能损坏胶条和槽，IPG胶条甚至会烧胶。

二.不加样品水化

(一) 标准型胶条槽：

1.用适量的水化液进行胶条水化，方法同步骤3-5，水化过夜。

2.于胶条糟的加样孔中加入浓缩的样品。每个加样孔的一侧可加入7.5μl 样品(每个加样孔分别有两侧可加样)，采用此种方法上样，每个胶条槽最多可加入30μl样品。

3.设置IPGphor仪器运行参数：等电聚焦电泳时的梯度电压和温度，电泳参数见表。

4.进行等电聚焦电泳。

5.暂时不进行第二向的IPG胶条可夹在两层塑料薄膜中于-80°C保存几个月。

(二)通用型杯上样胶条槽：

1.采用Immobiline DryStrip水化盘或标准型胶条槽进行IPG胶条的水化，加入适量的水化液进行胶条水化，方法同步骤3-4，水化过夜。

2.将通用型杯上样胶条槽的尖端与IPGphor仪器的阳极平台接触；胶条槽的平端与IPGphor仪器的阴极平台接触。

3.将已水化的IPG胶条转移到通用型杯上样胶条槽。胶面朝上，先将IPG 胶条尖端(阳性端)朝胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，胶条必需横跨胶条槽的与IPGphor仪器的两个电极板接触的区域。对于7cm和11cmIPG 胶条，需将IPG胶条的平端距离胶条槽平端大约1.5cm处放置，并确保胶条位于胶条槽的中央(通用型杯上样胶条槽内四对凸起可用于指导胶条放置的位置)。

4.在IPG胶条表面上盖适量Immobiline DryStrip覆盖油(3-5ml)，充满整个胶条槽。

5.取两个IEF电极片，用去离子水浸湿后放在滤纸上，去除多余的水。

6.分别将两个IEF电极片放在IPG胶条胶的两端，分别将电极压在两个电极片的外缘。

7.样品杯可放在两个电极间除胶条槽内侧凸起外任何位置，对于碱性分离范围的IPG胶条，尽量将样品杯靠近阳极放置。

8.在样品杯中加入少量不含样品的水化液检查是否漏液。上样前吸走水化液。

9.上样前将样品离心去掉不溶物，每个样品杯最多可加样100μl。

10.盖上胶条槽的盖子，再盖IPGphor仪器的盖子。

11.设置IPGphor仪器运行参数：等电聚焦电泳时的梯度电压和温度。电泳参数见表。

2.2 IPG胶条的平衡：

IPG胶条平衡两次，每次15分钟。平衡缓冲液包括6 M 尿素和30% 甘油，会减少电内渗，有利于蛋白从第一向到第二向的转移。第一步平衡在平衡液中加入DTT，使变性的非烷基化的蛋白处于还原状态；第二步平衡步骤中加入碘乙酰胺，使蛋白质巯烷基化，防止它们在电泳过程中重新氧化，碘乙酰胺并且能使残留的DTT烷基化(银染过程中，DTT会导致点拖尾"point streaking") 。将IPG胶条轻轻润洗，并去除多余的平衡缓冲液，然后放入第二向SDS胶中。

如果缩短平衡时间，会影响一部分蛋白从IPG胶条转移到SDS胶的效率。这种情况下建议在蛋白从 IPG胶条转移到SDS胶后，将IPG胶条染色，以检查是否所有蛋白都已离开IPG胶条。

2.2.1仪器：

玻璃管 (200 mm 长, 20 mm i.d.), Parafilm, 振荡仪

2.2.2试剂：

1. 4x分离胶缓冲液（1.5M Tris-HCl, pH8.8和0.4%（w/v）SDS）：

45.5g Tris和1g SDS溶于200ml去离子水中，用6N HCl调节pH到8.8，最后用去离子水将体积补足到250ml，加入25mg叠氮钠并过滤。此溶液

可于4?C储存两周。

2. 平衡缓冲液 (0.05 M Tris-HCl , pH 8.8，6 M 尿素, 30% (w/v) 甘油和2% (w/v) SDS)：180 g尿素, 150 g甘油, 10 g SDS和16.7 ml分离胶缓冲液溶于去离子水中，最终将体积补足到500ml。此种缓冲液可于室温下保存两周。

