细胞实验操作流程
细胞冻存、复苏及传代操作流程
1. 试剂与仪器：
1.1 试剂
PBS磷酸缓冲液：Solarbio，货号：P1022
胰蛋白酶-EDTA溶液：Gibco公司，货号15400054 100 mL；
青链霉素：Gibco公司，货号15140-112 100 mL；
FBS：Gibco公司，货号10091-148 500 mL；
DMEM （4.5g/L glucose）培养基：CORNING公司，货号10-013-CVR 500 mL；RPMI 1640 ：CORNING公司，货号10-040-CVR 500mL；
DMSO：SIGMA公司，货号：D8418；
PBS磷酸缓冲液：Solarbio，货号：P1022
1.2 仪器
生物安全柜：
离心机：
37℃恒温水浴箱：
-80℃冰箱：
4℃冰箱：
荧光倒置显微镜：
37℃恒温培养箱：
液氮罐：
2、实验方法：
2.1 细胞冻存
配制含10% 体积DMSO的冻存培养液（90% FBS+10% DMSO或70%培养基+20%FBS+10%DMSO），冻存盒室温放置。
将正常生长的贴壁细胞用PBS清洗2遍后加入胰蛋白酶-EDTA（6 cm皿加入1 mL，10 cm皿或T25细胞瓶加入2 mL），37℃放置直至细胞显微镜下缩成圆球状，加入消化液体积2倍以上培养基，终止消化，将细胞吸取至15 mL离
心管中，800 rpm离心5 min，去上清加入适量冻存液重悬细胞，1mL分装于冻存管中，做好标记。
悬浮细胞收集细胞培养液于15 mL离心管中，800 rpm离心5 min，去上清加入适量冻存液重悬，1 mL分装于冻存管中，做好标记。
将冻存管放入冻存盒中，放入-80℃过夜，第二天转入液氮中长期保存。2.2 细胞复苏
从液氮罐中取出冻存管，快速浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化；从37℃水浴中取出冻存管，在安全柜中，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到15 mL离心管中（15 mL 离心管中已事先加入4 mL培养基）混匀，800 rpm，离心5 min，弃去上清液，加入含10%血清的培养液重悬细胞，根据离心后的细胞沉淀，将细胞培养在10 cm 皿或6 cm皿的培养皿中（一般选用6 cm皿）37℃培养箱静置培养。次日更换1次培养液，继续培养。
2.3 细胞传代
状态良好的贴壁细胞用PBS清洗2遍后加入胰蛋白酶-EDTA（6cm皿加入1 mL，10 cm皿或T25细胞瓶加入2 mL），37℃放置直至细胞显微镜下缩成圆球状，加入胰酶体积2倍以上培养基，终止消化，将细胞吸取至15 mL离心管中，800 rpm离心5 min，去上清加入1-2ml培养基重悬细胞，吹打均匀后根据细胞生长速度1瓶传2瓶或1瓶传3瓶，补齐培养基（6cm皿加5ml，10cm皿加10ml）后放入37℃培养箱继续培养。
悬浮细胞在显微镜下观察，健康的细胞干净而透明，核清晰可见，静置培养时常见小细胞团。
①若细胞状态好，培养基干净而无明显颗粒物沉淀，可直接1:2或1:3分瓶传代培养。
②若细胞有碎片，培养基中颗粒物多，则需收集细胞培养液于15ml离心管中，600rpm离心5min，去上清，加入适量完全培养基重悬，轻柔吹打混匀后，根据细胞生长速度，1:2或1:3传代培养。
3、注意事项
1）细胞一旦染菌后直接舍弃并检查所有试剂耗材是否污染，如细胞样本非常
珍贵可考虑按下列操作抢救挽回，抢救过程染菌风险极高千万要小心谨慎。
及时换掉已受污染的培养基，PBS清洗7-8次，洗至显微镜下观察看不到一颗细菌为宜，清洗后用高浓度双抗（20×）浸泡5分钟，PBS清洗两次，用含2×双抗的完全培养基另外添加抗支原体药和庆大霉素进行培养；
2）细胞消化过程需紧密观察细胞状态，避免消化过度导致细胞死亡，消化时间在1-10分钟不等。
3）细胞冻存密度一般控制在1×106个/ml，可按实验需要进行调整，尽量不要低于1×105个/ml，防止因细胞过于稀疏而导致的复苏失败。
4）细胞培养过程中如发现因细胞状态不佳导致的培养基底部出现黑点杂质，可将细胞消化下来后用PBS重悬，低转速（500rpm，3min）离心，重复两次。
细胞迁移操作流程
1、实验原理：
将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。Transwell迁移实验常用8.0、12.0 μm 膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。
2、实验材料与仪器：
2.1试剂
PBS磷酸缓冲液
培养基：
胰酶；
FBS：
Transwell板（24孔板，孔径8um）：Corning Incorporated公司。
0.1%结晶紫：SIGMA公司。
4%多聚甲醛：SIGMA公司。
2.2 仪器
台式低速离心机：
二氧化碳培养箱：
细胞培养皿：Thermo公司；
倒置显微镜：
生物安全柜：
3、实验方法：
3.1 实验流程
3.2 实验步骤
（1）消化收集细胞，1000rpm离心5min；
（2）用1×PBS清洗一次，用对应空白培养基重悬细胞，计数，调整细胞密度为1×105-1×106个/ml；
（3）选择孔径大小为8.0μm的transwell板，上室加入100μL细胞悬液，下室加600μL含血清的培养基作为趋化因子，37°C、5%CO2孵育；
（4）24-48h（最迟不超过48h）后取出小室，用1×PBS清洗三次；
（5）用4%多聚甲醛固定30min，用1×PBS清洗三次；
（6）0.1%结晶紫染色30min，用1×PBS清洗三次，使用棉签去除滤膜表面未穿膜细胞；
（7）拍照（200×）计数。
4、注意事项
1）每个细胞迁移能力不同，本实验需先做预实验摸清铺入的细胞密度，大部分肿瘤细胞可发生迁移的细胞数目在2-8万个/孔。
2）用棉签擦除滤膜表面未穿膜细胞时动作一定要轻柔，滤膜本身柔软易变形，一旦用力过大导致滤膜变形，后续显微镜拍照时便无法细胞将聚焦在同一平面内，导致实验失败。
细胞划痕操作流程
1、实验原理
细胞划痕实验（Wound Healing)是一种操作简单，经济实惠的研究细胞迁移/肿瘤侵袭的体外试验方法。这种方法的原理是，当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。基本的步骤包括“划痕”的制造，细胞迁移期间图像的获得以及后期数据的处理。
2、实验材料与仪器：
2.1试剂
培养基：Corning公司；
双抗（青霉素、链霉素）：Gibco 公司；
胰酶：0.5%Trypsin-EDTA，Gibco公司；
记号笔
直尺
2.2 仪器
生物安全柜：
离心机：
倒置显微镜：
37℃恒温培养箱：
3、实验方法：
3.1 实验流程
3.2 实验步骤
（1）先用记号笔在6孔板背面，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔0.5~1cm 一道，横穿过孔。每孔至少穿过4条线；
（2）取生长对数期细胞消化计数铺六孔板，贴壁过夜，控制第二天细胞密度达100%；
（3）第二天用10μl或200μl枪头比着6孔板盖，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜；
