几种真菌的分离与鉴定

几种真菌的分离与鉴定
几种真菌的分离与鉴定

常见真菌的分离与鉴定

病原真菌的一般特性

真菌(Fungi)是微生物中的一个大类,是一群数目庞大的细胞生物,估计全世界已有记载的真菌有10万种以上。它们的子实体小者用显微镜才能见到,大者可达数十厘米,它们共同特征是具有真正的细胞核,产生孢子和不含叶绿素,以寄生或腐生等方式吸取养料,仅少数类群为单细胞,其他都有分支或不分支的丝状体,能进行有性或无性繁殖,具有纤维素(或其他葡聚糖)或几丁质的微纤维或两者兼有的细胞壁的有机体。对人类和动物致病的真菌大约100余种,属于病原真菌。

一、基本性状

(一)形态结构

真菌分单细胞真菌与多细胞真菌两大类,前者属于酵母菌(yeast)一般呈球形或卵圆形,后者称为霉菌(mold)或丝状真菌,呈丝状分枝,菌丝交织象绒球状,另有一些真菌可因寄生环境及培养条件(养料、温度、氧气等)的不同可交替出现两种形态,即在室温中呈霉菌型,在37℃或体内呈单细胞的酵母型,这类真菌有双相性,所以称之为双态真菌或二相真菌。

真菌的细胞结构与一般植物细胞相似,有定型的细胞核及完善的细胞器,但胞壁与细菌胞壁不同,不含粘肽而是由角质及葡聚糖组成,也含有脂多糖蛋白质,其中酵母菌及类酵母菌皆以出芽增殖,不生长真菌丝,革兰氏染色呈阳性,丝状真菌分菌丝及孢子两部分,形态多种多样,分述如下。

1.菌丝(Hypha)真菌在合适的环境中,由孢子生出嫩芽,称为芽管。芽管逐渐延长呈丝状,称菌丝。菌丝继续生长并生长分枝,增殖的菌丝交织组成菌丝体。其中一部分菌丝深入被寄生的物体或培养基中吸取养料,称为营养菌丝体。另一部分菌丝向空间生长,称为气生菌丝体。气生菌丝体能产生孢子者称为生殖菌丝体。菌丝中各个细胞间有明显分隔者,称为有隔菌丝。主要见于病原性真菌。很多非病原真菌的菌丝无明显分隔,称为无隔菌丝。有些菌丝可呈各种特殊形式,如球拍状、破梳状、螺旋状、结节状、关节状、鹿角状、假菌丝。

2.孢子生成孢子是真菌扩大繁殖的一种方式。真菌孢子的抵抗力、形态及作用等均与细菌芽胞不同,分为无性孢子及有性孢子两大类。不经过两性细胞的结合而形成的孢子叫无性孢子,这一繁殖过程称为无性繁殖。常见的无性孢子有5 种:关节孢子、厚壁孢子、孢子囊孢子、芽孢和分生孢子。病原真菌属于不完全菌纲,很少产生有性孢子,大多数是无性孢子。

(1)厚壁孢子:当真菌在不利环境中,由菌丝内胞浆缩浓和胞壁增厚而成,呈圆形。当环境好转时可生成芽管成长为菌丝。

(2)关节孢子:菌丝断裂形成长方形两端略钝圆的孢子叫关节孢子。如白地霉和粗球孢子菌。

(3)孢子囊孢子:为鞭毛菌和接合菌的无性生殖形式。孢子囊中所含的孢子来源于分枝菌丝或胞囊梗顶端膨大形成孢子囊,囊内原生质浓缩集聚,割裂而成,一般数目较多,孢子囊形态多样,因种而异。

(4)芽生孢子:由菌细胞出芽生成,见于念珠菌及隐球菌,前者(类酵母菌)出芽后孢子伸长呈丝状,但不见与母细胞分离,称为假菌丝,在假菌丝上的收缩点也可出芽成芽生孢子。

(5)分生孢子:是子囊菌和半知菌的无性孢子,也是半知菌分类的主要依据,单细胞的分生孢子称小分生孢子,有蒂或无蒂,侧生或游离,分散或成群,圆形、梨形、卵圆形或其它形状,表面粗糙或光滑,或有或无各种纹饰。多细胞的分生孢子称大分生孢子,有纺锤形、棒形、球棍形、镰刀形及其它形状,两端尖或圆或一端圆,厚壁或薄壁,壁光滑或粗糙,有色或无色,分隔有多有少。

(二)培养特性及繁殖方式

1.培养特性大多数真菌对营养要求不高,只需要水、盐,简单的氮源及碳水化合物就可生长,一般常用沙堡氏琼脂基(主要成分葡萄糖4%、蛋白胨1%、琼脂2%)培养都能生长。但需要弱酸性(pH 4~6)、较低孵育温度(22~28℃),充分温度和氧气供应才能生长良好。侵害内脏的某些真菌在37℃含血的培养基中生长良好。真菌生长都比较缓慢,大多需孵育数天后才成明显菌落,菌落有下列三种类型:

(1)酵母型菌落:外观湿润稠软致密,类似一般细菌菌落,镜检只见有圆形或椭圆形生芽细胞(例如隐球菌的菌落)。

(2)类酵母型菌落:外观性状似酵母型菌落,镜检除见有出芽的细胞外,尚可见到假菌丝(例如念珠菌的菌落)。

(3)丝状型菌落:由多数分枝的菌丝体向上生长组成疏松的绒球状,表面有很多孢子,显示各种色泽,菌落可呈棉絮状绒球状粉末状或石膏样,其正面和背面可显示各种不同色素,常作为鉴定菌种的参考。镜检可见有纵横交织的菌丝及各种孢子(例如各种癣菌的菌落)。

2.繁殖方式有多样性,包括出芽增殖,菌丝增长,菌丝分枝和断裂,产生无性孢子及有性孢子进行繁殖,因此它繁殖力很强,但生长速度较慢。

(三)变异性和抵抗力

真菌很容易发生变异,在人工培养基中多次移种或孵育过久,就可出现形态结构、菌落性状、色素以及各种生理性状(包括毒力)的改变,用不同的培养基和温度培养真菌,其性状也有改变,真菌对干燥阳光紫外线及一般化学消毒剂耐受性却较强。但对热的抵抗力却不强。60℃以上1小时即可杀死孢子及其菌丝,

