血管生成实验模型研究进展

血管生成实验模型研究进展

吴家明1

,陆　茵

1,2

,郜　明1,张伟伟

1

(1.南京中医药大学中医药研究院,江苏南京　210029;2.江苏省方剂研究重点实验室,江苏南京　210029)

收稿日期:2007-09-21,修回日期:2007-11-01

基金项目:国家自然科学基金资助项目(No 30371727,30772766);江

苏省自然科学基金资助项目(No BK2003113)

作者简介:吴家明(1980-),男,硕士生,研究方向:肿瘤血管生成与

抗肿瘤转移研究,E 2mail:nj w ujia m ing@https://www.360docs.net/doc/3116776992.html,;

陆　茵(1963-),女,教授,博士生导师,研究方向:肿瘤血管生成与抗肿瘤转移研究,通讯作者,Tel:0252

86798154,E 2mail:luyingreen@https://www.360docs.net/doc/3116776992.html,

中国图书分类号:R 205;R 332;R 3632332;R 36413

文献标识码:A 文章编号:1001-1978(2008)01-0011-04摘要:抗血管生成已经成为治疗肿瘤转移、糖尿病视网膜病变、风湿性关节炎等疾病的重要策略之一。血管生成模型作为一种研究工具在探讨血管形成机制、发现促进或抑制血管生成药物等研究中发挥十分积极的作用。如何寻找适合的血管生成模型是研究人员在研究中常遇到的问题。该文就主要常用模型做较全面的介绍,并对其优缺点进行评价。关键词:血管生成;模型

血管生成(angi ogenesis )是指在原有的毛细血管和(或)微静脉基础上通过血管内皮细胞的迁移和增殖,从已存在的血管处以芽生或非芽生(套迭)形式形成新的、以毛细血管为主的血管系统过程

[1]

。血管生成是许多促进或抑制血管

生成的分子参与调节的一个平衡过程[2]。血管生成过多与肿瘤、糖尿病性视网膜病变等疾病有关[3],抑制血管生成已经成为治疗这些疾病的重要策略。因此寻找血管生成抑制剂成为研究热点。血管生成研究需借助血管生成模型进行,血管形成的许多过程都可以在血管生成模型中模拟完成,包括内皮细胞增殖、迁移、毛细血管网状结构的形成等。本文就常用体内、体外及整体模型进行综述。

1　体外模型

体外模型主要分为细胞水平及组织学水平两类,常用的体外模型有以下4种。

1.1　内皮细胞增殖实验(cell proli fera ti on a ss ay)　内皮细

胞活化增殖是血管生成的起始阶段。目前主要有两种测定细胞增殖的方法即净细胞数测定和细胞周期分析。

1.1.1　净细胞数测定　M TT 法(四甲基偶氮唑比色法)是

测定活细胞数的化学定量方法,操作简便,价格低廉。但它不适合测定对细胞代谢有影响的药物,因为这类药物能影响

MTT 测定的活细胞数。另外通过胸腺嘧啶核苷参入法测定DNA 合成来测定细胞增殖能力。抑制细胞增殖可能是由于

药物的抑制作用,也可能是药物的毒性作用引起。因此,这种方法常需要结合细胞凋亡实验的数据才可以更好地评价药物对细胞增殖的影响。

1.1.2　细胞周期分析　近年来有报道通过细胞周期分析来

评价药物对细胞增殖的影响,细胞短时间暴露到溴脱氧尿苷

(B rd U )中可以促使B rdU 参入细胞DNA 中。碘化丙啶(P I )

染色后测定细胞的总DNA 量,再用荧光激活细胞分析仪测定细胞中B rd U 和P I 的量可得出细胞周期信息[4]。但实验用的内皮细胞处于增殖状态,与体内静止状态的内皮细胞是不同的,实验结果与体内还是存在一定差异。

1.2　内皮细胞迁移实验(cell m i gra ti on a ss ay)　常用迁移

模型有两种:①细胞损伤模型:在培养血管内皮细胞的培养皿上用刀片划出#形区,经P BS 洗涤后再用含011%明胶的

ME M 培养20h,细胞用甲醇固定,Gie m sa 染色。在光镜下计

数从损伤边缘迁移出的细胞数,需要注意的是划出的损伤区域一定要精确。②Boyden 室模型,Boyden 室由两层组成,两层之间为胶原包被的多孔的多聚碳酸盐滤膜;血管内皮细胞放于上层,同时加入待测药物,共同培养6h 后,除去上层的细胞,下层细胞用甲醇固定,HE 染色,光镜下计算下层的血管内皮细胞数。龙淼云等[5]采用本模型研究证明了血管生成抑制因子arresten 对huvec 迁移有抑制作用。Boyden 室模型优点在于它对药物浓度梯度差异很敏感。但对实验技术要求较高且计数方法不同可能会造成统计结果误差较大。因此有必要建立一个严格的计数标准以减少因方法不同产生的误差。

