驼源天然单域重链抗体库的构建与鉴定

TripleTOF高分辨质谱在单克隆抗体药物完整分子量测定及轻重链分析中的应用

应用实例 I ：TripleTOF ?高分辨质谱在单克隆抗体药物完整分子量测定及轻重链 分析中的应用 实验设计 样品制备：将单抗Anti-Actin （mouse IgG2isotype, clone AC 40, Sigma ）溶解于含30%ACN 和0.1%FA 的溶液中，溶液用30KD 超滤膜（Millipore, P/N UFC503096）离心过滤，根据盐及去垢剂含量，重复以上操作3至8次。 单抗样品用DTT 在60oC 下反应35分钟后切断二硫键，以得到重链及轻链用于LC-MS 分析。 高流速液相色谱方法：在岛津液相色谱系统上利用C8 ZORBAX Poroshell 色谱柱（Agilent, 300SB-C8, 1.0 mm ×75 mm, 5 μm ）对完整抗体、重链、轻链进行快速分析。液相色谱梯度如表1右所示，流动相A ：2%乙腈，0.1%FA ，流动相B ：98%乙腈，0.1%FA 。 低流速液相色谱方法：利用Eksigent ? nanoLC-Ultra ?和cHiPLC ?-nanoflex 纳升液相系统对完整单抗样 品进行分析。富集柱：ChromXP C4-CL 3 μm, 300 ?,0.5 mm ×200 μm ，分析柱：ChromXP C4-CL 3 μm, 15 cm ×75 μm 。梯度如表1左所示，流动相A ：2%乙腈，0.1%FA ，流动相B ：98%乙腈，0.1%FA 。 串联质谱技术在生物制药中的应用 表1. LCMS 液相梯度：右部分-快流速液相色谱梯度表；左部分-纳流液相色谱梯度表。 质谱方法：高流速分析时TripleTOF ? 5600采用Turbo V?离子源，在分析最初的2分钟时间内利用分流阀将液体导入废液，避免盐进入质谱。而低流速分析时TripleTOF ? 5600采用纳升离子源。 数据处理：利用BioAnalyst?中的贝叶斯算法进行去卷积处理以得到蛋白的完整分子量。 抗体药物完整蛋白分析 电喷雾离子源（ESI ）结合飞行时间质谱（TOF ），由于其具有极佳的分辨率及质量测定范围，因此特别适合分析分子量较大的蛋白（~150 kDa ）。TripleTOF ? 5600系统的分析质量上限为40,000 Da ，在此质量范围内能够轻松检测经电喷雾电离后的蛋白多电荷离子。采用TripleTOF ? 5600液质联用系统的一级质谱扫描模式测定单抗样品anti-actin 的完整分子量（图1）。本次测定上样量为10 μg ，采用了一个15分钟，流速为200 μL/min 的快速梯度进行分析。通过高质量的质谱图可以测定蛋白的完整分子量，并提供蛋白中异质糖基化的额外细节信息（图1）。 图1. 单克隆抗体Anti-Actin 一级质谱图及去卷积后谱图anti-actin 精确分子量为148513 Da 。 六碳糖的典型丢失显示该抗体由于具有不同的糖基化糖型而表现出非均一性。

人源化单克隆抗体的构建技术

人源化单克隆抗体的构建技术 摘要：单克隆抗体从问世到现在已广泛应用于临床，经历了一段曲折的发展历程。其中人源化抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新，如PCR 技术、抗体库技术、转基因动物等。抗体技术从最初的嵌合抗体、改型抗体逐渐发展为今天的人源化抗体。本文综述了人源化单克隆抗体的构建技术。 关键词：人源化，单克隆抗体，构建 从20世纪70年代英国学者Milstein和德国学者Kohler利用细胞融合技术首次成功地制备出单克隆抗体以来[1]，单克隆抗体在医学、生物学、免疫学等诸多学科中发挥了巨大的作用。单克隆抗体可用于分析抗原的细微结构及检验抗原抗体未知的结构关系，还可用于分离、纯化特定分子抗原，甚至用于临床疾病的诊断和治疗等。然而，单克隆抗体技术在临床治疗应用中的进展却很慢，主要原因是目前单克隆抗体大多是鼠源性的，而鼠源性单克隆抗体应用于人体治疗时存在诸多问题：一是不能有效地激活人体中补体和Fc受体相关的效应系统；二是被人体免疫系统所识别，产生人抗鼠抗体(human antigen mouse antibody，HAMA)；三是在人体循环系统中被很快清除掉。因此，在保持对特异性抗原表位高亲和力的基础上进行人源化改造，减少异源抗体的免疫原性，成为单克隆抗体研究的重点[2]。随着对抗体基因的研究和DNA分子重组技术的应用，通过基因改造获得特异性抗体成为可能。1989年Huse等首次构建了抗体基因库，从而使抗体的研究从细胞水平进入到分子水平，并推动了第3代抗体—基因工程抗体技术的发展。至此，抗体的产生技术经历了三个阶段：经典免疫方法产生的异源多克隆抗体；细胞工程产生的鼠源单克隆抗体及基因工程产生的人源单克隆抗体。 人源化抗体就是指抗体的可变区部分（即Vh和Vl区）或抗体全部由人类抗体基因所编码。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为今天的人源化抗体。 1 嵌合抗体的构建 抗体分子与抗原结合特异性由L链和H链V区决定，抗体C区可作为异源蛋白诱发免疫反应，产生抗小鼠抗体（human anti-mouse antibody，HAMA）。将小鼠单克隆