在1%~3%石炭酸、2.5%碘酊、0.1%升汞及10%甲醛中可被灭活。用甲醛气体熏蒸被真菌污染的衣物用具,可杀灭真菌菌丝及其孢子。但真菌对一般抗菌素及磺胺药均不敏感。只对二性霉素、酮康唑、制霉菌素等非常敏感,治疗真菌感染常用此药。

(四)致病性与免疫性

1.致病性病原真菌的致病机制还是一个未完全解决的问题;根据其侵害部位,主要分为下列两类:

(1)浅部真菌病:主要由癣菌引起,大多为外源感染,常易侵害皮肤、指(趾)甲及须发等含角质的组织,引起癣症。

(2)深部真菌病:可由各种真菌引起,包括类酵母菌、二相真菌及丝状菌。侵害粘膜、皮下组织、内脏及脑膜等处,有时扩散全身,主要是内源性感染,也可由外源传染;前者是因机体抵抗力降低,如患重病,长期使用免疫抑制剂,广谱抗菌素或放射治疗,患恶性病,严重烧伤等时,造成体内菌群失调,以致常居在体内的某些真菌(如白念珠菌),甚至平时不致病的环境中的真菌(如曲霉、毛霉)等也会乘机侵害,一些传染性较强的内脏真菌病是内外源感染。

2.免疫性浅部真菌病一般在血中不产生特异性抗体,病后无免疫保护力,只是儿童头癣等青春期后头皮皮脂增多时可以自愈,以后不再感染,其他部位癣症治愈后仍可再感染。深部真菌病虽可产生抗体,但无明显免疫保护作用。

临床常见的病原性真菌

一、浅部真菌

(—)皮肤癣菌

皮肤癣菌又称皮肤丝状真菌,有下列三属(见表1),都只侵犯体表角化组织(皮肤,毛发及指甲和趾甲)。不侵害深部组织,或内脏,皆属外源性传染,由接触患癣病人、动物(狗、猫、鼠、牛、马等)或染菌物体而感染。

1.毛癣菌属

*红色毛癣菌

(1)直接镜检:皮屑及甲屑,分枝分隔的菌丝有时可断裂或关节孢子状,毛发:发外型感染表现为发外孢子排列成串。少数为发内型感染孢子在发内排列成链状;毛发穿孔试验阴性。

(2)培养特征:在葡萄糖蛋白胨琼脂,25℃,生长比较快,菌落形态有多

种表现,镜检也不完全一样,常见有下列四种:I 型:羊毛状:白色羊毛状菌丝充满斜面,典型的卷成筒状,边缘贴牢管壁,呈鲜红色,背面开始在中心有一红色小点,以后形成深红色环,最后成片为葡萄酒色,色素边缘划界非常明显。少数I 型菌株表现无红色色素,正面白色,背面呈淡黄色类似石膏I 型,亦有正面白色而背面呈灰黑色。II型:绒毛状:粉红色绒毛状菌丝生长,占斜面3/5,菌丝稀疏,透过菌丝可见粉红色的基底,背面颜色同I型相同。III型:粉未状:菌落表面稍有凸起,呈粉末状,粉红色,约占斜面的1/2~2/3,背面同I型。IV 型:沟纹状:菌落生长相对较慢,比以上三种类型为小,占斜面的1/3~1/2,菌落中央凸起,从中央向四周有排列比较整齐的放射状沟纹,边缘整齐,表面菌丝甚少。开始微带黄色,以后变粉红,背面同I型。

(3)菌种鉴定:①菌落特征及色素;②大小分生孢子的形态;③玉米粉吐温琼脂上产生红色色素;④毛发穿孔试验阴性;⑤尿素酶试验阴性。

*须癣毛癣菌

(1)直接镜检:皮屑内见分枝分隔的菌丝,甲屑内为关节状菌丝。毛发感染为发外型,发内有时有菌丝。

(2)培养特性:在沙氏上生长较快,菌落形态可分为两大类:毛型和粉型;下列I、II 型为毛型,III、IV、V 型属粉型。自炎症明显的皮损中所分离出的菌株多属粉型。毛型菌落外观均似红毛,应注意鉴别。具体分型①羊毛状(I 型),又称趾间毛癣菌,菌落生长快,白色羊毛状。气生菌丝较多且长,排列紧密,充满斜面,好象红毛,正面雪白,背面淡黄色。镜检见较细分枝,分隔的菌丝,胞浆浓。有少量球形或长形小分生孢子,无螺旋菌丝和大分生孢子。间或可见球拍菌丝及结节菌丝。②绒毛型(II型),生长快,菌落雪白。表面有紧密的细短气生菌丝,中央可有乳头状突起,边缘如刀切,背面棕黄色或棕红色。镜检见较细的分枝、分隔的菌丝,小分生孢子多,有时成葡萄串状,无螺旋菌丝或大分生孢子;③乳皮状(III型),开始为乳白色菌丝,不久一部分菌落变为粉末样,色微黄,光滑,似牛乳表面的一层薄膜,可一块块地挑取,中央有少许褶叠,边缘不整齐,背面淡黄或棕黄色。镜检见粗细不一,分枝分隔的菌丝和大量螺旋菌丝,间或可见破梳状菌丝,结节菌丝及球拍菌丝,大分生孢子少,棒状,两端圆,与分生孢子梗的连接处较窄,薄壁光滑,小分生孢子多,球形或长形,有时成葡萄串状排列。④粉末状(IV型),菌落粉末状,表面平坦、光滑。间或有少数白色气生菌丝,中央有乳头状凸起,边缘锯齿状。菌落生长快,充满斜面,色黄或奶油色,外观像石小、背面棕黄或棕红色。⑤颗粒状(V 型):生长快,菌落粉样,表面不平,呈颗粒状。有不规则的褶叠或沟纹,边缘不整齐。下面色黄带红或棕黄。背面棕红色。IV、V 镜检均见大量棒状大分生孢子及无数圆形的小分生孢子,少数长型。游离或葡萄状成串,有螺旋菌丝和球拍菌丝。

