实验技术手册(细胞免疫方面)
单克隆抗体的制备
1975年，K?hler和Milstein创立了杂交瘤技术制备单克隆抗体，单克隆抗体具有特异性高，灵敏度高，重复性好，可供应量大，检测时间短以及能够查出混合物中的少量成分等优点。
1试验材料
1.1试验动物和细胞
雌性6～8周龄BALB/c小鼠
SP2/0骨髓瘤细胞
1.2主要实验试剂
HRP标记羊抗小鼠IgG、福氏完全佐剂（FCA）、福氏不完全佐剂（FIA）、聚乙二醇（PEG）、二甲基亚砜（DMSO）、降植烷、TMB底物、HAT(50×)、HT(50×)、三抗溶液（100×）小鼠单抗Ig类和亚类鉴定用ELISA试剂盒均为SIGMA公司；
DMEM粉、特级胎牛血清（FBS）均为GIBCO公司；
牛血清白蛋白（BSA）
1.3主要实验仪器和耗材
CO2细胞培养箱（Thermo和上海新苗医疗器械制造有限公司WJ-160B-Ⅲ）
酶联检测仪（BIO-RAD Model 680）
血球计数板（上海求精生化试剂仪器有限公司）
pH计（Sartorius赛多利斯科学仪器）
APL高压灭菌锅（CL-32L）
生物安全柜(ESCO北京五州东方科技发展有限公司)
三恒电泳仪（JY600C）
数显恒温磁力搅拌器（78HW-1，杭州仪表电机有限公司）
电子分析天平（Sartorius赛多利斯科学仪器）
分光光度计（WPA Biowav eⅡ+）
进口液氮罐（Thermo）
Protein A柱
恒温水浴锅（HH-2金坛市科兴仪器厂）
微型台式真空泵（GL-80ZB型，海门市）
电热恒温培养箱（DHP-9032上海天恒医疗器械）
低速离心机 (L-550长沙湘仪离心机仪器有限公司)
高速冷冻离心机（SIGMA 2-16PK）
倒置显微镜（Nikon TS100）
超低温冰箱(Thermo)
96孔酶标板（）
96孔、24孔细胞培养板、T25培养瓶、35mm培养皿、60mm培养皿、100mm培养皿、冻存管0.22μm过滤器(PALL)
2主要试剂配制
2.1常规试剂配制
PBS（或PB）（0.02mol/L，pH7.4）：
A液（0.2 mol/L Na2HPO4）：Na2HPO4·12H2O 71.64g,加蒸馏水至1000ml；
B液（0.2 mol/L NaH2PO4）：NaH2PO4·2H2O 3.12g,加蒸馏水至1000ml；
取A液81ml加B液19ml混合，再用生理盐水（或蒸馏水）做10倍稀释即成。
饱和硫酸铵溶液（pH7.4）：称取80~85g A·R级(NH4)2SO4，以50~80℃蒸馏水100ml溶解，搅拌20min，趁热过滤。冷却后以浓氨水（15N NH4OH）调pH至7.4。配好的饱和硫酸铵，瓶底应有结晶析出。取饱和硫酸铵40ml，加蒸馏水60ml稀释即成40%饱和硫酸铵。
2.2细胞融合试剂配制
DMEM不完全培养基：DMEM粉1袋，3.7g NaHCO3，用1mol/L HCl调pH至7.2-7.3，加灭菌超纯水定容至1000ml。0.22μm滤膜过滤除菌至1L试剂瓶中，4℃保存。
胎牛血清（FBS）的灭活：56℃，灭活30min，分装100ml或50ml一瓶，-20℃冻存。
10%FBS完全培养基：FBS 10ml，DMEM不完全培养基90ml，三抗溶液1ml，4℃保存。
20%FBS完全培养基：FBS 20ml，DMEM不完全培养基80ml，三抗溶液1ml，4℃保存。
HAT培养基：20%FBS培养基98ml，HAT（50×）贮存液2ml。
HT培养基：20%FBS培养基98ml，HT（50×）贮存液2ml。
冻存液：完全培养基:DMSO=9.2:0.8，即含8%DMSO，与培养过程中使用的血清保持一致，需新鲜配制。
2.3ELISA试剂配制
(1) PBS 10×stock solution
40g Na2HPO4·12H2O
5g KH2PO4
81g NaCl
1.0mL 20% NaN3 (20g NaN3溶解在100mL蒸馏水中)
用蒸馏水溶解，定容到1L。
(2) Coating buffer
1.59g Na2CO3
2.93g NaHCO3
1.0mL 20% NaN3
用800mL蒸馏水溶解，调pH到9.6，定容到1L。
(3) Blocking buffer
将0.5gBSA 溶解在100mL Coating buffer 中（即0.5%BSA溶液）。
(4) Tween buffer
100mL PBS 10×stock solution
5g BSA
0.5mL Tween 20
1.0mL 20% NaN3
用800mL蒸馏水溶解，定容到1L。
(5) Tween wash buffer
45g NaCl
2.5mL Tween 20
用足量蒸馏水溶解，定容到5L。
(6) Enzyme substrate buffer
97mL Diethanolamine（乙二醇胺）
700mL 蒸馏水
1.0mL 20% NaN3
用大约100mL 1M浓盐酸调pH到9.8，然后加101mg MgCl2·H2O（相当于181.4mg
MgCl2·12H2O），最后定容到1L。
(7) Substrate（现用现配）
将1个NPP药片溶解在5mL Enzyme substrate buffer中，黑暗条件下保存。
（8）OPD底物缓冲液：
0.2M Na2HPO4 25.7ml
0.1M 柠檬酸 24.3ml
加蒸馏水 50ml，pH 5.0
（9）OPD底物（现配先用）
OPD工作液配制：10ml底物缓冲液中加入5mg OPD，完全混匀后加H2O2(浓度
30%)4μl/10ml即可，100μl/孔，492 nm的波长读数。
2.4SDS-PAGE试剂配制
30%聚丙烯酰胺贮存液：29g丙烯酰胺，1g N,N’-亚甲双丙烯酰胺，加蒸馏水至100ml，充分溶解后过滤，调pH7.0，4℃棕色瓶保存备用。
分离胶缓冲液（1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8）：18.17g Tris碱，加蒸馏水约80ml，用浓盐酸调pH至8.8，加蒸馏水定容至100ml。
浓缩胶缓冲液（1.0mol/L Tris-HCl，pH6.8）：12.11g Tris碱，加蒸馏水约80ml，用浓盐酸调pH至6.8，加蒸馏水定容至100ml。
10%（w/v）SDS溶液：10g SDS，加蒸馏水定容至100ml。
10%（w/v）过硫酸铵：1g过硫酸铵，加10ml蒸馏水溶解，300μl/支分装-20℃冻存。
2×上样缓冲液：4%（w/v）SDS，2%（w/v）β-巯基乙醇，20%（v/v）甘油，0.2%（w/v）溴酚蓝，溶于0.1mol/L Tris-HCl（pH6.8）中。
5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15.1gTris碱，72g甘氨酸，5g SDS，溶于1000ml 蒸馏水中。
考马斯亮蓝染色液：0.25g考马斯亮蓝R-250溶解于100ml甲醇、水、冰乙酸（9:9:2）混合物中，过滤除去未容物。
脱色液：甲醇:水:冰乙酸=1:7:2的混合物。
3试验方法
单克隆抗体制备技术路线如图1-1。
3.1动物免疫
根据常用免疫学实验技术，采用搅拌混合法，将100μg/ml的400μl抗原溶液与等体积的400μl佐剂充分混合，最终形成“油包水”的乳化状态。初次免疫：用FCA乳化后，每只鼠打4针（腋下腹股沟淋巴结丰富处）每针0.2 ml，即免疫抗原剂量为每只40μg；3周后第二次免疫：用FIA乳化，剂量针数同上；3周后第三次免疫：不加佐剂直接腹腔注射，剂量同上。三免后10d分别尾静脉采血，采用ELISA间接法测其效价，未达到效价要求的继续按三免方式每隔两周免疫一次，直至效价达到1：105。融合前3d加强免疫：50μg OV A抗原量，腹腔注射，3d后取脾融合。
图1-1单克隆抗体制备技术路线图
3.2小鼠血清效价的测定
3.2.1包被抗原和酶标二抗的最适浓度
以高纯度的抗原包被酶标板，包被浓度分别为5μg/ml、10μg/ml、50μg/ml，阳性对照取抗原蛋白免疫后小鼠血清作1:100、1:1000和1:10000稀释，阴性对照取未免疫的小鼠血清作1:100稀释，空白对照采用样品稀释液，HRP标记羊抗小鼠IgG分别稀释成1:1000、1:2500、1:5000、1:7500和1:10000。检测结果中以空白对照值相对最小、阴性值与空白值之差小于0.1、以及阴阳性差别相对最大的包被抗原浓度和酶标二抗抗体稀释度为最适条件。
3.2.2小鼠血清效价的检测
采用间接ELISA法测定小鼠血清效价。小鼠尾静脉采血0.1ml，37℃放半小时后，在4℃过夜，4℃ 5000r/min离心10min，收集血清，用间接ELISA法检测血清效价，同时设阴性和空白对照。间接ELISA法程序如下：
1）包被：用包被液稀释OV A抗原，使浓度达到10μg/ml，以100μl/孔包被酶标板，置4℃过夜。
2）洗板：弃去酶标板孔内液体，用PBST洗涤三次，每次30min，拍干。
3）封闭：每孔加100μl封闭液封闭游离结合位点，37℃湿盒温育1h，洗板同上。
4）加待测样品：用样品稀释液适当稀释待检血清，阴性对照为同批正常鼠血清（100倍稀释），空白对照为样品稀释液，每孔加100μl，37℃湿盒温育1h，洗板同上。
5）加酶标二抗：将HRP标记羊抗小鼠IgG按1:5000稀释，每孔加100μl，需新鲜配制，37℃湿盒温育1h，用PBST洗涤6次，拍干。
6）显色：各孔加TMB底物液100μl，室温避光反应10min。
