生物制药技术复习题71284

名词解释

1、生物技术制药：是指利用生物系统或通过生物反应过程生产药物的技术。

2、生物药物：是指以生物资源为原料或以生物技术为手段开发生产的用作疾病的预防、诊断和治疗的医药品。

2.5、限制酶：及其特性限制性核酸内切酶，是一类专一性很强的核酸内切酶，专一地识别和作用于DNA分子上特定的核苷酸序列，切断DNA双链。

3、连接酶：能将两段DNA拼接起来的酶叫DNA连接酶。这类酶的发现和分离纯化，使两个DNA片段在体外连接形成重组DNA分子成为可能。

4、限制酶星活性：在标准条件下，每种限制酶都有严格的识别序列。在非标准条件下，会导致限制酶识别序列的特异性发生改变，在DNA内产生附加切割，称限制酶的第2活性或星活性。

5、基因载体：在细胞内具有能进行自我复制的独立DNA分子作为外源DNA片段的运载体，简称基因载体，又称分子克隆载体或无性繁殖载体。

6、粘粒：是一种有λ噬菌体粘性末端的杂种质粒，由λDNA的cos区段与质粒DNA重组构建而成。

7、基因文库：将供体生物的DNA用限制酶切成许多片段，在连接酶的作用下分别与克隆载体进行体外重组，这种含有供体生物全部不同基因的重组克隆载体的总体称供体生物的基因文库。

8、cDNA基因文库：以供体生物的总mRNA为模板，在反转录酶作用下合成核苷酸序列互补的DNA（cDNA），将全部cDNA分别与克隆载体进行体外重组，这些含有供体生物全部不同基因的重组克隆载体的总体称供体生物的cDNA基因文库。

9、PCR技术：聚合酶链式反应（Polymerose chain reaction）技术，简称PCR技术，是一种用于在体外扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的分子生物学技术。应用该技术可在很短的时间内得到数百万个特异DNA序列的拷贝。

10、转化：将携带目的基因的重组质粒导入受体细胞的过程称为转化。

11、转染：将重组噬菌体DNA直接导入受体细胞的过程称为转染。

12、感染：将重组噬菌体DNA包装到噬菌体头部成为有感染力的噬菌体颗粒，再导入受体细胞的过程。

13、多克隆位点：基因载体上由多种限制酶单一识别序列组成的序列，是插入外源目的基因DNA片段的位点。

14、高丰度mRNA：从某些特定型分化细胞分离的细胞质中，编码某特种蛋白质的目的mRNA占总mRNA的50~90%。称为高丰度mRNA。

15、抗体：指能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。

16、单克隆抗体：采用B淋巴细胞杂交瘤技术，由纯一的单克隆细胞系产生的，针对一个抗原决定簇的，结构和特异性完全相同的高纯度抗体称单克隆抗体。

17、第二抗体：能与抗原和抗体发生免疫反应后形成的复合物进行特异结合的抗体，又称抗抗体。

18、克隆化：分离获得单细胞并将单细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个过程。这些细胞集团中的每个细胞的生物学特性和功能是完全相同的。

19、细胞分化：生物细胞随功能不同所产生的形态变化称分化。

20、悬浮培养：利用液体培养基培养生物细胞，使细胞悬浮于培养基中生长增殖的过程。

21、贴壁培养：使细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法。

22、愈伤组织培养：从植物各种器官的外植体增殖而形成愈伤组织的培养。

23、外植体：指用于植物组织或细胞培养的器官或组织，如根、茎、叶、花、果、胚乳、胚珠、花粉等。

24、继代培养：由最初的外植体上切下的新增殖的组织或细胞，培养一代称为“第一代培养”，连续多代的培养即为“继代培养”。

25、植物生长调节剂：指对植物的生长发育有调节作用的物质，既包括人工合成的，也包括一些天然的化合物以及植物激素。

26、植物激素：仅指植物天然产生的对植物的生长发育有调节作用的物质。

简答题

1、限制酶有哪些特性？

（1）不同限制酶能专一地识别不同的特异核苷酸序列（核苷酸序列不同，序列大小不同）。

（2）各种限制酶的识别序列都具有回文结构。（3）各种限制酶的切割类型是各式各样的，切后形成各种粘性或平整末端。（4）在标准条件下，每种限制酶都有严格的识别序列。在非标准条件下，会导致限制酶识别序列的特异性发生改变，在DNA内产生附加切割，称限制酶的第2活性或星活性。