（4）用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基；
（5）一般按0、24、48、72h取样，在显微镜下拍照，并且保证在不同时间点下，拍下相同视野的照片。
4、注意事项
1）划痕前不需要吸干培养基，划痕结束后再吸掉培养基加PBS清洗后加无血清培养基；
2）划痕的距离不宜太宽，以免不能在显微镜视野下呈现；
3）若划痕实验过程中需药物作用，其药物浓度需在无血清条件下进行摸索。4）若在相应时间点拍照时发现漂浮的细胞过多，此时需更换培养基，洗干净漂浮的细胞后再继续拍照。
5）划痕法一般只能用于上皮，纤维样细胞系。因为
a.这些细胞本身有迁移能力，且较强。
b.细胞有极性，方便测量，观察。
c.细胞对无血清有较强的忍受力（至少24小时），因此很多肿瘤细胞系是不适合做划痕的，很多肿瘤细胞系在无血清培养下，12小时细胞凋亡就超过50%。而一些上皮样细胞系甚至可以忍受高达72小时的无血清实验。
克隆形成实验操作流程
1、实验原理：
克隆形成实验是肿瘤细胞学研究中的一种常用技术，其原理是将细胞分离成单细胞悬液，在培养基上接种培养，根据集落形成数量和大小来检测细胞增殖能力和致瘤性。该实验可用来研究肿瘤细胞的增殖能力、侵袭性，探讨细胞对不同杀伤因素的敏感性。
根据培养基是否需要软琼脂，克隆形成实验可以分为平板克隆形成实验（PCF）和软琼脂克隆形成实验（SACF）。PCF是直接将细胞接种于培养瓶、培养皿中，优点为操作简便、细胞间分泌的促生长因子可在培养液中扩散、克隆形成率高，适用于贴壁生长的细胞; 缺点为细胞在贴壁前易于移动。SACF 是采用半固体培养基模拟体内生长环境，适用于悬浮细胞及不依赖于贴壁生长的肿瘤细胞。在悬浮状态下不能增殖的细胞（如正常成纤维细胞）不适用此法。
2、实验材料与仪器：
2.1试剂
培养基：Corning公司；
双抗（青霉素、链霉素）：Gibco 公司；
胰酶：0.5%Trypsin-EDTA，Gibco公司。
2.2 仪器
生物安全柜：
离心机：
倒置显微镜：
37℃恒温培养箱：
3、实验方法：
3.1 实验流程
3.2 实验步骤
（1）适用细胞：贴壁细胞
（2）将目的细胞的培养基吸弃，用1×PBS润洗2遍去除残余的培养基，加入胰酶消化细胞（最好将细胞消化成单个细胞或者后续吹打细胞使其成单个细胞状态）。细胞离心弃去上清，用适量培养基重悬，使用细胞计数板计数，根据计数结果将细胞密度稀释（最好梯度稀释）成合适的密度（如
10000个/ml）；
（3）细胞铺板：若要观察正常细胞的克隆形成情况，建议按六孔板每孔300-500个铺板，14-20天后结束培养；若要看药物处理或辐射等处理的细胞集落形成情况，建议做个预实验，六孔板分别铺500，2000，4000，8000，个/孔，14-20天后结束培养，找出最适的密度，然后再进行后续的实验；
（4）14-20天后，细胞停止培养，吸去培养基，用1XPBS洗3遍，然后用4%PFA固定液固定30分钟，1XPBS洗3遍，然后加入0.1%结晶紫染色30分钟，再用1XPBS洗3遍至五紫色背景，最后在镜下数细胞集落数。
4、注意事项
1）细胞培养过程较长前期3-4天换一次培养基，后期2-3天换一次培养基，可观察培养基颜色来保证细胞营养充足。
2）细胞停止培养前先在显微镜下观察其形成集落情况，以看到大部分集
落由50个以上单个细胞组成为宜。
3）用PBS清洗结晶紫染液时应尽快吸掉,不可在PBS中浸泡时间过长，以免褪色。
细胞凋亡检测操作流程
1、实验原理：
在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V 是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素（EGFP、FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。
碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
2、实验材料与仪器：
2.1试剂
Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection kits ：联科生物
流式胰酶：Gibco 公司，
流式管。
2.2 仪器
流式细胞仪：
3、实验方法：
3.1 实验流程
3.2 不带GFP荧光细胞凋亡实验步骤（Annexin V-FITC/PI）
（1）收集细胞：①贴壁细胞：收集细胞上清，用1×PBS清洗两次，0.25%流式胰酶（不含EDTA）消化细胞，轻轻吹打，收集细胞，500×g
常温离心5-10min；
②悬浮细胞：轻柔吹打，收集细胞，500×g常温离心5-10min；（2）用1×PBS（4℃预冷）清洗两次，500×g，离心5-10min收集细胞；
（3）用1×Binding Buffer（ddH2O稀释）重悬细胞，调整细胞密度为3-5×105个/ml；
（4）转移300 μL上述细胞悬液至流式管；
（5）每管细胞中加入5 μL的Annexin V-FITC混匀后室温避光孵育15min，之后再加入5 μL的PI混匀后，室温避光孵育5min；
（6）最后补加200 μL的1×Binding Buffer，转移至流式管上机检测；
（7）选择荧光通道FITC和PE通道，检测细胞量在所圈定的细胞群一般收集1×104个细胞。
3.3带GFP荧光细胞凋亡实验步骤（Annexin V-APC/7-AAD）
3.3.1仪器参数调节
（1）收集1×106-3×106个细胞，用预冷PBS清洗两次，500×g，离心5-10min收集细胞；
（2）加入500ul Apoptosis Positive Control Solution重悬，置冰上孵育30min；（3）用预冷PBS洗涤，500×g，离心5-10min收集细胞；
（4）加入预冷1×Binding Buffer重悬，并加入数量相同且未经处理的活细胞与之混合。加入预冷1×Binding Buffer补充至1.5ml，等分为三管，其中一管为空白对照组，两管为单染管；
（5）流式上机，用单染管调节荧光通道的补偿。
3．3.2样本检测
（1）按照实验方案诱导凋亡；
（2）收集细胞：①贴壁细胞：收集细胞上清，用1×PBS清洗两次，0.25%流式胰酶（不含EDTA）消化细胞，轻轻吹打，收集细胞，500×g
常温离心5-10min；
②悬浮细胞：轻柔吹打，收集细胞，500×g常温离心5-10min。（3）用1×PBS（4℃预冷）清洗两次，500×g，离心5-10min收集细胞；
（4）用1×Binding Buffer（ddH2O稀释）重悬细胞，调整细胞密度为1×106-1×107个/ml；
（5）转移100 μL上述细胞悬液至流式管，约1×105-1×106个/管；
（6）每管细胞中加入5 μL的Annexin V-APC和10ul7-ADD，轻柔涡旋混匀后室温避光孵育15min；
（7）最后补加300 μL的1×Binding Buffer，转移至流式管上机检测；
（8）选择荧光通道APC和PerCP通道，检测细胞量在所圈定的细胞群一般收集1×104个细胞。
4、注意事项
1）每管细胞量一般是1×105个；
2）凋亡实验必须收集含有凋亡细胞的细胞上清，不可弃用；
