蛋白免疫印迹杂交技术手册

蛋白免疫印迹杂交（Western Blot）技术手册蛋白免疫印迹杂交（Western Blot. WB）是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜（blot）上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WB是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。本指南讨论Western Blot操作方法及常见问题分析，有助于成功完成WB。 A 蛋白样本提取制备 1 细胞或组织裂解 2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 3 蛋白定量 4 电泳上样样品的准备 B 电泳 1 PAGE胶的制备 2 蛋白分子量Marker 3 阳性对照 4 内参对照 5 上样与电泳 C 转膜与显色（Western Blot） 1 胶中蛋白的检测 2 蛋白转膜 3 膜上蛋白的检测：丽春红 4 膜的封闭 5 一抗的孵育 6 二抗的孵育 7 显色 D 常见问题分析与解决方案附录1 WB实验试剂配制方法附录2 SDS-PAGE胶的配制

WB概述:检测原理 Western Blot过程示意图聚丙烯酰胺凝胶电泳转膜封闭孵育1小时或过夜孵育一抗孵育1小时或过夜孵育酶标二抗 1小时洗膜 3×5min/1×10min 孵育底物（如为显色法，则直接孵育至显色即可） 1min 胶片曝光显影 1-30min

A 蛋白样本提取制备蛋白样品制备是Western Blotting的第一步，更是决定WB成败的关键步骤，总体原则和注意事项： 1：尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白（通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品） 2：保持蛋白的处于溶解状态（通过裂解液的PH 盐浓度表面活性剂、还原剂等的选择）3：提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，（低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂） 4：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略） 5：样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。 A-1 细胞或组织裂解 A-1-1 细胞裂解细胞裂解操作方法： 1. 培养的细胞经预冷的PBS漂洗2次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂（种类与量见本节2）； 2. 吸净PBS，加入预冷的裂解液，（1 ml per 107 cells/100mm dish/150cm2 flask; 0.5ml per 5x106 cells/60mm dish/75cm2 flask）； 3. 用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中； 4. 4℃摇动30 min； 5. 4℃离心12,000 rpm，20 min（根椐细胞种类不同调整离心力）； 6. 弃沉淀，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本； A-1-2 组织裂解 1 用灭菌的预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解； 2 将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf管中，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于-80°C；

(完整版)WesternBlot(免疫印迹法)实验方法步骤

Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤发布日期:2008-8-25 热门指数:4360 Western Blot(免疫印迹法) 主要包括以下4个基本步骤： n 样品制备 n 电泳分离 n 蛋白的膜转移 n 免疫杂交与显色――蛋白检测溶液和试剂 n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS) n Modified RIPA buffer Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;P MSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mM n 1X SDS 样品缓冲液 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝 n 转移缓冲液 25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3) n 10X Tris缓冲盐(TBS) 准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6 n 脱脂奶粉或BSA n 甲醇 n TBS/T缓冲液 1X TBS, 0.1% Tween-20 n 封闭缓冲液（TBS/T）

1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSA n 一抗的稀释 1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗) Note:一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。 n 预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率样品制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。 1．培养细胞或药物处理。 2．弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。 3．加入1X SDS样品缓冲液(6-well plate, 100 μl /w或75 cm2plate, 500-1000 μl/瓶)，刮落细胞，转移到Ep管。注意：冰上操作。 4．超声10~15秒剪切DNA以减低样品粘性。 5．煮沸样品5 minutes。 6．离心12000g, 5 min，取上清。 7．电泳分离：上样15μl~20 μl 至SDS-PAGE 胶(10 cm x 10 cm)电泳。如要定量检测某蛋白的表达水平，应用RIPA裂解液(1 ml per 107cells/100 mm dish/150 cm2flask)裂解细胞，收集裂解液至离心管中，在振荡器上混匀4～15min，14000g离心15min（4℃），弃沉淀，用B radford法或其它蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度以调整上样体积和上样量，进行Western杂交时还需设置内或外参照，通常用beta-actin。注意：一般上样20~30 μg已足够，如待检蛋白为低丰度蛋白，可加大上样量至100μg，但电泳条带易拖尾，可制备亚细胞组份或采用更敏感的检测方法。电泳分离（参照SDS-PAGE电泳方法）转膜杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于Western blot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜(NC) 和PVDF膜。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被