1.3　小管形成实验(tube for ma ti on a ss ay)　小管形成实验

能模拟人体内毛细血管生成的过程,包括内皮细胞出芽增殖和毛细血管网结构形成等步骤,接近人体内血管生成的实际过程。内皮细胞在基质胶、纤维蛋白胶、胶原等基质上培养时能形成网状结构。用电子显微镜来分析小管间的紧密连接,从而定量血管生成情况[6]。需要指出的是似乎所有的内皮细胞都能在细胞外基质上形成管状结构,有些非内皮细胞也能在基质胶上形成管腔结构[7]。实验一般采用24孔培养板,但它底面积大,Matrigel 用量多,计数区域大只能随机选择几个典型区域且数据分析耗时长。Sanz 等[8]采用384孔和1536孔培养板培养可节约胶的用量,借助计算机可以计算整个孔的小管及小管之间的连接数及小管的长度和面积。改进方法后减少了原来分析困难及重现性差的缺点。

1.4　大鼠动脉环实验(ra t aorti c r i n g a ss ay)　1990年N ic 2osia 等首次将此模型应用于血管生成研究中。取下大鼠主

动脉后,剪成1mm 宽的血管环,再用纤维蛋白胶或胶原蛋白胶包埋,然后以无血清的MC DB131培养液培养。培养过程中每天计算主动脉环产生的新生微血管数并进行定量分析。用不同胶培养的大鼠主动脉环新生血管的生长曲线不同。胶原包埋的主动脉环,培养1wk 时血管数达到顶峰,第

2wk 开始萎缩。用纤维蛋白胶包埋时能使血管数顶峰期维

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11?中国药理学通报　Chinese Phar m acological B ulletin 2008Jan;24(1):11～4

持更长,且新生血管数是前者的213倍。2002年Zhu等[9]将此方法改进,采用更薄的胶层包埋动脉环使得新生成血管染色更方便;应用双重染色法和共聚焦显微镜在同一层面上观察到内皮细胞和平滑肌细胞及外周细胞共同存在并证明了新生血管主要由内皮细胞构成。方法学的改进有利于血管生物学家更深入研究血管生成的机制。动脉环取材范围广泛,观察方法简单,可从分子水平阐明血管生长的分子调控机制,是一个较好的体外血管生成模型。但它不能完全真实反映肿瘤生长的微血管环境[10],另外从不同种属和不同大小的动物体内取出的动脉环血管生成数差别很大。

2　体内模型

体外模型虽然有其优点,但并不能完全替代体内模型,因此体内模型亦非常重要,下面就主要常用的体内模型作一些介绍。

2.1　角膜微囊实验(cornea l m i cropocket a ss ay)　1974年Folk man等首次将该模型用于肿瘤血管生成研究。正常角膜本身无血管可避免其他模型中原有血管的干扰,因此诱导角膜血管生成反应更能真实地反映血管生成过程。早期实验采用兔眼角膜,Bernardini等[11]将体重为2～3kg的健康新西兰白兔麻醉后,在角膜边缘处用虹膜刀植入载体,3～4 d后血管从边缘出芽,7～10d内新生毛细血管进入载体,通过计数载体内新生毛细血管数和生长率可评价药物对血管新生的效果。但实验过程中易诱发非特异性炎症反应,难与肿瘤微血管生成因子刺激的血管生成相区别,并且模型中微血管生成呈环状排列,分布无规律,造成定量困难。后来Folk man等用组织相容性好且较少引起炎症反应的高分子材料制成多聚缓释载体,在载体中加入微血管生成因子后再植入角膜微囊。改进后的模型较少引起炎症反应,但成本较高。1979年Muthukkaruppan等将方法进一步改进,采用鼠眼角膜进行实验,成本大大降低,效能基本相同,但大鼠的眼球小,给试验操作带来一定难度。