3. 溴酚蓝溶液: 0.25% (w/v) 溴酚蓝溶于分离胶缓冲液中

25 mg溴酚蓝溶于10 ml 分离胶缓冲液中， 4?C储存。

2.2.3实验步骤：

1. 使用前每10ml平衡缓冲液中加入100mg DTT (相当于平衡缓冲液I)，根据表

2.3加入适量平衡缓冲液I和溴酚蓝溶液。取出IPG胶条分别放入玻璃管中(支持膜贴着管壁，每个玻璃管中放入一条IPG胶条)，用Parafilm封口，在振荡仪上振荡15分钟，倒掉平衡缓冲液 I。

2. 每10ml平衡缓冲液加入400mg碘乙酰胺(相当于平衡缓冲液II)。根据下表加入适量平衡缓冲液II和溴酚蓝溶液。用Parafilm封口，在振荡仪上振荡15分钟，倒掉平衡缓冲液 II。

表2.3 IPG胶条平衡液用量

3.用去离子水润洗IPG胶条一秒钟，将胶条的边缘置于滤纸上几分钟，以去除多余的平衡缓冲液。

4. IPG胶条的转移：将IPG胶条放在位于玻璃板之间的凝胶面上，使胶条支持膜贴着其中的一块玻璃板，用一薄尺将IPG胶条轻轻地向下推，使整个胶条下部边缘与板胶的上表面完全接触。确保在IPG胶条与板胶之间以及玻璃板与塑料支持膜间无气泡产生。

5. 可选操作：加入分子量标准蛋白

分子量标准蛋白溶液与等体积的1%琼脂糖溶液混合后，加入到IEF 上样纸片上能得到很好的效果。终浓度为0.5%的琼脂糖会凝聚，在施加电压前可以防止标准蛋白的扩散。

其他可选的方法是，将标准蛋白以15-20μl的体积加入到IEF上样滤纸片。如要减少加样量将上样滤纸片切成更小的面积。将上样滤纸片放在玻璃板上，将一定量的蛋白标准溶液加到上样滤纸片上，然后用镊子将上样滤纸片放置在IPG胶条末端一侧，与板胶的凝胶表面接触。

6. 最后用琼脂糖密封液进行封顶，用少量的密封液（约1-1.5ml) 使IPG 胶条被完全覆盖住，在此过程中不要产生气泡。

第三章第二向SDS电泳

目前由于更多的使用垂直的系统来进行第二向SDS-PAGE，故这里不再介绍水平的MultiphorII 系统。

3.1垂直SDS-PAGE：

3.1.1溶液：

1. 丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液（30.8%T，

2.6%C）：

30%（W/V）丙烯酰胺和0.8%甲叉双丙烯酰胺的水溶液。将300g丙烯酰胺和8g甲叉双丙烯酰胺溶解于去离子水中，最后用去离子水将体积补足到1000ml。过滤后可于4?C储存两周。

2. 分离胶缓冲液（1.5M Tris-HCl, pH8.6和0.4%（w/v）SDS）：

90.85gTris和2gSDS溶于400ml去离子水中，用6N HCl 调节pH到8.6，最后用去离子水将体积补足到500ml，加入50mg叠氮钠并过滤。此溶液可于4?C储存两周。

3. 10%（w/v）过硫酸铵溶液：

1g过硫酸铵溶于10ml去离子水中。此溶液需使用前新鲜配制。

4. 覆盖液（缓冲液饱和的异丁醇）：

混合20ml上述分离胶缓冲液和30ml异丁醇，等几分钟后去掉异丁醇层。

5. 取代液（50%(v/v)甘油和0.01%溴酚蓝水溶液）：

混合250ml甘油（100%）和250ml去离子水，再加入50mg溴酚蓝，搅拌几分钟。

6.低熔点琼脂糖溶液：含有0.5%(w/v)低熔点琼脂糖的电极缓冲液。

3.1.2灌胶步骤：

根据第一向IEF电泳时IPG胶条的大小选择第二向合适的垂直电泳槽。最新推出的Ettan DALT II 是为大规模、高通量、高重复性双向电泳第二向SDS-PAGE专门设计的。同时进行12块26 x 20cm板胶电泳，适于长至24cmIPG胶条。其灌胶模具每次最多可灌制14块胶。通常不需要浓缩胶。