3）细胞消化和清洗过程中动作轻柔，减少细胞碎片；
4）贴壁细胞消化，用不含EDTA胰酶消化，以免EDTA与Ca2+鳌合，影响Annexin V结合；
5）需要有两个单染样本，用于调节通道的荧光补偿；
6）实验过程中，工作液及荧光染料需置于冰上。但是染色需在室温进行；
7）加完染料处理后必须在1h内进行流式上机检测；
8）流式图举例
细胞周期检测操作流程
1、实验原理：
由于细胞周期各时相的DNA含量不同，因此，可通过特异性与DNA结合染料来检测细胞内的DNA含量来测定细胞周期。流式中常用碘化丙啶(Propidium，简称PI)与DNA结合，其荧光强度与DNA含量成正比。因此，通过流式细胞仪对细胞内DNA含量进行检测，同时获得的流式直方图对应的各细胞周期可通过特殊软件计算各时相的细胞百分率。
2、实验材料与仪器：
2.1试剂
无水乙醇：上海凌峰化学试剂有限公司；
Cell Cycle Staining Kit：联科生物；
流式胰酶：Gibco Company。
流式管。
2.2 仪器
流式细胞仪：
3、实验方法：
3.1 实验流程
3.2 实验步骤
细胞处理前需进行同步化处理，一般用无血清培养基培养24h，也可用秋水仙素进行预处理。
（1）收集细胞（细胞量2×105-1×106）
①贴壁细胞：收集细胞上清，用1×PBS清洗两次，0.25%流式胰酶消化细
胞，轻轻吹打，收集细胞，500×g常温离心5-10min；
②悬浮细胞：轻柔吹打，收集细胞，500×g常温离心5-10min；
（2）用1×PBS（4℃预冷）清洗两次，500×g，离心5-10min收集细胞；（3）用250ul的PBS重悬细胞；
（4）将细胞悬液缓慢加入至750μL的-20℃预冷的无水乙醇中，边加边搅拌混匀，-20℃固定过夜后进行检测，如暂不进行后续实验，可在-20℃保存数日；
（5）1000rpm离心10min离心细胞，弃去乙醇，轻弹管壁使沉淀松散，加入2-5mL室温下的PBS放置15min使细胞再次水化，1500rpm离心5min弃上清；
（6）加入1mL的DNA staining solution混匀，室温避光孵育30min；
（7）将细胞悬液转移至流式管中上机检测。
4、注意事项
1）选择P2门里面收集10000个细胞。
2）实验过程中，工作液及荧光染料需置于冰上。但是染色需在室温进行；
3）加完染料处理后必须在1h内进行流式上机检测。
4）流式图举例：
(完整版)实验室仪器操作规程
数显式压力试验机操作规程 一、使用前应先检查油箱内的油液是否充足，可查看右侧面油标， 如不足，则应打开后箱板向油箱内添加，至液面在油标处为宜。 二、检查各油管接头和紧固件是否有松动，如有松动则拧紧。检 查防尘罩应完整无损。检查电气接地、保险熔丝等安全防护措施是否有效。 三、首次使用时，检查油路和电路是否运行正常。 参数设置，选择合适的测量范围、显示方式和加荷方式。四、将试件表面擦拭干净，检查外观有无明显缺陷，如有必须更 换无损试件。 五、按下启动按扭，手柄放在“上升”位置，调控送油旋钮，按 需要速率平稳进行加荷试验，至试件被压碎，负荷下降。随即关闭送油，手柄放在“下降”的位置，使油液迅速流回油箱。 六、试验结束时，按面板上“打印”键，打印机即可打印输出该 次的试验报告。 七、操作中禁止将手等人体任何部分置于上下压板之间，并注意 试件破碎时碎片崩出伤人；试后随即清除破碎试块，以待下次试验。当不再做试验时，要打开回油阀，关闭送油阀，切断电源。
万能材料试验机操作规程 一、开机预热，检查设备运行状态。 二、根据试样和需要，选用相应的变形、负荷测量范围和显示方 式。 三、根据试样形状及尺寸，把相应的钳口装入上下钳口座内。 四、开动油泵拧开送油阀使试台上升10mm，然后关闭送油阀，如 果试台 已在升起位置时，则不必先开动油泵送油。 五、按动钳口夹紧按扭，将试样的一端夹在上钳口中（必须给电 磁阀送电）； 六、开动电动机，将下钳口升降到适当高度，将试件另一端夹在 下钳口中（须注意试样放置在轴线上）。 七、在试样上安装引伸计（注意：引伸计一定要夹好）。 八、调整变形显示为“零”。 九、按试验要求的加荷速度，缓慢的拧开送油阀进行加荷试验（加 荷时电磁阀应在无电状态）。 十、油缸升起后加荷前应按负荷和位移清零。 十一、根据需要，在特征点出现后取下引伸计。 十二、试样断裂后，卸载。 十三、取下断裂后的试样。 十四、注意加载过程中不能离人、不能超载，注意设备、人身安全。
病毒感染细胞实验整体流程及原理
病毒感染细胞实验整体 流程及原理 Standardization of sany group #QS8QHH-HHGX8Q8-GNHHJ8-HHMHGN#
病毒感染细胞实验整体流程及原理 目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 慢病毒 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通 siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合 RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞 (比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 1）含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养 48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、- 80 ℃保存。 6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 、腺病毒 原理
实验室常用仪器操作规程
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6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 、腺病毒 原理 腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 特点 1）几乎可以感染所有类型的细胞 2）可以获得复制缺陷型 (E1 和 E3 缺失) 的腺病毒 3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到 1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。 4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单. 5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。 腺病毒包装简要流程 1）构建表达 siRNA/miRNA 的腺病毒载体 2）采用 PacI 消化纯化的质粒。 3）消化好的腺病毒表达载体转染 293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。 4）将病毒粗提液感染 293A 细胞以扩增病毒。 5）分装，-80℃保存。 、慢病毒和腺病毒的比较 2、构建目的基因到载体
细胞迁移侵袭实验操作步骤