(3)菌种鉴定:①菌落形态;②菌丝较细,是皮肤癣菌中最细的一种;③ 螺旋菌丝多见;④大分生孢子的形态和球形小分生孢子;⑤尿素酶阳性;⑥毛发穿孔阳性。

(1)直接镜检:皮屑、甲屑内可见分枝分隔的菌丝或成串的孢子,病发取黑点部位的断发,毛发损害为发内型大孢子,呈关节型排列,充满整个发内,故毛发出皮即断。

(2)培养特性:在沙氏琼脂培养基室温培养菌落生长慢,开始为圆形、白色、潮湿发亮的菌落,类似酵母;以后中央褶叠或突起,产生紫色色素,并逐渐扩大,或中央紫色,边缘淡红色,最外围有一圈白色的环。培养基颜色不变,边缘无放射状菌丝,整齐如刀切,下沉不明显,背面无色至深紫色,少数菌株无颜色,呈无色紫色毛癣菌,镜检见粗细不一的菌丝,分隔较密,胞浆淡,有很多不规则的突起和肿胀,但无鹿角菌丝。厚壁孢子多,多为间生,偶见小分生孢子2~ 5 个大生分生孢子。

( 3 )菌种鉴定:①菌落形态,紫色色素;② VitB 能促进菌落生长,形

成大分生孢子;③发内型感染。

2.小孢子菌属

*羊毛状小孢子菌

(1)直接镜检:皮屑内见分枝、分隔的菌丝,病发为发外型感染。

(2)培养特性:在沙氏琼脂培养基上室温生长快。开始为黄色绒毛样生

长,2 周后菌丝较多,呈羊毛状,可充满大部分斜面。中央趋向粉未化。正面桔黄,背面红棕色,平皿中培养的菌落表面中央可有少数同心园,无放射状沟

纹。生长约4-5 周后开始变异,菌丝增多,大分生孢子减少或消失。镜检见大

量纺锤形,厚壁的大分生孢子。一端稍弯曲,末端有帽样肥大,有6-15 个分隔。小分生孢子较少,长形,无柄侧生。可有球拍状菌丝,破梳状菌丝,结节

菌丝及大量厚壁孢子等。

( 3 )菌种鉴定:①菌落形态及色素,在PDA 培养基上能产生黄色色素;

②特征性的厚壁、顶端膨大微弯曲,如戴帽的大分生孢子;③发外孢子型感染。

*石膏样小孢子菌

(1)直接镜检:皮屑内见菌丝或成串的孢子,病发为发外型感染,孢子较大,排列成串。

(2)培养特性:在沙氏琼脂培养基上室温生长快,开始为白色菌丝,后成

棕黄色粉未状菌落,凝结成片,菌落中心有隆起,外围有少数极短的沟纹,边缘不整齐,背面红棕色。镜检:见多数较小,纺锤形,4~6 个的大分生孢子,壁

厚1~3μm ,两端园,壁有刺,菌丝较少,小分生孢子棒状无柄,有时可见球拍状菌丝,螺旋,破梳状菌丝及结节菌丝。

(3)菌种鉴定:①菌落形态;②大分生孢子的形态;③毛发穿孔试验阳

性。

*絮状表皮癣菌

(1)直接镜检:皮屑及甲屑内见分枝分隔的菌丝。

(2)培养特性:在沙氏培养基室温生长快。菌落开始蜡状,高出斜面,表面有不规则的褶叠,上覆粉未样菌丝,黄绿色。较大的菌落中央有褶叠,外围可见放射状沟纹,最外围有不整齐的平滑圈。菌落下沉明显,培养基常为之开裂。背面黄至棕色。镜检:见典型的杵状大分生孢子,2~4 个分隔。游离端圆形,薄壁光滑,基部平截。常2~4个成群,无小分生孢子,老龄菌落厚壁孢子多,菌丝较细,分枝,分隔,间或可见球拍,结节和螺旋菌丝。

(3)菌种鉴定:①菌落特征;②典型杵状大分生孢子;③无小分生孢子。

二、深部真菌

(一)白念珠菌:(Candida albicans)

1.标本来源痰、大便、口腔或阴道分泌物、尿、脑脊液、胸水、脓液、皮屑及痂皮等。

2.直接镜检氢氧化钾涂片,可见卵圆形、圆形芽孢,薄壁,直径约2~4μm 芽孢,椭圆形芽孢的芽管延长形成假菌丝,有时在菌丝旁附着芽孢,PAS 染色为红色。

3.培养及镜检

(1)葡萄糖蛋白胨琼脂:30℃划线培养一天即有光滑小菌落生长,菌落为奶油色,闪光或呈蜡状,柔软光滑,老的菌落渐变硬,表面有皱褶或有毛发状突起。镜检,在菌丝交接处有群集的卵圆形孢子或在菌丝旁侧有少许芽孢,3.0~6.5×3.5~12.5μm。

(2)玉米培养基:菌落外观同上,镜检:菌丝很少分枝,有少量芽生孢子,在菌丝的顶端或侧缘有厚壁孢子,直径7~17μm。

(3)快速鉴定与鉴定程序:①将标本直接接种在科玛嘉上,24 小时出现翠绿色菌落,②将初代分离的酵母样菌接种在含1%吐温80米粉中,25℃室温中24~48 小时,镜检可见顶端产生圆形厚壁孢子或接种于0.5ml,正常人血清或羊血清中,置37℃温箱中,经1~2 小时镜检有芽生孢子及芽管形成,可初步鉴定为白念珠菌。③API 酵母快速鉴定:同化试验结果:葡萄糖+,麦芽糖+,乳糖-,半乳糖+。

二)热带念珠菌(Candida Tropicalis)

1.标本来源:同白念珠菌。

2.直接镜检:同白念珠菌。

3.培养及镜检:

