链脲佐菌素STZ诱导I型糖尿病

小剂量多次链脲佐菌素腹腔注射诱导1型糖尿病小鼠模型及模型鉴定

摘要：目的考察对C57BL/6J小剂量多次链脲佐菌素腹腔注射诱导1型糖尿病模型的成模率、

模型鉴定及稳定性。方法雄性C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组、链脲佐菌素50mg/kg多次

给药组，考察多次给药后链脲佐菌素对小鼠血糖、血清胰岛素、IL-10、IFN-γ、胰腺组织的影响。

结果50mg/kg多次给药诱导C57BL/6J小鼠成模率为83.64%，空腹血糖值显著升高(P<0.01)，

血清胰岛素和IL-10值明显下降(P<0.01)，血清IFN-γ含量明显增加(P<0.01)，胰腺组织中胰岛数

目显著减少，胰岛周围及胰岛内出现胰岛炎。结论小剂量(50mg/kg)多次链脲佐菌素腹腔注射

C57BL/6J可诱导稳定可靠的1型糖尿病小鼠模型。

关键词：链脲佐菌素；1型糖尿病模型；腹腔注射；小剂量多次

Multiple low dose intraperitoneal injection of streptozotocin-induced type 1 diabetes mice

and model identification

Abstract：Objective To investigate the molded rate of type 1 diabetes and model stability of C57BL/6J

induced by intraperitoneal injection of multiple low dose strptozotocin. Method Male C57BL/6J were

randomly divided into normal control group and streptozotozin 50mg/kg dose group, blood glucose,

serum insulin, IL-10 and IFN-γ were measured after repeated administration of streptozotocin. Results

The molded rate of multiple 50mg/kg dose group was 83.64%, the fasting blood glucose serum IFN-γ

level were significantly higher than the normal group while the serum insulin and IL-10 values

decreased significantly (P<0.01). The number of islets of pancreatic tissue was significant reduction

and insulitis occurs surrounding the islets. Conclusion Multiple low dose (50mg/kg) intraperitoneal

injection of streptozotocin in C57BL/6J can induce stable mouse model of type 1 diabetes.

Key words: streptozotocin; type 1 diabetes model; intraperitoneal injection; multiple low dose

胰岛素依赖型糖尿病又名1型糖尿病，是由于机体自身反应性免疫应答攻击胰岛β细胞，使其遭破坏、功能缺失，从而导致胰岛素绝对缺乏所引起的糖尿病。由于β细胞具有产生胰岛素和调节血糖的功能，β细胞群的毁坏最终导致了血糖的失调和高糖血症的发生。这种疾病的发生通常被认为是由于遗传易感性以及免疫系统对环境的免疫应反应答亢进而引起。因此，可以说1型糖尿病是由遗传和环境因素相互作用而引起的一种代谢异常综合征。胰岛素依赖型糖尿病已成为危害青少年健康最主要的慢性病之一，其治疗仍然是全球医疗的棘手问题。糖尿病带来的危害，几乎都来自它的并发症。血糖控制良好与否与并发症密切相关，因此治疗目标是达到最佳血糖控制，以延缓或防止并发症。[1]。建立可靠的动物模型是治疗1型糖尿病的必备条件。目前诱导1型糖尿病模型的方法众多，如化学诱导法、T细胞介