7）终止：各孔加50μl终止液终止反应。
8）读数：用酶联检测仪在450 nm波长处测定OD450值。
3.3杂交瘤细胞株的建立
3.3.1饲养细胞的制备
取未免疫的BALB/c小鼠眼动脉采血后拉颈处死，分离血清作为抗体检测时的阴性对照血清，-20℃冻存备用。将小鼠尸体浸泡于75%酒清中5min，无菌条件下剪开腹部皮肤后撕开暴露出腹膜，在腹膜开一小口，用DMEM不完全培养基约10ml反复冲洗腹腔并收集巨噬细胞，放入50ml离心管，1000r/min离心10min，弃上清，用HAT培养基重悬细胞并计数，调整浓度在2×105/ ml左右。将含腹腔巨噬细胞的培养液加入到4块96孔板内，每孔100μl（约两滴）。放入37℃ 5%CO2培养箱内培养，24h后融合使用。
3.3.2SP2/0骨髓瘤细胞悬液的制备
在融合前一周复苏SP2/0骨髓瘤细胞并扩大培养，骨髓瘤细胞生长快通常以1:10传代，使用10%FBS完全培养基培养，调整好细胞状态。融合前12h需要换液一次，使大多数细胞在融合时处于对数生长期，细胞浑圆透亮、圆亮、形态均一，排列整齐，成半致密分布。融合时将各瓶SP2/0骨髓瘤细胞收集到50ml离心管中，用DMEM不完全培养基悬浮，1000r/min离心10min，弃上清，沉淀用30ml DMEM不完全培养基再离心洗涤一次，然后将其重悬至10ml DMEM不完全培养基混匀，取上述悬液计数。
3.3.3免疫脾细胞悬液的制备
取加强免疫后3d的BALB/c小鼠，摘除眼球采血后拉颈处死，分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清，-20℃冻存备用。将小鼠尸体浸泡于75%酒清中5min。无菌条件下剪开左侧腹部皮肤，可看到脾脏，换眼科剪镊，剪开腹膜，取出脾脏置于已盛有10ml DMEM不完全培养基的平皿中，轻轻洗涤，并细心剥去周围脂肪和结缔组织。将脾脏移入另一个盛有10ml DMEM不完全培养基的平皿中，用注射器内芯在200目的铜网上挤压研磨脾脏，使脾细胞浸入平皿中的DMEM不完全培养基。用吸管吹打数次，制成单细胞悬液。将脾细胞悬液转移至50ml离心管中，加DMEM不完全培养基至30ml，巴斯德吸管吹匀细胞，1000r/min离心10min，弃上清，沉淀用30ml DMEM不完全培养基再离心洗涤1~2次，然后将细胞重悬于10ml DMEM不完全培养基混匀，取上述悬液计数。通常每只小鼠可得1×108~2.5×108个脾细胞。
3.3.4细胞融合
1）将SP2/0骨髓瘤细胞和脾细胞按1:5的比例混合，一般取1×108个脾细胞和2×107个SP2/0骨髓瘤细胞的悬液量，混合于一支50ml离心管中，补加不完全培养基至30ml，充分混匀，1000r/min离心7min。
2）将上清尽量弃净，轻击弹击管底，使两种细胞的沉淀松散均匀成糊状。
3）用巴斯德吸管吸取37℃预热的45% PEG（pH8.0）0.7ml，在30s内沿管壁缓慢滴入管内，边加边转动离心管；然后立即在60s内将细胞全部吸入吸管中，静置30s，然后在60s内将细胞吹入离心管中。
4）用吸管立即在5min内加25ml预热至37℃的DMEM不完全培养基，使PEG稀释而失去促融作用，第1min内缓慢滴入1ml，边滴边转动离心管，第2min内滴入4ml，后3min内将剩余20ml DMEM不完全培养基加完。
5）800r/min离心6min，弃上清。
6）加入40ml预热的HAT培养基中，轻轻吹吸细胞沉淀，混合均匀，用巴斯德吸管滴加到前一天制备的饲养细胞板中，每孔100μl（约两滴），每块板少加一个孔用做阴性对照，置37℃ 5%CO2培养箱中培养。
3.3.5杂交瘤细胞的筛选
融合后的细胞7d内用HAT培养基，7~14d内用HT培养基，第14d后可用普通的完全培养基，每3d更换培养液一次，换液时吸去1/2~2/3培养液，加入等量新鲜培养液。经常观察杂交瘤细胞生长情况，待杂交瘤细胞长满孔底面积1/10以上时，于换液3d后即可吸出细胞培养上清100μl供抗体检测。抗体检测的方法为间接ELISA法（方法同3.2.2），以骨髓瘤细胞培养上清作为阴性对照，以免疫鼠血清作为阳性对照。
3.3.6杂交瘤细胞的克隆
3.3.6.1饲养细胞的制备
取健康BALB/c小鼠，无菌取脾，去除周围脂肪和结缔组织，轻轻洗涤，在盛有10ml DMEM不完全培养基的平皿中，用注射器内芯在200目的铜网上挤压研磨脾脏，制成单细胞悬液。将脾细胞悬液转移至50ml离心管中，加DMEM不完全培养基至30ml，巴斯德吸
管吹匀细胞，1000r/min离心10min，弃上清，沉淀用30ml DMEM不完全培养基再离心洗涤1~2次，然后将细胞重悬于HT培养基中，取上述悬液计数，调整细胞浓度在1×106/ml，将稀释后的含脾细胞的培养液加到96孔培养板，每孔100μl（约两滴）。放入37℃ 5%CO2培养箱内培养，24h后克隆化使用。
3.3.6.2有限稀释法克隆化
将检测为阳性孔中的融合细胞用HT培养基轻轻吹打至24孔板内并10倍稀释，计数细胞，调整细胞数在1×103/ml~5×103/ml。用HT培养基再将其细胞数稀释至20个/ml、10个/ml、5个/ml三种不同的稀释度，取此杂交瘤细胞悬液分别加入已铺好饲养细胞的细胞培养板中；每种杂交瘤细胞分装96孔板一块，每块板留一个孔做阴性对照，20个/ml的稀释度加23孔，其余两个稀释度各加36孔，每孔100μl，三个稀释度的每孔杂交瘤细胞数分别为2、1、0.5；置37℃、5%CO2培养箱培养，视情况3~5d换液一次，采用半换液方式，待出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；倒置显微镜下观察，分别标记出单个、多个细胞克隆生长孔，取单细胞克隆孔上清作抗体检测；取阳性孔进行亚克隆，同时将每个阳性孔细胞株进行扩大培养，并冻存2支以上的细胞；直到所有的克隆细胞孔都为阳性时克隆成功，至少进行三次克隆。
3.3.7腹水法大量制备单克隆抗体
1）小鼠预处理：取10~15周龄的BALB/c小鼠，用降植烷注射小鼠腹腔，0.3ml/只，处理后的小鼠10d至2个月内均可使用。
2）SP2/0骨髓瘤细胞悬液制备：复苏并扩大培养SP2/0细胞，接种前将处于对数生长期的SP2/0细胞收集于50ml离心管，1000r/min离心10min，弃上清，用无血清培养基（DMEM 不完全培养基）重悬细胞，计数并调细胞浓度至2~4×106/ml，作为ELISA检测时的阴性腹水对照。
3）杂交瘤细胞悬液制备：扩大培养各杂交瘤细胞株，接种前将处于对数生长期的杂交瘤细胞分别收集于50ml离心管，1000r/min离心10min，弃上清，用无血清培养基重悬细胞，计数并调细胞浓度至2~4×106/ml。
4）接种细胞：小鼠预处理10d后接种细胞，沿45°角注入腹腔，调好浓度的细胞悬液1~2×106/0.5ml/只，SP2/0细胞接种2只小鼠，每株杂交瘤细胞接种5只小鼠。
5）接种后观察：接种后1~5d，小鼠无明显不适，腹部膨胀也不明显；第6d腹部开始膨隆，之后必须每天观察小鼠腹水产生情况；7~12d后，当小鼠腹部膨胀且行动迟缓时抽取腹水。
6）腹水的处理：收集的腹水3000r/min离心10min两次，除去上层脂肪和下层细胞成分和其它的沉淀物，收集中间澄清腹水，测定抗体效价，分装，-70℃冻存备用。
3.3.8杂交瘤细胞的冻存
1）将杂交瘤细胞扩大培养，于收集前24h换一次液。
2）将细胞吹打悬浮均匀后，吸出100μl，10倍稀释后，取1滴计数细胞。其余加入50ml 离心管，1000r/min离心10min，弃上清。
3）用新鲜配制的细胞冻存液将细胞悬浮成5×106/ml~1×107/ml。
4）将细胞悬液混匀后，装入冻存管内，1ml/支，拧紧盖子，标明细胞名称及冻存日期，置冻存架上。
5）缓慢降温。将细胞冻存管放4℃ 0.5h，放-20℃ 4h，再放-70℃过夜，最后再转入液氮中。
3.3.9单克隆抗体的纯化[54]
3.3.9.1离心过滤法去脂
腹水用0.22μm孔径的滤膜过滤，除去较大的凝块和脂肪滴；过滤后的腹水经4℃ 12000g （约10000r/min）离心15min，弃去下层细胞残渣以及小颗粒物质，收集上清备用。
3.3.9.2protein A柱层析纯化
1）上层析柱前，所有配制的溶液都要经过过滤和曝气（超声20min）处理，腹水样品也要过滤，但不要曝气。
2）透析后的样品，以平衡缓冲液（0.02mol/L PB，pH7.4）稀释至5ml。
3）将Hitrip protein A柱（5ml）安装到蛋白纯化仪上，先用10 ml去离子水平衡，流速2ml/min。4）再以10倍柱体积的平衡缓冲液平衡，流速1ml/min。
5）将5ml稀释的腹水样品注射进上样环，用5~10倍柱体积的平衡缓冲液将样品结合到柱上，至图谱中基线走平。
6）再用5~10倍柱体积洗脱缓冲液（0.1mol/L 柠檬酸缓冲液，pH3.0）将样品从柱上洗脱下来，收集穿过峰和洗脱峰，洗脱峰用中和液（1mol/LTris-HCl，pH9.0）中和，迅速将洗脱液的pH调至7.2左右。
7）对收集到的各管进行SDS-PAGE凝胶电泳分析纯度及浓度差异，选择浓度和纯度高的液体，用超滤管浓缩，4℃10000r/min离心20min。
8）抗体保存：添加终浓度为0.1%叠氮钠和1%的BSA于-70℃长期保存。
3.3.10单克隆抗体的鉴定
3.3.10.1单抗效价测定和腹水中的蛋白质含量测定
