单克隆抗体的重链和轻链在体积排阻色谱柱上的检测
ZM1006
? Sepax Technologies, Inc.
Monoclonal Antibody Heavy and Light Chain Separation on
Zenix ? (7.8 x 300 mm)
Keywords: Size exclusion, Zenix, proteins, pore size, monoclonal antibody, reduced monoclonal antibody, heavy chain, light chain, volatile mobile phase
Column: Zenix TM
-300 7830 Mobile phase: 0.1% TFA, 0.1% formic acid and 20% acetonitrile
Flow: 0.5mL/min Detection: UV 280nm Injection volume: 20 L Sample: Reduced monoclonal antibody (1 mg/mL) with 20 mM DTT
人源化单克隆抗体的构建技术
人源化单克隆抗体的构建技术 摘要：单克隆抗体从问世到现在已广泛应用于临床，经历了一段曲折的发展历程。其中人源化抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新，如PCR 技术、抗体库技术、转基因动物等。抗体技术从最初的嵌合抗体、改型抗体逐渐发展为今天的人源化抗体。本文综述了人源化单克隆抗体的构建技术。 关键词：人源化，单克隆抗体，构建 从20世纪70年代英国学者Milstein和德国学者Kohler利用细胞融合技术首次成功地制备出单克隆抗体以来[1]，单克隆抗体在医学、生物学、免疫学等诸多学科中发挥了巨大的作用。单克隆抗体可用于分析抗原的细微结构及检验抗原抗体未知的结构关系，还可用于分离、纯化特定分子抗原，甚至用于临床疾病的诊断和治疗等。然而，单克隆抗体技术在临床治疗应用中的进展却很慢，主要原因是目前单克隆抗体大多是鼠源性的，而鼠源性单克隆抗体应用于人体治疗时存在诸多问题：一是不能有效地激活人体中补体和Fc受体相关的效应系统；二是被人体免疫系统所识别，产生人抗鼠抗体(human antigen mouse antibody，HAMA)；三是在人体循环系统中被很快清除掉。因此，在保持对特异性抗原表位高亲和力的基础上进行人源化改造，减少异源抗体的免疫原性，成为单克隆抗体研究的重点[2]。随着对抗体基因的研究和DNA分子重组技术的应用，通过基因改造获得特异性抗体成为可能。1989年Huse等首次构建了抗体基因库，从而使抗体的研究从细胞水平进入到分子水平，并推动了第3代抗体—基因工程抗体技术的发展。至此，抗体的产生技术经历了三个阶段：经典免疫方法产生的异源多克隆抗体；细胞工程产生的鼠源单克隆抗体及基因工程产生的人源单克隆抗体。 人源化抗体就是指抗体的可变区部分（即Vh和Vl区）或抗体全部由人类抗体基因所编码。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为今天的人源化抗体。 1 嵌合抗体的构建 抗体分子与抗原结合特异性由L链和H链V区决定，抗体C区可作为异源蛋白诱发免疫反应，产生抗小鼠抗体（human anti-mouse antibody，HAMA）。将小鼠单克隆
液相色谱柱的选择
液相色谱柱的选择、使用、维护和常见故障及排除液相色谱的柱子通常分为正相柱和反相柱。正相柱大多以硅胶为柱，或是在硅胶表面键合 -CN,-NH3等官能团的键合相硅胶柱；反相柱填料主要以硅胶为基质，在其表面键合非极性的十八烷基官能团（ODS）称为C18柱，其它常用的反相柱还有C8,C4,C2和苯基柱等。另外还有离子交换柱，GPC柱，聚合物填料柱等。本文重点介绍反相色谱柱的选择和使用： 一、反相色谱柱的选择 1．柱子的PH值使用范围 反相柱优点是固定相稳定，应用广泛，可使用多种溶剂。但硅胶为基质的填料，使用时一定要注意流动相的PH范围。一般的C18柱PH值范围都在2-8，流动相的PH值小于2时，会导致键合相的水解；当PH值大于7时硅胶易溶解；经常使用缓冲液固定相要降解。一旦发生上述情况，色谱柱人口处会塌陷。同样填料各种不同牌号的色谱柱不尽相同。如果流动相PH较高或经常使用缓冲液时，建议选择PH范围大的柱子，例如戴安公司的Acclaim柱PH 2-9或Zorbax的PH 2-11. 5的柱子。 2．填料的端基封尾（或称封口） 把填料的残余硅羟基采用封口技术进行端基封尾，可改善对极性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分离；填料稳定性好了，组分的保留时间重现性就好。如果待分析的样品属酸性或碱性的化合物，最好选用填料经端基封尾的色谱柱。 3．戴安公司Acclaim柱子介绍—极性封尾C16固定相柱 戴安公司有28种类型的柱子，Acclaim反相柱填料高纯，金属含量极低，完全封尾。PH 2-9范围内兼容，低流失，高柱效。尤其是2003年推出的Acclaim极性封尾C16柱，是最先商品化的磺酰氨-O链接键的色谱柱，具极低的硅羟基活性，能在极性溶剂甚至100%水的条件下长期使用。对酸
体积排阻色谱