表3.1 凝胶浓度与其对应的分离范围

表2.3 灌制垂直SDS胶的配方

*TEMED

1.按仪器说明书装好灌胶模具，倒入凝胶溶液（在Hofer DALT 和Ettan DALT II的灌胶模具中，拔掉灌胶的胶管后，取代液会把管道中剩余的凝胶溶液压入模具中）。在每块胶的上面加入覆盖液以得到平的凝胶上样平面。

2.灌胶后立即在每块凝胶上铺上一层用水饱和的正丁醇或异丁醇，以减少凝胶暴露于氧气，形成平展的凝胶面。

3.同时灌制多块凝胶时，室温下至少聚合3小时。聚合后倒掉覆盖在凝胶上的正丁醇溶液，并用凝胶储存液冲洗凝胶表面。

4.暂时不需要的凝胶可用塑料薄膜包好于4?C保存1-2天。将整个凝胶模具完全浸没在凝胶储存液中可4?C条件下保存1-2周。

3.1.3电泳步骤：

1.电泳槽中装满电泳缓冲液，并打开温控系统，调节温度为15°C。

2.将平衡好的IPG胶条浸入电极缓冲液中几秒钟。

3.将IPG胶条小心的放置于SDS胶面上，并轻压使IPG胶条与SDS胶

面充分结合，上面覆盖2ml热的琼脂糖溶液(75°C)，使琼脂糖在5分钟内凝固。其余的IPG胶条重复上述操作。

4.将胶盒插入电泳槽中，开始电泳。采用垂直的SDS胶电泳，不必象水平电泳一样，电泳过程中去除IPG胶条。

6. 当溴酚蓝染料迁移到胶的底部边缘即可结束电泳。

7. 跑好的胶转移到染色盒里固定，准备染色。

附1：SE600系统电泳参数：

o

附 2：Ettan Dalt II系统电泳参数：

o

第四章 2-DE胶蛋白质点的检测

2-DE胶蛋白质点的检测方法大致有：1）考马斯亮兰染色法；2)银染法；3）负染法；4）荧光染色法；5）放射性同位素标记法等。这几种检测方法的灵敏度各不相同。目前最常用的是银染法和考染法。由于银染的灵敏度是考染的50倍，故一般用银染法进行分析处理，再用考染法来进行样品微量制备。

4.1考马斯亮兰染色:

4.1.1经典的考马斯亮兰染色程序：

1 固定 20 % TCA 1h

2 染色 0.1% CBB in 40% EtOH/10% acetic acid 2h

3 脱色 40% EtOH&10% acetic acid 2x 30 min

4 强化 1% acetic acid overnight

5 清洗 deionized H2O 30 min

局限：灵敏度低（≈1μg protein/spot）

4.1.2 Neuhoff胶体考染法：

1 固定：12％（w/v）三氯醋酸（TCA） 2h

2 染色：200ml染色液混合50ml甲醇 16-24h

染色液：在490ml含2％（w/v）的H3PO4中加50g (NH4)2SO4直至完全溶解，再加0.5g CBB G-250（已溶于10mlH2O中），搅拌混合。无需过滤，使用前摇匀。

3 漂洗：

1）0.1 m ol/L Tris-H3PO4缓冲液（pH 6.5）漂洗两分钟；

2）25％（v/v）甲醇漂洗不超过1min

4 稳定：在20％的(NH4)2SO4中稳定蛋白质－染料复合物。

优点：背景低，灵敏度高，可达到200ng protein/spot.