采用间接ELISA法（同3.2.2）检测单抗效价，杂交瘤细胞培养上清和纯化后的腹水按一定稀释度稀释，以免疫小鼠血清为阳性对照，以SP2/0培养上清和制备的腹水以同等稀释度作为阴性对照。将腹水适当稀释，测280nm和260nm处的OD值，根据经验公式计算蛋白质浓度。
3.3.10.2单抗类型和亚类的测定
严格按照小鼠单抗Ig类和亚类鉴定用ELISA试剂盒的说明书进行。原理是利用双抗体夹心法鉴定小鼠淋巴细胞杂交瘤培养上清中单克隆抗体类和亚类（可区分出IgG1\IgG2a\IgG2b\IgG3\IgM\IgA）。采用小鼠抗体共有位点的二抗包被酶标板，与加入的培养上清中的小鼠抗体结合，再加入HRP标记的抗小鼠各类、亚类的抗体来分别反应，最后用TMB底物系统显色并用稀硫酸终止，再通过酶标仪检测吸光度来判断被测单克隆抗体的类或亚类。
以各杂交瘤细胞培养上清为样品，方法是将传代的杂交瘤细胞用DMEM不完全培养基培养24~48h，取1ml上清，置-20℃备用。此样品不含牛血清蛋白以及腹水中其他抗体和杂蛋白的干扰，最适合测定抗体类型和亚类。
3.3.10.3腹水抗体的纯度分析
采用SDS-PAGE对腹水抗体进行纯度分析，按《分子克隆实验指南》的方法[55]进行。蛋白样品与2×上样缓冲液等量混合，煮沸10min，取20μl加样。配制15%分离胶，5%浓缩胶，置于蛋白电泳仪中加样，按浓缩胶80V、分离胶100V的电压进行恒压电泳，待溴酚蓝距分离胶底部约0.5cm，约1.5h电泳结束，考马斯亮蓝R-250染色2~3h，脱色液脱色至背景无色为止，拍照。
3.3.10.4单抗的特异性鉴定
采用间接ELISA法测定McAb的特异性，以10μg/ml的OV A、BSA，以及20%（v/v）的猪血清、兔血清包被酶标板，检测OD450值应不大于0.2。
3.3.10.5单抗的稳定性分析
将6株杂交瘤细胞株液氮冻存一个月后复苏，传代培养后取上清测抗体效价，与未冻存前的细胞培养上清比较，以分析杂交瘤细胞株分泌单抗的稳定性。冻存前将最后一次的细胞培养上清分装入1.5ml离心管中，每株细胞装两支，每支1ml，置于-20℃冻存。于一个月后解冻并测其效价，也与与未冻存前的细胞培养上清比较，以分析单抗的稳定性。
多克隆抗体的制备（周期约35-40d）
1处理抗原
1.1抗原的获得
已经纯化的蛋白经过透析浓缩后，浓度控制在0.25-0.5mg/ml，分装在1.5ml的离心管中，500ul/管；
1.2抗原的乳化
取500ul的弗氏完全佐剂，与等量的抗原混合，装入乳化器中，混合至乳白色的均一相（约200-300来回）；
2动物（兔子）免疫
2.1初免
将乳化好的抗原装进注射器，背部皮下多点注射对兔子进行免疫；
2.2加强免疫
初免后2周（2-3周）对兔子进行第一次加强免疫（加强免疫时佐剂换为弗氏不完全佐剂），操作同上；第二次加强免疫与第一次加强免疫间隔1周（1-2周），操作同上；以此类推，直至抗体效价达到满意为止（一抗稀释度≥1000倍）；
3全血收集
采集前对兔子进行空腹处理（禁食6h），并对其称重。耳静脉注射3﹪戊巴比妥钠溶液（按照1ml/kg量计）后，绑定兔子。颈动脉插管后将血液流入干净的50ml离心管中，直至兔子死亡，收集全血体积约80-120ml；
4血清提取
全血采集后，在37℃条件下放置1-2h，然后转入4℃下过夜。第二天4℃条件下低速（Sigma 3-30K，5000rmp，5min）离心，收集上清（约为全血体积的30﹪-40﹪），分装到1.5ml离心管后保存于-80℃，并做好记录；
5蛋白A柱抗体IgG的纯化
5.1将3ml血清从-80℃冰箱取出，在冰上融化,用10mM PBS PH7.4（加NaCl）稀释为30ml,
0.22um滤膜过滤，并置于冰上。取80ul样品（记为S1），留作后面SDS-PAGE分析。
5.2安装装置，用双蒸水洗涤蛋白A柱，直到核酸蛋白检测仪显示为0。
5.3平衡：用泵将10mM PBS PH7.4抽到柱内洗涤柱子，调节流速使柱内液面保持不变，平
衡液体积为柱内填料体积的30ml。
5.4上样：将盛有已经稀释的血清的烧杯放置于冰上，用泵抽到柱内，当核酸蛋白检测仪有
读数时开始收集穿透液。取80ul穿透液（记为S2），留作后面SDS-PAGE分析。
5.5平衡：用泵将10mM PBS PH7.4抽到柱内洗涤柱子，平衡液体积为柱内填料体积的30ml。
5.6洗脱
①用0.1M柠檬酸（PH6.0）溶液洗脱柱子，待核酸蛋白检测仪有数据显示时收集
洗脱液，直至显示数据基本稳定时。0.1MTris PH9.0调节收集液的酸碱度为中
性。取80ul样品（记为S3），留作后面SDS-PAGE分析。
②用0.1M柠檬酸（PH5.0）溶液洗脱柱子，待核酸蛋白检测仪有数据显示时收集
洗脱液，直至显示数据基本稳定时。0.1MTris PH9.0调节收集液的酸碱度为中
性。取80ul样品（记为S4），留作后面SDS-PAGE分析。
③用0.1M柠檬酸（PH4.0）溶液洗脱柱子，待核酸蛋白检测仪有数据显示时收集
洗脱液，直至显示数据基本稳定时。0.1MTris PH9.0调节收集液的酸碱度为中
性（边调边收集）。取80ul样品（记为S5），留作后面SDS-PAGE分析。
④用0.1M柠檬酸（PH3.0）溶液洗脱柱子，待核酸蛋白检测仪有数据显示时收集
洗脱液，直至显示数据基本稳定时。0.1MTris PH9.0调节收集液的酸碱度为中
性（边调边收集）。取80ul样品（记为S6），留作后面SDS-PAGE分析。
5.7处理柱子：用30ml(约8倍柱体积)蒸馏水洗涤柱子，20﹪乙醇封柱后，4℃保存。
5.8分别关闭微型记录仪、核酸蛋白检测仪的电源开关，关闭蛋白A柱流水开关。加样泵
加样管中水排空，拧松螺旋使管的形状恢复，关闭电源。
5.9SDS-PAGE分析纯化效果
配制12﹪分离胶和浓缩胶，将收集的待分析的样品（S1、…S6）处理后（80ul样品＋20ul 5×Loading buffer.，煮沸10min）上样，电泳。结束后起胶、染色、脱色，观察抗体的纯化情况，拍照。
5.10分装储存：将分析后的目的成分进行Bradford法测其浓度，分装标记后存于-80℃冰箱。附：
20mM PBS PH7.4
0.1M NaH2PO419ml
0.1M Na2HPO481ml
NaCl 4.5g
溶解到800ml蒸馏水中，调节PH7.4，然后定容到1L，室温保存。
SP2/0细胞培养(悬浮细胞)
1. 培养基配方：
DMEM不完全培养基：DMEM粉（GIBCO）1袋，3.7g NaHCO3，用1mol/L HCl调pH至7.2-7.3，加灭菌超纯水定容至1000ml。0.22μm滤膜过滤除菌至1L试剂瓶中，4℃保存。
胎牛血清（FBS）（GIBCO）的灭活：56℃，灭活30min，分装100ml或50ml一瓶，-20℃冻存。
10%FBS完全培养基：FBS 10ml，DMEM不完全培养基90ml，三抗溶液1ml，4℃保存。
冻存液：完全培养基:DMSO=9.2:0.8，即含8%DMSO的完全培养基，与培养过程中使用的血清保持一致，需新鲜配制。
2. 细胞传代：
根据镜检细胞情况，一般按照1：4传代。培养基在37℃预热。
(1) 直接法传代：向原T25细胞瓶中加入新鲜完全培养基12ml，用弯头滴管多次吹吸，使细胞从细胞瓶壁上脱落下来，并吹匀，每个T25细胞瓶4ml细胞悬液，37℃ CO2培养箱中培养2~3天再次传代。
(2) 离心法传代：用弯头滴管多次吹吸原T25细胞瓶壁上的细胞，使细胞从细胞瓶壁上脱落下来，并吹匀，将细胞悬液吸入15ml离心管中，封口，离心（900rpm，5min）去上清，沉淀物加新培养液12ml后再混匀按照1：4传代。每个T25细胞瓶3ml，再补加1ml新鲜培养液，37℃ CO2培养箱中培养2~3天再次传代。
(3)换液：将T25细胞瓶立起，让SP2/0细胞沉降下去，吸弃T25细胞瓶中的上清培养基1/2-2/3，加入新鲜完全培养基补足到4ml，用弯头滴管多次吹吸，使细胞从细胞瓶壁上脱落下来，并吹匀。
BmN细胞（家蚕卵巢细胞）培养(半悬浮或微贴壁细胞)
1. 培养基配方：
TC-100不完全培养基：TC-100粉22.09g，0.35g NaHCO3，用1mol/L NaOH调pH至6.0-6.2，加灭菌超纯水定容至1000ml。0.22μm滤膜过滤除菌至1L试剂瓶中，4℃保存。
胎牛血清（FBS）（四季青）的灭活：56℃，灭活30min，-20℃冻存。
15%FBS完全培养基：FBS 15ml，DMEM不完全培养基85ml，三抗溶液1ml，4℃保存。
冻存液：完全培养基:DMSO=9.2:0.8，即含8%DMSO的完全培养基，与培养过程中使用的血清保持一致，需新鲜配制。
2. 细胞传代：
根据镜检细胞情况，待培养皿长满90%以上，一般按照1：2或1：3传代。培养基在27℃预热。
(1)直接法传代（1：2传代）：吸弃60mm培养皿中的培养基，加入2ml的完全培养基，用1ml枪头以直接吹打法多次吹吸，使细胞完全从细胞瓶壁上脱落下来，并吹匀。取1ml 细胞悬液于新60mm培养皿中，原皿和新皿各补加新鲜培养基2ml，将培养皿转入27℃培养箱中培养，3天后再传代。
(2) 直接法传代（1：3传代）：吸弃60mm培养皿中的培养基，加入3ml的完全培养基，用1ml枪头以直接吹打法多次吹吸，使细胞完全从细胞瓶壁上脱落下来，并吹匀。各取1ml细胞悬液于两个新60mm培养皿中，原皿和新皿各补加新鲜培养基2ml，将培养皿转入27℃培养箱中培养，4~5天后再传代。
人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y
一、复苏方法（去DMSO）
材料和试剂准备
1. 细胞：SH-SY5Y；