2.2　鸡胚绒毛尿囊膜实验(ch i ck chor i oa ll an to i c m e m2 branes a ss ay)　1931年Le wis等建立鸡胚绒毛尿囊膜实验模型,最初用于胚胎组织移植物发育潜能的研究。1977年Folk man等首次将其用于肿瘤微血管生成研究。该模型取材方便、易于观察、实验周期短和费用低,适用于大量血管生成药物的筛选,同时也存在一些缺陷。植入物渗透压和pH 的不同所导致的细胞损伤和炎症反应及鸡胚内血管纤维蛋白降解产物均可刺激微血管生成,造成假阳性结果。鸡胚发育本身存在的血管生长亦可干扰结果,导致结果可信度下降。

2.3　海绵植入实验(sponge i m pl an t a ss ay) 1987年An2 drade等提出海绵植入实验模型:先将待测药物注入无菌聚酯海绵中,再将海绵植入大鼠皮下。海绵植入后用133X清除技术测定其中的血流,血管化后可以客观、重复评价血管新生,也可以通过局部注射促进或抑制血管生成物,再收集渗出液来做生化分析。海绵植入实验可模仿肿瘤缺氧微环境,也适用于肿瘤血管生成研究。该模型也存在一些缺点,海绵植入皮下会引起非特异性炎症反应,肉芽组织逐渐包裹海绵。此外,使用不同成分海绵可引起较大的实验差异,放射性气体的使用也使得实验进一步复杂化。

2.4　圆盘血管生成系统(the d isc a ss ay)　1988年Fajardo 等将圆盘血管生成模型应用于伤口愈合和实体瘤血管生成研究。将药物或肿瘤细胞悬液加到聚乙烯醇泡沫材料制成的圆盘中央,再将小圆盘植入小鼠胸部或腹部皮下。实验结束后取出小圆盘,石蜡包埋后切片,在显微镜下可以观察到血管、成纤维细胞及粘连组织。通过计算组织切片中血管交叉点和测定血管内面积来定量新生血管,这些方法直观且易操作。同时本模型仍存在一些缺陷,植入圆盘后引起的异物反应也能刺激血管形成,并且不能连续和动态观察小圆盘内血管生成情况。

2.5　基质胶栓实验(ma tr i gel plug a ss ay)　1992年Passani2 ti等建立基质胶栓(matrigel p lug)模型。基质胶是从Engle2 berth2Hol m2S war m瘤中提取的,主要由基膜蛋白构成。4℃时基质胶是液态,将bFGF与胶混匀后注射到小鼠皮下,胶在体温状态下形成胶栓,内皮细胞等迁移入胶栓内形成血管样结构。1～3wk后取出胶栓及包围在周边的肉芽组织,再定量胶栓内血管。过去定量血管生成常采用计算血管数,但基质胶栓中血管分布不规则导致计数困难。也有采用测定新生血管血液中血红素含量来定量血管生成,但无法区分新生血管、血窦及大血管中的血液[10],结果定量也不准确。近来有报道通过注射荧光素标记的高分子量葡聚糖来定量新生血管[12]。该模型也可应用于组织再生实验[13]。所有组织似乎都包含有促进或抑制血管生成的因子,而胶栓中除新生血管外本身没有组织,这其实也是一个缺点。另外,每次注射相同体积的胶液却难以得到相同体积的胶栓,导致基质胶栓模型结果差异较大[6]。虽然该模型存在以上缺点,现仍被广泛用于促进或抑制血管生成药物筛选。

2.6　海绵—基质胶实验(the sponge/ma tr i gel a ss ay)　2002年Akhtar等[14]结合海绵植入实验和基质胶栓实验建立海绵—基质胶(s ponge/matrigel)模型。方法是将015m l 的Matrigel注射到小鼠皮下,待胶凝固后麻醉小鼠,轻轻刮掉注射胶液处的毛发,在皮肤上开一小口,再在胶栓上开一小口后植入含有供试药物的无菌聚乙烯海绵、瘤块或其他组织,再用镊子将海绵移至胶栓的中央,实验结束后取出胶栓并定量新生血管数。模型改进后血管能定向生长,灵敏度比基质胶栓实验更高,不足之处在于实验耗时更长。