(1)葡萄糖蛋白胨琼脂,在25℃中培养,菌落平滑有光泽,白色,时间较久表面有皱纹,粘稠,甚至有毛样外观,镜检可见卵圆形细胞或球形细胞(约5~9μm×6~12μm)。

(2)玉米琼脂:产生丰富的假菌丝及发育良好芽生孢子,但无厚壁孢子生长。

(3)快速鉴定:①科玛嘉培养基上,24 小时出现蓝灰色。②同化试验。

(三)克柔氏念珠菌(Candida Krusei)

⒈标本来源:同白念珠菌。

⒉直接镜检:同白念珠菌。

⒊培养及镜检:

⑴葡萄糖蛋白胨琼脂:菌落扁平,平滑、干燥,有时表面有皱折,通常是乳白色到淡黄,镜检所见:大多数孢子是较大的柱状,2.5~5.5μm×7.5~21.5μm,亦有少数短卵圆形孢子。假菌丝丰富,芽生孢子在菌丝上轮生。

⑵玉米琼脂:对称分枝的菌丝,芽生孢子较少,无厚壁孢子。

⑶葡萄糖蛋白胨液培养基:在培养基表面生长,与试管壁粘连。

⑷快速鉴定:①科玛嘉培养基上24小时出现淡粉红色菌落。②同化试验。

(四)近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)

⒈标本来源:同白念珠菌。

⒉直接镜检:同白念珠菌。

⒊培养及镜检:

⑴葡萄糖蛋白胨琼脂:乳酪样菌落,通常表面光滑,亦有菌落表面粗糙及皱折。镜检所见:卵圆形芽生孢子 2.5~5.0×4~8μm,假菌丝形成丰富。

⑵玉米琼脂:交叉分枝菌丝,侧生芽生孢子较多,无厚壁孢子。

⑶葡萄糖蛋白胨液基:无表面生长,在管底生长。

⑷快速鉴定:①科玛嘉培养上24小时出现粉色光滑菌落。②同化试验:API。

(五)光滑念珠菌(Candida glabrata)

⒈标本来源:痰、尿、血、皮肤、阴道、伤口、腹水、胸水、胆汁等。

⒉直接镜检:卵圆形芽生孢子,直径2~7μm或更大,单芽,位于孢子的细端,无荚膜,无子囊或菌丝。

⒊培养及镜检:

⑴葡萄糖蛋白胨琼:白色或奶油色乳酪样菌落,日久变棕灰色,表面平滑,稍有光泽,本菌只在酸性条件下生长,pH>6.5 即不生长,镜检:同直接涂片。

⑵快速鉴定:①科玛嘉培养基上24小时出现紫色菌落。②同化:API试验。

(六)胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)

⒈标本来源:痰、尿、血、大便、皮肤、CSF、咽喉、体液等。

⒉直接镜检:圆形或卵圆形,3~5μm 直径,有荚膜的芽生孢子,单芽生,孢子内有少数颗粒,无菌丝,不着色。

⒊培养及镜检:

⑴葡萄糖蛋白胨琼脂:25℃或37℃时,生长迅速,菌落10天内可达2~

2.5cm 直径,为乳酪样生长,边缘整齐,表面光滑,但无光泽,桔红,日久颜色逐渐消退,呈淡黄色或桔黄色,培养基不变色,镜检同涂片所见,有时可见假菌丝,无子囊。

⑵快速鉴定:①菌落产生红色色素;②使尿素琼脂由黄变红。

(七)新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)

⒈标本来源:脑脊液、痰、脓、尿、粪、血、活体组织及尸体解剖材料等。

⒉直接镜检:墨汁染色,可见圆形厚壁孢子,菌体直径约4~20μm,外围有一透光的厚荚膜,厚度约5~7μm,荚膜内的菌体可出芽或不出芽,孢内有一较大的反光颗粒(脂质颗粒,不是孢核)和许多小颗粒,可与白细胞或淋巴细胞相鉴别。

培养及镜检:

⑴在葡萄蛋白胨琼脂,25℃或37℃培养时,2~5 天即生长出乳白色细菌粘液性菌落,呈不规则圆形,表面有蜡样光泽,以后菌落增厚,颜色由乳白、奶油转桔黄色。非致病性隐球菌37℃不生长。镜检类似直接镜检,可见圆形孢子,直径2.5~8μm,多数有芽,孢子外围有荚膜,但荚膜开始甚狭,日久渐增厚,

无真菌丝及子囊孢子,但可有芽管。

⑵快速鉴定:①37℃生长;②尿素酶变红;③咖啡酸变棕色;④同化试验,不发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖等。

三、其它实验室常见的丝状真菌

⒈标本来源:皮屑,甲屑,耵聍,痰,粪,尿,脓液,活检与尸检组织标本。

⒉直接镜检:涂片见分枝,分隔的菌丝及足细胞,与外界相通腔道内标本中有时可见分生孢子头,为曲霉的特征结构。

⒊培养:初代用沙氏培养基,次代用察氏PDA培养基,接种后室温培养 2 周。少数能产生闭囊壳的曲霉需培养3周或更长时间。

⒋菌种鉴定:(1)菌落,菌落生长速度,表面质地,颜色,形态和气味等,其中颜色的特征较稳定,是曲霉分类的主要依据之一;(2)分生孢子头:分生孢子头的形态,颜色和大小。分生孢子头由顶囊、瓶梗、梗基和分生孢子链组成,是曲霉的特征性结构。(3)分生孢子梗或分生孢子柄,注意它的长短,颜色,表面粗糙或光滑,是否有隔等。(4)分生孢子梗上的顶囊,注意顶囊的大小,形态,颜色,梗占据顶囊表面积的大小等。(5)瓶梗及梗基:统称小梗,注意单层还是双层,有些既有单层又有双层,甚至同一顶囊上也两者兼有。(6)分生孢子:形态,大小,颜色,表面是否光滑及有无纹饰。(7)具有性生殖的曲霉能产生闭囊壳。(8)部分曲霉能产生壳细胞,足细胞。(9)有些能产生菌核。致病的曲霉有烟曲霉,黄曲霉,黑曲霉,土曲霉,构巢曲霉,棒曲霉,杂色曲霉,米曲霉等等。