2. 试剂：SY5Y培养基（含10％小牛血清）
3. 仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶T25、吸管5mL&1mL&200uL、废液缸、15mL
离心管；
4. 实验前准备：将SY5Y培养基（含10％小牛血清）于37 ℃水槽中水浴。
操作步骤
1．取出冷冻管后，须立即放入37 ℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。
2．用70％酒精擦拭消毒后，净化台上打开盖，用吸管吸出细胞悬液，装入15mL离心管中，再补加5ml SY5Y（含血清）培养液。
3．低速离心900转/分5分钟，弃上清，再加5mL SY5Y（含血清）培养液至15mL离心管中，轻柔吹打使细胞使悬浮。
4．移装入T25培养瓶中，置温箱37°C培养。
二、培养及换液
24h后，观察细胞的生长状况；
48h后，若细胞培养液变黄，更换细胞液；
换液，即吸弃旧培养液，加入新的5mL培养液；
换液24h后，若细胞铺满培养瓶的70%-80%，可进行传代；
三、传代
材料和试剂准备
材料和试剂
1. 细胞：SH-SY5Y
2. 试剂：0. 5％胰酶、SY5Y培养基（含10％小牛血清）、Puck’s with EDTA；
3. 仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶T25、吸管5mL&1mL&200uL、废液缸、15mL
离心管等
4. 实验前准备：将SY5Y培养基（含10％小牛血清）& Puck’s with EDTA于37 ℃水槽中水
浴；Trypsin置于冰盒上；
操作步骤
1. 吸除培养瓶内旧培养液。
2. 向细胞瓶内加入Puck’s with EDTA 1mL，0.5%胰酶 50uL，轻摇细胞瓶混匀。
3. 置温箱中3分钟，当发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化，加入5mL SY5Y
培养基（含10％小牛血清）。
5. 用5mL吸管轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。
6．再加入9mL SY5Y培养基（含10％小牛血清），混匀后，分装3瓶，每瓶5mL或计数板计数后，再加入适量的再加入SY5Y培养基（含10％小牛血清），混匀后把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中，置温箱中培养。
无菌操作注意事项
1. 操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦
试。
2. 细胞长得比较慢，一般4-5天传一次代，但要常常观察，若培养液变酸要及时换液。
3. 操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。
4. 不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。
5. 瓶子开口后要尽量保持45℃斜位。
6. 吸溶液的吸管等不能混用。
四、冻存
1. 细胞：SH-SY5Y
2. 试剂：0. 5％胰酶、SY5Y培养基（含10％小牛血清）、Puck’s with EDTA；
3. 仪器和器材：倒置显微镜，细胞专用冻存盒、吸管5mL&1mL&200uL、废液缸、15mL
离心管、DMSO；
4. 实验前准备：将SY5Y培养基（含10％小牛血清）& Puck’s with EDTA于37 ℃水槽中水
浴；Trypsin置于冰盒上；
操作步骤
1.细胞准备：选对数生长期细胞，收集细胞24小时前换液一次。
2.按常规方法把细胞制成细胞悬液，吸入离心管中，离心去上清。
3．冻存液：用该细胞培养液适量（3mL）吸管轻轻吹打令细胞重悬，后一滴滴加入DMSO 330ul。（按90%培养液+10%DMSO比例，视细胞数而定适量增减）
4.分装：分装入无菌安剖中，每安剖加1.3毫升细胞悬液。
5.封口：用塑料安剖时拧紧瓶口即可；
冻存方法
冷冻保存方法一: 冷冻管置于4℃ 30~60 min→ -20 ℃ 30 min（*-20 ℃不可超过1 h，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过）→ -80 ℃ 16~18 h(或隔夜) →液氮槽
vaporphase 长期储存。
冷冻保存方法二: 冷冻管置于细胞专用冻存盒直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。1天后，再放入液氮槽vapor phase长期储存。
肾上腺嗜铬细胞瘤pc12
PC-12细胞是一个常用的神经细胞株。
来源：Rattus norvegicus (褐家鼠) 肾上腺嗜铬细胞瘤（一种交感神经系统的肿瘤）
形态：多角型细胞生长特性：贴壁较松，容易成团；
注释：PC-12细胞株来源于一种可移植的鼠嗜铬细胞瘤，该细胞对神经生长因子（NGF）有可逆的神经元显形反应，该细胞不合成肾上腺素。
培养液：C6+10%FBS。
传代：吸去培养液。加入新的培养液，用吸管吹下细胞或用手拍打培养瓶或刮下细胞到培养液中，用移液器把细胞吹散。加适量的细胞到新的培养器皿中。（以1：2为宜，传代期间2-3天更换培养液）
冻存：90%培养液+10%DMSO冻存于液氮。
PC12细胞来源大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤,广泛用于神经系统疾病的体外研究。
大/小鼠脑细胞
来源：大/小鼠脑细胞
形态：神经细胞小,突起多而不规则；贴壁较牢；
培养液：C6+10%FBS。
传代：吸去培养液。加入新的培养液，用吸管吹下细胞或用手拍打培养瓶或刮下细胞到培养液中，用移液器把细胞吹散。加适量的细胞到新的培养器皿中。（以1：2为宜，传代期间3-4天更换培养液一次）
冻存：90%培养液+10%DMSO冻存于液氮。
免疫荧光操作步骤及注意事项
免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。 由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤：
TjpgDec技术手册
TjpgDec技术手册 -------R0.01b版 前言 相信大家对FATFS文件系统都不陌生了，2012年FATFS的作者推出了JPG/JPEG图片的解码函数库TJpgDec的R0.01b版，使用方法和FATFS文件系统的使用一样，仅仅调用2个简单的库函数就能完成对JPG/JPEG图片的解码，而且输出的数据格式为RGB888或RGB565。 本文档是根据ChaN的专用网页提供的英文版技术手册翻译而来，因个人水平有限以及时间仓促，错误之处在所难免。本文档原始版权归TJpgDec的作者所有，本人只是做了一下翻译的工作，把这篇文档献给所有嵌入式开发人员，希望能够帮到你们。 嵌入式奋勇前进 2013-10-20
一．前言： TJpgDec是一款为小型嵌入式系统服务的高效且完善的JPEG图片解码模块。它占用内存极少，因此可以移植入像AVR,8051，PIC,Z80，Cortex-M0等等小型单片机中。 二．特点： ?库函数是按照ANSI-C规范编写的，所以应用平台不受 约束。 ?易于使用的主模式操作方式。 ?完全可重入的架构。 ?非常小的内存占用： o RAM仅占用3KB，而不受图片大小的影响。 o ROM 占用3.5-8.5KB，主要用于存储代码和const 常量。 ?输出格式: o输出图片比例: 1/1, 1/2, 1/4 ，1/8 可选 o输出像素格式: RGB888/RGB565（可预设） 三．应用程序接口： 共有2个应用程序接口函数，用于分析和解码JPEG图片（译者注：移植TJpgDec时需要在主程序中调用这两个库函数） ?jd_prepare –为解码一个JPEG图片做准备 ?jd_decomp –解码JPEG图片 四．I/O接口函数： TJpgDec需要用户自定义2个I/O接口函数，用于输入JPEG数据和输出解码后得到的像素数据。 ?Input funciotn - 从输入的数据流中读取JPEG的数据 ?Output function –把解码后得到的像素数据发送到输出设备 五．备注说明： TJpgDec应用模块是一款可用于教育和研发的开源软件。你完全可以根据自己的项目需要或者商业产品的需要，自由更改本软件，而不用担负任何个人责任。 六．ChaN的个人网页：（即TjpgDec库函数下载地址）https://www.360docs.net/doc/373657335.html,/fsw/tjpg/00index.html 注：其他信息，如各版本信息，在此不作翻译了。
免疫荧光操作步骤及注意事项
免疫荧光操作步骤及注意事项 免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术(比如流式细胞仪)测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透(或称为透化)、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备(通俗的说法是细胞爬片)是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片(Slides or Coverslips)的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法(如ELISA或Western Blot)中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4?或-20?避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。