一. 分离原理 尺寸排阻色谱法：是按分子尺寸的差异进行分离的一种液相色谱方法，也称凝胶色谱法。排阻色谱的固定相多为凝胶。凝胶是一种由有机分子制成的分子筛, 其表面惰性, 含有许多不同大小孔穴或立体网状结构。凝胶的孔穴大小与被分离组分大小相当, 对不同大小的组分分子则可分别渗到凝胶孔内的不同深度。尺寸大的组分分子可以渗入到凝胶的大孔内, 但进不了小孔, 甚至于完全被排斥，先流出色谱柱。尺寸小的组分分子, 大孔小孔都可以渗进去, 最后流出。因此, 大的组分分子在色谱柱中停留时间较短, 很快被洗出。小的组分分子在色谱柱中停留时间较长。经过一定时间后, 各组分按分子大小得到分离。 当组分X进入柱子后,它就要从高浓度的流动相向固定相孔隙内的流动相扩散。当组分X进 入色谱固定相达到扩散平衡时： Xm ? Xn 组分的分配系数为： 尺寸排阻色谱中任何组分的分配系数应符合：0 ≤ K ≤ 1 二. 固定相 尺寸排阻色谱常用固定相有无机和有机两大类。 无机凝胶：又称硬质凝胶。是具有一定孔径范围的多孔性凝胶，如多孔硅胶、多孔玻璃珠等，此类凝胶化学惰性、稳定性及机械强度均好，耐高温，使用寿命长，但装柱时易碎，不易装 紧，柱效较低。 有机凝胶：又称半硬质凝胶。如苯乙烯二乙烯苯交联共聚物凝胶，能耐较高压力，适用于有机溶剂作流动相，有一定可压缩性，可填得紧密，柱效较高。但在有机溶剂中有轻度膨胀。新型凝胶色谱填料，克服了传统软填料的一些弱点，粒度细，机械强度高，分离速度快，效果好，特别是无机填料表面键合亲水性单分子层或多层覆盖的单糖或多糖型等填料广泛用于 生物大分子的分离。 三. 流动相
尺寸排阻色谱流动相：从样品的溶解性考虑，流动相应与凝胶本身有相似性，黏度低，与样品的折光率相差大;能润湿凝胶，防止吸附作用。 常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、N，N’-二甲基甲酸胺、三氯甲烷(凝胶渗透色谱);水(凝胶 过滤色谱)等。 (可用于分离相对分子质量大的分子，如蛋白质、核酸等)
柱效
液相色谱柱柱效的提高和测算 液相色谱柱柱效的提高和测算 摘要本文通过对如何提高液相色谱柱柱效的阐述,介绍了几种国际上流行的测量和计算柱效值的方法。 关键词液相色谱柱谱峰扩宽柱效值理论塔板数 一、提高液相色谱柱柱效的方法 我们知道色谱峰的扩宽与移动相在热力学的分配过程、移动相和固定相中传质阻力所引起的不平衡有关,谱峰扩宽(非平衡)的程度是流速对传质速率的直接函数。要提高液相色谱的效率可从以下几方面入手。 (1)降低移动相的流速,但会使分析时间延长。 (2)减少固定相的量,但色谱柱中样品的负载量也随之减小。 (3)减小固定相的颗粒度,但不能过分,过分后色谱柱的渗透率也会减小。 (4)选用低粘度的移动相,以利于快速传质,但却不利于多组份分析。 (5)适当提高柱温,可降低移动相的粘度,但柱效和分离度也随之降低。 (6)尽量减小停滞移动相的体积,但却加快了移动相的流速。 从以上介绍可看出,在色谱分析过程中,各种因素是互相联系和制约的。只有通过对柱效值的跟踪测算,对自己分析方法不断的研究和实践,才能找到最佳的工作条件。 二、对柱效值进行跟踪测算应注意的问题 我们也应记住柱效值即塔板数只表示该色谱柱装填的好坏,只用柱效值并不足以预测在所有条件下的柱性能,因为在这些条件下,柱性能主要表示动力学过程对色谱柱谱带加宽的量。其他一些影响峰宽的因素,如柱外效应和热力学因素(通常表现为峰拖尾),在理想情况下对于确定柱效值并不起重要作用。因为任何一个柱性能的定义都必然与用此色谱柱所做的分离相联系,所以依据一个单独的数字来评定柱性能是不切实际的。对大多数色谱工作者来说,柱性能指的是色谱柱用于特定分离的能力,而仅仅有高柱效并不能保证这种分离能力。 不管用什么特定的测试方法,都会有几个参数影响柱效的测定。这些参数包括:洗脱液的成分和粘度及其线流速,测定塔板数所用的溶质,温度,柱长,填料装填方式,颗粒度,还有所选用的测量和计算方法。尽管大多数柱效测算没有设法消除液相色谱仪器系统各部件对表观峰宽的影响,但只要仪器是正常使用的,这些影响是次要的。而测量和计算方法对柱效值的确定起着极大的作用。 三、几种测量和计算柱效值的方法 因为色谱峰是假定样品浓度在移动相和固定相中呈正态分布而得到的样品谱带分布,故常常把色谱峰型看作正态曲线来计算理论塔板数。因此计算柱效(以理论塔板数n为单位)的公式习惯上定义为: 式中tR为色谱峰的保留时间; σ2是以时间为单位测量色谱峰的偏差;a是和峰高(从测峰宽的基线量起)有关的常数, ωb是峰宽,表示由色谱峰顶点与色谱峰两侧拐点处做切线与峰底基线相交两点间的距离。图1所示为正态峰轮廓所测量峰宽处的峰高与7种可能的测定n的方法所对应的常数a值之间的关系。
单克隆抗体药物
浅谈单克隆抗体药物 摘要：单克隆抗体药物是生物医药领域中最耀眼的明珠。该类药物具有靶向性强、特异性高和毒副作用低等特点，代表了药品治疗领域的最新发展方向，在肿瘤、自身免疫性疾病的治疗手段不断升级过程中，单抗药物扮演着不可替代的角色，已经成为全球靶向治疗药物的主流。在刚刚兴起的细胞免疫治疗中，单抗药物同样是位列第一的品类，单抗产业是目前乃至未来医药行业中极具投资价值的细分行业。本文从单克隆抗体简介，常见的单克隆抗体药物、国内外单克隆抗体药物的研发现状，及对单抗药物的展望几个方面做一简介。 关键词：单克隆抗体单抗药物研发现状 1单克隆抗体 抗体是由B淋巴细胞转化而来的浆细胞分泌的，每个B淋巴细胞株只能产生一种它专有的、针对一种特异性抗原决定簇的抗体。这种从一株单一细胞系产生的抗体就叫单克隆抗体，简称单抗。这些抗体具有相同的结构和特性。抗体与特异性表达的肿瘤细胞表面蛋白质结合，从而阻碍蛋白质的表达，起到抗肿瘤作用。抗体还可使B淋巴细胞产生免疫反应，诱导癌细胞凋亡。早期单抗为鼠源性单抗,易被人体免疫系统识别，应用受到限制。后来采用基因工程的方法生产人源或人鼠嵌合型单抗，广泛应用于临床。 2常见的单克隆抗体药物 2.1利妥昔单抗（Rituximab）-美罗华-CD20单抗 第一个被美国食品药物管理局（FDA）批准用于临床治疗的单抗，是一种针对CD20抗原的人鼠嵌合型单克隆抗体，能特异性地与CD20结合，导致B淋巴细胞溶解的免疫反应，抑制其增殖，诱导成熟B淋巴细胞凋亡和提高肿瘤细胞对化疗的敏感性。90%以上的B淋巴细胞淋巴瘤细胞均有CD20表达，不表达于非定向干细胞或浆细胞。本药可使耐药淋巴瘤细胞对VP-16、顺铂重新敏感，用于CD20表达的复发或化疗耐药的惰性B淋巴细胞淋巴瘤，有效率46%。利妥昔单抗+CHOP 方案为治疗弥漫大B淋巴细胞淋巴瘤标准方案，可使全完缓冲（CR）率、生存时间明显延长[2-3]。 2.2曲妥珠单抗-赫赛汀-HER-2单抗 为重组DNA人源化的抗p185蛋白（癌基因）单克隆抗体-IgG抗体。进入人体后能选择性地与由细胞核内表皮生长因子2基因调控的p185糖蛋白结合。本