(二)青霉属:

⒈标本来源:皮屑,甲屑,耵聍,痰,粪,尿,脓液,活检与尸检组织标本。

⒉直接镜检:可见分枝、分隔的菌丝,无顶囊,偶可发现帚状枝。

⒊培养:初代培养用沙氏培养基,次代培养用察氏或麦芽汁培养基。

⒋菌种鉴定:

(1)菌落特征:菌落形态包括生长速度、菌丝高度、颜色、渗出物、气味和质地。质地包括①绒状②絮状③束状。

(2)菌丝的粗细、颜色、埋伏型,部分埋伏型或部分气生型。

(3)分生孢子梗分枝或不分枝,是自气生菌丝亦成从埋伏菌丝上长出。单根或成束,壁光滑或粗糙。

(4)帚状枝:为青霉属的特征性结构,指分生孢子梗分枝处毛瓶梗的整个扫帚状结构。不包括分生孢子。

帚状枝的形状有 4 种:①单轮青霉组;②对称双轮青霉组;③不对称组;④ 对称多轮组。

(5)瓶梗:帚状枝的最后一级分枝即产孢细胞,大致分3 种类型:① 柱形;

②披针形;③瓶形。

(6)副枝:支持梗基的细胞称副枝,可有一个或一个以上。

(7)分生孢子:大小、颜色、形状、表面是否光滑或粗糙。

(8)菌核:闭囊壳。

⒌致病青霉有:产黄青霉、桔青霉、淡紫青霉、灰绿青霉、马尔尼菲青霉等。

小结

真菌特征是具有真正的细胞核,产生孢子和不含叶绿素,以寄生或腐生等方式吸取养料;

不同病原菌可通过培养、镜检、菌种鉴定上各有不同特征,可以进行分离和鉴定。

川芎内生真菌的分离与鉴定

川芎内生真菌的分离与鉴定 汪杨丽,严铸云,郭晓恒,宋杰,陈新,万德光 成都中医药大学药学院中药材标准化实验室,四川成都 (610075) E-mail:wangyangli27@https://www.360docs.net/doc/2c13927232.html, 摘要:目的:探讨川芎内生真菌类群与川芎品种和产地的关系。方法:采用平板分离法分离川芎的内生真菌,采用点植法对分离菌株进行分类鉴定。结果:从6个产地的川芎根茎样品共获得内生真菌50株,经形态观察分类鉴定为1纲、3目、4科、13属。结论:不同产地及不同品种川芎的内生真菌在数量、分布、种群及其组成存在差异,推测川芎的道地性可能和川芎内生真菌种群有关。 关键词:川芎,内生真菌,分离鉴定 川芎为伞形科(Umbelliferae)藁本属植物川芎(Ligusticum chuanxiong Hort.)的干燥根茎,具有活血行气、祛风止痛的功效,是著名的川产道地药材。四川都江、彭州为川芎的主要产区。此外,云南丽江、甘肃庄浪和华亭、江西等地也产,分别称“云芎”、“西芎”、“抚芎”[1~3]。有关不同产地及不同品种川芎的化学成分品质、药理、药效的研究报道较多[4],但至今未见从川芎根茎分离内生真菌及其内生真菌种群多样性的研究报道。根据内生真菌和植物互惠共生的关系[5,6],本文对不同产地及不同品种的川芎进行内生真菌的分离,探讨川芎在特定生境中的微生物群落结构的特征。 1. 材料与方法 1.1材料 1.1.1植物来源(见表1) 1.1.2 培养基 PDA培养基[7](马铃薯葡糖糖培养基)+青链霉素混合液[8](用于分离);PDA 培养基;促孢培养基(KH2PO41g、KNO31g、MgSO4.7H2O 0.5g、KCl 0.5g、淀粉0.2g、葡萄糖 0.2g、蔗糖 0.2g、琼脂15~20g、蒸馏水 1000ml、PH自然)。 表1 各种川芎的样品情况 药材名原植物部位采集地采集时间 川芎Ligusticum chuanxiong Hort. 根茎四川彭州敖平2006.5.20 川芎L. chuanxiong Hort. 根茎四川都江堰石羊2006.5.22 山川芎L. chuanxiong Hort. 根茎四川彭州小鱼2006.7.24 山川芎L. chuanxiong Hort. 根茎四川汶川水磨2006.8.10 西芎L. sinense Oliv. 根茎甘肃平凉市华亭马峡2006.9.14 云芎L. chuanxiong Hort. cv. Jinxiong根茎云南丽江泸沽湖2006.8.17注:以上品种经成都中医药大学严铸云副教授鉴定 1.2方法 1.2.1. 内生真菌的分离先去掉新鲜川芎的须根,用自来水将川芎根茎表面洗净,用5%的NaClO溶液浸泡5min,用自来水反复的漂洗,稍干后切成适宜大小的小块,在无菌的条件下,用75%酒精中浸泡5 min,用无菌水冲洗3~4次,无菌滤纸吸干,然后用无菌刀片将表皮削去,分别切成5 mm×5 mm×1 mm的小块种植于PDA培养基内,每个培养皿中放7小块,每个样品6个培养皿,置28℃恒温箱中培养3~15d,观察到培养基上从各植物组织块内部向周围