重大危险源识别、评价、监控及安全管理制度(标准版)

( 安全管理 ) 单位：_________________________ 姓名：_________________________ 日期：_________________________ 精品文档 / Word文档 / 文字可改 重大危险源识别、评价、监控及安全管理制度(标准版) Safety management is an important part of production management. Safety and production are in the implementation process

重大危险源识别、评价、监控及安全管理 制度(标准版) 第一章总则 第一条为了全面贯彻《安全生产法》，落实“安全第一、预防为主”的方针，坚持以人为本的科学发展观，加强企业安全生产工作的控制能力和事故预防能力，实现中国建材集团安全生产工作从被动防范向源头管理转变，特制定本制度。 第二条重大危险源是指长期或临时生产、搬运、使用或储存危险物品，且危险物品的数量等于或超过临界量的单元（包括场所和设施）。 第三条企业根据工作需要建立相应重大危险源监督管理工作机构,建立健全重大危险源安全管理规章制度，落实重大危险源安全管理与监控责任制度，明确所属各部门和有关人员对重大危险源日常

安全管理与监控职责，制定重大危险源安全管理与监控实施方案。 第四条单位存在重大危险源的，其主要负责人全面负责本单位重大危险源的安全管理与监控工作。 第二章重大危险源普查登记 第五条单位必须按照《安全生产法》、《重大危险源辨识》（GB18218-2000）（见附件一）和申报登记范围（见附件二）的要求对本单位的重大危险源进行登记建档，并填写《重大危险源申报表》（见附件三），报当地安全监管部门。 第六条单位应根据工作需要，建立健全重大危险源管理数据库、档案库和定期报告制度，实现自身重大危险源的简易辨识与危险源的危险等级初次评估。 第三章重大危险源监控评估 第七条单位应对重要的设备、设施以及生产过程中的工艺参数、危险物质进行定期检测，建立健全重大危险源评估监控的日常管理体系。 第八条单位应建立重大危险源档案，重大危险源档案应包括：

火力发电电厂危险源识别与控制

电厂危险源识别与控制 10 [ 标签：火力发电, 电厂危险源 ] 鸢鹏 2010-06-11 07:25 最近在干一个火力发电厂脱硝的项目，求这方面的危险源辨识与控制清单 满意答案好评率：33% 近年来，国家越来越重视重大危险源的安全管理工作，相继颁布了法律、法规和下发了一系列规范性文件，对重大危险源的安全管理提出了具体的要求。中华人民共和国《安全生产法》、国家安全生产监督管理总局《关于开展重大危险源监督管理工作的指导意见》、《关于认真做好重大危险源监督管理工作的通知》等，极大地推动了重大危险源监督管理工作的深入开展。做好重大危险源监督管理工作已经成为转变安全生产监管方式、创新安全生产监管手段、提高安全生产监管效果的重要途径。 火力发电厂投资巨大，生产工艺复杂，在许多生产环节存在着危险有害因素，有些已经构成重大危险源，对人民生命财产安全构成一定威胁。按照国家规定对火力发电厂的重大危险源进行有效的管理，对安全生产具有重要意义。 1. 重大危险源辨识的依据 重大危险源辨识的依据是《重大危险源辨识》（GB18218-2000）和《关于开展重大危险源监督管理工作的指导意见》（安监管协调字【2004】56号）。 一个（套）生产装置、设施或场所，或同属于一个工厂的且边缘距离小于500m的几个（套）生产装置、设施或场所，叫做一个单元。在这个单元中，如果存在一种或若干种物质的混合物，由于它的化学、物理或毒性特性，使其具有易导致火灾、爆炸或中毒的危险，这些物质称作危险物质。长期地或临时地生产、加工、搬运、使用或储存危险物质，且危险物质的数量等于或超过临界量的单元，构成重大危险源。危险物质的临界量，是对于某种或某类危险物质规定的数量，在上述标准和文件中有明确规定。 重大危险源申报登记的范围是：贮罐区（贮罐）、库区（库）、生产场所、压力管道、压力容器、煤矿（井工开采）、金属非金属地下矿山、尾矿库。贮罐区（贮罐）、库区（库）、生产场所危险物质数量超过临界量包括以下两种情况： ①单元内现有的任一种危险物品的量达到或超过其对应的临界量； ②单元内有多种危险物品且每一种物品的储存量均未达到或超过其对应临界量，但满足下面的公式： 式中，——每一种危险物品的现存量。 ——对应危险物品的临界量。 2. 火力发电厂重大危险源的辨识 在火力发电厂中存在的危险有害物质主要有煤粉、乙炔、点火轻柴油、汽轮机油、绝缘油、次氯酸钠、二氧化氯、氢气、盐酸、氢氧化钠、氨、联胺、硫酸、六氟化硫、磷酸三甲苯酯、高温高压水汽、烟气、锅炉灰渣等。此外还有锅炉、压力容器等特种设备和变压器、电缆等电气设备设施。因此，生产过程中存在火灾、爆炸等危险因素，对这些危险有害物质和因素进行分析，从中辨识出重大危险源，并按照有关规定进行管理，对于提升安全生产水平将会起到重大促进作用。 2.1 锅炉重大危险源的辨识 按照安监管协调字[2004]56号文规定，若蒸汽锅炉额定蒸汽压力大于