实验介绍 细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 实验步骤： 1材料准备： 可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（%（g/ml）PBS结晶紫） 2步骤和流程 基质胶铺板： 用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。 制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。 接种细胞 ①取细胞悬液100μl加入Transwell小室。 ②24孔板下室一般加入600μl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。24h较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 结果统计 直接计数法，“贴壁”细胞计数，这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的
实验仪器操作流程
TYE—2000KN压力试验机操作规程 一．一般规定： （1）本机由本室指定的试验人员进行操作，非本室人员未经许可，不得随意摆弄，以防事故发生。 （2）试验操作人员在试验前必须对本机进行检查，看贮油是否足够，油管接头是否松动，如油不足应加油，松动的油管接头应拧紧。（3）每次试验完毕，应及时关闭油泵，切断电源后应清理试台上的渣物，并盖好防尘罩。 二．操作方法： （1）首次对试样的最大荷载，应有所估计，然后根据所估计的最大荷载，合理选择并悬挂应力弹簧，校正指针回零。 （2）将试件放在下压板中心，顺时针旋动上压板手轮直至上压板接触试件。 （3）接通电源开动油泵，关闭加油阀，打开送油阀，按要求速度加荷，至试件破坏后，立即徐徐松开回油阀，关闭送油阀，读取从动指针所指荷载值并记录之（大弹簧读取外圈值，小簧读取内圈值）。（4）反时针转动上压板手轮，取出已破坏的试件。
ZBSX-92型振筛机操作规程 一. 一般规定： 使用人员在使用前，仔细阅读使用说明书，了解本机的有关事项，方可使用。 二. 操作步骤： 2.1接通电源。 2.2先将装有试样的套筛固定在振筛机上； 2.3将旋扭转至要求定时位，即可开始工作，若中途停机，应切断电源开关，让定时片中自行停止位置，不可强行扭回。 2.4将筛好的试样分别称重。 三. 注意事项： 1.1开机前，加足润滑油至螺孔面。 3.2转动旋扭时，不应过快，过猛，以免损坏零件。 3.3每隔6个月更换机油一次，使用时注意避免盖板上脦根导杆变形。
101型电热恒温干燥箱 一. 一般规定 使用人员在使用前，仔细阅读使用说明书，了解本机的有关事项，方可使用。 二. 操作方法 1. 打开电源开关。 2. 将温控仪设定所需温度，温控仪绿灯灭，此时箱内开始升温，同时打开鼓风机开关，使鼓风机工作，并注意鼓风机运转状况是否正常。 3. 恒温时，可关闭辅助加热开关，只留一组工作，以免功率过大，影响恒温波动度。 三. 注意事项 1. 本箱装置时必须用导线连接通地。 2. 本箱非防爆型，故带腐蚀性及易燃性物品禁止放入箱内干燥，
细胞实验操作流程
细胞冻存、复苏及传代操作流程 1. 试剂与仪器： 1.1 试剂 PBS磷酸缓冲液：Solarbio，货号：P1022 胰蛋白酶-EDTA溶液：Gibco公司，货号15400054 100 mL； 青链霉素：Gibco公司，货号15140-112 100 mL； FBS：Gibco公司，货号10091-148 500 mL； DMEM （4.5g/L glucose）培养基：CORNING公司，货号10-013-CVR 500 mL；RPMI 1640 ：CORNING公司，货号10-040-CVR 500mL； DMSO：SIGMA公司，货号：D8418； PBS磷酸缓冲液：Solarbio，货号：P1022 1.2 仪器 生物安全柜： 离心机： 37℃恒温水浴箱： -80℃冰箱： 4℃冰箱： 荧光倒置显微镜： 37℃恒温培养箱： 液氮罐： 2、实验方法： 2.1 细胞冻存 配制含10% 体积DMSO的冻存培养液（90% FBS+10% DMSO或70%培养基+20%FBS+10%DMSO），冻存盒室温放置。 将正常生长的贴壁细胞用PBS清洗2遍后加入胰蛋白酶-EDTA（6 cm皿加入1 mL，10 cm皿或T25细胞瓶加入2 mL），37℃放置直至细胞显微镜下缩成圆球状，加入消化液体积2倍以上培养基，终止消化，将细胞吸取至15 mL离
心管中，800 rpm离心5 min，去上清加入适量冻存液重悬细胞，1mL分装于冻存管中，做好标记。 悬浮细胞收集细胞培养液于15 mL离心管中，800 rpm离心5 min，去上清加入适量冻存液重悬，1 mL分装于冻存管中，做好标记。 将冻存管放入冻存盒中，放入-80℃过夜，第二天转入液氮中长期保存。2.2 细胞复苏 从液氮罐中取出冻存管，快速浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化；从37℃水浴中取出冻存管，在安全柜中，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到15 mL离心管中（15 mL 离心管中已事先加入4 mL培养基）混匀，800 rpm，离心5 min，弃去上清液，加入含10%血清的培养液重悬细胞，根据离心后的细胞沉淀，将细胞培养在10 cm 皿或6 cm皿的培养皿中（一般选用6 cm皿）37℃培养箱静置培养。次日更换1次培养液，继续培养。 2.3 细胞传代 状态良好的贴壁细胞用PBS清洗2遍后加入胰蛋白酶-EDTA（6cm皿加入1 mL，10 cm皿或T25细胞瓶加入2 mL），37℃放置直至细胞显微镜下缩成圆球状，加入胰酶体积2倍以上培养基，终止消化，将细胞吸取至15 mL离心管中，800 rpm离心5 min，去上清加入1-2ml培养基重悬细胞，吹打均匀后根据细胞生长速度1瓶传2瓶或1瓶传3瓶，补齐培养基（6cm皿加5ml，10cm皿加10ml）后放入37℃培养箱继续培养。 悬浮细胞在显微镜下观察，健康的细胞干净而透明，核清晰可见，静置培养时常见小细胞团。 ①若细胞状态好，培养基干净而无明显颗粒物沉淀，可直接1:2或1:3分瓶传代培养。 ②若细胞有碎片，培养基中颗粒物多，则需收集细胞培养液于15ml离心管中，600rpm离心5min，去上清，加入适量完全培养基重悬，轻柔吹打混匀后，根据细胞生长速度，1:2或1:3传代培养。 3、注意事项 1）细胞一旦染菌后直接舍弃并检查所有试剂耗材是否污染，如细胞样本非常
实验室常用细胞株