几种真菌的分离与鉴定教学文案

常见真菌的分离与鉴定 病原真菌的一般特性 真菌(Fungi)是微生物中的一个大类,是一群数目庞大的细胞生物,估计全世界已有记载的真菌有10万种以上。它们的子实体小者用显微镜才能见到,大者可达数十厘米,它们共同特征是具有真正的细胞核,产生孢子和不含叶绿素,以寄生或腐生等方式吸取养料,仅少数类群为单细胞,其他都有分支或不分支的丝状体,能进行有性或无性繁殖,具有纤维素(或其他葡聚糖)或几丁质的微纤维或两者兼有的细胞壁的有机体。对人类和动物致病的真菌大约100余种,属于病原真菌。 一、基本性状 (一)形态结构 真菌分单细胞真菌与多细胞真菌两大类,前者属于酵母菌(yeast)一般呈球形或卵圆形,后者称为霉菌(mold)或丝状真菌,呈丝状分枝,菌丝交织象绒球状,另有一些真菌可因寄生环境及培养条件(养料、温度、氧气等)的不同可交替出现两种形态,即在室温中呈霉菌型,在37℃或体内呈单细胞的酵母型,这类真菌有双相性,所以称之为双态真菌或二相真菌。 真菌的细胞结构与一般植物细胞相似,有定型的细胞核及完善的细胞器,但胞壁与细菌胞壁不同,不含粘肽而是由角质及葡聚糖组成,也含有脂多糖蛋白质,其中酵母菌及类酵母菌皆以出芽增殖,不生长真菌丝,革兰氏染色呈阳性,丝状真菌分菌丝及孢子两部分,形态多种多样,分述如下。 1.菌丝(Hypha)真菌在合适的环境中,由孢子生出嫩芽,称为芽管。芽管逐渐延长呈丝状,称菌丝。菌丝继续生长并生长分枝,增殖的菌丝交织组成菌丝体。其中一部分菌丝深入被寄生的物体或培养基中吸取养料,称为营养菌丝体。另一部分菌丝向空间生长,称为气生菌丝体。气生菌丝体能产生孢子者称为生殖菌丝体。菌丝中各个细胞间有明显分隔者,称为有隔菌丝。主要见于病原性真菌。很多非病原真菌的菌丝无明显分隔,称为无隔菌丝。有些菌丝可呈各种特殊形式,如球拍状、破梳状、螺旋状、结节状、关节状、鹿角状、假菌丝。 2.孢子生成孢子是真菌扩大繁殖的一种方式。真菌孢子的抵抗力、形态及作用等均与细菌芽胞不同,分为无性孢子及有性孢子两大类。不经过两性细胞的结合而形成的孢子叫无性孢子,这一繁殖过程称为无性繁殖。常见的无性孢子有5种:关节孢子、厚壁孢子、孢子囊孢子、芽孢和分生孢子。病原真菌属于不完全菌纲,很少产生有性孢子,大多数是无性孢子。 (1)厚壁孢子:当真菌在不利环境中,由菌丝内胞浆缩浓和胞壁增厚而成,呈圆形。当环境好转时可生成芽管成长为菌丝。

杜仲内生真菌的分离及其鉴定

杜仲内生真菌的分离及其鉴定 摘要:从杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)的根?茎?叶中分离得到80株内生真菌,经显微形态特征观察鉴定为14个属,其中根部33株涉及10个属,茎部26株涉及9个属,叶部21株涉及6个属?结果表明,杜仲的不同部位内生真菌的数量?分布和种群存有差异? 关键词:内生真菌;分离;鉴定;杜仲 Isolation and Identification of Endophytic Fungi from Eucommia ulmoides Abstract: Eighty strains of endophytic fungi attributed to 14 genus were isolated and morphologically identified from the roots, stems and leaves of Eucommia ulmoides Oliv.. Among them, 33 strains of 10 genera were obtained from roots,26 strains of 9 genera from stems, and 21 strains of 6 genera from leaves. The results showed the facts that the quantity, population, and distribution of the endophytic fungi were varied in different tissues of Eucommia ulmoides. Key words: endophytic fungi; isolation; identification; Eucommia ulmoides Oliv. 杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)是我国独有的杜仲科杜仲属中的单种植物,具有 降压?消炎?防癌抗癌等多种药用功效?杜仲全身是宝,经济价值极高[1]?近年来,杜仲研究?开发取得了突破性进展,更使其身价倍增?目前这一重要的药用植物在利用上一方面已出现野生资源匮乏?药材供应不足的问题,另一方面其产品开发与活性物质提取的研究又较活跃,故寻找类似的替代资源受到关注[2]?自发现了能够产生紫杉醇的内生真菌以来,植物内生真菌能够产生与宿主相同或相似的生物活性成分已逐步得到验证[3,4]?本研究对杜仲内生真菌的种类进行分离及鉴定,以期了解杜仲内生真菌的资源情况,进一步研究其生物多样性? 1材料与方法 1.1材料 分离所用材料为杜仲的根?茎?叶,采自西北农林科技大学林学院校园内,树龄约20年,树体健壮,无病虫害? 1.2培养基 分离培养基为WA-抗生素培养基:琼脂20 g,氨苄青霉素200 mg,链霉素200 mg,水1 000 mL?

一种抗真菌抗生素的分离纯化及初步鉴定

一种抗真菌抗生素的分离纯化及初步鉴定 摘要:从海南五指山采集的土样中分离到一株放线菌,编号为WS-23883,其发酵提取物对多种植物病原真菌具有很强的抑制活性?对其产物进行提取精制及制备液相纯化,获得了纯度达90%以上的化合物?生测表明,在20 μg/mL浓度下该抗生素对多种植物病原真菌的抑制率达100%?根据活性产物紫外吸收光谱,可判断其为一多烯大环内酯类抗生素?质谱分析表明,活性化合物分子质量约667 u,据此判断其为一四烯大环内酯类抗生素? 关键词:多烯大环内酯;抗生素;化合物;纯化;鉴定 Isolation, Purification and Preliminary Identification of A Kind of Antibiotic with High Antifungal Activity Abstract: One actinomyces strain WS-23883 was isolated from soil sample collected in Wuzhishan Mountain area, Hainan province. The extraction of the fermentation broth was bioassayed with some plant disease pathogens; and it exhibited high antifungal activity. The compound with purity above 90% was obtained through macroporus resin column absorbtion method and preparative HPLC. The bioassay showed that the inhitition ratio was 100% at the concentrition of 20 μg/mL. The UV absorption spectrum and mass spectrum showed that the compound was atetraene macrolide antibiotic. Key words: polyene macrolide; antibiotic; compound; purification; characterization 从海南五指山采集的土样中分离到一株放线菌,其发酵提取物对多种供试植物 病原真菌及某些腐生真菌具有很强的抑制活性?采用常规方法对该菌的发酵产物进行了提取精制,得到了纯度在90%以上的样品,从目标产物的紫外吸收光谱可判断其为一多烯类抗生素?HPLC-MS检测表明,活性产物分子离子峰为667,可以确定其分子质量约为667 u,综合分析后确定其为一四烯大环内酯类抗生素? 1材料与方法 1.1菌株 1.1.1抗生素产生菌编号为WS-23883,从海南五指山采集的土样中分离得到,由湖北省生物农药工程研究中心保存? 1.1.2生测指示菌番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)?小麦颖枯病菌(Septoria nodorum)?小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)?水稻纹枯病菌(Rhizoctonia