蛋白质免疫印迹技术的实验研究

万方数据

蛋白质免疫印迹技术的实验研究作者：张燕婉，叶珏，时那，孟宪敏，王来元， ZHANG Yan-wan， YE Jue， SHI Na， MENG Xian-min， WANG Lai-yuan 作者单位：中国医学科学院,阜外心血管病医院中心实验室,北京,100037 刊名：实验技术与管理英文刊名：EXPERIMENTAL TECHNOLOGY AND MANAGEMENT 年，卷(期)：2008,25(10) 被引用次数：21次参考文献(9条) 1.郭尧君蛋白质电泳实验技术 2006 2.Nieman T Detection based on solution-phase chemiluminescence systems 1989 3.李晓军,秦浚川,武建国蛋白印迹技术研究进展[期刊论文]-临床检验杂志 2004(3) 4.Towbin H;Staehelin T;Gordon Electrophoretic franker of proreins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets.Procedure and some appHcations 1979(76) 5.Hauri H P;Bucher K Immunoblotting with monodonal antibodities:Importance of the blocking solution 1986(159) 6.高红,王贵新,王维林,张可仞用蛋白印迹技术初步评价肝母细胞瘤血管内皮生长因子表达的意义[期刊论文]-中华小儿外科杂志 2006(2) 7.Towbin H;Gordon J Immunoblotting and dot immunobinding:current status and outlook 1984(72) 8.Tovey ER;Baldo BA Characterisation of allergens by protein blotting 1987(08) 9.沈关心;龚非力抗体技术实验指南 2006 本文读者也读过(1条) 1.段勇.黄韬.袁育林.刘华.李娅.金克炜.DUAN Yong.HUANG Tao.YUAN Yulin.LIU Hua.LI Ya.JIN Kewei蛋白质免疫印迹技术检测肺癌组织上皮钙粘蛋白的表达[期刊论文]-检验医学2009,24(1) 引证文献(7条) 1.秦双立,徐玥蛋白质印迹法在氟中毒研究中的应用[期刊论文]-山东化工 2015(13) 2.马瑛,马明,沈辉,骆新荣,高庆华不孕奶牛宫颈黏液相关ASA免疫印迹分析[期刊论文]-中国奶牛 2013(06) 3.程娜娜,韩榕He-Ne激光和增强UV-B辐射对拟南芥叶片微管蛋白的影响[期刊论文]-激光生物学报 2013(04) 4.刘娇,华碧春,黄智锋蛋白表达检测技术在中药肝损伤机制研究中的应用进展[期刊论文]-浙江中医药大学学报2013(04) 5.韩继美胶体金免疫层析法对AFP、CEA和FN的快速检测[学位论文]硕士 2009 6.黄斌芳c-Jun基因启动子区的遗传变异与肺癌易感性的研究[学位论文]硕士 2012 7.程娜娜He-Ne激光和增强UV-B辐射对拟南芥叶片微管结合蛋白MAP65-1的影响[学位论文]硕士 2014 引用本文格式：张燕婉.叶珏.时那.孟宪敏.王来元.ZHANG Yan-wan.YE Jue.SHI Na.MENG Xian-min.WANG Lai-yuan 蛋白质免疫印迹技术的实验研究[期刊论文]-实验技术与管理 2008(10)

