真菌漆酶的研究进展

真菌漆酶的研究进展

宋瑞（安徽大学生命科学学院合肥230039）

【摘要】漆酶是一种蓝色多铜氧化酶，和植物中的抗坏血酸氧化酶，哺乳动物的血浆铜蓝蛋白属同族，能够催化多种有机底物和无机底物的氧化[1,2]，同时伴随分子氧还原成水。漆酶广泛分布于真菌、高等植物、少量细菌和昆虫中，尤其在白腐真菌中普遍存在。漆酶特有的结构性质和作用机理使其具有巨大的应用价值。本文就真菌漆酶结构，功能的研究进展作一综述，并对其应用作简单介绍。

【关键词】真菌漆酶三维结构功能应用

1真菌漆酶结构特征

1.1 漆酶的组成

漆酶是一种糖蛋白，肽链一般约由500个氨基酸组成[3]，糖基含量差异较大，占整个分子质量的10%—80%[4]，据相关报道，漆酶的热稳定性可能与其糖基化有关。糖组成包括半乳糖、葡萄糖、甘露糖、岩藻糖、氨基己糖和阿拉伯糖等。Mayer[5]认为漆酶并不均一，它由多条5000~7000分子量的糖肽链基本结构单元组成。由于结构单元之间的缔合度不同，造成了各种漆酶分子量的不同。另外，分子中的糖基的差异，也会引起漆酶的分子量随来源不同会有很大的差异，从59—390ku不等。真菌漆酶约含19种氨基酸，绝大部分为单体酶，但也有例外，如双孢蘑菇和长绒毛栓菌漆酶由两个亚基组成[6]，而柄孢壳漆酶I由四个亚基组成。漆酶种类繁多，不同种类的真菌产生的漆酶种类不同，即使同一种真菌在不同环境下也产生不同种漆酶。

1.2漆酶的晶体结构

由于漆酶是含糖蛋白质，且糖质量分数较高，一直以来很难获得X-衍射分析所用的单晶体，因此阻碍了关于漆酶结构的研究进展。1998年第一个漆酶晶体是Ducros V[7]制备的来自灰盖鬼伞(Coprinus cinereusv)T1Cu缺失型漆酶晶体，并分析了其结构。至今为止，Bacillus subtilis(CoA)[8]；Melanocarpus albomyces(MaL)[9]；Rigidoporus lignosus(RiL)[10]；Pycnoporus cinnabaricus(PcL)[11]；Coprinus cinereus(CcL)[12]和Trametes versicolor(TvL)[13]漆酶的三维结构已相继被报道。

漆酶分子整体由3个杯状结构域所组成，分别称作结构域A、B、C，每个结构域主要由β-折叠桶，α-螺旋，loop结构所组成。三者紧密结合形成球状结构。这是铜蓝蛋白家族所共有的结构形式[7,9]。分子当中含有二硫键，漆酶种类不同，二硫键数目也不一样，MaL 漆酶分子由3个二硫键，分别是位于结构域A Cys4～Cys12、结构域A和C界面上Cys114～Cys540、结构域C Cys298～Cys332，而CcL，RiL漆酶中则含有两个二硫键。在CcL漆酶分子中，由结构域A的Cys85和结构域B的Cys487形成一个二硫键，另一个二硫键存在于结构域A和结构域B(Cys117—Cys204)之间。一个伸展的loop(氨基酸284—327)连接结构域B和结构域C。Asn343上有N连接的N—乙酰葡萄胺。

1.3 漆酶的催化中心

真菌漆酶分子中一般都含有4个Cu原子，根据磁学和光谱学性

质不同可将4个Cu原子分为三类：Ⅰ型Cu2+(T1Cu)和Ⅱ型Cu2+(T2Cu)各一个，都是单电子受体，呈顺磁性；Ⅲ型Cu24+(T3Cu)两个，是耦合离子对，是双电子受体，反磁性[14]。T1Cu位于结构域C上，T2Cu 和T3Cu位于结构域A和C的界面上。漆酶绝大多数都只含4个Cu 原子，Karhunen E等[15]研究的射脉菌( Phlebia radiata)漆酶却只含有2个Cu原子(T1Cu、T2Cu各一个)，无T3Cu原子，但该漆酶分子中含有1个具有类似T3Cu功能的有机小分子辅基吡咯喹啉(pyrroloquinolinequinone，PQQ)。Palmieri G等[16]从糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)中纯化的一种新型漆酶POXA1中含有1个Cu原子，2个Zn原子和1个Fe原子，由于缺少T1Cu，在610nm处没有吸收峰，酶蛋白呈白色。在不同种真菌漆酶分子中，与Cu原子相连的1个Cys 和10个His及其周围的氨基酸配基则是相对保守的，这些氨基酸都分布在含有两对His的N末端区域，或是分布于C末端的Cys和其余结合铜原子的His之间。Cu离子构成了漆酶的活性中心，在漆酶催化氧化过程中起决定性作用，如果除去Cu离子，漆酶将失去催化功能。