高效液相色谱柱
高效液相色谱柱 怎样选择色谱柱 现代高效液相色谱中，分离效果好坏很大程度上取决于色谱填料的选择。但是色谱填料的选择范围很宽，要做合适的选择，必须对此有一定的认识和了解。 1、正相色谱 正相色谱用的固定相通常为硅胶（Silica），以及其他具有极性官能团，如胺基团(NH2,APS)和氰基团（CN，CPS）的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他团的极性较强，因此，分离的次序是依据样品中的各组份的极性大小，即极性强弱的组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如：正乙烷（Hexane）,氯仿（Chloroform）,二氯甲烷（Methylene Chloride）等。 2、反相色谱 反相色谱填料常是以硅胶为基础，表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相。反相色谱所使用的流动相极性较强，通常为水，缓冲液与甲醇，已腈等混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强组合最先被冲出，而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保留。常用的反相填料有C18（ODS）、C8（MOS）、C4（B）、C6H5（Phenyl）等。 二、聚合物填料 聚合物调料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等，其主要优点是在PH值为1～14均可使用。相对与硅胶基质的C18填料，这类填料具有更强的疏水性；大孔的聚合物填料对蛋白质等样品的分离非常有效。现在的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料，色谱柱柱效较低。 三、其他无机填料 其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化。由于其特殊的性质，一般仅限于特殊的用途。如石墨化碳也用于正逐渐成为反相色谱填料。这种填料的分离不同与硅胶基质烷基键合相，石墨化碳的表面即是保留的基础，不再需其它的表面改性，该柱填料一般比烷基键合硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强，石墨化碳可用于分离某些几何导构体，又由于HPLC流动相中不会被溶解，这类柱可在任何PH与温度下使用。氧化铝也可用于HPLC，氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的色谱柱柱床，其优点是可在PH高达12的流动相中使用。但由于氧化铝与碱性化合物作用也很强，应用范围受到一定的限制，所以未能广泛应用，新型氧化锆填料也可用于HPLC，商品化的仅有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱，应用PH范围1～14，温度可达100℃。由于氧化锆填料几年才开始研究，加之面临的实验难度，其重要用途与优势尚在进行中。 怎样选择填料粒度 目前，商品化的色谱料粒度从1um到超过30um均有销售，而目前分析分离主要用3um、5um
低分子量的达肝素钠和依诺肝素钠在体积排阻色谱柱的分离
min 10121416182022 nRIU 5000 10000 15000 20000 25000 30000 min 10121416182022 mAU 1 2 3 4 1 8 . 2 1 9 1 6 . 1 3 1 9 . 9 8 UV 234 nm RI Columns: Zenix?-100 (3 m, 100 ?, 7.8x300 mm) Flow Rate: Mobile phase: 0.5 mL/min 2.84% Na2SO4, pH 5.0 Temperature: 35 o C Detection: UV 234 nm and RI Injection volume: 25 μL Samples: 10 mg/mL Dalteparin in water, pH 6.0, MW 3,000 – 8,000 Da LMW Heparin-Dalteparin and Enoxaparin Analysis on Zenix?-100 (7830)
Columns: Zenix ?-100 (3 m, 100 ?, 7.8x300 mm) Flow Rate: Mobile phase: 0.5 mL/min 2.84% Na 2SO 4, pH 5.0 Temperature: 35 o C Detection: UV 234 nm and RI Injection volume: 25 μL Samples: 10 mg/mL Enoxaparin in mobile phase, MW 3,000 – 8,000 Da Keywords: Size exclusion, Zenix, Zenix-100, low molecular weight heparin, high resolution, Enoxaparin, Dalteparin, Pharmaceuticals
GE中低压层析柱-柱效测定方法-详解