2、Taq DNA聚合酶的用途？

该酶可用于对DNA进行测序，但主要用于PCR（聚合酶链式反应），对DNA分子的特定序列（目的基因）进行体外扩增。

3、基因载体有哪些特性？

①要有复制子（Replicom）功能，且复制起始区中没有限制酶的酶切位点。

②要含有强启动子，要有能促进外源DNA高水平表达的调控区。

③要有多种限制酶的单一切点，以适用于多种限制酶产生的DNA片段的插入。

④具有两种以上易被检测的选择性遗传标记，作为对重组与非重组转化体的选择标记。

⑤载体DNA的分子量要尽可能小，以利于容纳较长区段的外源DNA片段。

⑥应属于松弛型复制，能在氯霉素存在下扩增其拷贝数。

⑦从安全防治考虑，载体应为非传递性，有较小的宿主范围，不为传递性载体所诱导。

4、如何将天然的原始载体改造成理想的基因载体？

①引入强启动子。②引入选择性标记基因。③切除大部分多余序列段，以提高容纳外源DNA片段的能力。

④引入由多种限制酶单一识别序列组成的多克隆位点。⑤引入多种用途的辅助序列。

5、简述cDNA基因文库构建的基本步骤。

①从供体生物细胞或组织中提取纯化得总RNA。

②从总RNA中分离纯化出总mRNA。

③以总mRNA 为模板反转录合成总cDNA。

④总cDNA分别克隆到载体上—构建DNA重组体。

⑤cDNA文库的鉴定。

⑥含目的基因cDNA重组体的筛选

6、PCR技术的基本程序

①变性：首先使双链DNA在反应液中经热变性（94~95℃）而分开成单链（或使反转录合成的cDNA:RNA杂交链分开成单链）。

②退火：然后降温至40~60℃，在低温下与两个引物进行退火，使引物与单链DNA配对结合。

③延伸：再在中温72℃下利用Taq DNA聚合酶的聚合活性和热稳定性进行聚合（延伸）反应。

7、简述RT-PCR技术合成目的基因的基本步骤。

①从供体生物特定分化型组织或细胞中提取纯化总RNA，其中目的mRNA为高丰度mRNA。

②以Oligo(dT)为引物，以总RNA中的总mRNA为模板，在反转录酶作用下合成互补的总cDNA。

③变性：升温至94~95℃加热5min，使总mRNA ﹕cDNA的杂交链由于热变性而分开成单链。

④退火：降温至40~60℃，加入“上游”寡核苷酸引物和“下游”寡核苷酸引物，进行退火，使引物与单链mRNA 和cDNA结合。

引物应是与目的基因3‵端互补的核苷酸序列

⑤延伸：升至中温72℃，在反应体系中（扩增缓冲液）加入Taq 聚合酶和四种dNTP，分别以目的mRNA和目的cDNA单链为模板进行聚合（延伸）反应。

如此按变性、退火、延伸进行约30次重复循环，得到目的cDNA大量拷贝（10 6倍）。

⑥从反应液中分离提取出双链目的cDNA扩增产物。

⑦目的cDNA与载体DNA进行体外重组，构建重组克隆载体。

⑧带有目的cDNA的重组载体转导进入宿主细胞。

8、目的基因DNA与载体DNA体外重组的定向克隆法和粘性末端连接法各有何特点？如何克服酶切后同一DNA 片段自身环化？

（1）定向克隆法：当用两种不同的限制酶（如用BamHⅠ和HindⅢ）消化同一DNA基因组时，切下来的同一DNA 片段带有非互补的突出末端，这样供体DNA片段只能以一个方向很容易地连接到同样用BamHⅠ和HindⅢ进行消化而产生相匹配粘性末端的载体DNA当中。

特点：该法的优点是由于载体DNA片段两突出末端不互补，不能自身环化，但与目的基因DNA片段定向重组率却较高。

（2）粘性末端连接法：用一种限制酶酶切，会产生带有相同粘性末端的外源目的DNA片段，必须与用同一种限制酶消化而形成具有相同匹配末端的质粒载体相连接。

特点：质粒载体DNA和外源DNA片段都可能发生自身环化，也有可能形成串联寡聚物。

（3）用碱性磷酸酶去除载体DNA两端的5‵磷酸基团以尽量减少载体DNA的自身环化或连接。经去磷酸化的载体DNA仍然可有效地与具有5‵末端磷酸的外源DNA相连接。

9、理想受体细胞应具有哪些特性？

①具有接受外源DNA的能力，能发展成感受态细胞。

②应为限制酶和修饰系统缺陷型，即外源DNA导入后不致被降解或修饰。

③其遗传型应是抗重组（rec A-）的，以保持外源DNA在受体细胞中的完整性。

④不适于在人体内或非培养条件下生存。

⑤重组体DNA不易转移，只在受体细胞中复制。

10、抗生素抗性基因失活法筛选含目的基因工程细胞株的原理和方法。

很多质粒载体都带有1个或多个抗生素抗性基因标记，在这些抗药基因内有限制酶的识别位点。当用某种限制酶消化并在此位点插入外源目的DNA时，抗药基因不再表达，称为抗性基因插入失活。