4.1.3 热考马斯亮兰染色及二次染色法：

1 染色（0.025%(w/v)考马斯亮兰R350）：将1片Phast Gel Blue 药片溶入 1.6L 10%醋酸，将染色液加热到90o C倒入凝胶染色盘，振荡10min；

2 脱色：10%醋酸室温振荡脱色2h，期间需多次更换脱色液，脱色液可通过铺有活性炭的滤纸层过滤回收；

脱色液和染色液可重复使用。

脱色后的凝胶可进行扫描分析，选中的点可用Spot Picker自动切胶仪挖出，再进行后续的硝酸银染色可得到更多的蛋白点。用考马斯亮兰预染过的胶再进行银染灵敏度比单独银染更高，且热染过程迅速。

二次染色

待考马斯亮兰染色后的背景完全脱除后，可用以下的银染法进行二次染色。因为蛋白点已经经过固定，可直接从敏化步骤开始染色。

4.2硝酸银染色：

银染的方法种类很多，目前有文献报道的就有100多种。但是其准确的染色机制还不是特别的清楚。大致的原理是银离子在碱性pH环境下被还原成金属银，沉淀在蛋白质的表面上而显色。

由于银染的灵敏度很高，可染出胶上低于1 ng/蛋白质点，故广泛的用在2D凝胶分析上。待找到自己感兴趣的蛋白质点后，再通过考染富集该目的点，然后做进一步的肽段指纹图谱分析（PMF）或序列测定。随着质谱技术的不断完善和发展，对银染后的f mol级的蛋白质点直接测定已非难事。这里介绍一种可兼容质谱分析的银染方法，实验程序如下：

Step Solution (250ml per gel) Gel Type

1mm unbacked 1mm on film or glass support or 1.5 unbacked

固定25ml acetic acid, 100ml methanol

125ml milli-Q water

2x15 min 2x60 min

敏化75ml methanol, 0.5g Na2S2O3, 17g

NaAc, milli-Q water to 250ml

30 min 60 min

漂洗250ml milli-Q water3x5 min 5x8 min

银染0.625g AgNO3, milli-Q water to 250ml20 min 60 min

漂洗250ml milli-Q water2x1 min 4x1 min

显色 6.25g Na2CO3, 100μl formaldehyde,

milli-Q water to 250ml

4 min 6 min

终止 3.65g EDTA, milli-Q water to 250 ml10 min 40 min

漂洗250ml milli-Q water3x5 min 2x30 min

银染注意事项：

1). 很多银染程序都使用了戊二醛（glutardialdehyde），它能提高银染的灵敏度和染色结果的重复性，但是因为戊二醛会修饰蛋白质，从而会影响对蛋白质点的质谱鉴定和分析；

2). 保证所有的染色器皿绝对的干净，可使用玻璃或塑料做染色器皿；

3). 水的纯度对染色结果好坏影响是很大的，至少要用双蒸水（导电率<2μS），有条件的可使用Millipore water；

4). 染色过程中避免手去接触凝胶，必须戴上一次性手套或无粉乳胶手套；

5).所用的化学试剂一定是要分析纯（AR）。

Appendix I: Troubleshooting

1.总的策略

?化学试剂纯度要高，至少是分析级，目前国产试剂达不到纯度要求

?使用去离子水(电导<2uS)

?尿素和丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺需新鲜配制

?Deionize urea prior to use

?包含尿素的溶液加热温度不超过37°C,否则会发生蛋白质氨甲酰化

?过滤所有的溶液，使用干净无灰尘的容器

2.样品制备

?样品提取缓冲液(裂解缓冲液)必须新鲜配制。或者分装成1ml，于-78°C 冷冻保存，裂解缓冲液一旦溶解不能再冷冻

?如有必要，在细胞裂解时加入蛋白酶抑制剂。注意：几种蛋白酶抑制剂在DTT或β-巯基乙醇存在时失效

?40000g离心1小时以去除蛋白提取液中的不溶物

3.灌胶

?过硫酸铵溶液需新鲜配制。40%过硫酸铵溶液储存于冰箱中只能使用2-3天，低浓度过硫酸铵溶液只能当天使用

?TEMED需在氮气下储存，每6个月换一次

?带U型框的玻璃板需用疏水硅烷处理，避免胶聚合后与玻璃板粘连

?水平SDS浓缩胶中加入甘油(37.5%)的目的是为了减少电内渗

?如果SDS胶结合于GelBond PAG膜上， GelBond PAG膜需用去离子水

4.IPG胶条的水化

?IPG胶条需水化到0.5mm厚

?IPG胶条的的水化时间取决于水化缓冲液的组成。如果尿素(>8M)和去污剂(>1%)浓度过高，至少需水化6小时，最好过夜

?采用Multiphor II做第一向电泳时，水化后的IPG胶条需用去离子水清洗，否则IPG 胶条表面会有尿素结晶，干扰IEF。(使用IPGphor时，IPG 胶条水化后不必清洗)