GE中低压层析柱柱效测定方法 柱效测定是一项经常使用的操作，对于定量表征层析柱的工作状态是否良好， 工艺的验证具有重要的意义。但是实际工作中很多朋友都遇到不会测柱效或者 测出来注销过低的状况，不知道如何解决。所以今天我就给大家详细介绍一下 柱效的正确测定方法，以及经常遇到的问题如何解决。 本方法适用于所有GE公司中低压液相色谱的预装柱及自己填装的层析柱。 介绍分为5个部分，测前准备、试剂选择、测柱效操作、测试结果积分、经常 发生的问题。 1. 测前准备： ⑴?KTA层析设备。要求设备的型号与层析柱大小匹配，从上样阀门到紫外和电 导检测器之间的体积要做到最小（管路内径尽量细，管路尽量短），这对于准确测量实验室小层析柱的柱效非常重要。 ⑵测试平衡溶液及样品。这个部分在试剂选择中单独细说。 ⑶装填好的层析柱。使用平衡缓冲液在测柱效的流速下至少平衡1.5 CV（柱体积），平衡方向与测柱效方向必须一致 ⑷样品环。容积大于1%柱体积。 2. 试剂选择 测柱效主要有两种测试系统：1 NaCl 测试系统；2 丙酮测试系统。只要操作正确，两个系统测出来的结果是基本一致的。但是要注意：各试剂的浓度不能随意改变，否则影响测试结果。 ⑴NaCl测试系统 对于所有种类的柱子和填料，都可以使用氯化钠系统测柱效 平衡液： 0.4 M NaCl水溶液 样品： 0.8 M NaCl水溶液 3. 测柱效操作 测柱效全程使用30 cm/h线性流速。平衡层析柱至少1.5 CV，将1% CV的样品（NaCl或丙酮）注射进入层析柱，使用平衡液冲洗直至电导或紫外280nm出 现响应峰。 4. 测试结果积分 以UNICORN6版本为例演示给大家看如何操作（各UNICORN版本操作基本一致）。以NaCl系统测柱效的所有操作针对电导曲线，以丙酮系统测柱效的所有操作 针对UV 280曲线（手头没有测柱效结果，所以随便找了一个图，里面有两个峰。大家测柱效的结果只有一个峰） 1) 在Evaluation窗口中打开测柱效结果文件，在Curve窗格中点击右键，选 择Customize 2) 勾选复选框去掉不需要显示的曲线
高效液相色谱柱柱效测定及分离条件考察
高效液相色谱柱柱效测定及分离条件考察 一、实验目的 1．了解高效液相色谱仪的基本结构和工作原理 2．学习高效液相色谱仪的使用 3．学习、掌握液相色谱柱柱效测定方法 4．考察流动相配比对分离情况的影响 二、基本原理 高效液相色谱法是以液体作为流动相的一种色谱分析法，它亦是根据不同组分在流动相和固定相之间的分配系数的差异来对混合物进行分离的。气相色谱中评价色谱柱柱效的方法及计算理论塔板数的公式同样适合于高效液相色谱，即： 2 22/11654.5??? ??=???? ??=Y t Y t n R R 式中：t R 为组分的保留时间 Y 1/2为色谱峰的半峰宽度 Y 为色谱峰的峰底宽度 影响高效液相色谱分离的因素很多，其中，流动相的种类及配比是最重要的参数。 三、仪器和试剂 1．仪器：Agilent 1200 高效液相色谱仪（紫外检测器） 2．50μL 微量进样器 3．试剂：苯、萘、联苯、甲醇均为分析纯；纯水为重蒸的去离子水。 配制成含苯、萘、联苯各30μL/ml 的甲醇溶液。 四、实验条件 1．色谱柱 长15cm ，内径 4.6mm ，装填5μm 的C-18烷基键合固定相 2．流动相 组成1：甲醇:水（95:5）；组成2：甲醇:水（85:15）；流量均为0.8ml/min 3．紫外光度检测器 波长254nm 4．进样量 5μL 五、实验步骤 1．设定流动相为“组成1”的比例，按照标准操作步骤将仪器调节至进样状态，待仪器流路及电路系统达到平衡，且色谱基线达到平直时，开始进样。 2．吸取5μL 苯、萘、联苯的甲醇溶液进样，在此条件下用色谱工作站记录色谱数据。 3．改变流动相比例至“组成2”，待平衡后重复步骤2操作。 4．用色谱工作站之“数据处理”系统处理数据文件并记录所需数据。 六、数据记录及处理 1．记录实验条件。 （1）色谱柱与固定相 （2）流动相及其流量、柱前压 （3）检测器波长 （4）进样量 2．分别记录三个组分色谱峰的保留时间t R 和相应色谱峰的半峰宽Y 1/2。 3．分别计算苯、萘、联苯在两种流动相组成条件下的理论塔板数n ，并比较流动相组成改变前后色谱分离的差异。 七、思考题 1．由本实验计算出的各组分理论塔板数说明什么问题？ 2．紫外光度检测器是否适用于检测所有有机化合物，为什么？ 3. 试分析流动相条件改变后保留时间及分离度的差异，并阐明原因。
第九章 凝胶渗透色谱
凝胶色谱分析二〇一一年九月九日
第九章凝胶色谱分析 凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography, GPC），又称尺寸排阻色谱（Size Exclusion Chromatography, SEC），其以有机溶剂为流动相，流经分离介质多孔填料（如多孔硅胶或多孔树脂）而实现物质的分离。GPC可用于小分子物质和化学性质相同而分子体积不同的高分子同系物等的分离和鉴定。凝胶渗透色谱是测定高分子材料分子量及其分布的最常用、快速和有效的方法[1]。凝胶渗透色谱（GPC）的创立历程如下[2,5]： 1953年Wheaton和Bauman用多孔离子交换树脂按分子量大小分离了苷、多元醇和其它非离子物质，观察到分子尺寸排除现象；1959年Porath和Flodin用葡聚糖交联制成凝胶来分离水溶液中不同分子量的样品；1964年J. C. Moore将高交联密度聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂用作柱填料，以连续式高灵敏度的示差折光仪，并以体积计量方式作图，制成了快速且自动化的高聚物分子量及分子量分布的测定仪，从而创立了液相色谱中的凝胶渗透色谱。 近年来，光散射技术（如图9-1所示，一束光通过一间充满烟雾的房间，会产生光散射现象。）广泛应用于高分子特征分析领域[3]。