Northern杂交技术

Northern blot技术经乙二醛和二甲基亚砜变性处理后进行的RNA电泳这一方法原于McMaster和Carmichael(1977)。含有乙二醛－DMSO的凝胶比含有甲醛的凝胶更难于进行电泳，因为前者泳动速率较慢而且需将电泳液时行循环以避免电泳过程中形成过高的H＋梯度。尽管上述两种凝胶具有近乎相等的分辨率（Miller，1987），但用含朋乙二醛－DMSO的凝胶对RNA进行分级离，通常Northern杂交所显示的RNA条带更为锐利。1）在灭菌的微理离心管内，混匀下列液体： 6mol/L乙二醛 5.4μl DMSO 16.0μl 0.1mol/L磷酸(pH7.0) 3.0μl RNA（多达10μl） 5.4μl市售乙二醛通常为40％溶液（6mol/L）。由于接触空气的后乙二醛易于氧化，所以使用前需通过混合床树脂（Bio-Rad AG 501-X8 对乙三醛溶液进行去离子处理，直至溶液pH值大于5.0为止，然后可分装在小份，用盖紧的小管贮存于－2 0℃。每小份乙二醛溶液只用1次，剩余液体应予丢弃。0.1mol/L磷酸钠（pH7. 0）的配法如下：将3.9ml 1mol/L磷酸二氢钠、6.1ml 1mol/L磷酸氢二钠和90ml 水混合，用DEPC处理上述溶液后高压灭菌。每一泳道至多可分析10μg RNA，通常用10- 20 μg 细胞总RN A进行Northern杂交，可以检测高丰度mRNA（占mRNA总量的0.1％以上），如等测RNA含量极微，每个泳道应加0.5-3.0μg poly(A)+RNA。 2）将微量离心管盖严，将RNA溶液置于％0℃温育50℃温育60分钟后，用冰水浴冷却样品，离心5秒钟，使管内所有液体沉降至管底。 3）于50℃温育RNA溶液的同时，灌制琼脂糖水平凝胶，用1.4 ％琼脂糖分析1kb 以下的R NA样品，而用1％琼脂糖分析1kb 以上的RNA样品。用0mmol/L 磷酸钠（pH7. 0 ）后，降温至70 ℃，加入碘乙酸钠固体至终浓度为10mmol/L（使RNA酶失活），再降温至50℃，制胶，加入RNA样品前一至少放置30分钟使其凝固。用于RNA电泳的电泳槽需用去污剂溶液洗净，用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满3％H2O2，于室温放置10分钟后，用经D EPC处理的水彻底冲洗电泳槽。因乙二醛可与溴化乙锭发生化学反应，所以制胶和电泳过程中诮避免作用溴化乙锭。 4）将RNA样品冷却至0℃，加入4μl 灭菌的并经用DEPC处理的戊二醛－DMSO凝胶中样缓冲液，随后立即将上述样品加至凝胶加样孔。用已知大小的乙醛酰RNA作为分子量标准参照物，如用18S和28S rRNA或或9S兔β－珠蛋白mRNA，上述RNA长度分别为6322、2 366和710个碱基。也可以从BRL购置已知大小的RNA混合物作为分子量标准照物。通常分子量标准参照物的泳道位于凝胶边缘，便于电泳后将其切去进行溴化乙锭染色，可能的话应在分子量标准参照物以及欲转移至硝酸纤维素滤膜或尼龙膜的样品之间留空一个泳道。乙二醛－DMSO凝胶加样缓冲液 50％甘油

northern印迹杂交

northern印迹杂交 Northern印迹杂交（Northern blot）。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern 印迹技术，RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Western blot。Northern 印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似，只是在进样前用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2'-羟基基团。RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合，它同样可在高盐中进行转印，但在烘烤前与膜结合得并不牢固，所以在转印后用低盐缓冲液洗脱，否则RNA会被洗脱。在胶中不能加EB，因为它会影响RNA与硝酸纤维素膜的结合。为测定片段大小，可在同一块胶上加分子量标记物一同电泳，之后将标记物切下、上色、照相，样品胶则进行Northern转印。标记物胶上色的方法是在暗室中将其浸在含5μg/ml EB的0.1mol/L醋酸铵中10min，光在水中就可脱色，在紫外光下用一次成像相机拍照时，上色的RNA胶要尽可能少接触紫外光，若接触太多或在白炽灯下暴露过久，会使RNA信号降低。琼脂糖凝胶中分离功能完整的mRNA时，甲基氢氧化银是一种强力、可逆变性剂，但是有毒，因而许多人喜用甲醛作为变性剂。所有操作均应避免RNase的污染。 RNA甲醛凝胶电泳和吸印方法。 <1>试剂： 10×MSE缓冲液：0.2mol/L吗啉代丙烷磺酸（MOPS），pH7.0，50mmol/L醋酸钠，1mmol/L EDTA pH8.0。 5×载样缓冲液：50%甘油，1mmol/L EDTA，0.4%溴酚蓝。甲醛：用水配成37%浓度（12.3mol/L），应在通风柜中操作，pH高于4.0。 20×SSC；去离子甲酰胺； 50mmol/L NaOH(含10mmol/L NaCl)； 0.1mol/L Tris，pH7.5。 <2>步骤： [1]40ml水中加7g琼脂糖，煮沸溶解，冷却到60℃，加7ml10×MSE缓冲液，11.5ml 甲醛，加水定容至70ml，混匀后倒入盛胶槽。 [2]等胶凝固后，去掉梳子和胶布，将盛胶槽放入1×MSE缓冲液的电泳槽。 [3]使RNA变性（最多20μg），RNA4.5ml,10×MSE缓冲液20ml，甲醛3.5ml，去离子甲酰胺10ml。 [4]55℃加热15min，冰浴冷却。 [5]加2ml5×载样缓冲液。 [6]上样、同时加RNA标记物。