ATCC? Number: CRL-2865? Price: $329.00 Designations: T47D-KBluc Depositors: VS Wilson Biosafety Level: 1 Shipped: frozen Medium & Serum: See Propagation Growth Properties: adherent Organism: Hom o sapi ens (human) Morpholog y: epithelial Source: Organ: mammar y gland; breas t Tissue: duct Disease: ductal carcinoma Derived from metastatic site: pleural effusion Cell T y p e: epithelialtransfected with reporter plas mid Permits/F orms: In addition to the MTA menti oned above, other ATCC and/or regulatory per mits may be required for the transfer of this ATCC material. Any one purchasing ATCC material is ultimatel y r esponsible for obtaining the permits. Please click here for information regarding the s pecific requirements for shipment to your loc ation. Reverse Transcript: N Age: 54 years adult HeLa Mar kers: N
实验室仪器操作使用规范流程
实验室仪器操作使用规程 文件编号：SH/ZJ-05/02-2011 版本：A/01 页数：21 生效日期：2011年9月1日 编写：日期： 审核：日期： 批准：日期： 分发号：受控印章： 质量总监： 01 质检部部长：02 分发日期： 第1节质检部仪器设备一览表
第2节仪器操作使用规程 1. 高速组织捣碎机（DS-1） 1、将刀对准机轴，按下联轴节弹性元件至尺槽，使其居于容器盖园孔，方可启动电机。
2、物料须缓缓倒入容器中，先开慢速（1 ) ，后开快速（2 ) ，但慢速只能作起步作用，不宜长用。 3、由于电动机高速运转，不能长时间使用，必须每使用三分钟，休息五分钟，方可继续使用。 2. 绞肉机（MM8） 一、注意事项 1、机器旋转过程中严禁用手伸入绞肉筒，以免发生伤手事故； 2、需绞的肉一定要去净皮、骨、筋，并把肉切成细条状，以免损坏机器； 3、空机启动，螺杆转向必须与箭头指示牌所指的方向一致，导正常运转后，才可把肉放进绞肉筒进行绞肉，否则容易造成肉卡住机件，使机不能启动和正常运转，严重时会挤破绞肉筒、出肉轮，甚至会烧坏电动机： 4、如发现电动机运转不正常，应立即切断电源，停机检查原因，看是否有皮、骨、筋卡住； 5、如果出现肉呈糊状，可能由以下原因造成： ①出肉轮太松造成，切肉入与出肉孔板接触不良，应重新调整； ②出肉孔板堵塞，要给予疏通； ③切肉刀太钝，应修磨或更换；
二、使用方法 使用时，绞肉部分各零件应清洗干净，步骤如下： 拧出出肉轮，按顺序取出出肉孔板、切肉刀、送肉螺杆，然后松开夹紧手柄，取出绞肉筒，清洗完后，再装回绞肉筒，板动夹紧手柄至夹紧位置，然后，依次装入送肉螺杆，切肉刀、出肉孔板，再旋上出肉轮，要注意出肉轮不要旋得太紧，只需旋至刚与出肉孔板接触即可，通电旋转，再将出肉轮的松紧调至适当位置，否则会影响机器的使用寿命及出肉质量。以上工作做完即可进行绞肉，开机后把预先去掉皮、骨、筋并切成长条状的肉投入绞肉筒，如果出肉太慢，可用塞肉棒（严禁直接用手）把绞肉筒的肉条适当往下推送，但也不能送得太急，以免超过电动机承载能力，损坏电动机。 使用完毕，应将绞肉部分各零件卸下清洗抹干，以备下次使用。 3. 电子计数天平（LT200OA） 一、构造 本仪器由称盘、外壳、电源、检定分度值等部件组成； 二、使用方法 1、预热：接通电，打开开关，天平显示从“F…… 2 ”到“F…… 9 ”后即显示“0.0”或“0”，然后预热30 分钟左右，方能使称量准确；
细胞培养的流程
细胞培养的流程，从购买试剂、分装，到无菌操作、实验、观察的过程？ 对于新手来说，细胞培养真是太难了，很多的细节你不可能一下子就考虑到、预见到，因此请教细胞培养的高手就显得非常重要且可贵了。 细胞培养包括仪器的清洗、消毒灭菌，试剂的购买、配制、分装，细胞的分离，无菌操作，培养细胞的观察，实验的设计，及结果的分析等等。但这每一个过程的含金量都很高，要求非常严格。 如果你正在培养细胞，或曾经培养过细胞，你一定有很多的经验值得大家分享，你一定有你自己的一套培养细胞的流程，从哪开始到哪结束你也一定有太多的想说。因此，你不妨说说你的细胞培养流程，以便我们广大的细胞培养新借以一鉴。 于此，我先代表广大细胞培养新手谢谢各位园丁里的奉献者！ 有空整理一下再写写。。呵呵谢了先版主建议不错，我刚开始养细胞时遇到的各种困难可以说是不计其数了，解决困难耗费了大量地时间，可惜呀！ 养细胞是一项即有难度又很讲究技术的过程，作起来不易，要真正详细的写出来示人更难！书上的规范和标准很多，但作起来每人都有自己的方法，适宜就好。 我看还没有人跟帖，我就先说一点，从最初阶段开始：（自己的做法） （一）仪器的清洗 总的分为两大类：可泡酸的和不可泡酸消毒的。酸指消毒的清洁液（由浓硫酸、重铬酸钾和蒸馏水配置的次强酸液） 可泡酸的主要是玻璃仪器培养细胞的板子，离心管等塑料器皿。消毒过程：自来水冲洗3-5遍----→超声波清洗30′----→烘干----→濅入清洁液过夜（不少于6h）----→自来水冲洗15－20遍----→蒸馏水洗3-5遍，烘干备用。 不可泡酸的主要是胶塞和盖子，虑器等，先在清水中濅泡后冲洗烘干----→2%NaOH濅泡过夜，自来水冲洗，5%HCl濅泡三○min，流水冲洗----→蒸馏水漂洗----→烘干备用。 消毒好的器具一定找个干净的柜子保存，使用前高压消毒灭菌，我科室主要使用铝制饭盒分装器具，挺方便的，用前高压。 今天暂说一点，以后有机会再续，望给师弟妹们有所借鉴。斑竹不厚道，现在知道为什么没有别的战士跟贴了么？我怎么也耗了几十分钟打的字，你就这样打击别人的信心，还有可能往后面延续么！再说，经验何止这些这点...... 您的帖子我看见了，您的抱怨我也接受！并且跟您补上一分！ 每个斑竹给分的标准有一定的差别，但是可以肯定的是：我们有自己的加分原则，大原则是不变的！比如：版内讨论得很多的东西，重复发帖一般不予以加分！ 您的这个帖子属于改范畴！ 感谢您对细胞版的支持！如果有问题可以直接pm我们！ 再次感谢！再多说点啊！ 呵呵接着说呀，很好，很有帮助，我是新手，要多向你学习顶一下。我也说说我的一些体会吧。 1、首先说清洗： 对于玻璃器皿（如移液管、盖玻片之类）可先用酸液浸泡24h以上，再用清水浸泡24h。之后用清水将移液管冲洗10遍，除去残留酸液，再用双蒸水冲洗3-5遍，彻底洗净后放入不锈钢筒中，双层牛皮纸扎口，高压灭菌20min，烘干待用。我们实验室的酸液一般是次强酸液（重铬酸钾120g 浓硫酸200 mL 蒸馏水1 000 mL）配液时要小心烫伤。装培养基的瓶子则要在每次用完培养基以后就要立即洗净，临用时再次用清水冲洗3-5遍，再用双蒸水漂洗3次，洗净后瓶口盖上锡箔纸，外包双层牛皮纸扎口后高压灭菌20min，与其配套的瓶盖则洗净后另行包好同时灭菌、烘干。培养基过滤器灭菌同瓶子，也要在用完后及时洗净、
细胞免疫荧光实验步骤
