基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术
生物工程下游技术实验模块实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术
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实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术
1．实验目的
（1）掌握工程菌大规模培养及高密度发酵技术的原理。
（2）学习工程菌高密度发酵的技术方法。
2．实验原理
重组大肠杆菌的高密度培养是增加重组蛋白产率的最有效的方法，高密度发酵在增加菌密度的同时提高蛋白的表达量，从而有利于简化下游的纯化操作。重组大肠杆菌高密度培养受表达系统、培养基、培养方式、发酵条件控制等多种因素的影响，在实际操作中需要对各种因素进行优化，建立最佳的发酵工艺。发酵工艺优化的研究可通过每次改变一个因素或同时改变几个参数来进行，然后运用统计学分析寻找它们之间的相互作用。
工程菌提高分裂速度的基本条件是必须满足其生长所需的营养物质，因此，培养基成分和浓度的选择就成为首要解决的问题，在成分选择上，要尽量选取容易被工程菌利用的营养物质，例如，普通培养基中一般是以葡萄糖为碳源，而葡萄糖需经过氧化和磷酸化作用，生成1，3-二磷酸甘油醛，才能被微生物利用，即用甘油作为培养基的碳源可缩短工程菌的利用时间，增加分裂增殖的速度。目前，普遍采用6g/L的甘油作为高密度发酵培养基的碳源。另外，高密度发酵培养基中各组分的浓度也要比普通培养基高2～3倍，才能满足高密度发酵中工程菌对营养物质的需求。当然，培养基浓度也不可过高，因为过高会使渗透压增高，反而不利于工程菌的生长。
补料的流加方式直接影响着发酵的效果。分批补料培养的特点是，在培养过程中不断补充培养基，使菌体在较长时间里保持稳定的生长速率，从而达到高密度生长。但是在补料流加过程中既不能加入得过快，也不能加入得过慢。过慢则无法满足逐渐增加的菌体生长需要，同时也使培养过程中产生的抑制性副产物大量积累；而过快则使携带目的蛋白的质粒没有充裕的时间复制，降低目的蛋白的表达量；而且快速的细菌生长还易引发质粒的不稳定性。
高密度发酵是工程菌剧烈生长繁殖的过程，这期间对氧气的需求量也大大提高，这就需要及时调整通风量和搅拌速度，一般的高密度发酵通风速度达18L/min（20L发酵罐），搅拌速度达500r/min以上，需保持60%以上的溶氧饱和度。此外，还需要考虑通风速度和搅
拌速度的增加，对泡沫和发酵液粘稠度的影响。另外，工程菌的生长和繁殖也会使温度和PH值发生变化，也要及时进行调整在我们实验中，严格控制补料流加的速度，在有效提高菌体产量的同时提高目的蛋白表达量。
如果使用全自动发酵罐系统，发酵参数由计算机程序控制，则会大大完善高密度发酵工艺，因为程序化控制会使发酵参数自动达到最佳状态，而且参数的改变比手动要温和、平稳，这些都对工程菌的生长繁殖极为有利。
以上几个方面是建立工程菌发酵工艺的关键，对基因工程中的大多数工程菌来说，只要综合考虑，严格控制，都会建立起成熟稳定的高密度发酵工艺。
3．器材及试剂
（1）仪器
发酵罐、冷冻高速离心机，可见光分光光度计，恒温培养箱。
（2）试剂
①菌种和质粒宿主菌为BL21，表达质粒pET24a SA-IL-2和pET24aSA-GM-CSF由本研究所构建和常规保存。
②LB培养基（）
蛋白胨10g/L
酵母粉5g/L
NaCl 10g/L
高压灭菌20min，用时加入卡那霉素
③2Y 培养基（）
蛋白胨16g/L
酵母提取物10g/L
氯化钠4g/L
高压灭菌20min，用时加入卡那霉素
④半合成培养基（）
(NH4) 2SO4 L
NH4Cl 0. 3g/L
蛋白胨4g/L
酵母粉L
甘油10g/L
磷酸盐适量( KH2PO4∶K2HPO4∶Na2HPO4·12H2O=2∶4∶7)
微量元素MgSO4·7H2O L
高压灭菌20min，用时加入卡那霉素
⑤补料基质（）
酵母粉5g/L
蛋白胨10g/L
MgSO4·7H2O L
甘油170g/L
高压灭菌20min，用时加入卡那霉素
⑥Bradford蛋白浓度测定试剂盒
4．实验步骤
（1）发酵用菌种的筛选