1.3a T1Cu结合位点

T1Cu形成单核中心接受来自底物的电子转移，具有典型的蓝铜谱带，紫外可见光谱上600nm处有吸收峰，它是底物反应场所，把来自底物的电子传递三核中心铜原子上。T1Cu以Cu2+形式存在，在所有的漆酶中都与两个His的N原子和一个Cys的S原子配位结合，形成扭曲的四面体结构。有些多铜氧化酶还有第四个轴向的氨基酸配

基，在不同的多铜氧化酶中配基种类不同，在抗坏血酸氧化酶中为Met，大多数其它真菌漆酶中通常为Phe，而灰盖鬼伞漆酶中为Leu，距离T1Cu 3.51?，因此不能成为T1Cu的配基。这种配位的不同被认为可能引起真菌漆酶氧化还原电位升高。Perrycr等[17]认为此位置的还原电势强弱与其疏水基团大小成正比，如为甲硫氨酸(Met)配基，亮氨酸(Leu)配基，苯丙氨酸(Phe)配基，其还原电势依次升高。然而Silvia Garavaglia等[10]通过比较CcL(低Eo)和TvL(高Eo)的不同发现，Leu或Phe不同的配位并不是导致氧化还原电位变化的最主要因素，认为T1Cu-NE间的距离则是影响氧化还原电位高低的主导因素。

围绕在T1Cu一侧的是一个疏水性口袋，Leu462两边分别为Phe340和Phe398。T1Cu存在于Ile454的一侧，且位于一个约12?宽、6?深的凹陷中，结构域A和结构域C的三个loop构成了凹陷的表面。这个区域与还原底物的结合有关。这些伸展的loop区，决定了底物特异性，而真菌漆酶具有极度广泛的底物专一性，这可能是由于漆酶中缺少这些区域，序列变异性也较大，且结合位点相对较大，再加上loop 构象上存在的变化(表现在室温和100K结构之间的不同)的影响。1.3b T2/T3Cu结合位点

T2Cu与T3Cu形成三核中心接受来自T1Cu单核位点的电子，与高度保守的四个His-X-His花样的8个His配位结合，T2Cu结合2个，每个T3Cu结合3个[8,10]。两个T3Cu之间结合漆酶的第二个底物氧分子。T2Cu具有电子顺磁共振效应，不易结合弱的配体，且不稳定，当螯合剂存在时，能够被一些2型耗竭(T2D)衍生物选择性还原

去除；T3Cu的两个铜原子间偶联，其EPR性质消失，由于电子在OH和两个T3Cu之间的传递，在330nm处有特征吸收带。另外，在400～460nm间有一些小吸收带，推测是一些反应中间体，如氧/过氧中间体(PI)[18,19，20]。T2Cu与2个His和一个水分子或一个氯原子配位，形成T型几何结构[21]，这种结构对一价铜比二价铜更有利。

在灰盖鬼伞漆酶晶体结构中，由于去除糖链导致T2Cu缺失，与抗坏血酸氧化酶相比，其构象发生些许变化。T3Cu对的两个Cu原子相距为5.3?，而后者只有3.7?；含氧的配基只结合T3Cu原子对中的一个，而且它在两个Cu原子间是不对称排列的，相距Cu3(a)和Cu3(b)分别为2.17?和3.26?；另外与其相似的是T2D漆酶（T2Cu 被螯合，T1Cu和T3Cu保持完整），在T2D漆酶中，与T2Cu配位的His399的咪唑环发生了旋转，因而能与T3Cu原子对中的一个Cu（距离2.5?）配位；His399存在构象柔性，在1.68?，100K结构中有两种构象，一种与抗坏血酸氧化酶和血浆铜蓝蛋白中的构象相对应，另一种是与T3Cu(a)配位的新位置。在100K时，两种构象比例为60:40，而在2.2?室温结构中比例为80:20。总之，T3Cu(b)与His109、His66、His453配位，形成一个轻微扭曲的三角平面，距离氧桥3.26?，距离T3Cu(a)5.1?。T3Cu(a)有两种配位状态，一种是与His451、His111、His401的N和氧桥配位，距离分别为1.98、2.01、2.04和2.17?，犹如一个扭曲的四面体。另一种是Cu3(a)与旋转进入配位区的His399形成第五个配位，距离2.5?。因此，T2D漆酶有两种构象，其平衡受温度变化和结晶条件的影响。