重大危险源辨识、评价及监控通用版

安全管理编号：YTO-FS-PD319 重大危险源辨识、评价及监控通用版 In The Production, The Safety And Health Of Workers, The Production And Labor Process And The Various Measures T aken And All Activities Engaged In The Management, So That The Normal Production Activities. 标准/ 权威/ 规范/ 实用 Authoritative And Practical Standards

重大危险源辨识、评价及监控通用 版 使用提示：本安全管理文件可用于在生产中，对保障劳动者的安全健康和生产、劳动过程的正常进行而采取的各种措施和从事的一切活动实施管理，包含对生产、财物、环境的保护，最终使生产活动正常进行。文件下载后可定制修改，请根据实际需要进行调整和使用。 随着社会的不断进步，经济发展速度不断加快，科学技术渐渐渗透到人们生产生活的各个层面。例如汽车的发明，用计算机监控的生产装置等。这些无疑给企业的生产带来了方便，给人们的生活带来了实惠。但另一方面现代化的生产又给人们的生产生活带来了巨大的威胁。例如：（1）20xx年2月23日，广州增城市福和镇一私人化工厂发生氯气泄露事故，导致上百名村民出现轻重不同的中毒症状。附近8个村约二三千名村民连夜紧急撤离。（2）20xx年9月21日，法国南部城市图卢兹一家化工厂储藏在库房的约300t硝酸铵爆炸，死亡29人，受伤2442人。从这些重大事故的频频发生，体现出重大事故的发生主要是因为化工厂对重大危险源没有保持足够的警惕性，管理不善造成的。重大事故的主要类型一是有毒有害物质大量泄露，引起大范围内的人员死亡、中毒和环境污染；二是可燃物质大量泄露，遇火源引起火灾和爆炸。重大事故的频频发生，使我们痛苦地认识到现代化工生产，特别

单克隆抗体药物

浅谈单克隆抗体药物 摘要：单克隆抗体药物是生物医药领域中最耀眼的明珠。该类药物具有靶向性强、特异性高和毒副作用低等特点，代表了药品治疗领域的最新发展方向，在肿瘤、自身免疫性疾病的治疗手段不断升级过程中，单抗药物扮演着不可替代的角色，已经成为全球靶向治疗药物的主流。在刚刚兴起的细胞免疫治疗中，单抗药物同样是位列第一的品类，单抗产业是目前乃至未来医药行业中极具投资价值的细分行业。本文从单克隆抗体简介，常见的单克隆抗体药物、国内外单克隆抗体药物的研发现状，及对单抗药物的展望几个方面做一简介。 关键词：单克隆抗体单抗药物研发现状 1单克隆抗体 抗体是由B淋巴细胞转化而来的浆细胞分泌的，每个B淋巴细胞株只能产生一种它专有的、针对一种特异性抗原决定簇的抗体。这种从一株单一细胞系产生的抗体就叫单克隆抗体，简称单抗。这些抗体具有相同的结构和特性。抗体与特异性表达的肿瘤细胞表面蛋白质结合，从而阻碍蛋白质的表达，起到抗肿瘤作用。抗体还可使B淋巴细胞产生免疫反应，诱导癌细胞凋亡。早期单抗为鼠源性单抗,易被人体免疫系统识别，应用受到限制。后来采用基因工程的方法生产人源或人鼠嵌合型单抗，广泛应用于临床。 2常见的单克隆抗体药物 2.1利妥昔单抗（Rituximab）-美罗华-CD20单抗 第一个被美国食品药物管理局（FDA）批准用于临床治疗的单抗，是一种针对CD20抗原的人鼠嵌合型单克隆抗体，能特异性地与CD20结合，导致B淋巴细胞溶解的免疫反应，抑制其增殖，诱导成熟B淋巴细胞凋亡和提高肿瘤细胞对化疗的敏感性。90%以上的B淋巴细胞淋巴瘤细胞均有CD20表达，不表达于非定向干细胞或浆细胞。本药可使耐药淋巴瘤细胞对VP-16、顺铂重新敏感，用于CD20表达的复发或化疗耐药的惰性B淋巴细胞淋巴瘤，有效率46%。利妥昔单抗+CHOP 方案为治疗弥漫大B淋巴细胞淋巴瘤标准方案，可使全完缓冲（CR）率、生存时间明显延长[2-3]。 2.2曲妥珠单抗-赫赛汀-HER-2单抗 为重组DNA人源化的抗p185蛋白（癌基因）单克隆抗体-IgG抗体。进入人体后能选择性地与由细胞核内表皮生长因子2基因调控的p185糖蛋白结合。本