细胞免疫荧光实验步骤 细胞免疫荧光实验步骤 简单实验步骤如下: 1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时. 2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟 3.PBS洗净:3min＊3 4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS 5.PBS洗净:2＊5min 6.羊血清封闭：３７度，２０分钟 ７.一抗，４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度１－２小时 ８.４度PBS洗净，３min＊５次 ９.二抗３７度小于一小时 １０.３７度PBS洗净，３＊５min 凉干封片（封闭液ＰＨ８.５） 活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备 （一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、 胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法) ↓ 用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为 5×10６～１×10７／ml ↓ 取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl) 的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS 稀释)灭活正常兔血清 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右 1000rpm×5min
↓ 弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠 (或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右 1000rpm×5min ↓ 加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入 1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察， 视细胞浓度加入100～500μl固定液) ↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察 (标本在试管中可保存5～7天) （二）试剂和器材 1. 各种特异性单克隆抗体。 2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。 4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。 （三）注意事项 1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN ３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。 3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。 4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。 附: 1. DPBS (×10, 贮存液)
实验室仪器标准操作规程的编写规范
适用范围 本规范适用于本单位仪器设备标准操作规程的编写。 操作规程编写的基本要求 1格式要求 1.1文件名称及编码 1.1.1文件名称命名方式为“生产厂家（或者品牌）简称+型号+仪器名称+标准操作规程”，例如：安捷伦1200高效液相色谱仪标准操作规程。 1.1.2编码方式为“ZY+序号-5.5-2013”，例如：ZY12-5.5-2013。 1.1.3字体均为宋体小四，并加粗。 1.2实施日期 1.2.1实施日期格式参照“2013.01.01”，字体均为宋体小四，并加粗。 1.3规程内容格式 1.3.1全部字体均为宋体小四，行距为1.5倍，内容小标题加粗。规程中的层次划分及编号，一律采用阿拉伯数字，层次的划分，一般不超过4部分，且首行不缩进。 2内容要求 2.1依据仪器设备使用说明、培训教程和上级已发布的标准操作规程编写，且与有关规定相协调。 2.2文字表达应准确、简明、通俗易懂，逻辑严谨，避免产生不易或不同理解的可能。 2.3规程中的图样、表格、数值、公式和其他技术内容应正确无误。 2.4规程中的术语、符号、代号应统一，与有关标准相一致，同一术语应表达同
一概念。 3规程一般由以下部分构成 3.1操作程序 3.1.1操作前准备 3.1.1.1核对和确认所用设备与检测目的所要求的一致性。 3.1.1.2识别设备计量检定状态标志和技术状态标志应符合规定；需要时，应标明对设备进行检定（自验）与检定周期的要求。 3.1.1.3设备使用技术条件和工作环境条件的检查与确定。 3.1.1.4安全与劳动保护条件的检查与确认。 3.1.1.5设备正确停机状态的检查与确认。 3.1.1.6检查并加油、加水、加燃料（必要时），达到规定要求。 3.1.2开机与运行 3.1.2.1接通电源，观察指示信号的要求与规定。 3.1.2.2必要时，仪器的预热或预置的要求与规定。 3.1.2.3校准或调零的要求与规定。 3.1.2.4设备自身系统误差的测定。 3.1.2.5必要时（如长时间停机后初次运行时）开机空运行，观察运行的稳定性。 3.1.2.6对样品的要求与规定 3.1.2.7上样和运行的操作步骤，要求与规定 3.1.2.8读取检测数据的方法。 3.1.2.9必要时（如长期停机，初次运行）在首次运行前，采用非检验试样做试验，观察设备运行的稳定性、可靠性。 3.1.3停机与保养 3.1.3.1检测完毕，停机状态的要求与规定。 3.1.3.2切断电源，观察指示信号的要求与规定。
Seahorse-XF实验流程
Seahorse XF实验流程 （此为简略版实验流程，详细步骤参见培训手册） XF实验前一天 1.种细胞：将细胞接种到Seahorse XF细胞培养板中，在生长培养基中过夜培 养。注：细胞接种时间和培养时间可根据细胞处理要求进行选择。 2.预热仪器：打开Seahorse仪器和电脑，并打开软件，使仪器升温至37℃， 过夜预热。 3.> 4.水化探针：在Utility Plate中加入Seahorse XF校准液，将测试板放回 培养箱中过夜水化探针。 Utility Plate上，置于37℃无CO 2 XF实验当天 1.准备检测液：用Seahorse XF Base Medium配制检测液，加入所需要的底物， 将溶液加热至37℃，用NaOH调pH值至，过滤，置37℃水浴中备用。 注：检测液中所需要添加的底物及浓度取决于细胞类型和实验设计，或者与生长培养基保持一致。 2.】 3.观察细胞：将细胞板从CO2培养箱中取出，在显微镜下观察细胞状态。 培养箱4.细胞换液：将生长培养基换为检测液，然后将细胞放置在37℃无CO 2中1小时。 5.配药：根据试剂盒说明书，配制并稀释药物至所需浓度。 6.加药：将稀释好的药物分别加入测试板上的A，B，C，D 四个加药孔中。 注：根据实验设计选择所用加药孔数量。 7.\ 8.设计实验模板：用软件记录实验条件和设计实验程序。 9.上机：开始运行实验程序，将加过药的测试板和装有校准液的Utility Plate 一起放置到仪器托板上。 10.仪器自动校准探针。 11.换细胞板：当软件出现提示信息时，将Utility Plate换为细胞板。