导法等，其中化学诱导法由于简单易操作得到较为广泛的应用。链脲佐菌素(STZ)是诱导糖尿病动物模型的最常用药物之一[2]，链脲佐菌素即2-甲基-2-(3-亚硝基脲)-D-吡喃糖，结构类似于N-乙酰葡糖糖胺，最初是作为抗生素和抗肿瘤药物从细菌中分离得到的，生物半衰期为5-15分钟，STZ诱导1型糖尿病模型分为两种方法：一次大剂量腹腔注射和多次小剂量腹腔注射，一次大剂量造模短时间内造成大量胰岛β细胞破坏往往使动物容易死亡，而应用小剂量多次腹腔注射STZ造成小批量持续性的胰岛β细胞损坏，这种渐进的方式使动物模型易发生胰岛炎症，最终导致胰岛素分泌绝对不足和高血糖的发病过程与人类1型糖尿病十分相似[3, 4]。目前研究认为GlcNAcase[5]、多聚(ADP-核糖)转移酶(PARP)[6]、K ATP通道[7]、活性氧(ROS)[8, 9]、iNOS[10]等可能与STZ对β细胞的毒性作用有关。不同品系的小鼠对STZ的敏感性是不同的，C57BL/6小鼠是近交系小鼠，因其实验结果精度高、可比性好以及应激反应均一等优点收到较多应用[11, 12]。雄性小鼠比雌性小鼠更倾向于被STZ诱导，产生细胞毒性[13]。本研究考察了50mg/kg剂量的STZ对C57BL/6J多次腹腔注射后诱导的1型糖尿病小鼠血糖、成模率和模型稳定性，探讨STZ对小鼠血清胰岛素、细胞因子及胰岛炎症的影响。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物100只4周龄C57BL/6J小鼠，雄性，体重17±3g，购自扬州大学比较医

学中心，许可证号：SCXR(苏)2012-0004；

1.1.2主要试剂链脲佐菌素(STZ，南京百世金进口分装)，小鼠胰岛素ELISA试剂盒、小

鼠IL-10 ELISA试剂盒、小鼠IFN-γELISA试剂盒均购自于南京百世金生物技术有限公司；

1.1.3主要仪器博仕珑血糖仪，博仕珑血糖试纸(台湾厚美德生物科技有限公司)，Bio-Rad

550型酶标仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1STZ造模

100只雄性C57BL/6J小鼠适应性喂养2周，随机分为2组，造模组90只，正常对照组10只。正常对照组腹腔注射柠檬酸钠缓冲溶液(0.1mol/L新鲜柠檬酸钠缓冲溶液，pH 4.5)0.1mL/只，模型组腹腔注射同等体积STZ-柠檬酸钠缓冲溶液，剂量为50mg/kg，每日1次，连续5天。造模前，小鼠禁食不禁水12h。

1.2.2造模前后小鼠血糖变化

在STZ注射前，分别用血糖仪测定正常对照组和模型组小鼠的血糖，并于造模后第1、2、3、4、7、13周测定对照组和模型组小鼠的血糖，观察STZ注射前后小鼠血糖的变化，以末次注射STZ第7天和14天，空腹血糖(禁食8h)≥11.1mmol/L视为模型成功。

1.2.3血清胰岛素、IL-10、IFN-γ含量的测定

分别选取造模前正常小鼠以及造模后第2、4、13周空腹血糖值≥11.1mol/L 的小鼠眼镜脉丛取血，室温静置待血凝固后，4000r/min 离心10min 后分离血清，-70℃冻存。血清胰岛素、IL-10、IFN-γ含量的测定方法均为酶联免疫分析法(ELISA)，操作过程按照试剂盒说明书进行。

1.2.4 胰腺组织病理学分析

采用常规HE 染色法观察胰岛的组织学改变，选择正常对照组小鼠以及造模后空腹血糖≥11.1mmol/L 且持续2周的模型组小鼠，脱颈法处死送于南京百世金生物技术有限公司做H&E 染色分析，主要步骤为去胰腺组织固定于10%福尔马林溶液内，脱水，石蜡包埋，制片(4μm 厚)，HE 染色，光学显微镜观察胰岛：0级，胰岛完整，胰岛周围及内部均为炎细胞浸润；1级，胰岛外周有轻度炎细胞浸润；2级，以岛内有炎细胞浸润，面积<50%；3级，胰岛岛内炎细胞浸润，面积>50%；4级，炎细胞完全浸润胰岛，胰岛萎缩、坏死、消失。