重大危险源辨识与监控试题及答案

重大危险源辨识与监控考试题 部门、班组：姓名：得分： 一、单选题 1.重大事故隐患是指企业在生产经营过程中存在可能造成()人以上伤亡，或者500万元以上直接经济损失，或重大社会影响的潜在事故危害。( ) A.10 B.6 C.15 D.20 2.重大危险源是客观存在的危险物质或能量超过的设备设施。( ) A.500卡 B.1000卡 C.一定量 D.临界量， 3.事故发生的概率P和事故损失严重程度S的乘积称为( ) A.风险率 B.损失量 C.严重量 D.危险级 4.一般危险因素的危险等级分为几级?( ) A.2级 B.5级 C.3级 D.4级，即安全的、临界的、危险的和破坏性的 5.我国国标《重大危险源辨识》标准于哪一年发布实施?( ) A.2001年 B.2000年 C.1999年 D.2002年 6.《重大危险源辨识》GBl8218-2000中，定义了哪一类物质的临界量?( ) A.爆炸性物质 B.建筑物质 C.化工物质 7.《重大危险源辨识》GBl8218-2000中，定义了哪一类物质的临

界量?( ) A.易燃物质 B.建筑物质 C.化工物质 8.《重大危险源辨识》GBl8218-2000中，定义了哪一类物质的临界量?( ) A.活性化学物质 B.建筑物质 C.化工物质 9.《重大危险源辨识》GBl8218-2000中，定义了哪一类物质的临界量?( ) A.有毒物质 B.建筑物质 C.化工物质 10.下面哪一种危险源属于第一类危险源?( ) A.有毒物质 B.集聚性人群 C.高速公路上浓雾茫茫 11.下面哪一种危险源属于第二类危险源?( ) A.有毒物质 B.压力容器 C.高速公路上浓雾茫茫 二、多选题 1.《重大危险源辨识》GBl8218-2000中，定义了哪些物质的临界量?( ) A.爆炸性物质 B.易燃物质 C.活性化学物质 D.化工物质 E.有毒物质 2.下面哪些危险源属于第一类危险源?( ) A.有毒物质 B.集聚性人群 C.高速公路上浓雾茫茫 D.活性化学物质 E.压力容器 3.下面哪些危险源属于第二类危险源?( )

【WO2019206729A1】鉴定抗体轻链和重链的可变结构域的配对【专利】

(12)NACH DEM VERTRAGüBER DIE INTERNATIONALE ZUSAMMENARBEIT AUF DEM GEBIET DES PATENTWESENS(PCT)VER?FFENTLICHTE INTERNATIONALE ANMELDUNG (19)Weltorganisation für geistiges Eigentum Internationales Büro (43)Internationales Ver?ffentlichungsdatum(10)Internationale Ver?ffentlichungsnummer WO2019/206729Al 31.Oktober2019(31.10.2019) W IP O P C T (51)Internationale Patentklassifikation: C40B40/10(2006.01)C12N15/10(2006.01)Erkl?rungen gem??Regel4.17: —hinsichtlich der Berechtigung des Anmelders,ein Patent zu (21)Internationales Aktenzeichen:PCT/EP2019/059728beantragen und zu erhalten(Regel4.17Ziffer ii) (22)Internationales Anmeldedatum:Ver?ffentlicht: 16.April2019(16.04.2019)—mit internationalem Recherchenbericht(Artikel21Absatz (25)Einreichungssprache:Deutsch3) (26)Ver?ffentlichungssprache:Deutsch (30)Angaben zur Priorit?t: 18169334.225.April2018(25.04.2018)EP (71)Anmelder:BAYER AKTIENGESELLSCHAFT [DE/DE];Kaiser-Wilhelm-Allee1,51373Leverkusen (DE). (72)Erfinder:STRERATH,Michael;Marc-Chaga l-Str86, 40477Düsseldorf(DE).BENDER,Christian;Glasstr.10, 50823K?ln(DE).V?LKER,Johanna;Ehrenbergstra?e 6,10245Berlin(DE).BOLIVAR LOPEZ,Julio,Cesar; Achenbach Str.56,40237Düsseldorf(DE). (74)Anwalt:BIP PATENTS;Alfred-Nobel-Str.10,40789 Monheim am Rhein NRW(DE). (81)Bestimmungsstaaten(soweit nicht anders angegeben,für jede verfügbare nationale Schutzrechtsart)AE,AG,AL, AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY, BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM, DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT, HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN, KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD, ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO, NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW, SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM, TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VC,VN,ZA,ZM,ZW. (84)Bestimmungsstaaten(soweit nicht anders angegeben,für jede verfügbare regionale Schutzrechtsart)ARIPO(BW, GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST, SZ,TZ,UG,ZM,ZW),eurasisches(AM,AZ,BY,KG,KZ, RU,TJ,TM),europ?isches(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ, DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT, LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI, SK,SM,TR),OAPI(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN, GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG). (54)Title:IDENTIFYING THE PAIRING OF VARIABLE DOMAINS OF LIGHT AND HEAVY CHAINS OF ANTIBODIES (54)Bezeichnung:IDENTIFIZIEREN DER PAARUNG VON VARIABLEN DOM?NEN AUS LEICHTEN UND SCHWEREN KETTEN VON ANTIK?RPERN (57)Abstract:The present invention relates to the identification of antibodies and/or antibody fragments in a selection process.The present invention relates to a method,a System and a Computer program product for identifying pairs of genes which encode the variable domains of light and heavy chains of selected antibodies and/or antibody fragments. (57)Zusammenfassung:Die vorliegende Erfindung befasst sich mit der Identifikation von Antik?rpern und/oder Antik?rperfragmen?ten in einem Selektionsverfahren.Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ein Verfahren,ein System und ein Computerprogramm?produkt zur Identifikation von Paaren von Genen,die die variablen Dom?nen von leichten und schweren Ketten von selektierten An?tik?rpern und/oder Antik?rperfragmenten kodieren.