当插入外源目的DNA的重组载体导入宿主细胞并在药物选择性平板培养时，根据对该药物由抗性转变为敏感，便

可筛选出重组转化子。

②先用含Amp的选择性平板培养基涂布培养，淘汰大部分非转化的宿主细胞。

②将所有长出的单菌落编号后分别接种于含Tet的选择性培养基上，在此培养基上不能生长的菌落，即为外源基因插入Tetr基因的BamHⅠ酶切位点的重组菌株，长出的为含有非重组质粒载体的宿主细胞株

11、β-半乳糖苷酶插入失活法筛选含目的基因工程细胞株的原理和方法。

许多质粒载体（如PUC系列）都带有一个来自大肠杆菌的Lac操纵子的部分DNA区段（Lac Z‵和调控序列Lac R），这一区段编码β-半乳糖苷酶N端的一个片段（但无酶活力）。宿主细胞可编码β-半乳糖苷酶C端的部分片段（也无酶活力），但两者之间可通过基因互补（称α互补），从而融为一体形成具有酶活力的β-半乳糖苷酶。

由α互补而产生的Lac+细菌在有诱导物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）和生色底物5-溴-4-氯-3‵-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）的培养基上形成蓝色菌落。

当外源DNA片段插入到质粒载体的多克隆位点后，Lac Z‵片段失活，破坏了α互补作用。因此，带有外源目的DNA 重组质粒的细菌将产生白色菌落，从而仅通过目测就可识别并筛选出带有重组质粒的转化子菌落。

12、用于制备杂交瘤细胞的骨髓瘤细胞应具备哪些特性（简答题）？

①不能产生自身免疫球蛋白为避免杂交瘤细胞分泌的抗体不纯，骨髓瘤细胞不具有产生抗体的能力。

②应为HGPRT缺陷的细胞系其细胞内嘌呤核苷酸或嘧啶核苷酸合成的补救途径必须丧失。即磷酸核糖转移酶或嘧啶核苷酸激酶的活力丧失，即HGPRT阴性细胞。

3.合率高，容易培养，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定。

13、杂交瘤细胞选择性培养的原理？

选择性培养基为HAT培养基，它是用次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶（T）配制的。其中氨基喋呤（A）能阻断DNA合成的主要途径。

骨髓瘤细胞因是HGPRT缺失型，无DNA合成的补偿途径，因此瘤细胞和瘤-瘤融合细胞因不能合成DNA而死亡。

而B细胞和B-B融合细胞在这样的离体培养条件下，无法生存几天内亦迅速死亡。

骨髓瘤细胞是HGPRT（磷酸核糖转移酶）缺陷型，但B细胞中有这种酶，因此B-瘤融合的杂交瘤细胞含有HGPRT 酶，可利用次黄嘌呤和胸腺嘧啶（T）来合成DNA，使杂交瘤细胞得以生长。