由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤: (1) 细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次;对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤(1000rpm,5min)2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 (2) 固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4?保存3个月。PBS洗涤3×5 min. (3) 通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min. (4) 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min. (5) 一抗结合。室温孵育1h或者4?过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min. (6) 二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。 (7) 封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。 (一)细胞准备 用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。贴壁良好
细胞免疫荧光步骤
创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王* 方法一： 1.首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片） 2.然后在4％PFA里面室温下固定30分钟，PBS洗两次，0.1% TX-100室温下作用1 －2分钟使细胞膜通透。 3.接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿） 里面，放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。 4.剪一片合适大小的parafilm，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS中的一抗（稀释倍数 依具体抗体而定），每个玻璃片30ul足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PBS里洗三次。 5.接下来二抗孵育步骤同上。 6.最后，在载玻片加上mounting medium（大约每个玻璃片加10ul），把玻璃片放上 去（细胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。 7.抗体很重要，不能有非特异性结合。你可以先做WB检测一下你的抗体，看看有没 有杂带。 8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法 合适）。如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。 方法二： 1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则 是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。 2.我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔 细摸索，我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。
免疫荧光方法
（2）实验方法 （1）用PBS浸洗准备好的细胞涂片3次，每次3min。 （2）0.1%的TritonX-100（用PBS配制）处理涂片5-10min。 （3）PBS洗净载玻片上的TritonX-100，加0.1%的牛血清白蛋白BSA溶液(用PBS 配制)孵育固定好的细胞30min。 （4）弃去BSA，滴加0.1%BSA稀释的一抗(1:200)，即软骨多糖诱导48hH22细胞免疫的小鼠血清，免疫湿盒中4℃过夜。同时用正常小鼠血清作对照。 （5）用PBS浸洗细胞涂片3次，每次3min，以确保一抗清洗彻底。 （6）避光条件下滴加BSA稀释的荧光标记的山羊抗小鼠IgG二抗(1:200)，然后室温、暗室中孵育1.5-2h。 （7）PBS洗净荧光二抗，用荧光显微镜观察。 为了防止由于一抗未洗净带来的假阳性现象，实验中同时设置一组阴性对照，涂片染色操作步骤同上，把一抗换成PBS。 3.4.1.1免疫荧光染色法检测抗原、抗体结合情况将H22鼠肝癌细胞制成细胞涂片，分别以空白组小鼠血清、模型组小鼠血清和免疫组小鼠
血清为一抗，经荧光二抗染色后得到免疫荧光检测结果，并计算各组细胞的阳性表达率，结果如图3-1所示。 (a) (b) (c) (d)*P<0.01vs模型 组,#P<0.01 vs空白组图3-1免疫荧光染色法检测抗体生成 Fig.3-1 Theimmunofluorescent staining for antibody test图3-1中(a)、(b)、 (c)一抗分别为空白组小鼠血清、模型组小鼠血清、免疫成功小鼠血清， (d)为免疫荧光阳性表达率。从图3-1中可以看出，一抗为空白小鼠血清的荧光极弱，一抗为模型组小鼠血清的荧光仍然不强，而一抗为治
施工工艺(建筑工程技术指导手册)
建筑工程技术指导手册 1 总则 1.1农村危房改造重建要以保证困难农户重建房屋质量，保护困难农户生命财产安全，改善困难农户居住条件为基本原则，贯彻执行国家法律、法规及相关的标准规范。 1.2服从村庄、集镇、建制镇总体规划和建设规划，注重将农房改造重建与村庄整治、人居环境改善相结合。 1.3农村危房改造重建，要因地制宜采用合格的建筑材料，鼓励应用节能环保型的新技术、新材料、新工艺。 1.4本指导手册主要用于农村困难农户翻建新建二层（含二层）以下的自用住宅及附属用房。 2房屋选址 2.1新建房屋选址要符合规划要求。符合规划的建房户应尽量利用原宅基地恢复建设。有条件的地方，择址新建的房屋应与生态建设紧密结合，不占或少占耕地。 2.2房屋选址应选择稳定基岩，坚硬土，开阔平坦、密实、硬度均匀稳定的有利地段建房。避开活动断层和可能发生滑坡、山崩、地陷、非岩质的陡坡，突出的山嘴，孤立的山包地段，避开饱和砂层、软弱土层、软硬不均的土层和容易发生砂土液化的地段。 2.3选择向阳、通风良好的地段，避开风口和窝风地段。 2.4拟建房屋不能占压地下管线，应与各类电力线路保持安全距离（其中1千伏以下不小于4米，4千伏以下不小于6米），否则必须报告电力线路管理部门采取安全防护措施。 3房屋的建筑设计 3.1房屋建筑设计应围绕使用功能兼顾周围环境，鼓励建房人员采用本地区农房设计通用图集及新技术建设农房。 3.2房屋建筑设计体现以整体环境为中心的设计理念，兼顾农村地方特色，做好房屋外部环境的整体空间布局，处理好户外交往空间，要在保护、节约耕地
的前提下做到以实用为主，采取多种单元类型，系列化拼接，注意房屋建筑节能措施的实施和使用节能建材。 3.3房屋功能布局要做到生产功能与生活功能区分，实行人畜分离，采用科学合理的农村房屋家居功能模式。 3.4在建筑结构设计中要使用成熟的节能体系和节能环保建材；计算各结点承载力；确定窗墙比；提高门窗保温隔热性能和气密性；合理选择朝向；综合利用新能源、可再生能源。 3.5对主要持力层范围内存在软弱粘性土层的地基，应设置钢筋混凝土圈梁或进行地基加固处理。 3.6 在抗震设防地区，要充分考虑抗震设防要求；在雷区应考虑防雷设防要求。 4基础工程 4.1基础地基选择 4.1.1 基础持力层应落在中硬土以上地质均匀的老土层上，基础埋深不少于500毫米。 4.1.2 当基础地基出现软硬不均时，对软土部分进行处理，挖成台阶型，使地基持力层土质相对均匀一致。 4.1.3 当基础持力层落在斜面岩层上时，基槽应挖成台阶型并应有镶固，防止基础滑移。 4.1.4 在坡顶建房，基础应距边坡一定距离，具体视地质情况定。当边坡角大于45°、坡高h大于8米时，应请专业技术人员进行边坡稳定性验算，防止圆弧滑动。对于稳定的边坡，基础底面外边缘线至坡顶水平距离L不得小于2.5米。如所建房屋临近边坡底部，在确保边坡安全稳定的情况下，也应与边坡保持一定距离。 4.2毛石基础施工 4.2.1 砌筑毛石基础的第一皮石块时，基底应用高强度等级的砌筑砂浆找平坐浆，石块大面向下，并选择比较方正的石块砌在各转角处。 4.2.2 应根据石块自然形状交错位置，尽量使石块间缝隙最小，然后将砂浆填在空隙中，并且铁钎插捣密实。严禁采取先放小石块后灌浆的放法。 4.2.3 基础最上一皮石块，宜选用较大的毛石砌筑。基础的第一皮及转角处、交接处和洞口处，应选用较大平毛石砌筑。 4.2.4 毛石基础的转角及交接处应同时砌筑。如不能同时砌筑又必须留槎