12.实验完成时根据软件提示信息退出测试板和细胞板，并在显微镜下观察细胞 状态。 13.数据分析：采用wave软件和report generator对实验数据进行分析。
实验室细胞株管理规定
细胞株管理规定 一、什么是细胞株？ 原代代培养物经第一次传代培养后的细胞，常被称为细胞系（cell line）。由某一细胞系分离出来的、在性状上与原细胞系有一定差异的细胞系，常被称为该细胞系的亚系（subline）。 从一个经过鉴定的细胞系采用选择法或单细胞克隆进一步所得到的细胞群，常被称细胞株（cell strain）。由原细胞株进一步分离培养出的与原株性状不同的细胞群，又被称为亚株（substrain）。 二、细胞株管理规定 对已建立和经过鉴定的细胞株要进行严格管理，规定如下： 1.制度管理规定 A.细胞株应有专人负责保管，并由实验室负责人监督检查。更换保管人时应提 前做好工作交接，确保使用安全。 B.建立细胞株使用登记制度，记录细胞株的编号、名称、来源、冻存数量及日 期、取用数量及日期、剩余数量及保存方法。 C.细胞株长期保存应放置于液氮罐中，短时保存或过渡保存可置于-80℃冰箱 中。 D.保存的细胞株应定期复活、保种，即每半年对没有复苏过的细胞株进行维护， 复苏、培养和保存，并详细记录细胞株状态，如形态、生长速度、抗体分泌情况等。 E.细胞株不得外借，不得随便带出实验室。 F.细胞株的使用、保存、转移和销毁应符合相关部门的有关规定。 2．使用流程规定 A.如有新细胞株进入实验室，需告知实验室负责人并进行冻存保种； B.实验室人员需复苏细胞时，需提前向实验室负责人申请，经批准后方可复苏； C.设存取记录表，实验人员存取细胞时做好记录并把细胞复苏情况反馈至实验
室负责人，实验室负责人需监督实验人员做好细胞株使用记录情况； D.若复苏细胞人员复苏同一株细胞株两次均未成活，需通知负责人进行检查和 复苏，如贮存细胞确实出现问题，则及时清理。 三、细胞保存 A.冻存条件：90%FBS+10%DMSO，4℃冰箱预冷； B.冻存方法： 4 ℃（30-40min）→-20 ℃（1-2h）→-80 ℃（过夜/24 h以上，可短时保存 1-3个月）→液氮（永久保存； C.填写冻存记录表 四、细胞复苏 A.水浴锅37℃预热 B.从细胞冻存管理表中查找并记录所需细胞在液氮罐中的位置。 C.液氮罐中快速取出细胞，迅速放入水浴锅中融化，并持续晃动，避免因受热 不均产生冰晶，损伤细胞，融化时间为1～2min； D.将细胞悬液移至离心管中，加入10倍体积的细胞培养液，混匀； E.1200rpm/min，离心5min F.弃去上清液，加入新的培养液重悬，移至细胞培养瓶中，显微镜下观察细胞 形态，37℃培养箱培养。 G.次日，更换培养液继续培养，待其铺满培养瓶面积80%及以上，可尽心传代。 四、液氮罐的使用 A.开启液氮罐时，戴好防冻棉手套，防止冻伤； B.提前确定细胞保存位置，避免提篮在外停留时间过长； C.填写复苏记录表，负责人做好整理保藏记录，禁止短期内使用同一株细胞的 多管细胞，复苏后使用细胞的同时需补充细胞株库存，写明细胞名称、冻存时间、冻存人等细节。 五、附件 1.细胞冻存记录表 以50L液氮罐所配的6个提篮，每个提篮6层抽屉柜，每个抽屉柜5*5个冻存管。
实验仪器标准操作规程
实验仪器标准操作 规程
微波炉标准操作规程 1. 操作程序: 1.1插上电源，打开柜门，放进需要加热的物品，关上柜门。 1.2选择火力，融化培养基一般用中高火即可。 1.3选择时间：融化培养基须注意边加热边拿出观察培养基融化情况，防止培养基爆沸。其它物品加热时间视情况调整时间。1.4加热完毕，将定时器调至0位置，小心拿出加热物品，关闭柜门。 2.微波炉操作注意事项： 2.1 微波炉上不得堆放杂物，微波炉周边不应放置其它电子产品。 2.2炉内未放入加工原料时，不要通电工作，不可使微波炉空载运行，否则会损坏磁控管。 2.3 凡金属的餐具，竹器，塑料，漆器等不耐热的器皿，有凹凸状的玻璃制品，均不可放入炉内使用。瓷制碗碟不能镶嵌有金属边的容器，不能放入炉内。 2.4袋密封包装及金属罐的食品不能直接放入炉内，以免爆炸伤人。 2.5 一定要关好炉门，确保连锁开关和安全开关的闭合。 2.6炉子关掉后，不宜立即取出加热物品，因为此时炉内尚有余热，物品还可继续加工，应过1分钟后再取出物品。
2.7定期检查炉门四周和门锁，如有损坏，密闭不严，应停止使用。以防微波泄漏，不一把脸贴近微波炉观察窗，防止眼睛因微波辐射而损伤，也不宜长时间受到微波照射，以防止引起头晕，目眩，乏力，消瘦，脱发等症状，使人体损伤。 2.8如设备发生问题，第一时间告知主管，设备停止使用，报维修部维修。 2.9光波烹调为烧烤专用，一般情况下不使用光波烹调和组合烹调按钮。 WD-A型电子连锁传递窗标准操作规程 1 .操作程序: 1 .1电子连锁传递窗任何状态下只能打开一扇门，以达到两边空气的严格隔离。 1 .2接通传递窗电源红色电源指示灯亮，操作人员可经过两个按键操作菌灯或开门。 1 .3按开门键（红色钮），一侧门开，货物进入传递窗内，关窗门（据需要开启灭菌灯）。 1.4另一侧门按红色键，取出物品，关闭窗门（若灭菌完需先关闭紫外灯）。 1 .4停电应急开启：传递窗两侧都设有小孔，停电时只要在小孔内插入细铁丝往中间拨动即可开锁。 2维护和保养与清洁 2.1每次使用完毕均需要进行紫外照射舱体。
细胞实验的基本操作
细胞实验的基本操作 【细胞培养】 一、细胞的复： 非原代培养的细胞一般冻存于液氮之中，需要培养时要先从液氮中取出使之复。细胞复的原则——快速融化：必须将冻存在－196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。 具体操作如下： 1、实验前准备： 1.1、将水浴锅预热至37℃，并将含10%FBS的培养液置于其中预热；。 1.2、用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。 1.3、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。 2、取出冻存管及迅速解冻： 2.1、根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。 2.2、从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。 2.3、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，约1-2min后冻存管液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台。 3、平衡离心将细胞悬液吸到离心管中，1000～1500rpm离心3分钟； 4、制备细胞悬液吸去上清液，加入10 ml培养液，用吸管轻轻吹打均匀，使细胞悬浮； 5、细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。 6、培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液吸到培养瓶中，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱培养（略微拧松培养瓶盖），换液的时间由细胞情况而定。通常，除少数特别注明对DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入含有10-15ml（5－10倍）新鲜培养