免疫印迹步骤

2.6 免疫印迹（Western blot）（1）裂解细胞，提取细胞总蛋白：收集细胞（约2×106），离心洗涤2次，加入100μL RIPA裂解液，置冰上反应30min，4℃12,000r/min离心15min，取上清，蛋白定量后分装，-80℃冻存备用；（2）蛋白定量：Bradford法测定蛋白质含量[35]： ①分别在微量离心管中各加入0.5mg/mL BSA 5μL、10μL、15μL及20μL，以0.15mmol/L的NaCl补足至100μL，同时以两管100μL的 0.15mmol/L的NaCl作空白对照。 ②每管各加入900μL考马斯亮蓝G-250溶液，振荡混匀，室温放置2min。 ③用1cm光径的微量比色杯测A595吸光值，取A595吸光值对标准蛋白浓度作图，画出标准曲线，并测量待测样品的A595吸光值，从BSA标准曲线中确定待测样品的浓度。（3）SDS-PAGE电泳 ①制胶 SDS丙稀酰胺凝胶 12％分离胶8％分离胶5％积层胶去离子水 3.3mL 4.6mL 2.7mL 1.5mol/L Tris-Cl(pH8.8) 2.5mL 2.5mL － 1.0mol/L Tris-Cl(pH6.8) －－0.5mL 30%丙稀酰胺 4.0mL 2.7mL 0.67mL 10% SDS 0.1mL 0.1mL 0.04mL 10%APS 0.1mL 0.1mL 0.04mL TEMED 0.004mL 0.004mL 0.004mL Total 10mL 10mL 4mL 其中10%APS和TEMED需等临灌胶之前再加入。先配制好分离胶，在涡旋混合器上混匀，立刻用吸管将胶缓缓灌入到大小两块玻璃板之间，

(完整版)蛋白免疫印迹(westernblot)实验

蛋白免疫印迹（western blot）实验实验步骤：一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。 4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。 5. 膜染色液：考马斯亮兰 0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。 6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺 0.1 ml；H202 1.0 μl。【晶莱生物】二、蛋白样品制备 1.单层贴壁细胞总蛋白的提取（1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。（2）每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1 min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。（3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）（4）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。（5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）（6）于4℃下12000 rpm离心5 min。（提前开离心机预冷）（7）将离心后的上清分装转移倒0.5 ml的离心管中放于－20℃保存。

蛋白印迹实验报告

蛋白印迹实验报告篇一：实验十二Western印迹鉴定目标蛋白实验十二Western印迹鉴定目标蛋白实验目的 1.了解Western blot的原理及其意义，掌握Western blot的操作方法； 2.应用Western blot 技术分析鉴定经SDS-PAGE分离后转移到尼龙膜上的重组蛋白。实验原理 Western印迹法简称蛋白质印迹法。蛋白质样品经SDS-PAGE电泳后，凝胶所含的样品蛋白质区带通过电泳方法转移、固定到载体（如尼龙膜、硝酸纤维素膜）上，固相载体以非共价键的形式与蛋白质结合，从而固定住蛋白质；以膜上的蛋白或多肽为抗原，与相应的第一抗体起免疫反应，再和酶标记或同位