什么是轻链病、重链病

什么是轻链病、重链病 轻链病是一种浆细胞异常增生性疾病。是由于异常的浆细胞产生过多的轻链，而重链的合成相应减少。本病多发于中、老年人。 过多游离的轻链片段在血清或尿液中大量出现称为轻链病；一旦免疫球蛋白轻链在全身组织中沉积，引起相应的临床表现即为轻链沉积病。 重链病是淋巴浆细胞的恶性肿瘤，以恶性增殖的单克隆淋巴浆细胞合成和分泌大量结构均一、分子结构不完整的单克隆免疫球蛋白为特征，该蛋白仅由重链组成而不含轻链。 重链病是一组肿瘤性的浆细胞病，特征是血和尿中的单克隆蛋白由免疫球蛋白重链组成。这些重链缺乏轻链，是淋巴浆细胞增殖过程的表现。 M蛋白是单克隆性浆细胞或淋巴细胞大量增殖而产生的一种在氨基酸组成及排列顺序 上十分均一的异常球蛋白，其本质为免疫球蛋白或其片段。因常出现于骨髓瘤、巨球蛋白血症或恶性淋巴瘤病人的血和尿中，是由单克隆性抗体生成细胞产生，故称M蛋白。 重链病为骨髓瘤的变型，患者血清中的M蛋白为不完全的免疫球蛋白，只有重链而无 轻链，故名重链病，目前只发现γ、α和μ三种类型。轻链病也是骨髓瘤的一种特定类型，在患者血或尿中出现大量均一的异常免疫球蛋白及游离的κ或λ轻链，故命名为轻链病。 重链大小约为轻链的2倍，含450～550个氨基酸残基，分子量约为55或75kD。每条 H链含有4～5个链内二硫键所组成的环肽。不同的H链由于氨基酸组成的排列顺序、二硫键的数目和位置、含的种类和数量不同，其抗原性也不相同。 轻链大约由214个氨基酸残基组成，通常不含碳水化合物，分子量约为24kD。每条轻 链含有两个由链内二硫键内二硫所组成的环肽。L链共有两型：kappa与lambda，同一个天然免疫球蛋白分子上L链的型总是相同的。

单克隆抗体制备全攻略(二)