将光散射技术和凝胶渗透色谱（GPC）分离技术相结合，可以测定大分子绝对分子量、分子旋转半径、第二维里系数，也可测定分子量分布、分子形状、分枝率和聚集态等。目前，该技术在高分子分析领域已成为一种非常有效的工具，在美国，日本及欧洲广为使用，国内近年来亦引进了此项技术。 入射光 散射光 图9-1光散射现象 9.1 基本原理 9.1.1凝胶渗透色谱分离原理 让被测量的高聚物溶液通过一根内装不同孔径的色谱柱，柱中可供分子通行的路径包括粒子间的间隙（较大）和粒子内的通孔（较小）。如图9-2、图9-3所示，当待测聚合物溶液流经色谱柱时，较大的分子只能从粒子间的间隙通过，被排除在粒子的小孔之外，速率较快；较小的分子能够进入粒子中的小孔，通过的速率慢得多。这样经过一定长度的色谱柱分离后，不同相对分子质量的物质就被区分开了，相对分子质量大的在前面流出（其淋洗时间短），相对分子质量小的在后面流出（淋洗时间长）。从试样进柱到被淋洗出来，所接受到的淋出液总体积称为该试样的淋出体积。当仪器和实验条件确定后，溶质的淋出体积与其分
单克隆抗体制备全攻略(二)
6、单抗特性的鉴定 ⑴单克隆性的确定包括杂交瘤细胞的染色体分析、单抗免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定和单抗纯度鉴定等。 A、杂交瘤细胞的染色体分析 对杂交瘤细胞进行染色体分析可获得其是否是真正的杂交瘤细胞的客观指标之一，杂交瘤细胞的染色体数目应接近两种亲本细胞染色体数目的总和，正常小鼠脾细胞的染色体数目为40，小鼠骨髓瘤细胞SP2/0为62-68，NS-1为54-64；同时骨髓瘤细胞的染色体结构上反映两种亲本细胞的特点，除多数为端着丝点染色体外，还出现少数标志染色体。另一方面，杂交瘤细胞的染色体分析对了解杂交瘤分泌单抗的能力有一定的意义，一般来说，杂交瘤细胞染色体数目较多且较集中，其分泌能力则高，反之，其分泌单抗能力则低。 检查杂交瘤细胞染色体的方法最常用秋水仙素法，其原理是应用秋水仙素特异的破坏纺锤丝而获得中期分裂相细胞；再用0.075mol/L KCl溶液等低渗处理，使细胞膨胀，体积增大，染色体松散；经甲醇-冰醋酸溶液固定，即可观察检查。其操作步骤如下： a.在加秋水仙素前48-36小时将杂交瘤细胞传代。 b.秋水仙素处理：在培养瓶中加入秋水仙素（100ug/ml，除菌，-20℃保存），使最终浓度为0.1- 0.4ug/ml（若改用秋水仙胺则最终浓度为0.02-0.05ug/ml）；继续培养4-6小时，然后吹打细胞，移入离心管中，1000r/min10分钟，弃上清。 c.加入已预温到37℃的0.075mol/L KCl溶液5ml，将沉淀细胞悬浮并混匀，37℃水浴15-20分钟。 d.向悬液中加入新配制的固定液（甲醇与冰醋酸3：1混合）1ml，混匀，然后1000r/min10分钟，弃去上清液；本步骤的目的是使细胞表面轻微固定，可防止固定后细胞粘连成团块。 e.加入固定液5ml，将细胞悬浮并混匀，室温静置20-30分钟，然后1000r/min10分钟，弃去上清液；重复操作一次；其后加5ml固定液，将细胞悬浮并混匀，封上管口，置4℃过夜。 f.取出离心管，1000r/min5分钟，轻轻吸去上清液，根据细胞压积多少而留下0.5-1ml固定液，将细胞悬浮并混匀后，吸取细胞悬液1-2滴，滴在刚从冰水中取出的载玻片上，用口吹散，并在火焰上通过数次，使细胞平铺于载玻片上，自然干燥。 g.用新配制的10%Giemsa染液染色10-20分钟，然后用自来水洗去染液，自然干燥。（Giemsa 染液配方：Giemsa粉0.5g，甘油33ml，55-60℃保温2小时，加甲醇33ml混匀，保存于棕色瓶内作为原液；取原液1份，加1/15mol/L PH6.8PBS9份，即成10%Giemsa染液）。 h.镜检：选择染色体分散好，无重叠，无失散的细胞进行观察分析。每份标本应计数100个完整的中期核细胞，并注意观察是否有标志染色体。
蛋白纯化方法—凝胶过滤色谱
活性蛋白整体方案 凝胶过滤色谱 摘要：本文主要讲解了凝胶过滤色谱法（分子筛）在蛋白纯化实验中的应用，包括纯化原理、实验方案设计、技术操作以及相关案例介绍和问题分析。 基本原理 凝胶过滤色谱蛋白纯化法，又称为空间排阻色谱，分子筛等。其原理是应用蛋白质分子量或分子形状的差异来分离。当样品从色谱柱的顶端向下运动时，大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒从而被迅速洗脱；而较小的蛋白质分子能够进入凝胶颗粒中，且进入凝胶的蛋白在凝胶中保留时间也不同，分子量越大，流出时间就越早，最终分离分子大小不同的蛋白质。 凝胶过滤色谱原理 通常，多数凝胶基质是化学交联的聚合物分子制备的，交联程度决定凝胶颗粒的孔径。常用的色谱基质有：葡聚糖凝胶（Sephadex）、琼脂糖凝胶（Sepharose）、聚丙烯酰氨凝胶（Bio-Gel P）等。高度交联的基质可用来分离蛋白质和其他分子量更小的分子，或是除去低分子量缓冲液成分和盐，而较大孔径的凝胶可用于蛋白质分子之间的分离。选用合适孔径的凝胶很大程度取决于目标蛋白的分子量和杂蛋白的分子量。 实验方案设计 1.凝胶介质的选择 凝胶介质的选择主要是根据待分离的蛋白和杂蛋白的分子量选择具有相应分离范围的凝胶，同时还需要考虑到分辨率和稳定性的因素。比如，如果是要将目的蛋白和小分子物质分开，可以根据他们分配系数的差异，选用Sephadex G-25和G-50；对于小肽和低分子量物质的脱盐，则可以选用Sephadex G-10、G-15以及Bio-Gel P-2或P-4；如果