细胞免疫荧光实验步骤
细胞免疫荧光实验步骤 细胞免疫荧光实验步骤 简单实验步骤如下: 1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时. 2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟 3.PBS洗净:3min＊3 4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS 5.PBS洗净:2＊5min 6.羊血清封闭：３７度，２０分钟 ７.一抗，４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度１－２小时 ８.４度PBS洗净，３min＊５次 ９.二抗３７度小于一小时 １０.３７度PBS洗净，３＊５min 凉干封片（封闭液ＰＨ８.５） 活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备 （一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、 胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法) ↓ 用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为 5×10６～１×10７／ml ↓ 取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl) 的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS 稀释)灭活正常兔血清 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右 1000rpm×5min
↓ 弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠 (或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右 1000rpm×5min ↓ 加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入 1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察， 视细胞浓度加入100～500μl固定液) ↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察 (标本在试管中可保存5～7天) （二）试剂和器材 1. 各种特异性单克隆抗体。 2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。 4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。 （三）注意事项 1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN ３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。 3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。 4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。 附: 1. DPBS (×10, 贮存液)
防水工程技术手册
防水工程技术手册（2015版－1） 设计工程部
目录： 第一部分：总说明 第二部分： 第一节：屋面露台防水部分（设计要求）——————————————————第05页第二节：屋面露台防水部分（施工要求）——————————————————第10页第三节：墙面防水部分（设计要求）————————————————————第20页第四节：墙面防水部分（施工要求）————————————————————第24页第五节：厨卫防水部分（设计要求）————————————————————第29页第六节：厨卫防水部分（施工要求）————————————————————第29页第七节：门窗及幕墙防水部分（设计要求）—————————————————第30页第八节：门窗及幕墙防水部分（施工要求）—————————————————第32页第九节：地下室防水部分（设计要求）———————————————————第33页第十节：地下室防水部分（施工要求）———————————————————第37页第三部分：具体案例分析
第一节：常见案例分析——————————————————————————第38页第二节：特殊案例分析——————————————————————————第47页第四部分：相关项目实施大样 第一节：常见部位大样——————————————————————————第50页第二节：特殊部位大样——————————————————————————第56页第三节：施工流程大样——————————————————————————第58页 第一部分：总说明 1总说明 防水工程的设计及施工应遵循“防、排、截、堵相结合，刚柔相济、因地制宜，综合治理的原则”，做到先排后防，即首先不能有积水，要将水在短时
免疫荧光双标法
免疫荧光双标记在心肌石蜡切片中的应用 陈绪军肖明第吕志前卢成宝薛松袁忠祥徐根兴 作者单位：200080 上海市第一人民医院心血管外科 细胞性心肌塑型术（cellular cardiomyoplasty）用于缺血性心肌病的治疗受到人们越来越多的关注［1］，在证实移植的人干细胞在缺血/损伤的环境中分化为人心肌细胞方面，免疫荧光技术的运用逐渐增多，但多用的是新鲜冰冻切片，在石蜡心肌切片中应用较少，而且多是单一抗原的荧光标记［2］。有研究表明，酪胺信号放大( tyramide signal amplifications, TSA)技术可以提高反应的灵敏性［3］。为此，我们以人心肌石蜡切片标本为例，运用TSA－免疫荧光法与常规间接免疫荧光法分别对人心肌连接蛋白(connexin-43，Cx-43)蛋白及肌凝蛋白（myosin）进行标记，旨在为心肌石蜡切片建立一个免疫荧光双标记的方法。 一、材料与方法 1. 主要试剂：兔抗人肌凝蛋白（myosin）多克隆IgG抗体购自美国Chemicon 公司，标记异硫氰酸酯荧光素（FITC）的驴抗兔多克隆IgG抗体与标记有辣根过氧化物酶（HRP）的驴抗小鼠多克隆IgG抗体均购自美国Jackson Immunity 公司, 小鼠抗人Cx-43单克隆抗体、碘化丙啶(PI)与牛血清白蛋白（BSA）购自美国Sigma 公司，酪胺 (tyramide)-coumrian 结合物试剂盒购自美国PerkinElmer公司。 2．标本的取材、固定、切片及抗原修复: 人心肌取自一例6岁先天性心脏病小孩右房耳，中性福尔马林固定，4°C过夜固定，梯度酒精脱水，石蜡包埋，5 μm石蜡切片。石蜡切片常规脱蜡、梯度酒精浸泡后行抗原修复：浸入0.01 mol/L的柠檬酸缓冲液(pH 6.0)中，95℃，浸泡30 min, 室温冷却10 min。 3．Cx-43的免疫荧光标记：采用TSA-免疫荧光法［4］，按试剂盒说明书进行。磷酸盐缓冲液（PBS）室温洗涤2次，每次5 min。置入3% 过氧化氢/甲醇溶液中，室温，孵育10 min。再室温PBS洗涤3次，每次5 min。 3%的BSA室温孵育30 min。加入小鼠抗人Cx-43单克隆IgG抗体，4℃孵育过夜。TnT缓冲液（0.1 mol/L Tri-HCI, pH 7.5, 0.15 mol/L NaCl, 0.05% 吐温-20）室温洗涤3次，每次5 min。加入标记有HRP的驴抗小鼠IgG抗体，室温孵育1 h。TnT液室温洗涤3次，每次5 min。配制酪胺-coumrian 工作液：将酪氨-coumrian 结合物加入放大缓冲液中配成酪胺-coumrian 工作液（1∶50），避光，室温孵育15 min。再次TnT液洗涤3次。 4． Myosin的免疫荧光标记：接上一步。采用间接免疫荧光法［5］。兔抗人肌凝蛋白多克隆IgG抗体（1∶20）， 37°C孵育1 h，PBS洗涤3次。加入标记FITC的驴抗兔多克隆IgG抗体(1∶100)，避光，室温孵育1 h。PBS室温洗涤3次，每次5 min。 5．PI染细胞核：加入碘化丙啶（PI/PBS，1 μg/ml），室温避光孵育3 min。PBS室温洗涤3次后甘油封片。 6．荧光显微镜观察：运用带有3通道的AX-80型Olympus 荧光显微镜镜检：绿通道中观察FITC信号；蓝通道中观察coumrian信号；红通道中观察PI信号。图像的编辑采用Advanced SPOT 软件。 二、结果 在3通道的AX-80型Olympus 荧光显微镜中红、绿、蓝通道中分别可以观察到PI、FITC 及coumrian的信号，再经Advanced SPOT 软件叠加得到图1~4，红色代表PI标记的人心肌细胞核，绿色代表FITC标记的人心肌肌凝蛋白蛋白，蓝色为coumrian标记的人心肌Cx-43蛋白。图1显示为未加myosin抗体而加Cx-43抗体的人心肌石蜡切片; 图2中均加myosin 抗体与Cx-43抗体; 图3中加myosin抗体而未加入Cx-43抗体；图4均未加入 myosin抗体与Cx-43抗体。 三、讨论 1.心肌石蜡切片的免疫荧光双标记：在本研究中，图1与图2相比，人心肌石蜡切片中，不加myosin抗体的心肌纤维不着色，而加了myosin抗体的心肌纤维呈绿色，这表明心肌纤维被成功地标记上抗人myosin抗体，而且特异性高。Cx-43蛋白位于心肌细胞的周围，在本研究中由图1、图2与图3可以观察到，加Cx-43抗体的人心肌Cx-43蛋白呈