产纤维素酶真菌的分离和鉴定

产纤维素酶真菌的分离、筛选与鉴定 一、采样 地点:深圳大学杜鹃山深圳大学文科楼荔枝园深圳大学文山湖树丛 用具:灭菌信封小铁铲小刀分离培养基手套 采样的方法:取采样地点的表层土或地面15cm下的土样约10g,装入信封,立刻到实验室分离纯化 二、培养基: (1)马丁氏培养基:KH2PO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、琼脂20.0 g、水1000ml,pH 自然。 (2)PDA培养基:PDA培养基:用于里氏木霉的固体培养,含20 %土豆浸出液,1 %葡萄糖,2 % Agar。20 %土豆浸出液作法如下:将土豆去皮切碎,每20 g土豆加水100 ml,置电炉上煮20分钟,用纱布过滤,定容。 (均需要加入抗生素100μg/ml) 产酶筛选培养基(CMC培养基):羧甲基纤维素钠(CMC)20.0 g、蛋白胨5.0 g、酵母抽提物2.0 g、NaCl 5.0g、KH2PO4 1.0g、MgSO4·7H2O 0.2g、琼脂20g、蒸馏水1 000ml。 1%CMCNa底物溶液:1克CMCNa加热溶化于100ml pH值4.8,0.1mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中。 0.lmol/L的柠檬酸一柠檬酸钠缓 0.1mol/L柠檬酸: 含柠檬酸·H2O 21.01克/1000毫升。 0.1mol/L的柠檬酸三钠: 含柠檬酸三钠·2H2O 29.4克/1000毫升。 0.1mol/L的柠檬酸40ml与0.1mol/L的柠檬酸三钠60.6ml混合即可。 刚果红染液:2% 刚果红溶液。 NaCl脱色液:2%氯化钠溶液。 三、实验方法 3.1 真菌菌株的分离 取土样方法如前所述。取1.0 g所采集的土样加入到装有9 ml无菌水的试管中,充分振荡混匀后,吸取上清液作一系列梯度稀释,10-1,10-2,10-3,将稀释液涂布在分离培养基(可选择查氏、马丁氏或PDA培养基的任两种,倒平板前加入100 μg/ml头孢菌素或链霉素等抗生素),于28℃下培养,待菌落成熟,形成孢子后(约需5-7 d)将单菌落上的少量孢子点种至纤维素酶产生菌筛选培养基(CMC平板)平板上( 用前加入适量抗生素来抑制细菌生长) , 28℃倒置恒温培养。培养5-7d后用刚果红染色、NaCl脱色后筛选菌落周围有明显透

真菌的分离培养和鉴定论文

内蒙古广播电视大学 “一村一名大学生计划”毕业作业作业题目真菌的分离培养和鉴定___ 教学点名称:包头广播电视大学_ 学员姓名:张瑞光__________ 学号:1015004452077___ 专业:畜牧兽医专科____ 入学时间:2010秋_________ 指导教师:杨瑞芳 _________

真菌的分离培养和鉴定 【摘要】:从发霉的红薯上和酸败腐烂的苹果上挑取霉变物用沙堡琼脂培养基28℃培养2-3天,分离出几个真菌菌株。将分离株重新进行平板划线分离,挑取单菌落表面的少许孢子用马铃薯葡萄糖琼脂培养基进行载片小培养,经28℃培养2—3天于低倍镜下观察,通过菌丝和孢子对分离株进行鉴定。观察到簇生在分生孢子梗的顶端的呈帚状分枝的分生孢子和有隔菌丝,可鉴定为青霉类菌;观察到分生孢子梗上呈轮状着生、具有3个分隔、弯曲的孢子,可鉴定为弯孢霉类菌;观察到单细胞的芽殖孢子,并通过进一步的酵母菌生理生化测定,可鉴定为酵母菌。 【关键词】:真菌;菌落;菌丝;孢子 1 前言 真菌一词来源于拉丁文的“蘑菇”,现在真菌这一名词的概念不仅包括蘑菇,而是代表着一个相当庞大的生物类群。什么是真菌呢?从生物学的观点来看,它们是一大类真核微生物,无根茎叶,不含叶绿素,不能利用无机物来制造食物,靠寄生或腐生生活,仅少数为单细胞,其余为多细胞,大多数真菌有分枝或不分枝的丝状体,能进行有性生殖和无性生殖。从形态上分为酵母菌、霉菌、担子菌。 其实,真菌并不像其看起来的这般抽象,在我们的日常生活中几乎到处都有它们的存在,我们每个人都有过接触和

不同程度的感性认识。例如酿酒、制馒头用的酵母;酒曲的曲种(曲霉和根霉);做豆腐乳的毛霉和红曲霉;发酵饲料的黑曲霉;味美可口的蘑菇、木耳、银耳、猴头;作为中药的神曲、麦角、虫草、茯苓、灵芝;此外还有食品、衣物、用具等因潮湿而发生的霉;引起农作物病害的小麦锈病等等都是真菌。 真菌与细菌的大小、形态、结构及化学组成差异很大,单细胞个体比细菌大几倍至几十倍,具有细胞壁,但不含细菌细胞壁的肽聚糖。有些真菌因环境条件的改变而改变形态,称之为真菌的两相性,如假皮疽组织胞浆菌在动物机体呈酵母菌样。而在人工培养基上呈丝状。 真菌不仅种类多,数量大,而且分布极为广泛,与人类生产与生活有着极密切的利害关系。有些菌丝可引起人与畜禽疾病,有些霉菌还产生毒素,直接或间接的危害人类健康。因此,了解真菌的培养方法,认识其形态十分重要。 近年来在真菌分类方面趋向于采用Anisworth&bisby 的《真菌学辞典》介绍的分类系统。该系统认为真菌不属于低等植物,而是属于单独成立的真菌界,界以下分为黏菌门和真菌门。真菌门再分为鞭毛菌亚门、接合菌亚门、担子菌亚门和半知菌亚门。本研究从自然界分离到几株真菌,并用真菌分类方法对其进行了鉴定。