不同来源漆酶的T2/T3Cu结合位点也有所差异，在Rigidoporus lignosus(RiL)中T3Cu的2个铜原子间无OH桥存在，相反T2Cu，T3Cu(a)则分别与1个OH相连，但由于与OH是不对称相连，所以不能认为是OH桥。然而，Bacillus subtilis(CoA)T3Cu的2个铜原子则是通过1个OH桥配位连接起来，组成双核铜区，具有抗磁性，因而在EPR上无信号产生。Silvia Garavaglia等[10]认为在Rigidoporus lignosus(RiL)中，T3Cu(a)、T2Cu分别与1个OH相连是导致EPR沉默的原因，具有EPR活性的是与来自3个His的N原子相连的T3Cu(b)，而不是T2Cu。

T2和T3中心紧密相连形成一个三核中心，其结合方式可能有以下三种模式：(1)三个同原子族是通过羟基和/或过氧基桥链连接，早期的报道均持这种观点；(2)通过双氧（过氧）连接，两个氧原子到三个铜原子的距离几乎一样，均在2.4～2.6?之间，同两个T3Cu呈（扭曲）四面体，同T2Cu呈平面四方构型，Hakulinen等的分离态[22]和重组态[23]以及Bento等[24]的CuCl2浸泡态结构支持这种模型，(3)三个铜都同一个μ3-氧连接，另一个氧原子已经转变成水离去[25]，这可能是反应过程中的一种状态。

1.3c 活性中心结合方式

T1Cu距离三核中心约为1.25nm，通过T1Cu-Cys-His-三核中心联系起来，形成电子传递通道。Leif J[26]等人研究T. versicolor活性中心时发现其含有2个二硫桥：Cys117与Cys205形成一个二硫桥，把T1Cu 区和T2Cu区联系起来；Cys85与Cys487形成另一个二硫桥，把T1Cu

区与T3Cu区联系起来。从空间结构上看，T1Cu可能距离两个T3Cu 约13?[27]，而T2Cu到两个T3Cu的距离可能略微不等，T3Cu原子对间的距离约为 4.8?。总结所有有关漆酶结构的报道，三核中心无一例外的位于酶蛋白中央空穴，形成相对保守的结构。

2.漆酶的功能

2.1漆酶活性的影响因素

漆酶活性会受到一些酸的影响，如盐酸、磷酸、甲酸等，而碳酸，磷酸等的钠盐则对漆酶活性几无影响[28,29]，Bertrand于1908年对此作了最早报道。真菌漆酶和漆树漆酶都能被叠氮及氰化物、EDTA和二乙基二硫代氨基甲酸酯等抑止，但不受CO影响。一般来说，铜螯合剂对漆酶的活性都有抑制作用，（但乙二胺四乙酸能增加P. conchatus 漆酶的反应活性），不同的抑制剂对漆酶活性的抑制作用不一样，抑制剂对漆酶活性的影响随抑制剂浓度的不同而不同，抑制剂浓度越大，其抑制作用越强。在一定的温度范围内，随着反应温度的升高，漆酶的酶活力增加。但是，温度越高，漆酶越不稳定，也就越易失活。pH值对漆酶酶活性亦有类似影响，一般来说，大多数漆酶在碱性环境中不稳定、易失活。另外，介质、电磁场和糖链等等也对漆酶活性有影响。就其实质，可能是由于这些因素都会改变漆酶蛋白的空间结构，影响漆酶分子在溶液中的伸展特性所致。但是具体如何影响、作用的机制等都还因为体系的复杂性而不很清楚，所进行的探讨基本上还都只是宏观的，外在的。随着结构的越来越清晰，估计以后的研究会集中到结构－活性（构效）关系上来。