1.3 统计学分析

实验数据均以平均值±SD 值表示，使用SPSS 13.0进行统计学分析，对实验结果进行t 检验，生存率的比较用卡方检验，P <0.05为有统计学意义，实验结果用origin 8.0作图。 2 结果

2.1 造模后小鼠血糖的变化

与正常小鼠相比，造模后的小鼠出现多饮、多食、多尿等糖尿病病症，空腹血糖值明显升高，与正常组比较具有极显著性差异(P <0.01)，同时模型组小鼠的空腹血糖能够维持高血糖水平(图1)。以末次注射STZ 后，连续两周空腹血糖≥11.1mmol/L 为模型成功，即在注射STZ 完毕后第2周，有76只小鼠血糖≥11.1，死亡12只，模型成功率为83.64%，死亡率为13.33%。

血糖(m m o l /L )注射STZ后时间(周）)

图1 造模前后小鼠血糖变化

Fig.1 Effect of STZ on blood glucose level of mice

2.2 造模前后血清胰岛素、IL-10和IFN-γ的变化

选取造模后第2、13周成模小鼠和造模前正常小鼠血清测定血清胰岛素、IL-10和IFN-γ含量。与造模前正常小鼠相比，刚成模小鼠血清胰岛素水平显著降低(P <0.01)，直到造模后第13周，胰岛素水平能够维持在较低水平，与正常小鼠具有极显著性差异(P <0.01)(如图2所示)。与造模前正常小鼠相比，血清IL-10的水平显著降低，直到造模后13周时，IL-10一直在较低水平(P <0.01)(如图3所示)。与正常小鼠相比，血清IFN-γ的水平显著升高，到造模后13周，血清IFN-γ一直在较高水平(P <0.05)。 12

14

161820

22

**13

2

血清胰岛素(m )U /L 注射STZ后时间(周）)0**

图2 造模前后血清胰岛素变化

Fig.2 Effect of STZ on blood insulin of mice

**P <0.01,*P <0.05, compared with 0 week

400

600

800

13

2

注射STZ后时间(周）**I L -10(p g /m L )**

图3 造模前后血清IL-10变化

Fig.3 Effect of STZ on blood IL-10 of mice

**P <0.01,*P <0.05, compared with 0 week 600

800

100012001400

132

*

I F N -γ(n g /L )注射STZ后时间(周)*0

图4 造模前后血清IFN-γ变化

Fig.4 Effect of STZ on blood IFN-γ of mice

**P <0.01,*P <0.05, compared with 0 week

2.3 胰岛病理切片分析

图5A 为缓冲液组，HE 染色细胞着色浅、胰岛排列呈团索状，边缘规则，数目多。胰岛细胞无坏死，胰岛周围及胰岛内无炎细胞浸润。低倍镜下每视野胰岛数目较多，平均 5.14个。与缓冲液组相比，图5B 为模型组小鼠，低倍镜每视野下胰岛数目明显减少，平均胰岛数目为1.05个，胰岛周围以及胰岛内出现炎症，少数为2级。

图5 正常小鼠及模型小鼠胰腺HE染色

Fig.5 Photomicrographs of representative islets from pancreas tissue

A:control group B:model group

3讨论

本研究考察了小剂量多次腹腔注射链脲佐菌素诱导1型糖尿病模型，结果显示，STZ连

续多次小剂量注射后，小鼠出现多饮、多食、多尿等典型糖尿病“三多一少”的症状，胰腺病理切片显示模型组小鼠胰腺组织内出现炎性细胞浸润，血糖值升高。同时从小鼠血清胰岛素水平和细胞因子水平对模型成功与否进行鉴定，结果表明血清胰岛素水平显著下降，IL-10水平显著降低，IFN-γ水平显著升高，说明Th2介导的免疫应答下降，Th1介导的免疫应答升高，Th1/Th2失衡，造成胰岛β细胞损伤，导致1型糖尿病的发生，这符合人类1型糖尿

病的发病机制[3, 4]，说明成功诱导了1型糖尿病动物模型。

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