素标记的第二抗体反应，用适当的溶液漂洗去未结合抗体后，置含底物的溶液中温育，或通过放射自显影显出谱带，即可检测出样品中的特异蛋白组分。试剂与器材试剂 1.转移缓冲液：甘氨酸（39 mmol/L），Tris 碱（48mmol/L），SDS （%），200ml 甲醇（20%），定容至1,000mL； 2.封闭液：5% 脱脂奶粉，% 叠氮钠，溶于PBST溶液中； 3.丽春红S（Ponceaus）染液：丽春红S溶于1mL 冰乙酸中，加水至100mL；洗膜液：PBS 缓冲液含% Tween 20； 5．DAB浓缩显色液（50X）：DAB （二氨基联苯胺）是根过氧化物酶的底物之一，临用前稀释。 6．5 x PBS：在1600mL蒸馏水中溶解Na 2HPO4 , Na H2PO4, 40g Na Cl,

用/L NaOH调pH至，加水定容至2升。高压灭菌20 分钟，室温保存。用前稀释至1x 。 7．SDS-PAGE电泳用溶液和试剂。器材电泳装置一套; 2.电转移膜装置 3.抗体-酶反应摇床操作方法〈一〉电转移 1．将蛋白质样品进行SDS-PAGE，待溴酚蓝跑出胶后停止电泳（1）。 2．载手套切6-8张定性滤纸和一张尼龙膜，它们的大小应与凝胶的大小相同。在尼龙膜的一（左）角作一记号（或剪角），与滤纸和海棉（纤维）垫浸泡于转移缓冲液中。 3．剥胶，并将凝胶裁成合适大小，切角以做记号（2）。 4．按下图示制备“夹心饼”，打开电极板，在一边放上一块纤维垫，再依次往上叠加3-4张滤纸，将凝胶轻放于滤

蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项

蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项 1.收集蛋白样品(Protein sample preparation) 可以使用适当的裂解液。收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。BCA法。 2. 电泳(Electrophoresis) (1) SDS-PAGE凝胶配制 (2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。 100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。 (3)电泳

i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。 ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）（3）当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3 min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。（4）配4%的浓缩胶,加入TEMED（TEMED,中文名为四甲基乙二胺，是一种无色透明的液体，有微腥臭味，可以用于配制SDS-PAGE胶。TEMED可以催化APS产生自由基，从而加速聚丙烯酰胺凝胶的聚合,可作为一种促凝剂使用）后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。