活性蛋白整体方案 是分子量相近的蛋白质，一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶。具体凝胶过滤色谱介质应用如下： 常用凝胶过滤色谱介质的分离范围 凝胶介质蛋白质的分离范围/103凝胶介质蛋白质的分离范围/103 Sephadex G25 Sephadex G50 Sephadex G100 Sephadex G200 Sepharose6B Sepharose4B 1~5 1.5~30 4~150 5~600 10~4000 60~20000 Sepharose2B Bio-Gel P-4 Bio-Gel P-10 Bio-Gel P-60 Bio-Gel P-150 Bio-Gel P-300 70~40000 0.5~4 5~17 30~70 50~150 100~400 2.凝胶介质的预处理 凝胶在使用前应用水充分溶胀（胶：水=1：10），自然溶胀的耗时较长，可采用加热的方法使溶胀加速，即在沸水浴中将凝胶升温至沸，1~2h即可达到溶胀。在烧杯中将干燥凝胶加水或缓冲液，搅拌，静置，倾去上层混悬液，除去上清液中的凝胶碎块，重复数次，直到上清澄清为止。 3.色谱柱的选择 色谱柱的体积和高径比与色谱分离效果密切相关，凝胶柱床的体积、柱长和柱的直径以及柱比的选择必须根据样品的数量，性质和分离目的进行确定。组别分离时，大多采用2~30cm长的色谱柱，柱床体积为样品溶液体积的5倍以上，柱比一般在5~10之间；而分级分离一般需要100cm左右的色谱柱，并要求柱床体积大于样品体积25倍以上，柱比在20~100之间。 4.凝胶柱的填装 凝胶色谱柱与其它色谱方法不同，溶质分子与固定相之间没有力的作用，样品组分的分离完全依赖于他们各自的流速差异。装住时关住柱子下口，在柱内加入约1/3柱床体积的水或缓冲液，然后沿着柱子一侧将缓冲液中的凝胶搅拌均匀，缓慢并连续的一次性注入柱内。待凝胶沉积约5厘米左右时，打开柱子下口，控制流速在1ml/min。 5.样品的处理与上样 根据样品的类型和纯化分析，需要选择合适的缓冲液，为了达到良好的分析效果，上样量必须保持在较小的体积，一般为柱床体积的1%~5%，蛋白质样品上样前应进行浓缩，使样品浓度不大于4%（样品浓度与分配系数无关），但需要注意的是，较大分子量的物质，溶液粘度会随浓度增加而增大，使分子运动受限，影响流速。上样前，样品要经滤膜过滤或离心，除去可能堵塞色谱柱的杂质。 6.洗脱与收集 凝胶过滤色谱的缓冲液用单一缓冲液或含盐缓冲液作为洗脱液即可，主要考虑俩个方面的原因：蛋白的溶解性和稳
高效液相色谱(HPLC)柱效测定
实验六高效液相色谱(HPLC)柱效测定 093858 张亚辉 一. 实验目的 1、学习高效液相色谱仪的基本操作方法。 2、了解高效液相色谱仪原理和条件设定方法。 3、了解高效液相色谱法在日常分析中的应用。 二. 实验原理 高效液相色谱法是以液体作为流动相，借助于高压输液泵获得相对较高流速的液流以提高分离速度、并采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分离和分析的一种色谱方法。 在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。反之，则称为正相色谱分离系统。反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。 定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度（R）的计算公式为： R＝ 2[t(R2)-t(R1)] /1.7*(W1＋W2) 式中 t(R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间； t(R1)为相邻两峰中前一峰的保留时间； W1及W2为此相邻两峰的半峰宽。除另外有规定外，分离度应大于1.5。 本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE，常被用作塑料增塑剂。它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。待测物性质见表1。 表1色谱柱测试条件
如果要检测不同条件对谱图分离的影响，可按表1配制几种物质的混合溶液，在不同条件下进行HPLC分离检测。 三.仪器与试剂 1、仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul微量注射器。 2、试剂 甲醇（色谱专用），高纯水 四. 实验步骤 1、色谱条件 色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶（C8） 柱温：室温 流动相：初始为高纯水：20％，甲醇：80％ 检测器：DAD检测器; 检测波长：220nm； 进样体积：20μl定量环，实际注射每次可控制在40μl。 2、待测溶液的配制 首先用甲醇做溶剂配制储备液：邻苯二甲酸二甲酯（0.3880g/L），邻苯二甲酸二乙酯（0.2770g/L），邻苯二甲酸二丁酯（0.3776g/L）。然后各取1mL储备液用水和甲醇（20：80）稀释至10mL，作为待测溶液。 3、色谱测定 (1) 按操作规程开启电脑，开启脱气机、泵、检测器等的电源，启动Agilent 1100在线工作软件，设定操作条件。流量为1.000ml/min。 (2) 待仪器稳定后，开始进样。将进样阀柄置于“LOAD”位置，用微量注射器吸取混合物溶液40ul，注入仪器进样口，顺时针方向扳动进样阀至“INJECT”位置，此时显示屏显示进样标志。 (3) 记下各组分色谱峰的保留时间及峰面积及分离比。 (4) 实验完毕，清洗系统及色谱柱。依次用甲醇-水（60：40）、甲醇-水（70：30）……直到纯甲醇作流动相清洗，每次清洗至基线走稳，至少清洗15min。 五.实验结果
常见液相色谱柱性能比较