3　整体模型

体内和体外实验模型结果最终需要应用整体模型来进行全面的评价和验证,以下是一些常用的整体模型。

3.1　斑马鱼实验模型(zebraf ish m odel)　1999年Serbedzi2 ja等[15]用斑马鱼来筛选影响血管生成的小分子物质。斑马鱼是热带淡水鱼具有以下优点[16]:①斑马鱼是脊椎动物,有独立的组织器官,其器官与人器官在结构、生理、分子水平等方面惊人地相似;②个体小,喂养费用低廉,所需空间场地不大;③胚胎透明,从完整的活体可以观察到所有内部器官和结构,避免杀死或解剖动物,从而可多角度观察动力学过程。斑马鱼体外排卵、体外受精、在无营养条件下可存活

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3～4d。血管生成与其他脊椎动物相似,所以非常适合体内血管细胞生物学研究[17]。与其它模型相比,斑马鱼模型实验周期短,只需要3d,斑马鱼容易喂养,药物需要量少,单剂量给药,一次可以筛选较多化合物且适合于量效关系研究[18]。另外斑马鱼模型还可以快速鉴定血管生成中的新的候选疾病基因及有潜在治疗效应的化合物[17]。斑马鱼模型目前研究还处于尝试验证阶段,但已显示出诱人的前景。3.2　爪蟾蝌蚪模型(xenopus l aev is t adpole m odel)　Ny等建立爪蟾蝌蚪模型。蟾蜍发育很快,受精后4d用显微成像技术能观察完整发育和功能性脉管系统。蟾蜍胚胎是可应用于血管生成研究的有用模型。蟾蜍与斑马鱼一样与其他脊椎动物的血管类似[18],但蟾蜍与斑马鱼不同的是它淋巴系统发达,可用于淋巴管生成的分子研究。

3.3　肿瘤模型(tu m or m odel)　林红英等[19]报道了与血管生成有关的转基因肿瘤动物模型。也有很多其他的肿瘤模型被用来研究药物抗肿瘤的潜在活性以及对瘤块大小(直径、面积或体积)和动物存活时间的影响[20-23]。肿瘤模型可专门用于研究药物潜在的抗血管生成活性,它可以在同一个实验中研究药物的摄取、分布以及效应。同时也可以用来检测一个药物是否具有抗血管生成作用,如果药物有抗血管生成的作用,就会阻止或大大减少肿瘤新生血管的数量。实验性肿瘤特别是皮内注射形成瘤的局部环境与自发性生长瘤不一样,动物肿瘤模型与人体内肿瘤生长环境还有一定差别,因此动物实验不能完全等同于人体实验。

4　问题与展望

迄今为止血管生成模型还没有一个统一的评价标准。Stat on等[24]认为理想的血管生成实验模型应该可靠、操作简便、定量容易、更重要的是和人体生理条件相关。但是由于血管生成反应中细胞及分子活性复杂,单独一种模型不可能满足以上所有条件。体内外血管生成模型各有其优缺点。体外模型能较好地控制和监测实验过程,操作相对简单,实验费用较低,但条件难标准化,实验结果不能完全反映体内情况需要体内实验来证实。体内模型实验条件较接近体内环境,但操作繁琐耗时、价格昂贵、结果不易定量且易变性大。最终还是需要借助整体模型来验证和评价。由此可见许多实验模型还有待于日后进一步研究和完善。只有借助趋近完善的模型我们才能更好地筛选血管生成抑制剂,从而得到更客观、真实及全面的信息。

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中国药理学通报　Chinese Phar m acological B ulletin　2008Jan;24(1)

The advances of ang i ogenesis a ss ay m odels

WU J ia2m ing1,LU Yin1,2,G AO M ing1,ZHANG W ei2wei1

(1.Traditional Chinese M edical Research Institute,N anjing U niversity of TC M,N anjing　210029,China;2.Key L aboratory for

M odern Research of T raditional Chinese M edical For m ulae of J iangsu,N anjing　210029,China)

Abstract:Anti2angi ogenesis has been one of the i m portant strat2 egies in treating tu mor metastasis,diabetic retinopathy,rheu2 matic arthritis etc.Angi ogenesis models have p layed an active r ole in studying the mechanis m of angi ogenesis and devel op ing drugs of p r o2or anti2angi ogenesis.A common p r oble m faced by angi ogenesis researchers has been the difficulty of choosing suit2 able models.This paper revie ws p rinci pal models in use f or s ome details and their advantages and shortages.