6、单抗特性的鉴定 ⑴单克隆性的确定包括杂交瘤细胞的染色体分析、单抗免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定和单抗纯度鉴定等。 A、杂交瘤细胞的染色体分析 对杂交瘤细胞进行染色体分析可获得其是否是真正的杂交瘤细胞的客观指标之一，杂交瘤细胞的染色体数目应接近两种亲本细胞染色体数目的总和，正常小鼠脾细胞的染色体数目为40，小鼠骨髓瘤细胞SP2/0为62-68，NS-1为54-64；同时骨髓瘤细胞的染色体结构上反映两种亲本细胞的特点，除多数为端着丝点染色体外，还出现少数标志染色体。另一方面，杂交瘤细胞的染色体分析对了解杂交瘤分泌单抗的能力有一定的意义，一般来说，杂交瘤细胞染色体数目较多且较集中，其分泌能力则高，反之，其分泌单抗能力则低。 检查杂交瘤细胞染色体的方法最常用秋水仙素法，其原理是应用秋水仙素特异的破坏纺锤丝而获得中期分裂相细胞；再用0.075mol/L KCl溶液等低渗处理，使细胞膨胀，体积增大，染色体松散；经甲醇-冰醋酸溶液固定，即可观察检查。其操作步骤如下： a.在加秋水仙素前48-36小时将杂交瘤细胞传代。 b.秋水仙素处理：在培养瓶中加入秋水仙素（100ug/ml，除菌，-20℃保存），使最终浓度为0.1- 0.4ug/ml（若改用秋水仙胺则最终浓度为0.02-0.05ug/ml）；继续培养4-6小时，然后吹打细胞，移入离心管中，1000r/min10分钟，弃上清。 c.加入已预温到37℃的0.075mol/L KCl溶液5ml，将沉淀细胞悬浮并混匀，37℃水浴15-20分钟。 d.向悬液中加入新配制的固定液（甲醇与冰醋酸3：1混合）1ml，混匀，然后1000r/min10分钟，弃去上清液；本步骤的目的是使细胞表面轻微固定，可防止固定后细胞粘连成团块。 e.加入固定液5ml，将细胞悬浮并混匀，室温静置20-30分钟，然后1000r/min10分钟，弃去上清液；重复操作一次；其后加5ml固定液，将细胞悬浮并混匀，封上管口，置4℃过夜。 f.取出离心管，1000r/min5分钟，轻轻吸去上清液，根据细胞压积多少而留下0.5-1ml固定液，将细胞悬浮并混匀后，吸取细胞悬液1-2滴，滴在刚从冰水中取出的载玻片上，用口吹散，并在火焰上通过数次，使细胞平铺于载玻片上，自然干燥。 g.用新配制的10%Giemsa染液染色10-20分钟，然后用自来水洗去染液，自然干燥。（Giemsa 染液配方：Giemsa粉0.5g，甘油33ml，55-60℃保温2小时，加甲醇33ml混匀，保存于棕色瓶内作为原液；取原液1份，加1/15mol/L PH6.8PBS9份，即成10%Giemsa染液）。 h.镜检：选择染色体分散好，无重叠，无失散的细胞进行观察分析。每份标本应计数100个完整的中期核细胞，并注意观察是否有标志染色体。

基坑支护工程危险源识别与监控

基坑开挖工程危险源识别与监控 （1）基坑工程事故的类别 1）与挡土结构有关的事故挡土墙 ①挡土结构施工不良。 ②挡土结构渗漏水严重，致使挡土结构后面土体流失。 ③挡土结构异常变形。 ④地面超载引起挡土板结构上侧压力过大。 ⑤各阶段挖土超挖引起挡土结构上侧压力过大。 ⑥未进行支护与土体整体稳定和抗滑移演算错误，导致挡土结构整体垮 塌。 ⑦对雨水、周边排水等地表水造成的侧压力增加考虑不足导致挡土结构垮 塌。 2）与锚杆体系有关的事故 ①勘察、设计上的不当造成事故。 ②施工不良造成的事故。 3）与支撑体系有关的事故 ①设计不当造成的事故。 ②施工不良造成的事故。 4）与地下水治理不当有关的事故 ①发生在挡土结构上的事故。 ②发生在挡土底部的事故， ③发生在基坑周边的事故。

④未对井点降水进行整体流量均匀性控制，地下水位降低过大、过快导致 已有临近建（构）筑物沉降、开裂等事故。 5）与管理不当有关的事故 ①放坡开挖时坡度过陡，土坡可能丧失其稳定性。 ②基坑周围过多堆放荷载，引起边坡失稳。 ③挖土施工速度过快，改变了原土层的平衡状态，易造成滑坡。 ④基坑周围停放重型机械，使支护荷载增大，引起边垛失稳破坏。 ⑤附近基坑施工对基坑支护的影响引起围护结构破坏。 ⑥基坑暴露时间过长，坑底回弹增大从而影响支护结构稳定性。 （2）引发事故的主要原因 ①在调查阶段，事前对周围环境调查不够，如临近建筑物的基础情况调查不足、地下设施及地下构筑物情况调查不足、地质勘查不详细、地质资料不足等。 ②在设计阶段，选用的土的物理力学性质指标有误，选用的设计方法有误，荷载估计不足等。 ③在施工阶段，不适当地增加基坑四周地面上施工荷载、基坑超挖、回填土不密实、支撑结构断面不足、异常降水使墙后侧压力过大等。 （3）危险源的监控项目 ①支护结构水平位移。 ②周围建筑物、地下管线变化。 ③地下水位。