蛋白质免疫印记技术实验报告

蛋白质免疫印迹技术曹学敏郭晓华谷中如古泽江河北大学生命科学学院2010生物技术河北保定071002 摘要：目的：学习掌握动物抗血清的制备原理及技术，通过实际操作学会动物抗血清的制备，掌握Western－blotting的基本原理，熟悉Western－blotting的实验操作。方法：，使用鸡卵类粘蛋白对小白鼠进行常规免疫，获得抗血清，然后利用Western－blotting 检测抗血清。结果：纯化的鸡卵类粘蛋白能引起小鼠的免疫反应关键词：常规免疫抗血清免疫印记 Abstract：objective：learn to master the theory and technology of preparing animals’ antiserum by operating the experiment in person ,learn to prepare the animals’antiserum , mastering the basic principles of Western－blotting, and being familiar with the experiment operation of Western－blotting. Methods : using chicken ovomucoid operating the routine immunization of laboratory rat, and obtain the antiserum, then detecting the antiserum through Western－blotting. Result: purified chicken ovomucoid can lead to the immunization of laboratory rat Keywords: routine immunization antiserum Western－blotting 前言免疫印迹(Western blotting)是一种检测固定在固相基质上的蛋白质的免疫化学方法该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种常规技术，是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。进行免疫之前必须具备可特异性识别目的蛋白质的单抗或多抗，以及含有目的蛋白质的粗制或纯化的样品。因此，免疫印迹可以从复杂抗原中检出特定的抗原或者从多克隆抗体中检出单克隆抗体，又可以对转移到固相膜上的抗原或抗体进行连续分析，以取得目的蛋白的定位、定性或定量。现在，免疫印记技术，在对人的病理研究上，也有了很大的应用，免疫印记法检测细胞中癌基因的表达及其意义。 1、试剂与器材 1．1小鼠的常规免疫与抗血清的制备所需试剂与器材注射器蜗旋混合器纯化的鸡卵类粘蛋白苦味酸（以75%乙醇配置）标记小鼠佐剂（完全佐剂不完全佐剂）酒精棉球冰箱离心机 1.2 Western Blot 12%分离胶，3.6%浓缩胶马斯亮蓝脱色液PVDF膜甲醇电泳缓冲液封闭液（0.5%BSA、TBST溶液）一抗（自制多克隆抗血清以TBST按1:100比例稀释）二抗（羊抗鼠，按1:1000比例用TBST稀释）DAB显色液蒸馏水镊子烧杯海绵垫 2 方法 2.1 小鼠的常规免疫和抗血清的制备（1）抗原的提取与制备 1）抗原为纯化的鸡卵类粘蛋白 2）利用苦味酸（以75%乙醇配置）标记小鼠背部（2）初级免疫：小鼠背部多点皮下注射，0.2mL/只小鼠 1）抗原与佐剂的混合：取1.5mL蛋白与1.5mL完全佐剂混合，震荡混匀，

蛋白质免疫印迹技术常见问题分析 (1)

常见问题分析一.无信号一抗和二抗不匹配：二抗需和一抗宿主的物种相同（如一抗来自兔，二抗为抗兔抗体）。没有足够的一抗或二抗结合目标蛋白：使用高浓度抗体。4 °C 延长孵育时间（如过夜）。封闭剂与一抗或二抗有交叉反应：使用温和的去污剂如吐温-20，或更换封闭剂（常用的脱脂奶粉、BSA、血清或明胶）。一抗不识别待检物种的蛋白：参照说明书，比对免疫原序列和蛋白序列以确保抗体和目的蛋白会发生反应，设置阳性对照。蛋白上样量不足：每条泳道蛋白上样量不低于20μg，使用蛋白酶抑制剂并设置阳性对照。组织中目的蛋白含量低：浓缩使信号最大化。转膜不充分：使用可逆染色剂如丽春红检测转膜效果，检查转膜操作是否正确。PVDF 膜需预先浸在甲醇中，然后浸到转移缓冲液中。洗膜过度：勿过度洗膜。过度封闭使目标蛋白不能显色：使用0.5% 奶粉或无奶粉代替5% 奶粉的抗体稀释液，或更换封闭剂，减少封闭时间。一抗失效：使用新鲜抗体，重复使用有效浓度会降低。二抗受叠氮钠抑制：避免叠氮钠和HRP 标记抗体一起使用。检测试剂盒过期和底物失活：使用新鲜的底物。二．背景高未进行非特异性封闭或封闭不充分：延长封闭时间，考虑更换合适的封闭剂。一抗浓度过高：稀释抗体至合适浓度，以更高稀释度抗体延长孵育时间（耗时长但特异性结合最好）。二抗与封闭剂非特异性结合或反应：设置二抗对照（不加一抗）。未结合蛋白质洗涤不充分：增加洗涤次数。选膜不当产生的高背景：硝酸纤维素膜比PVDF 膜背景低。膜干燥：在孵育过程中防止膜变干，每一步都要保证膜有充分的反应液，可放入搅拌子不断搅动或轻轻振荡使膜浸在溶液里。三．多带现象细胞传代次数过多，蛋白表达不同：使用原始未传代的细胞株，和现在的细胞株一起做平行对照实验。体内表达的蛋白样本具有多种修饰形式如乙酰化、甲基化、烷基化、磷酸化、糖基化等：参考文献，使用试剂使样品去磷酸化、去糖基化来证明翻译后的修饰。蛋白样本降解（蛋白质分子量降低）：在样品缓冲液中加入足够的蛋白酶抑制剂。检测到未经报道过的新蛋白或同一蛋白家族中具有相似表位而结构不同的蛋白：查阅其它文献报道，或BLAST 搜寻，使用说明书推荐的细胞株或组织。一抗浓度过高，高浓度时常出现多条蛋白带：降低抗体浓度和/或孵育时间。二抗浓度过高，高浓度产生非特异性结合：降低抗体浓度，加入二抗对照（不加一抗）。抗体未经纯化：使用亲和纯化的抗体，减少非特异条带。目标蛋白形成多聚体：SDS-PAGE 电泳加样前，煮沸10 分钟而不是5 分钟，使蛋白质解聚。四．背景有不均匀的白色斑点转膜时膜上有气泡或抗体在膜上分布不均：转膜过程中尽量除去气泡，抗体孵育时保持摇动。五．背景有黑色斑点抗体结合了封闭剂：过滤封闭剂。