常见液相色谱柱性能比较 一、高性能色谱柱特点：柱效高，价格高，通用性好，使用寿命长，pH范围宽 1、Waters公司Xbridge 2005年waters公司推出，杂化颗粒柱。 优点：pH 1-12,在高pH状态下，没有能与此色谱柱匹敌的，目前市场的宽pH色谱柱在高pH的状态下（9-12）普遍寿命很短，如Gemini，资生堂公司Capcell，YMCPro-C18，包括waters 的第一代杂化柱Xterra都是寿命不长，Zorbax Extend更是不堪。柱效与一流的硅胶柱相当，甚至有过之无不及，杂化颗粒柱和聚合物色谱柱的问题在于柱效，Xterra和常见的PSDVB的色谱柱都有不错的pH范围，但是柱效低的问题无法解决，这是聚合物填料一般比较软且不耐压的原因造成。在如此宽的pH范围，最大的好处是可以在化合物的保留平台区去开发方法 （pH1-3,pH9-12），这样能得到更稳定更容易重现的方法，对酸性，中性，尤其是碱性化合物都能得到理想的峰形。 注：Waters UPLC色谱柱与Xbridge采用同类型填料，只是颗粒度是1.7um，所以不再重复。缺点：价格高，平均每支￥7000多的，不是大多数中国客户可以接受的。 2、MerckChromolith整体化色谱柱 Merck公司2001年推出。 优点：高流速、低压力，可以快速分析样品，因为压力低，所以可以串联色谱柱以获得更高的柱效而不用担心色谱柱耐压问题，低压力是因为硅胶棒的大量中孔的存在，中孔的存在也让这支色谱柱不怕堵，在处理比较脏的样品的时候会优势很大（如中药），实际的寿命也因此延长。这个色谱柱最大的特点是柱效高出峰时间快，特别适合之前分析时间超长的实验条件，目前很好的例子就是人参的指纹图谱，因为成分复杂，之前出峰要2个小时，现在用整体化色谱柱30min 就可以分析完了（已有报导），且不影响柱效，类似于UPLC，但不像UPLC那么容易堵。 缺点：规格单一，单价比较高，单价￥7000左右，所以通过串联获得更高柱效的方式显得比较奢侈。 3、Phenomenex公司Gemini ，采用硅胶球聚合物包被技术。pH范围1-12。 优点：因为聚合物涂层抑制了碱性溶液水解硅胶，所以可以承受一定的碱性条件，由于是硅胶球颗粒，所以柱效不错，比Xterra或者PSDVB这类色谱柱柱效好。单价比较低，￥3000以内。 缺点：聚合物涂层稳定性比较差，所以当涂层损失时，色谱柱会很坏被碱性溶液溶解，这也是其寿命远不及Xbridge的原因。另外涂层损失也会影响结果重现性。 4、资生堂Capcell ，采用硅胶球聚合物包被技术。pH范围1-10。 类似于Gemini同样的技术，只是参数指标比phenomenex低调。 单价偏高，￥5000以内。 5、Agilent ZorbaxExtend，采用双配位键和相技术。pH2-10 优点：不详 缺点：在使用高pH时，基本上都会介绍Extend，但是实测数据说明该款色谱柱的耐高pH 能力较差。 二、高纯硅胶柱特点：柱效高，峰形好，适用广泛，价格合适，为各色谱柱公司目前主流色谱柱 1、Merck的Purosphere STAR ，为Merck公司1999年推出，pH 1.5-10.5，通用性好，柱效高；缺点：市场推广较差，知名度比较低， 2、Phenomenex的Luna ，Phenomenex公司的主打色谱柱，pH1.5-10，通用性好，在进口色谱柱市场上占有一定份额；缺点：装填相对松散，柱头填料容易塌陷
单克隆抗体的制备方法
一、单克隆抗体的概念和原理免疫反应是人类对疾病具有抵抗力的重要因素。当动物体受抗原刺激后可产生抗体。抗体的特异性取决于抗原分子的决定簇，各种抗原分子具有很多抗原决定簇，因此，免疫动物所产生的抗体实为多种抗体的混合物。用这种传统方法制备抗体效率低、产量有限，且动物抗体注入人体可产生严重的过敏反应。此外，要把这些不同的抗体分开也极困难。近年，单克隆抗体技术的出现，是免疫学领域的重大突破。 （1）单克隆抗体的基本概念抗体主要由B淋巴细胞合成。每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。
（2）单克隆抗体技术的基本原理要制备单克隆抗体需 先获得能合成专一性抗体的单克隆B淋巴 1 细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。其制备原理示意如下： 二、基本方法 2 1. 抗原提纯与动物免疫 7对抗原的要求是纯度越高越好，尤其是初次免疫所用的抗原。如为细胞抗原，可取1×10个细胞作腹腔免疫。可溶性抗原 需加完全福氏佐剂并经充分乳化，如为聚丙烯酰胺电泳纯化的抗原，可将抗原所在的电泳条带切下，研磨后直接用以动物免疫。 选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠龄在8～12周，雌雄不限。为避免小鼠反应而不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3～4只小鼠。
(完整版)色谱柱的使用及维护
前言 液相色谱的分离原理是,在色谱柱流动相中样品的不同组分与固定相发生吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和等作用,由于作用力的大小、强弱不同,各种组分在固定相中滞留的时间也不同,因而先后从以 固定相中流出而得到分离。因此液相色谱分离的关键之一是色谱柱中的固定相。柱效的好坏直接影响目标化合物的分析和检测。但在液相色谱运行过程中,色谱柱极易发生问题,因此掌握正确使用和维护 色谱柱的知识非常必要。色谱柱使用过程中容易发生柱堵塞引起系统压力过高;柱效低引起峰拖尾、变宽;柱污染、损坏导致鬼峰等问题。引起这些问题的内在原因有: (1) 硅羟基的死吸附。色谱柱的基材硅胶粒子表面存在硅胶羟基。任何物质在色谱柱中都存在双分配效应,即在流动相与固定相之间进行分配,又在流动相与硅羟基之间进行分配。被分析物质被硅羟基吸附称为非特异性吸附,或称死吸附。当硅羟基对被分析物质的吸附趋近于饱和状态时,色谱柱柱效下降,峰形出现拖尾、变宽。 (2) 重金属。