Key words:angi ogenesis;model

◇论 著◇

新生霉素抑制H L260/Bcr2Abl细胞

增殖与阻断Hsp90伴侣功能的关系

吴丽贤,许建华,张昆仲,温彩霞,黄秀旺

(福建医科大学药理系,福建医科大学临床药理研究所,福建福州　350004)

中国图书分类号:R329124;R329125;R341;R733170212; R97713;R979119

文献标识码:A文章编号:1001-1978(2008)01-0014-06摘要:目的　研究新生霉素(novobi ocin,NB)对HL260/Bcr2 Abl细胞的作用,并探讨该作用是否与Bcr2Abl水平和热休克蛋白90(H s p90)分子伴侣的功能有关。方法　用蛋白免疫印迹法检测Bcr2Abl的含量,采用免疫共沉淀的方法研究H s p90分子伴侣的功能。先将Bcr2Abl与其分子伴侣共沉淀下来,然后用免疫印迹法检测沉淀物中与Bcr2Abl结合的H s p90和H s p70含量变化。应用蛋白酶体抑制剂ALLn L研究Bcr2Abl降解的途径。结果　NB能降低HL260/Bcr2Abl 细胞中Bcr2Abl的蛋白水平,NB使Bcr2Abl与H s p90和H s p70的结合减少,促进蛋白酶体降解Bcr2Abl蛋白,ALLn L 处理后NP240ins oluble部分Bcr2Abl蛋白水平提高。结论　该研究证明NB通过干扰H s p90伴侣功能,减少Bcr2Abl与H s p90和辅伴侣的结合,从而促进蛋白酶体降解Bcr2Abl蛋白,最终抑制HL260/Bcr2Abl细胞增殖。

关键词:新生霉素;Bcr2Abl蛋白;热休克蛋白90;分子伴侣

H s p90具有促进新合成的蛋白和变异蛋白折叠的功能,该功能受H s p90与辅伴侣相互作用和

收稿日期:2007-08-01,修回日期:2007-10-09

基金项目:国家自然科学基金资助项目(No30171158,30472187);

福建省自然科学基金资助项目(No C0610025);福建省属

高校资助项目(No2005k048)

作者简介:吴丽贤(1975-),女,博士,讲师,研究方向:抗肿瘤药理学,E2mail:wlx2lisa@https://www.360docs.net/doc/3116776992.html,;

许建华(1958-),男,博士,教授,博士生导师,研究方向:

抗肿瘤药理学,通讯作者,Tel:0591283569307,E2mail:xjh

@mail.fj m https://www.360docs.net/doc/3116776992.html, H s p90与ATP结合/水解所调节[1-3]。H s p90作为分子伴侣,其已确定的客户蛋白(client p r otein)超过100个[4-9]。H s p90能成为抗肿瘤药物的很有前景的靶点,是因为它的许多客户蛋白是细胞增殖信号通路中的重要分子,与肿瘤密切相关。H s p90的N2端和C2端都能与辅伴侣或ATP相互作用,从而调节其伴侣的活性[10,11]。近来研究表明H s p90抑制剂有多类,如作用于H s p90N2端ATP结合区域的G A 和其衍生物172AAG;作用于H s p90C2端二聚化区域的顺铂和新生霉素(NB);影响H s p90翻译后修饰的组蛋白去乙酰化酶和蛋白酶体抑制剂[7]。

融合基因bcr/abl是由9号染色体与22号染色体相互易位形成的,该基因编码的Bcr2Abl蛋白具有很强的酪氨酸激酶(PTK)活性,扰乱了正常的信号转导,不仅是慢性粒细胞白血病(C ML)发病的分子学基础,也是C ML对多种化疗药物产生耐药的主要原因[12-16]。由于Bcr2Abl是H s p90的客户蛋白之一,因此抑制H s p90的分子伴侣功能就很有可能同时阻断Bcr2Abl激活的多条信号传导通路。An 等[17]在研究中发现:Bcr2Abl是热休克蛋白H s p90的一种“客户”蛋白,它需要与H s p90/p23伴侣复合物结合,才能获得稳定性,进而发挥抗凋亡、诱导耐药等活性。H s p90N2端抑制剂G A能使Bcr2Abl与H s p90/p23伴侣复合物解离,同时Bcr2Abl与H s p70/p60Hop伴侣复合物结合增加,Bcr2Abl蛋白失去正常的稳定性,进而被蛋白酶体降解。

香豆素类抗生素是一类含有42羟基香豆素基本结构的物质,其代表药物新生霉素已在临床使用,

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