常见真菌的分离与鉴定

常见真菌的分离与鉴定 发表时间:2010-08-20 发表者:皮肤科 (访问人次:361) 作者:上海长征医院皮肤科徐红 2005年6月13~19日全国各地举行了第8届中国护足周,主题是“积极治疗足病,杜绝家庭传染”。 在中国,每2个人中就有1人罹患足病,其中成年人发病比例高达75%;超过60%的足病为真菌感染,其中足癣发病率为45.2%,甲真菌病(俗称甲癣)占15.5%;40%的足癣患者是被家人传染的;在真菌患者中只有23.8%寻求治疗,其中50%的患者症状稍有好转就不继续治疗。 真菌其实很常见,真菌就生活在我们身边。    病原真菌的一般特性 真菌(Fungi)是微生物中的一个大类,是一群数目庞大的细胞生物,估计全世界已有记载的真菌有10万种以上。它们的子实体小者用显微镜才能见到,大者可达数十厘米,它们共同特征是具有真正的细胞核,产生孢子和不含叶绿素,以寄生或腐生等方式吸取养料,仅少数类群为单细胞,其他都有分支或不分支的丝状体,能进行有性或无性繁殖,具有纤维素(或其他葡聚糖)或几丁质的微纤维或两者兼有的细胞壁的有机体。对人类和动物致病的真菌大约100余种,属于病原真菌。 一、基本性状 (一)形态结构 真菌分单细胞真菌与多细胞真菌两大类,前者属于酵母菌(yeast)一般呈球形或卵圆形,后者称为霉菌(mold)或丝状真菌,呈丝状分枝,菌丝交织象绒球状,另有一些真菌可因寄生环境及培养条件(养料、温度、氧气等)的不同可交替出现两种形态,即在室温中呈霉菌型,在37℃或体内呈单细胞的酵母型,这类真菌有双相性,所以称之为双态真菌或二相真菌。 真菌的细胞结构与一般植物细胞相似,有定型的细胞核及完善的细胞器,但胞壁与细菌胞壁不同,不含粘肽而是由角质及葡聚糖组成,也含有脂多糖蛋白质,其中酵母菌及类酵母菌皆以出芽增殖,不生长真菌丝,革兰氏染色呈阳性,丝状真菌分菌丝及孢子两部分,形态多种多样,分述如下。 1.菌丝(Hypha)真菌在合适的环境中,由 孢子生出嫩芽,称为芽管。芽管逐渐延长呈丝状,   称菌丝。菌丝继续生长并生长分枝,增殖的菌丝交 织组成菌丝体。其中一部分菌丝深入被寄生的物体或培养基中吸取养料,称为营养菌丝体。另一部分菌丝向空间生长,称为气生菌丝体。气生菌丝体能产生孢子

分离与菌种 鉴定

《高级微生物实验指导》 一、目标微生物的分离与鉴定 在无菌条件下取样品10 g加入100 mL无菌生理盐水,用均质机将组织破碎均匀。经充分震荡做成1:10的均匀稀释液。用1 mL的灭菌吸管吸取1:10稀释液,注入9 mL灭菌生理盐水的试管内,震荡试管混匀,按上述操作依次进行10倍递增稀释,选择3个适宜的稀释度,每个稀释度做2个平行,用灭菌涂布棒均匀涂布于冷却的细菌分离培养基(NA)和真菌分离培养基(PDA)表面,分别将细菌培养基和真菌培养基于30℃和28℃下恒温培养2-4d。待菌长出后,挑取不同形态菌落,纯化,挑取单菌落于PDA斜面上,培养并保存。 二、细菌与霉菌总DNA的提取(CTAB法) 1、菌株DNA的提取通用试剂 (1)CTAB抽提液:2%CTAB,1.4M NaCl,20mM EDTA,100mM Tris-HCl,pH8.0;(2)β-疏基乙醇 (3)PVP(聚乙烯吡咯烷酮) (4)石英砂 (5)Tris平衡酚 (6)氯仿:异戊醇(24:1) (7)异丙醇 (8)75%乙醇 (9)无水乙醇 2、菌株DNA的提取步骤 (1) 将已纯化的菌种,接种于相应的分离培养基平板上,28℃培养2d-4d。 (2) 用灭菌药勺或解剖刀从培养皿中刮取足量菌丝至1.5ml离心管中。 (3)加少量PVP、灭菌海砂和65℃水浴预热的200μl CTAB抽提液,用玻璃棒研磨至匀浆; (4)加入400ul预热CTAB抽提液,颠倒混匀后于65℃水浴1h;期间轻柔颠倒混匀2-3次。 (5)冷却至室温后,12000rpm离心10min,上清液移至另一离心管中; (6)加入1/2体积(约300ul)的Tris平衡酚及1/2体积(约300ul)的氯仿:异戊醇(24:1),颠倒混匀。 (7)12000rpm离心10min,取上清液至另一离心管中; (8)重复(5)-(7)步2-3次,直到两相界面处无明显杂质; (9)加入等体积氯仿:异戊醇(24:1),轻轻颠倒混匀; (10)12000rpm离心10min,取上清液至另一离心管中; (11)向上清液中加入0.6倍体积的异丙醇,-20℃放置15min; (12)12000rpm离心10min,弃去上清液,加入70%乙醇500ul以悬浮沉淀;也可250ul 70%乙醇分两次悬浮沉淀; (13)12000rpm离心5min,弃上清,室温干燥;

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