色谱柱的基材硅胶粒子无论纯度多高,无论怎样处理,都会有不少于5 ×10- 6 的重金属以金属氧化物的形式残存在硅胶粒子的表面,这些金属氧化物很容易与其它化合物形成螯合物,使其被氧化,产生不对称峰或拖尾峰。例如儿茶素和大多数中药,因含有多酚结构,极易被金属氧化物氧化,影响其分离效果。 (3) 碳流失。固定相经长期使用,会有部分碳链被流动相洗脱下来,随流动相一起流出色谱柱外, 造成碳流失。 (4) 缓冲液中盐的析出。在做色谱分析时,有时流动相中会含有缓冲盐溶液。分析结束后,如果没有先用含一定配比的水相流动相冲洗,而直接用纯有机相冲洗,瞬间柱子中的微环境是高有机相、低水相。这时流动相中的缓冲盐溶液极易析出盐,将柱子堵塞,使柱压升高,柱效下降。 (5) 色谱柱变干。如果对色谱柱保存不当,使色谱柱中的保存液全部挥发,柱子内部变干,造成色谱柱的损伤,影响分离效果。 2 色谱柱的使用 新柱使用前应先检查产品包装、外观是否完好。认真阅读说明书及性能测试报告,了解新柱子的最佳性能指标,如某色谱条件下的柱压、柱效等。有时分析用的流动相与柱子的保存试剂不同,故在分析样品之前,应使用合适的试剂将柱子中的保存试剂清洗出来。要注意清洗用的流动相与保存溶剂的相溶性。反相C18 柱通过出厂测试后多保存在乙腈中,可用10～20 倍柱体积的甲醇或乙腈来平衡色谱柱。流速要缓慢提高,如开始0. 3～0. 5mL/ min , 10～15min 后可慢慢加快。 硅胶柱和极性色谱柱通过出厂测试后一般保存在正庚烷中。如果分析时需要使用含水的流动相,则使用前须用乙醇或异丙醇冲洗,流速0. 1～0. 3mL/ min ,将正庚烷冲洗干净后,再用流动相平衡。 实验过程中可以记录色谱柱的一些性能指标,如柱效、柱压等,供今后参考。每次分析样品前,要用流动相对色谱柱进行平衡,待基线平稳后再进样分析。梯度洗脱用初始流动相平衡。一次样品分离完成后,要有足够的时间使系统恢复平衡,再进行下一次分析。一般流动相平衡时间为30min ,若系统中有盐或水,平衡时间应延长。 3 色谱柱的清洗与保存 色谱柱清洗是日常的重要维护工作。如果样品分子残留在柱子、接头、流通池中,会污染系统,影响对其它样品的分析,降低柱效。因此分析工作结束后,要用适当的溶剂清洗系统中残留的样品。在反相系统中, 若流动相中无酸、碱、盐类物质, 可用90 %甲醇冲洗30～60min ,若含酸、碱、盐类物质,则要先用10 %甲醇或乙腈,或用与分析用流动相相同的
单克隆抗体的应用
单克隆抗体的应用 陈丽珊 1975年Kohler和Milstein首先报道，用细胞杂交技术，使经绵羊红细胞(SRBC)免疫的小鼠的脾细胞，与小鼠的骨髓瘤细胞融合，并由此创建了第一个B细胞杂交瘤细胞株，获得了抗SRBC的单克隆抗体。这是免疫学乃至医学史上的一个里程碑。 单克隆抗体的特点是：理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、便于人为处理和质量控制，并且来源容易。这些优点使它一问世就受到高度重视，并广泛应用于生物学和医学研究领域。 1 作为亲合层析的配体 单克隆抗体能与其相应的抗原特异性结合，因而能够从复杂系统中识别出单个成分。只要得到针对某一成分的单克隆抗体，利用它作为配体，固定在层析柱上，通过亲合层析，即可从复杂的混和物中分离、纯化这一特定成分。如用抗人绒毛膜促性腺激素(hCG)亲合层析柱，就可从孕妇尿中提取到纯的hCG。与其它提取方法(沉淀法、高效疏水色谱法等)相比，具有简便、快速、经济、产品活性高等优点。 2 作为生物治疗的导向武器 脂质体是由既亲水又亲油的两亲磷脂组成的连续双分子层微囊，内含水相空间，可包裹水溶性物质。包有细胞毒剂的脂质体膜上偶联抗体，可定向攻击靶细胞，称为免疫脂质体。这种“导向治疗”，在动物试验与体外试验中已获得满意效果。如热敏免疫脂质体，由抗人乳癌细胞抗体经疏水长链脂肪酸修饰，抗体带上长的疏水碳链，部分插入脂质体的脂双层膜中，抗体Fab段仍暴露在膜表面，因而保持了抗体活性。热敏免疫脂质体可特异识别靶细胞(人乳癌细胞)，并通过相变温度引起脂质体破裂，从而定向释放药物。另外，可将化疗药物、细菌毒素、植物毒素或放射性同位素等细胞毒剂与抗肿瘤抗原的单克隆抗体直接交联，利用其导向作用，使细胞毒剂定位于肿瘤细胞把它直接杀伤。这不仅提高了抗体的疗效，也可降低细胞毒剂对正常细胞的毒性反应。如应用抗T细胞单抗和柔红霉素结合物，在体外对非T 淋巴细胞就无杀伤作用。但是，要把这种方法应用于临床，目前还存在不少技术难关，包括人体对鼠源单抗的排异问题等。 3 作为免疫抑制剂 抗人T淋巴细胞单抗(McAb)作为一种新型免疫抑制剂，已广泛应用于临床治疗自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反应。其作用机理有赖于McAb的种类及其免疫学特性。注射抗小鼠Thy-1抗原的单抗，可以抑制小鼠同种皮肤移植的排斥反应。此外，对用于同种骨髓移植的供体骨髓，在体外经抗T细胞单抗加补体处理，能减轻移植物抗宿主病的发生。 4 作为研究工作中的探针 单克隆抗体只与抗原分子上某一个表位(即抗原决定簇)相结合，利用这一特性就可把它作为研究工作中的探针。此时，可以从分子、细胞和器官的不同水平上，研究抗原物质的结构与功能的关系，进而并可从理论上阐明其机理。如用荧光物质标记单抗作为探针，能方便地确定与其结合的相应生物大分子(蛋白质、核酸、酶等)在细胞中的位置和分布。 5 增强抗原的免疫原性 抗体对抗原免疫原性的增强作用由来已久，60年代就已发现幼猪对破伤风类毒素难以产生抗体，注射相应特异性抗体IgG，就能有效地提高对委内瑞拉马脑炎病毒的免疫应答。1984年以来，Celis等发现，抗乙肝病毒(HBs)IgG可增强HBs抗原对特异性人T细胞克隆的刺激增殖，并可诱生干扰素。在小鼠中发现，当低剂量的HBs抗原不产生免疫反应时，加入抗HBs抗体组成的复合物，则可有效地诱生免疫反应。根据这一作用，现已研制出乙肝的抗原—抗体复合物型治疗性疫苗。