Northern杂交技术

Northern?blot技术经乙二醛和二甲基亚砜变性处理后进行的RNA电泳这一方法原于McMaster和Carmichael(1977)。含有乙二醛－DMSO的凝胶比含有甲醛的凝胶更难于进行电泳，因为前者泳动速率较慢而且需将电泳液时行循环以避免电泳过程中形成过高的H＋梯度。尽管上述两种凝胶具有近乎相等的分辨率（Miller，1987），但用含朋乙二醛－DMSO的凝胶对RNA进行分级离，通常Northern杂交所显示的RNA条带更为锐利。 1）在灭菌的微理离心管内，混匀下列液体： 6mol/L乙二醛μl DMSO μl L磷酸μl RNA（多达10μl）μl市售乙二醛通常为40％溶液（6mol/L）。由于接触空气的后乙二醛易于氧化，所以使用前需通过混合床树脂（Bio-Rad AG 501-X8 对乙三醛溶液进行去离子处理，直至溶液pH值大于为止，然后可分装在小份，用盖紧的小管贮存于－20℃。每小份乙二醛溶液只用1次，剩余液体应予丢弃。L磷酸钠（pH7. 0）的配法如下：将1mol/L磷酸二氢钠、1mol/L磷酸氢二钠和90ml 水混合，用D EPC处理上述溶液后高压灭菌。每一泳道至多可分析10μg RNA，通常用10- 20 μg 细胞总RNA进行Northern杂交，可以检测高丰度mRNA（占mRNA总量的％以上），如等测RNA含量极微，每个泳道应加poly(A)+RNA。 2）将微量离心管盖严，将RNA溶液置于％0℃温育50℃温育60分钟后，用冰水浴冷却样品，离心5秒钟，使管内所有液体沉降至管底。 3）于50℃温育RNA溶液的同时，灌制琼脂糖水平凝胶，用％琼脂糖分析1kb 以下的RNA样品，而用1％琼脂糖分析1kb 以上的RNA样品。用0mmol/L 磷酸钠（pH7. 0 ）后，降温至70 ℃，加入碘乙酸钠固体至终浓度为10mmol/L（使RNA酶失活），再降温至50℃，制胶，加入RNA样品前一至少放置30分钟使其凝固。用于RNA电泳的电泳槽需用去污剂溶液洗净，用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满3％H 2O2，于室温放置10分钟后，用经DEPC处理的水彻底冲洗电泳槽。因乙二醛可与溴化乙锭发生化学反应，所以制胶和电泳过程中诮避免作用溴化乙锭。 4）将RNA样品冷却至0℃，加入4μl 灭菌的并经用DEPC处理的戊二醛－DMSO凝胶中样缓冲液，随后立即将上述样品加至凝胶加样孔。用已知大小的乙醛酰RNA作为分子量标准参照物，如用18S和28S rRNA或或9S兔β－珠蛋白mRNA，上述RNA长度分别为6322、2366和710个碱基。也可以从BRL

蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB )

蛋白质免疫印迹（Western Blot，WB ）标签： western-blot 免疫印迹蛋白质蛋白质免疫印迹可应用于：（1）从蛋白质混合物中检出目标蛋白质；（2）定量或定性确定细胞或组织中蛋白质的表达情况；（3）用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用后续分析。实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒裂解液 PBS SDS上样缓冲液电泳缓冲液转移缓冲液丽春红染液 TBST TBS 洗脱抗体缓冲液抗体仪器、耗材电泳仪移液器脱色摇床显影仪实验方法原理 Western免疫印迹，是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，探针是抗体，显色用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。 4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO40.24 g；加ddH2O至1000 ml。 5. 膜染色液：考马斯亮兰 0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。 6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺 0.1 ml；H202 1.0 ul。二、蛋白样品制备 1. 单层贴壁细胞总蛋白的提取（1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。（2）每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1 min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。（3）按1ml裂解液加10 ul PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）

蛋白免疫印迹法(WB)试验结果与HIV感染关系的分析

蛋白免疫印迹法(WB)试验结果与HIV感染关系的分析【摘要】目的通过对蛋白免疫印迹法(WB)试验结果的观察,确定个体是否感染HIV以及HIV感染的状况。方法对60份抗-HIV初筛阳性血清使用蛋白免疫印迹法(WB)进行确认实验。结果在被检测样品中,HIV-1型确认试验阳性54例,占90%;HIV-1型确认试验阳性,且提示HIV-2阳性感染1例,占1.6%;HIV-1型确认试验弱阳性(不确定)3例,占5%;HIV-1型确认试验阳性2例,占3.3%。结论蛋白免疫印迹法(WB)试验确定个体有无HIV感染以及HIV感染情况提供依据。【Abstract】Objective Through to western blot assay observation of result of the test, confirm individual infect HIV and HIV infect the state.Methods Safe the positive serum and use western blot assay to confirm to cases of 60 persist-HIV positive for the first time.Results Being measured in the sample, HIV-1 types confirm testing 54 cases of positive,takes 90%.HIV-1 types confirms testing positive,and point outHIV-2 infect one positively,takes 1.6%.HIV-1 types confirm testing weak positive 3,takes 5% HIV-1 type confirm testing negative 2,take 3.3%.Conclusion Western Blot Assay test offers basis on confirm whether individuals have HIV is infected and HIV infect the state. 【Key words】HIV infect;Western Blot Assay;Strip 艾滋病(AIDS)是一种目前尚无有效治愈方法,病死率极高的传染病,它在全世界的广泛流行已经成为严重的公共卫生问题和社会问题。截止到2007年7月底,我们对60名抗-HIV初筛阳性者进行了蛋白免疫印迹法(WB)确认实验,通过实验结果(蛋白带条)的观察,探讨与HIV感染关系,并且还可以在监控病情进展,观察治疗结果,综合监测和行为干预等方面起到重要作用,现将结果报告如下。 1 试剂与方法 1.1 试剂人类免疫缺陷病毒(HIV 1+2)型抗体免疫印迹试剂盒(新加坡健利检验诊断私人有限公司提供)。 1.2 仪器脱色摇床:江苏TS-1。 1.3 方法过夜孵育法 1.3.1 试剂的配制 1.3.1.1 稀释洗涤缓冲液将1体积的浓缩洗涤缓冲液(20X)加入到19倍体积的双蒸馏水中,充分混匀。

蛋白质免疫印迹

蛋白质免疫印迹（Western Blot ，WB ）标签： western-blot 免疫印迹蛋白质蛋白质免疫印迹（Western Blot ）可以：（1）从蛋白质混合物中检出目标蛋白质；（2）定量或定性确定细胞或组织中蛋白质的表达情况；（3）用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA 、蛋白质-RNA 相互作用后续分析。实验方法 ? 底物化学发光ECL 法 ? Western 印迹法 ? 图解实验方法原理 Western 免疫印迹（Western Blot ）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。与Southern 或Northern 杂交方法类似，但Western Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇 PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2DAB 试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE 试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml ；10%SDS 6.0 ml ；β-巯基乙醇 0.2 ml ；ddH 2O 2.8 ml 。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g ；Tris 5.8 g ；SDS 0.37 g ；甲醇200 ml ；加ddH 2O 定容至1000 ml 。