危险源识别及控制措施

目录 一、危险源辨识、评价及监控措施 二、重大危险源清单 三、重大危险源监控措施方案

危险源辨识、评价及监控措施可能导致死亡、伤害、职业病、财产损失，工作环境破坏或上述情况的组合所形成的根源或状态称为危险源。 为了坚决贯彻“安全第一，预防为主”的安全生产方针，保护人民生命财产的安全，依据现代安全管理的理论，应根据企业的施工特点，依据承包工程的类型、特征、规模及自身管理水平等情况，辨识出危险源，列出清单，并对危险源进行逐项评价，将其中导致生产安全事故发生的可能性较大，且生产安全事故发生会造成严重后果的危险源定义为重大危险源，如可能出现的高处坠落、物体打击、坍塌、触电、中毒以及其他群体伤害事故的状态。同时必须建立管理档案，其内容包括危险源的识别、评价结果和清单。对重大危险源可能出现伤害的范围、性质和时效性，制定消除和控制的措施，并制定相应的管理方案和应给予安，且纳入企业安全管理制度、员工安全教育培训、安全操作规程或安全技术措施中。 1、危险源的辨识 危险源辨识应全面、系统、多角度、不漏项，重点放在能量主体，危险物及其控制和影响因素上。 2、危险源的辨识范围 ①单位工程在其生产活动中，因自身活动，产品或服务而产生的危险源，包括： a) 施工准备阶段的危险源； b) 基础施工阶段的危险源； c) 结构施工阶段的危险源；

d) 装修施工阶段的危险源； e) 设备安装阶段的危险源； f) 工程验收交付阶段危险源； g) 停止施工阶段的危险源。 ②相关方(包括供货方、分承包合同方、劳务方等)的活动，产品或服务中的危险源，包括： a) 材料供应方提供原材料及产品的危险源； b) 工程分包方在施工活动中的危险源； c) 设备租赁方的设备在运行过程中的危险源； d) 劳务方在施工过程中的危险源； c) 其他相关方(参观、访问、检查、实习)活动中的危险源。 ③考虑三种状态下的危险源 a) 正常施工情况下的危险源； b) 异常施工情况下的危险源； c) 紧急情况(如火灾、爆炸、抢险等)的危险源。 ④考虑三种时态下的危险源 a) 过去曾出现的危险源； b) 现在正在发生的危险源； c) 将来可能出现危险源。 根据建筑施工特点，对现有的或计划中的作业环境和施工组织中存在的危险源和风险进行辨识、预测和评价。 3、危险源的辨识时间

单克隆抗体的制备方法

一、单克隆抗体的概念和原理免疫反应是人类对疾病具有抵抗力的重要因素。当动物体受抗原刺激后可产生抗体。抗体的特异性取决于抗原分子的决定簇，各种抗原分子具有很多抗原决定簇，因此，免疫动物所产生的抗体实为多种抗体的混合物。用这种传统方法制备抗体效率低、产量有限，且动物抗体注入人体可产生严重的过敏反应。此外，要把这些不同的抗体分开也极困难。近年，单克隆抗体技术的出现，是免疫学领域的重大突破。 （1）单克隆抗体的基本概念抗体主要由B淋巴细胞合成。每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。

（2）单克隆抗体技术的基本原理要制备单克隆抗体需 先获得能合成专一性抗体的单克隆B淋巴 1 细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。其制备原理示意如下： 二、基本方法 2 1. 抗原提纯与动物免疫 7对抗原的要求是纯度越高越好，尤其是初次免疫所用的抗原。如为细胞抗原，可取1×10个细胞作腹腔免疫。可溶性抗原 需加完全福氏佐剂并经充分乳化，如为聚丙烯酰胺电泳纯化的抗原，可将抗原所在的电泳条带切下，研磨后直接用以动物免疫。 选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠龄在8～12周，雌雄不限。为避免小鼠反应而不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3～4只小鼠。