EtherCAT技术手册
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免疫荧光技术的实验方法及其分类模板
免疫荧光技术的实验方法及其分类 一、免疫标记法及其分类 1.荧光免疫法 原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。底物用磷酸-4-甲基伞形酮, 检测产物发出的荧光, 荧光强度与Mb浓度呈正比, 可在 8min内得出结果。结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。该法重复性好, 线性范围宽, 具有快速、敏感、准确的特点。 以双抗夹心法为例, 首先将特异性抗体与固相载体连接, 形成固相抗体。除去未结合抗体, 然后加受检标本, 使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。洗涤除去未结合物, 接着加入荧光标记的抗体, 使之与抗原特异性结合, 形成抗体—抗原—抗体复合物。最后根据荧光强度, 即可对蛋白抗原进行定量。 传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大, 时间分辨荧光免 疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕, 作为标记物, 加入正常液后激发测定, 能有效去除短寿命本底荧光的干扰。 2.放射免疫法
放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原, 竞争性地与抗体结合, 形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物, 并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。然后经过离心沉淀等方法, 将抗原—抗体复合物与游离抗原分离, 分别测定其放射性强度与标准曲线比较, 即可对未标记的待测抗原进行定量。 RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强, 可准确定量到 ng/ml水平。但早期的方法操作麻烦, 耗时长, 且有放射性污染。近年来, 随着单克隆抗体的应用, RIA的灵敏度又有了较大提高, 且操作大为简化, 并已有商品试剂盒供应, 使用方便。 3.酶联免疫法(ELISA) ELISA法有竞争法和夹心法两种。竞争法是基于标准或血清Mb和微孑L板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立, 该法的最低检测限为10μg/L, 线性范围达1 000ug/L。夹心ELISA法与EIA具有良好的相关性(r=0.92)。ELISA法具有灵敏度高, 特异性强, 精密度好, 操作简单, 适用于多份标本的检测, 不需特殊仪器设备等优点, 易于推广普及。但不适合急诊的快速检测。
免疫荧光实验步骤大全(精华版)
免疫荧光染色大全（精华版） 组织免疫荧光法 （1）将待染组织切片置于65摄氏度恒温箱烤片1h，脱蜡 （2）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （3）0.5%Triton X-100（PBS 配制）室温通透 10min （4）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 注意：步骤（3）和（4）用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原直接跳过此步骤（5）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火3min，后转成低火 15min。 （6）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （7）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。 （8）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （9）使用1% BSA进行室温封闭 30min，用于封闭非特异性抗原表位。 （10）按抗体推荐使用说明书孵育特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜。（11）次日取出切片，室温下复温 30min。 （12）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （13）选取相应的免疫荧光二抗滴加于血管组织上，37°C避光孵育30min。（14）1×PBS洗涤 3 次，每次 5min。 （15）避光条件下，DAPI 染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用（16）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （17）在血管组织上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。 （18）使用荧光显微镜进行观察拍照。 贴壁细胞免疫荧光法 （1）在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3min （2）4%多聚甲醛固定细胞爬片15min （3）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （4）0.5%Triton X-100（PBS配制）室温通透10min （5）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （6）1%BSA室温封闭30min （7）弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜（8）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （9）细胞爬片滴加稀释至适当比例的荧光二抗 （10）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （11）DAPI染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用 （12）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （13）用抗荧光淬灭剂封片 （14）荧光显微镜下观察采集图像 细胞免疫荧光（悬浮细胞方法一） （1）收集悬浮细胞，细胞在冰浴中冷却，然后用台式离心机于4℃以800 g 离心5 min，吸去培养液并以4℃ 1×PBS重悬细胞。
公司工程技术资料管理手册
榆林神华能源有限责任公司 工程技术资料治理方法 (试行） 第一章总则 第一条为规范矿、土、安工程技术资料（以下简称资料）治理，提高工程质量治理水平，统一资料验收标准，建立完整、准确、规范的工程档案，依照《中华人民共和国建筑法》、《建设工程质量治理条例》、《建设工程文件归档整理规范》及国家、地点和神华集团现行有关法律、法范、规范、标准和规定，结合公司实际情况，制定本方法。 第二条本方法适用于榆林神华能源有限责任公司新建、改建、扩建的矿、土、安三类工程及其配套工程资料的编制、治理。参与工程建设的有关单位均应执行本方法。 第三条本方法与国家、地点及神华集团公司现行的法律、法规、规范、标准及规定相抵触的，执行国家、地点及神华集团公司的相关要求。 第二章参建方责任 第四条资料形成责任单位应对资料内容的真实性、完整性、有效性负责；由多方形成的资料，要各负其责。
第五条参与工程建设的有关单位应将资料的收集和整理纳入工程建设治理的各个环节及有关人员的职责范围。 第六条建设单位对工程预备时期、竣工验收时期形成的资料进行收集、整理和立卷，同时组织、监督和检查其他参与工程建设有关单位的资料形成、积存和立卷工作，并负责工程档案的归档。 第七条监理单位应按施工进度对施工资料的收集、整理及资料的完整性、准确性进行检查和审核。 第八条施工单位负责资料的收集、整理和立卷归档工作。 施工单位应建立健全内部工程技术资料治理体系，实行企业技术负责人负责制。工程项目的资料收集整理应由专人负责。施工单位资料员应在项目部技术负责人的指导下，负责资料督促收集、整理归档工作。资料员应严格按照《建筑工程资料归档规范》的要求，切实履行岗位职责，认真做好工程资料收集整理、立卷归档工作，不得代替他人编写工程施工资料。 实行总承包的工程项目，总承包单位负责汇总整理各分包单位的资料，并编制全部资料。分包单位应对各自分包项目的资料进行收集整理。在分包工程验收合格后，将施工资料及时移交总承包单位。
不用爬片的免疫荧光实验方法-雷萌生物