14、贴壁依赖型动物细胞离体培养有哪些形态类型，与其来源有何关系？

贴壁依赖型动物细胞离体培养形态类型有：

①纤维样细胞型

贴壁培养时，细胞呈梭形或不规则的三角形，细胞群常连接成网，生长时呈放射状、漩涡状或火焰状。

主要来源于中胚层组织的细胞（成纤维细胞、心肌细胞、平滑肌细胞或成骨细胞等）。

②上皮样细胞型

贴壁培养时，细胞呈扁平的不规则的多角形，生长时彼此紧密连接成单层细胞片。

主要来源于外胚层和内胚层组织的细胞，如皮肤、肠管和肺泡上皮细胞等。

15、简述动物细胞的生理特点。

（1）细胞分裂周期长：动物细胞分裂所需时间一般为12~48h。

（2）离体培养常需贴附于基质，并有接触抑制现象。

（3）正常二倍体细胞生长寿命是有限的。

（4）动物细胞对周围环境十分敏感，对多种物

理化学因素的变化耐受力很弱。

（5）对培养基要求高。

（6）蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同。

16、简述动物细胞培养的环境条件。

（1）水质：培养液用水必须经严格处理，使水中金属离

子降至最低，电阻值必须大于18MΩ。

（2）温度：哺乳动物细胞培养温度为37+0.5℃，而昆虫

细胞则为27℃左右。

（3）渗透压：由于无细胞壁，对培养液渗透压极敏感，

通常最理想的渗透压为290~300mOsm/kg。

（4）pH ：最适pH为7.2~7.4，低于6.8或高于7.6时会对

细胞产生不利影响。

（5）供氧：动物细胞对氧的消耗约为0.006~0.3μmol/106

细胞·h或24mg/106细胞·d。

在摇瓶培养时，培养液的体积不超过瓶总容积的30%，通过液面的空气交换就可保证有足够的氧。

17、动物细胞离体培养的无血清培养基除基本成分外，还需添加哪些特殊成分？

（1）激素和生长因子：有胰岛素、甲状腺素、生育酚、表皮生

长因子、成纤维细胞生长因子等。

（2）结合蛋白、血蛋白和铁传递蛋白等。

（3）贴附伸展因子：纤维结合蛋白、软骨素、胶原和昆布氨酸等。

（4）其它因子和元素：谷胱甘肽，锌、钴、钼、硒等。

18、动物细胞离体培养有哪些培养方法？各有何特点？

（1）悬浮培养使细胞悬浮于培养基中生长增殖的过程。

特点：①操作简便，培养条件较均一。

②传质和传氧效果好，容易扩大规模培养。

③较难采用灌流培养，细胞密度较低。

（2）贴壁培养使细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法。

特点：①优点是适用的细胞种类广，较易采用灌流连续培养的方式使细胞达到高密度。

②缺点是操作麻烦，需要合适的贴附材料和足够的贴附面积。

③培养条件不均一，传质和传氧较差。

④壁培养与悬浮培养的另一个不同之处在于传代或放大培养时，常需要用酶将细胞从基质上消化下来。

19、植物细胞培养的基本程序。

（1）由完整的植株制取所需的外植体（组织、器官或细胞）

（2）进行植物外植体培养或诱导愈伤组织进行脱分化细胞的培养，建立稳定高产的细胞株系。

（3）进行原生质体培养或液体悬浮大规模细胞培养。

20、植物细胞培养的生理特点。

（1）培养过程中细胞重量的增加主要取决于对数期，而次级代谢产物的累积则主要在稳定期完成。

（2）很少以单一细胞悬浮生长，而多以非均相集合体的细胞团形式存在。

（3）随着培养时间的延长（对数生长后期），细胞数量呈指数上升，开始分泌粘多糖和蛋白质，细胞密度高，培养基粘度大，易产生混合和循环不良的问题。

（4）其纤维素的细胞壁使得其外骨架相当脆弱，抗张力强度大，抗剪切能力小，传统的搅拌式生物反应器容易损坏其细胞壁。

21、植物细胞离体培养有哪些培养方法？各培养方法有何特点？

（1）固体培养法：利用加有凝固剂的固体培养基培养外植体

形成愈伤组织的方法。

特点：①简便易行，占用空间小，易于开展工作。

②愈伤组织或外植体仅有一部分与培养基接触，易导致愈伤组织内细胞生长不均衡。

③外植体基部插入固体培养基中，该处理呈现气体交换不畅，阻碍了该处组织呼吸作用的正常进行，同时也会堆积生长过程中排出的有害物质。

④由于重力作用或光线射入的不均匀性，愈伤组织细胞间易出现极化现象，导致细胞群体的不均匀状态。

⑤外植体在培养3周左右必须移换至新鲜培养基上，以保持正常生长，常需经多次继代培养，愈伤组织变得较为疏松时，才能进行悬浮培养。

（2）悬浮培养技术：指把离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行的无菌培养。

特点：①细胞较为均匀一致，而且细胞增殖速度快，适于大规模培养，在植物产品工业化生产上有巨大的应用潜力。

②植物细胞具有聚积成块的固有特性，即使由单细胞起始培养的悬浮培养物，也不是完全由单细胞组成，常是单细胞和小细胞团的混合体。

（3）固定化培养技术：利用包埋、吸附或共价结合的方法，将细胞固定于固体载体上进行无菌培养的技术。

特点：①高度保持反应器内的细胞量，能提高反应效率。

②固定化使细胞活性稳定，反应能够长期连续运行。

③产物易与细胞分离。

④使反应器能连续运转，易于控制生产中最适宜的环境条件、基质浓度等，使生产过程稳定。

⑤固定化后可控制细胞处于稳定期，有利于目的产物的生产。

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