?IPG胶条水化时，其胶面与水化盘或胶条槽之间避免产生气泡。采用胶条槽水化时，胶条上需覆盖硅油以防水化液挥发

5.第一相IEF

5.1采用样品杯上样

?样品体积不能少于20μl

?样品在阴极或阳极附近上样，未知样品需检查在何处上样，结果更好?样品浓度不能过高(最大10mg/ml)，以避免在上样位置生成蛋白沉淀。如果怀疑，最好用裂解缓冲液稀释，增大上样体积

?样品溶液中不能含高浓度的盐。脱盐或用裂解缓冲液稀释，低电压使样品慢慢进入胶中

5.2水化时加入样品

?样品溶液体积需根据IPG胶条大小调整(18cm长IPG胶条约需400μl样品溶液)，以保证水化后没有多余的样品留在水化盘中。

最好检查高分子量蛋白、碱性蛋白或膜蛋白是否进入IPG胶中

5.3等电聚焦

?使用IPG胶条时，不要进行预聚焦，否则会因为胶的电导非常低导致样品很难进入胶条

?为使样品进入胶的效率增加，采用30V低电压水化；继续以低电压梯度(200V，500V，1000V各1小时)进行电泳，最后达到8000V的进行电泳?聚焦时间跟IPG胶条的长度、pH范围有关。短的IPG胶条或宽pH梯度范围IPG胶条，聚焦时间短

?IEF结束后，如果IPG胶条暂时不进行第二向电泳，可于-78°C冷冻保存?上样附近有水析出是因为样品盐浓度过高，可脱盐或稀释样品，低电压上样，延长样品进入胶的时间

6. IPG胶条平衡和第二相(SDS-PAGE)

?平衡时间应该充分长(至少2 x 10分钟)

?平衡缓冲液包括Tris-HCl(pH8.8),SDS(1%),高浓度尿素(6M)和甘油(30%)提高蛋白质的溶解度并减少电内渗。第一步加入DTT(1%)是为了使蛋白去折叠；第二步加入碘乙酰胺是为了去除多余的DTT(银染过程中，DTT会导致点拖尾)

?对于非常疏水的蛋白或含有二硫键的蛋白，相对于DTT和碘乙酰胺，tributylphosphine更有效

?水平的SDS-PAGE：浓缩胶中加入大量的甘油(37%)是为了减少电内渗?水平的SDS-PAGE：浓缩胶的长度至少超过25mm

?蛋白从一向(IPG胶条)到二向(SDS胶)的转移为避免点拖尾和损失高分

7. 银染

?使用纯度高(分析级)的化学试剂

?使用高纯去离子水或双蒸水(电导<2uS) ?使用干净无灰的容器

?不要用手去碰胶，带手套或使用镊子

Appendix II: Solutions

常用试剂的配方：

A.裂解液(lysis solution)

(8M Urea, 4%CHAPS, 2% Pharmalyte3-10, 40 ml)

1.如果需要，尿素的浓度可以调高到9或者9.8M,也可用7M Urea，2M Thoiurea.

2.其他的去垢剂（如Triton X-100, NP-40, 还有其它的非离子去垢剂或者双性离子去垢剂）可以取代CHAPS.

3.如果需要，蛋白质酶的抑制剂和或者还原剂可以加入。

B．水化液

（不含有IPG buffer, Rehydration stock solution without IPG buffer）

分装贮存于-20℃

1.DTT和IPG buffer在用之前加入：每

2.5ml 水化液加7mg DTT.如果胶内上样，则样品液在用之前加入到2.5ml的水化液中。

0.如果需要，尿素的浓度可以调高到9或者9.8M.

3.其他的去垢剂（如Triton X-100, NP-40, 还有其它的非离子去垢剂或者双性离子去垢剂）可以取代CHAPS.

溴酚蓝储液