基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。 二、细胞的传代： 培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代物逐步积累（可见到培养液变黄），而且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞的继续生存。这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代。 1、贴壁细胞的传代 具体操作如下： 1.1、传代前准备： 1.1.1、预热培养用液：把装有培养液、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅预热。 1.1.2、用75％酒精擦拭双手和经过紫外线照射的超净工作台 1.1.3、正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。 1.1.4、点燃酒精灯：注意火焰不能太小。 1.1.5、准备好将要使用的已灭菌的空培养瓶。 1.1.6、取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后能放入超净台。 1.1.7、从培养箱取出细胞，注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察 细胞，并做好记录。 1.1.8、细胞培养瓶经用75％酒精擦拭后，再放入超净台。 1.2、胰蛋白酶消化：
肿瘤学研究常用实验技术及方法
精心整理 肿瘤学研究常用实验技术及方法复习题 1.表观遗传的科学内涵 三个特点？ a)基因功能完全、稳定地丧失，有遗传性； b)细胞外环境长期作用的结果，有可逆性； c)分析方法灵敏，可检出少数细胞的变化 2. DHPLC 3. i. ii. 梯度中 iii. SDS- iv. 1.丙烯酰胺有神经毒性，可经皮肤、呼吸道等吸收，故操作时一定要注意防护。 2.制备聚丙烯酰胺凝胶时，小心防止凝胶渗漏。 3.蛋白加样量要合适，加样量太小，条带不清晰，加样量太大，则泳道超载，条带过宽而重 叠，甚至覆盖至相邻泳道。 4.对多种蛋白质而言，电流大则电泳条带清晰，但电流过大，玻璃板会因受热而破裂，故适 合的电流为玻璃板微热。 5.胶转膜后应在膜上标记好正反面及电泳方向。 6.电转移时应注意勿将滤膜和胶的位置放反，而且滤纸、滤膜和胶应等大，以免短路。
4.组织培养/基因的克隆、转化与表达 i.请列举至少3种流式细胞仪的用途? 1.定量检测细胞膜、细胞质和细胞核中的各种细胞成分 2.研究细胞的各种功能状态(细胞增殖，细胞凋亡、细胞分化、酶活性、细胞膜通透性、 氧化还原状态、吞噬性等)。 3.定量检测血清中的各种可溶性生物分子成分 临床中应用：1.白血病和淋巴瘤的免疫分型 1. 2. 3.细胞 磷酸酶（phosphatase） 激酶（Kinase） 连接酶（Ligase） 5.生物质谱简介 生物质谱在蛋白组学中的应用？ 1.ProteinsMWmeasurements； 2.ProteinIdentification；(ID) 3.Peptideandproteinprofiling； 4.ImagingMS； 5.ProteinPTMs；5.ProteinQuantification 6.《常用电泳技术基本原理及应用》课程复习题
体外培养细胞的种类和命名
体外培养细胞的种类和命名 体外培养细胞的名称，随培养细胞技术的发展和细胞种类的增多而演变。最早采用的名称为细胞株（Cell strain），以后又出现细胞系（Cell Line）一词，两者曾一度混用致概念不明确，导致文献中也很混乱。我国也曾有类似情况，在我国尚未制定出统一名词前，本书用的名词基本参考Schaeffer，W.I.（1979）和国内有关会议、以及国内外杂志常用名词为准。 （一）初代培养 初代培养又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。一旦已进行传代培养（Subculture）的细胞，便不再称为初代培养，而改称为细胞系。 （二）细胞系 初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（Finite Cell Line）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。无限细胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性；有的不仅有永生性，异体接种也有致瘤性，说明已恶性化。这两种不同性质的无限细胞系，在国内外文献中对这些名词的应用上也常不十分严格。为概念上的明确，本书中对有恶性的无限细胞系采用“恶性转化细胞系”一词表示可能更妥。而对那些只具永生性而无恶性的细胞系，则用无限细胞系或转化细胞系即可。当前流传的NIH3T3、Rat-1、10T1/2等均属这类细胞系。 由某一细胞系分离出来的、在性状上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞系的亚系（Subline）。 （三）克隆细胞株 从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株（Substrain） （四）二倍体细胞 细胞群染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同（2n细胞占75％或80％以上）的细胞群，称二倍体细胞培养。如仅数目相同，而核型不同的即染色体形态有改变者为假二倍体。二倍体细胞在正常情况下具有限生命期，故属有限细胞系。但随供体年龄和组织细胞的不同，二倍体细胞的寿命长短各异。人胚肺成纤维细胞可传50代土10代，人胚肾只有8～10代，人胚神经胶质细胞15～30代；如从老龄个体取可传50则细胞生存期更短。由不同年龄供体取材建立的二倍体细胞系可供研究衰老之用。为保持二倍体细胞能长期被利用，一般在初代或2～5代即大量冻存作为原种（Stook Cells），用时再进行繁殖，用后再继续冻存，可供长期使用或延缓细胞的衰老。 （五）遗传缺陷细胞 从有先天遗传缺陷者取材（主要为成纤维细胞）培养的细胞，或用人工方法诱发突变的细胞，都属遗传缺欠细胞。这类细胞可能具有二倍体核型，也可呈异倍体。 （六）肿瘤细胞系或株 这是现有细胞系中最多的一类，我国已建细胞系主要为这类细胞。肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞，常已传几十代或百代以上，并具有不死性和异体