【ibidi--focus on cells】通道载玻片--新的免疫荧光方法 细胞的免疫荧光实验是一个基础的细胞实验，传统的方法是在培养板中放入预先处理好的盖玻片，待细胞贴壁后，使用镊子将盖玻片拿出再开始进行固定，染色等系列工作。 现在分享一种简便的免疫荧光方法，无需爬片，培养-操作-镜检，在一个培养皿/载玻片上完成所有工作！一气呵成！ 使用如图的培养皿和载玻片，免疫荧光步骤将简化为： 1.直接细胞培养 2.冲洗玻片/培养皿 3.固定细胞 4.冲洗玻片/培养皿 5.染色 6.冲洗玻片/培养皿 7.冻存液处理细胞 8.直接镜检观察 免去了指甲油封片的传统免疫荧光方法中的冗长步骤： 1.无需对盖玻片和载玻片消毒灭菌 2.无需对盖玻片进行包被 3.无需等细胞爬片 4.无需指甲油封片 之所能如此简便完成免疫荧光实验，是因为这些ibidi培养皿和载玻片的底部为特殊处理的材质，绝大多数细胞可以直接贴壁生长，而不需要另外包被。同时，这些耗材的底部薄如盖玻片，可以直接使用倒置显微镜进行观察，得到高质量的成像，适用于高端显微镜比如共聚焦显微镜。 成像效果：
下面再分享一种极致的免疫荧光方法，不仅更加简化实验步骤，而且可以节约试剂和细胞，同时还能得到更出色的成像效果。 如图的ibidi通道载玻片，简单快速完成免疫荧光实验。 步骤：培养-固定-染色-镜检，只需在这个载玻片上进行4个步骤，免疫荧光实验轻松完成~ 优点总结： 1、节约细胞和试剂 ibidi通道载玻片里的通道只有400μm高，以μ-slide VI为例，通道的容积只有30μl，而普通8well的腔式载玻片一个孔的容积有300μl。这意味着通道需要的试剂和细胞量仅需约十分之一！对于非常珍贵的细胞和试剂来说，这可是非常重要的。 2、成像效果好 使用通道载玻片时，能在相差显微镜下获得更好的成像效果。因为通道上下都是平坦的，不会因为凹液面的折射现象影响到相差显微镜成像。而well式的开放小室的相差成像会受到培养皿盖和液面的折射现象影响。
施工技术资料整理大全.pdf
施工技术资料整理大全 为了使工程建设施工期间，施工技术资料的填写统一、规范，对各种表格的填报及注意事项加以说明。 一、该“格式”中未列但实际施工中又必须使用的表格，可由施工单位自制，但须报经业主、监理代表处批准。对各类表格表头部门、主体部分填写要求说明如下： 1、表头部分填写： （1）项目名称或建设项目：指安阳至新乡高速公路改建工程。 （2）合同号：指标段号。 （3）工程部位：指桩号、层数、墩台号、孔号等。 （4）工程名称：指单位工程名称或分部工程名称。 （5）施工单位：指该合同段施工单位的全称或规范简称。 （6）监理单位： 2、签字部分填写： （1）试验、检验：填试验者或检验者本人姓名。 （2）计算、记录：计算结果者或记录数据者本人姓名。 （3）复核和审核：应由复核和审核人员分别签字，复核和审核人员不能为同一个人，且不能和试验（检验）、计算（记录）为同一个人。 （4）日期：填试验或检验当天日期。 （5）试验单位：指试验者所属，经交通行政主管部门批准具有试验室临时资质的单位全称，并加盖与该全称相符的公章。
（6）试样编号：指对试样进行分类编号和试验台帐对应便于查阅。 （7）取样地点：指取样的具体位置。 （8）试样说明：指试样的类型及特征。 3、表中主体部的填写： （1）应将试验、检测数据如实填在规定的格内或栏内。其中各项检测结果的计算及数据应符合有效数字的规定，测试结果应符合试验规程规定的精度或允许差的要求。计量单位要与表中规定的保持一致。 （2）如填写有误，应重新填写，不得涂改。 二、工程报验单及工程检验认可书 1、工程报验单应由施工单位在每道工序完工后，下道工序开始前，经自检合格后填写，并报监理认可。监理抽检合格后签署意见，并准许下道工序开始施工。工程报验单中“现场监理一栏”由现场旁站监理填写检验结果；“项目监理工程师意见”一栏由项目监理工程师写明是否允许进入下道工序施工。 2、报验频率： （1）路基土石方（包括清表、填前碾压）施工，应按施工段分层报验。 （2）排水工程、砌筑工程，应按施工段分工序报验。 （3）涵洞施工，应按不同工程部位分工序报验，实际施工中若有一道工序须分段、分项施工的（如基础砼的浇筑等），应按施工批次分别报验。涵洞盖板预制（包括其它小型预制件），应按浇筑批次分工序分别报验，若有一个批次的涵洞盖板用于不同涵洞施工的，应分别报验。
免疫荧光染色
荧光免疫染色和DAPI染色实验 1．实验原理 免疫染色的实验原理类似于Western Blotting，两者都是运用抗体的特异性识别作用来显示目的蛋白，但是由于免疫染色需要在原位进行，而且蛋白没有经过富集，因此其实验难度较高。 实验的基本原理是：利用固定剂（通常是甲醛或多聚甲醛）将细胞固定，使得细胞膜的通透性大大增加，并且利用Triton-X-100使得一部分膜蛋白变性，从而使通透性进一步加强。利用正常羊血清封闭，可以令许多蛋白先与血清内的非特异性抗体结合，而特异性的抗体由于动力学的关系可以通过竞争性的反应与目的蛋白结合，这一过程可以保证抗体识别的特异性。二抗可以特异性识别一抗的Fc区域，利用二抗连接不同的荧光基团，就可以在荧光显微镜下观察到不同的荧光，从而显示目的基因的表达情况。 另外，免疫荧光实验由于其较高的敏感性可以显示出基因表达的亚细胞情况(核内，核外，膜上以及一些较大的细胞器上)，所以通常被用来作为基因定位的方法。 DAPI的中文名称是4，6-联脒-2-苯基吲哚，是一种常用的荧光染料，其作用机理与溴化乙锭（EB）等染色剂的机理类似：它们与DNA双螺旋的凹槽部分可以发生相互作用，从而与DNA 的双链紧密结合。结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm而散射峰是461nm，正好UV （紫外光）的激发波长是356nm，使得DAPI成为了一种常用的荧光检测信号。 Jagielski M. et. Al在1976年首次运用该技术检测细胞培养中的支原体感染。后来随着技术的进步，该技术被运用于各种微生物的检测、生长监测，胚胎发育过程的检测，细胞周期的检测和各种核定位的实验。 本实验就是利用DAPI染色标记细胞核的位置。 免疫染色实验方法和步骤 免疫染色(immunol staining)包括免疫荧光(immunol fluorescence)、免疫组化(immunol histochemistry)、免疫细胞化学(immunol cytochemistry)等，可以参考如下步骤进行操作。 1. 样品准备(Sample preparation) 对于贴壁细胞： 可以直接用多孔板，例如6孔板、24孔板等，培养细胞，然后到预定时间时进行固定等后续操作。 也可以用洁净的盖玻片，70%乙醇中浸泡后，用无菌的镊子放置到6孔板内，然后用无菌的生理盐水、PBS或培养液洗去残留的乙醇。这时就可以种入细胞进行培养，待细胞贴在盖玻片上生长良好后，即可进行固定等后续操作。 对于悬浮细胞： 把细胞先在固定液中固定，然后把细胞滴加在载玻片上，干燥后细胞会紧贴在载玻片上。然后就可以进行后续操作。如果细胞的粘附能力不佳，可以在载玻片上用PDL等物质进行处理，以增强载玻片的粘附能力。 对于冷冻切片： 切片放置在载玻片上后，可以直接进行固定等后续操作。 对于石蜡切片：
市政工程施工技术手册汇编
市政工程 施 工 技 术 手 册 汇 编 甘肃星利达房地产开发有限公司 二0一五年 一、沥青砼面层施工 一、铺洒沥青下封层 在准备好的干燥水泥稳定粒料基层上，采用沥青洒布机喷洒一层约1～1.3L/m2的均匀热沥青，沥青采用AH-70，沥青喷洒时应保持沥青温度在150～170℃之间。 二、铺筑沥青面层试铺路段 沥青各面层施工开工前，均需先做试铺路段。通过合格的沥青混合料组成设计，拟定试铺路段铺筑方案，试铺路段宜选在正线直线段，长度不少于200m。
试铺路段施工分为试拌和试铺两个阶段： 根据各种机械的施工能力和相匹配的原则，确定合宜的施工机械，按生产能力决定机械数量与组合方式。 通过试拌决定： 拌和楼的操作方式：如上料速度、拌和数量与拌和时间、拌和温度等。 验证沥青混合料的配合比设计，决定正式生产用的矿料配合比和油石比。 通过试铺决定：摊铺机的操作方式：摊铺温度、摊铺速度、初步振实的方法和强度、自动找平方式等。 压实机具的选择、组合、压实顺序、碾压温度、碾压速度及遍数，振动压路机对下管网影响程度等。 施工缝处理方法。 各种沥青面层的松铺系数：确定施工产量及作业段的长度，修订施工组织计划。全面检查材料及施工质量是否符合要求。 试铺段的铺筑。严格按《公路沥青路面施工技术规范》JTJ032-94及《公路改性沥青路面施工技术规范》JTJ036-98规范操作。在试铺段的铺筑过程中，工程技术人员应全过程参加，检查施工工艺、技术措施是否符合要求，测温、观色、取样，并记录试验与检测结果，检查各种技术指标情况，对出现的问题提出改进意见。各层度铺，必须力争一次铺筑成功，使试铺面层成为正式路面的组成部分，避免材料浪费。试铺段的质量检查频率应比正常时增加一倍。 三、沥青混凝土面层 1、施工前的准备工作 （一）沥青混凝土拌和站 本工程因沥青混凝土面积较小，经过成本核算分析自建沥青混凝土拌和站，成本较高。经过对市场调查分析，可采用购买商品沥青混凝土进行施工。（二）沥青混凝土施工机械的配备 在沥青混凝土路面层的施工中，起了保证机械化施工的连续性，沥青混凝土拌和设备、沥青混凝土运输车辆、沥青混凝土摊铺机的合理配备是一个关键，而面层成型的质量又于沥青混凝土拌和设备与沥青混凝土的摊铺设备的合理配置密切相关。通过计算综合考虑，拟定本项目路面面层施工机械：一台装载机，两