2.2 漆酶的催化氧化

漆酶的催化氧化过程相当复杂，相比较其他多酚氧化酶，漆酶反应过程中不产生有害的过氧化氢和活性氧(ROS)，但同时产生醌或半醌等强抗氧化剂及水，是非常绿色的反应。

漆酶具有广泛的作用底物，基本上只要底物是具有相似于儿茶酚型的邻、对二酚就能够被漆酶催化，但酪氨酸一般不能被真菌漆酶催化氧化[30,31]。

2.3 漆酶的催化机理

漆酶催化机理较为复杂，反应不同机理也不同，漆酶的催化氧化过程主要包括：酶分子对底物的结合、电子在酶分子中的转移、氧分子的还原和产物的反作用。

漆酶是单电子氧化还原酶，它催化氧化还原反应机理主要表现在两方面。一方面是底物自由基中间体的生成。漆酶从底物分子中提取一个电子，使之形成不稳定的自由基，其可进一步发生聚合或解聚反应。还原态漆酶可被O2氧化，O2被还原为水。另一方面，整个催化反应是通过四个铜离子协同传递电子和价态变化来实现的。底物结合于T1Cu位点，T1Cu氧化底物得到1个电子，该电子通过Cu→Cys →His途径传递到T2／T3Cu三核中心位点，结合在该位点的第二底物分子氧，接受电子被还原为水。氧的还原可能分两步进行，首先接受两个电子生成过氧化氢中间体，该中间体再得到另两个电子被还原成水[14]。

关于分子间电子转移途径，即T1→Cys－His→T2/T3三核中心途

径，目前已知的主要有两种方式：

(1)T1Cu和T2Cu从底物各得一个电子被还原，随后T1Cu和T2Cu

同时向T3Cu对给出一个电子。然后T1Cu和T2Cu再次被还原，此时漆酶完全被还原，氧分子从T3Cu对连续得到4个电子被还原成水。

(2)底物结合于酶催化中心的T1Cu位点被氧化，T1Cu得到一个电子

被还原，通过Cu-Cys-His-三核中心途径，将T3Cu逐个还原，最后还原T2Cu[24,25,32]，再把电子传递给结合到三核中心的氧分子，使之还原为水。

氧需要通过一个S/O通道进入三核中心，得到4个电子，被铜离子还原成水。若有某个环节受到破坏，比如底物结合、氧通道等，均可能对整个催化反应产生影响。

由于受到糖链的影响，使得漆酶结构的研究进展进行缓慢，其催化机理还有许多细节有待研究。然而完全理解漆酶这种金属糖蛋白酶的结构和催化氧化机理，以及一些细节的问题，对于整个生命过程都具有深刻意义。漆酶之所以引起国内外广泛关注，正是由于其催化特性和广泛的应用所带来的。

3.漆酶的应用

3.1 合成方面的应用

研究表明，漆酶除了可以有效降解大分子有机物质外，其合成有机物的能力也很强，如漆酶可以合成真菌色素，并且可能参与菌索的形成。另外，漆酶可以把两种小分子化合物高效聚合成新的大分子化

合物，因此可利用漆酶常在温下生产高分子聚合物（如抗生素），是一种绿色的环境友好型的新方法[33]。

3.2有毒化合物的生物消除

环境污染问题日益严重，越来越多的污染物正侵蚀着人们赖以生存的环境，漆酶在许多有毒废物的处理中都有很好的应用价值。除了降解木素外，研究发现一些白腐菌可以降解多种芳香族类化台物和有机磷类毒剂。再后来发展的固定化酶技术，更使酶活回收率提高，且热稳定性较好。真菌漆酶可降解环境中多种有毒物质，对污染的局部环境进行生物修复。

3.3 造纸工业中的应用

漆酶具有氧化木素的能力，被广泛应用于造纸工业，尤其是生物漂白。漆酶参与木浆和草浆的漂白都有报道。试验证明，漆酶和合适的介体协同作用，对低值的木浆有高选择性，去除木素效率达到45％。

3.4食品工业中的应用

漆酶在改善人们生活有着不可忽视的贡献，在食品方面的应用越来越广泛。漆酶是饮料加工中常见的酶之一，主要用于饮料的澄清与色泽控制。另外食药用菌制种过程中加人漆酶制剂能加速木质素的分解，为菌丝提供更丰富的养料。试验发现，漆酶在午餐肉生产中的表现比过氧化物酶更有效，乳制品也同样如此。

3.5 其它方面的应用

漆酶在改善纤维特性，生物检测，生物燃料，生物传感器，工业染料脱色及木材工业中均有广泛的应用。

4 总结

尽管漆酶有着广阔的应用前景，但漆酶的某些性质，如其本身只能氧化酚型化物，高温易失活等又是目前其应用受阻的一个重要原因。对漆酶分子结构及其特性的研究就是为了有目的地改善漆酶的特性，增加其氧化性和稳定性，但目前对漆酶分子结构尤其是空间结构认识还有待进一步的研究。随着分子生物学方法的快速发展及漆酶研究的不断深入，必将有更多的漆酶蛋白的结构及作用机理被阐明。

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