单克隆抗体的应用

单克隆抗体的应用 陈丽珊 1975年Kohler和Milstein首先报道，用细胞杂交技术，使经绵羊红细胞(SRBC)免疫的小鼠的脾细胞，与小鼠的骨髓瘤细胞融合，并由此创建了第一个B细胞杂交瘤细胞株，获得了抗SRBC的单克隆抗体。这是免疫学乃至医学史上的一个里程碑。 单克隆抗体的特点是：理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、便于人为处理和质量控制，并且来源容易。这些优点使它一问世就受到高度重视，并广泛应用于生物学和医学研究领域。 1 作为亲合层析的配体 单克隆抗体能与其相应的抗原特异性结合，因而能够从复杂系统中识别出单个成分。只要得到针对某一成分的单克隆抗体，利用它作为配体，固定在层析柱上，通过亲合层析，即可从复杂的混和物中分离、纯化这一特定成分。如用抗人绒毛膜促性腺激素(hCG)亲合层析柱，就可从孕妇尿中提取到纯的hCG。与其它提取方法(沉淀法、高效疏水色谱法等)相比，具有简便、快速、经济、产品活性高等优点。 2 作为生物治疗的导向武器 脂质体是由既亲水又亲油的两亲磷脂组成的连续双分子层微囊，内含水相空间，可包裹水溶性物质。包有细胞毒剂的脂质体膜上偶联抗体，可定向攻击靶细胞，称为免疫脂质体。这种“导向治疗”，在动物试验与体外试验中已获得满意效果。如热敏免疫脂质体，由抗人乳癌细胞抗体经疏水长链脂肪酸修饰，抗体带上长的疏水碳链，部分插入脂质体的脂双层膜中，抗体Fab段仍暴露在膜表面，因而保持了抗体活性。热敏免疫脂质体可特异识别靶细胞(人乳癌细胞)，并通过相变温度引起脂质体破裂，从而定向释放药物。另外，可将化疗药物、细菌毒素、植物毒素或放射性同位素等细胞毒剂与抗肿瘤抗原的单克隆抗体直接交联，利用其导向作用，使细胞毒剂定位于肿瘤细胞把它直接杀伤。这不仅提高了抗体的疗效，也可降低细胞毒剂对正常细胞的毒性反应。如应用抗T细胞单抗和柔红霉素结合物，在体外对非T 淋巴细胞就无杀伤作用。但是，要把这种方法应用于临床，目前还存在不少技术难关，包括人体对鼠源单抗的排异问题等。 3 作为免疫抑制剂 抗人T淋巴细胞单抗(McAb)作为一种新型免疫抑制剂，已广泛应用于临床治疗自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反应。其作用机理有赖于McAb的种类及其免疫学特性。注射抗小鼠Thy-1抗原的单抗，可以抑制小鼠同种皮肤移植的排斥反应。此外，对用于同种骨髓移植的供体骨髓，在体外经抗T细胞单抗加补体处理，能减轻移植物抗宿主病的发生。 4 作为研究工作中的探针 单克隆抗体只与抗原分子上某一个表位(即抗原决定簇)相结合，利用这一特性就可把它作为研究工作中的探针。此时，可以从分子、细胞和器官的不同水平上，研究抗原物质的结构与功能的关系，进而并可从理论上阐明其机理。如用荧光物质标记单抗作为探针，能方便地确定与其结合的相应生物大分子(蛋白质、核酸、酶等)在细胞中的位置和分布。 5 增强抗原的免疫原性 抗体对抗原免疫原性的增强作用由来已久，60年代就已发现幼猪对破伤风类毒素难以产生抗体，注射相应特异性抗体IgG，就能有效地提高对委内瑞拉马脑炎病毒的免疫应答。1984年以来，Celis等发现，抗乙肝病毒(HBs)IgG可增强HBs抗原对特异性人T细胞克隆的刺激增殖，并可诱生干扰素。在小鼠中发现，当低剂量的HBs抗原不产生免疫反应时，加入抗HBs抗体组成的复合物，则可有效地诱生免疫反应。根据这一作用，现已研制出乙肝的抗原—抗体复合物型治疗性疫苗。

重大危险源辨识与监控试题及答案_最新版

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重大危险源辨识与监控试题及答案 温馨提示：该题库汇集大量内部真题、解析，并根据题型进行分类，具有很强的实用价值；既可以作为考试练习、突击备考使用，也可以在适当整理后当真题试卷使用。 本文档可根据实际情况进行修改、编辑和打印使用。 一、单选题 1.重大事故隐患是指企业在生产经营过程中存在可能造成()人以上伤亡, 或者500万元以上直接经济损失, 或重大社会影响的潜在事故危害。() A.10 B.6 C.15 D.20 2.重大危险源是客观存在的危险物质或能量超过的设备设施。() A.500卡 B.1000卡 C.一定量 D.临界量, 3.事故发生的概率P和事故损失严重程度S的乘积称为。() A.风险率 B.损失量 C.严重量 D.危险级 4.一般危险因素的危险等级分为几级?() A.2级 B.5级 C.3级 D.4级, 即安全的、临界的、危险的和破坏性的 5.我国国标《重大危险源辨识》标准于哪一年发布实施?()

A.2001年 B.2000年 C.1999年 D.2002年 6.《重大危险源辨识》GBl8218-2000中, 定义了哪一类物质的临界量?() A.爆炸性物质 B.建筑物质 C.化工物质 7.《重大危险源辨识》GBl8218-2000中, 定义了哪一类物质的临界量?() A.易燃物质 B.建筑物质 C.化工物质 8.《重大危险源辨识》GBl8218-2000中, 定义了哪一类物质的临界量?() A.活性化学物质 B.建筑物质 C.化工物质 9.《重大危险源辨识》GBl8218-2000中, 定义了哪一类物质的临界量?() A.有毒物质 B.建筑物质 C.化工物质 10.下面哪一种危险源属于第一类危险源?() A.有毒物质 B.集聚性人群 C.高速公路上浓雾茫茫 11.下面哪一种危险源属于第二类危险源?() A.有毒物质 B.压力容器 C.高速公路上浓雾茫茫

单克隆抗体的制备方法

单克隆抗体的制备方法 动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。 ②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。 （2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。 初次免疫1×107/0.5ml ip ↓2～3周后 第二次免疫1×107/0.5ml ip ↓3周后 加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv ↓ 取脾融合 细胞融合 1．细胞融合前准备 （1）骨髓瘤细胞系的选择：骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。常用的骨髓瘤细胞系见表2-4。 表2-4用于融合试验的主要骨髓瘤细胞系