取一管冷冻保存的甘油菌，用接种环接种于LB平板上，37℃培养过夜，随即挑选单克隆菌种于含有5mL LB培养液的试管中，30℃培养至A600nm为～时，IPTG诱导表达，离心收集菌体，进行SDS-PAGE以检测表达情况。将表达量最高的克隆作为发酵用种子,分装冷冻保存，每批发酵取出一管,以保证菌种的稳定性。
（2）工程菌的培养
①种子的活化：取冷冻保存的工程菌株划板，37℃培养约16h，挑单克隆接种于含3ml LB培养基的试管中，37℃、200r/min培养10h左右，然后按试管培养基量的2%转种1次，在相同条件下培养4h即成为活化种子。
②工程菌三角摇瓶培养：取活化的种子，以2%接种量接种于含200ml 2YT培养基的500ml 摇瓶中，37℃、250r/min旋摇培养，当OD600值为1～2时可以作为5L发酵罐的菌种。
③5L高密度发酵培养：发酵罐中的起始工作体积为，在罐中接入200ml三角摇瓶培养的种子(接种量为4%)。装料前校正pH和溶氧电极，发酵温度37℃，起始转速250rpm。发酵过程的几个关键参数为：
A.溶氧量及转速：空气流速设定为每分钟1个发酵体积，搅拌转速控制和溶解氧量参数相关联，每30s提高或降低10r/min，溶解氧量控制在35%左右，最大转速达800r/min时通入纯氧；
值：自动流加30%的氨水，使pH值保持在左右；
C.补料的流加：根据实际经验，用甘油代替葡萄糖作为碳源。补料的流加分两个阶段进行在5h的分批培养后，5～9h补加含5g甘油的补料；9～13h加入含100g甘油的补料。以上数据由微机自动收集和记录。整个发酵过程中,通过改变pH值、活化和诱导时间、溶解氧浓度和补料的流加，观察工程菌的生长和目的蛋白的表达。
（3）菌体浓度、目的蛋白表达量、菌体总蛋白的测定
①菌体浓度的分光光度测定波长为600nm；
②使用灰度扫描仪测定电泳条带中目的蛋白含量
③Bradford法测定菌体总蛋白
要点提示：
（1）发酵前应探索诱导外源基因高表达的最适条件，以使重组大肠杆菌既能高密度生长又能高效率表达外源目的蛋白。要实现外源基因的高表达而又不过多地影响宿主菌的生存，就必须优化诱导时期、诱导培养时间、诱导剂浓度等参数。
（2）发酵的全过程中不加补料，则由于碳源和氮源的供给不足，而收菌量和表达量均很低；所以，应该根据基因重组菌的需求，将限制性底物(通常为碳源)不断流加到反应器中，可避免高浓度底物的抑制作用。限制性底物的流加速率决定了细胞的比生长速率，从而影响重组菌的稳定性及外源基因的表达。维持补料分批发酵中重组菌恒定的比生长速率，应采用指数流加的方式，也可采用阶梯式提高流加速率的方法。
（3）高密度发酵中为了减少补料的稀释作用，通常采用高浓度补料液。这些浓液加入发酵液后，须立即混匀，否则细胞与局部的高浓度补料接触会造成代谢的失控。
微生物发酵工艺优化研究进展
龙源期刊网 https://www.360docs.net/doc/4b16752677.html, 微生物发酵工艺优化研究进展 作者：张锐 来源：《海外文摘·学术》2017年第03期 摘要：近些年，在有关技术领域中微生物的发酵技术已得到了非常广泛的应用，特别在医药行业内应用此种技术十分普遍。微生物科技发展非常快，因此，人们也有不断深入的研究微生物的发酵工艺。为此，本文对影响微生物发酵的培养条件和培养基进行了分析，又对优化微生物发酵工艺的办法进行了讨论研究，为微生物工程的发展提供参考价值。 关键词：发酵工艺；微生物；培养条件；工艺优化；培养基 中图分类号：TQ920.6 文献标识码：A 文章编号：1003-2177（2017）03-0058-02 1 微生物发酵受培养基的影响 微生物在进行生长、代谢时，培养基能供给微生物发酵所需要的能量与营养物质，对合成发酵产物的效率和产品的质量保障来讲有着重要意义。在进行微生物发酵时，因其发酵条件与菌种的差异和不同的发酵阶段，需要培养基的成分也不同。一般情况下，微生物生长需要的营养要素有生长因子，碳源，无机盐和氮源四类。 1.1 选择氮源与碳源作发酵的培养基 氮源为微生物提供含氮的有机物与蛋白质，并且，还是合成含氮产物的参与者。氮源主要是有机氮源与无机氮源两种，如豆粉，氨盐，蛋白胨与硝酸盐等。碳源能够为微生物提供能量来源，形成产物和构建细胞。碳源的形式有油脂，多糖，单糖，天然复合物，双糖等，如豆油，葡萄糖，淀粉与蔗糖等。选择发酵的培养基中要有均衡的碳源与氮源比，确保其菌体能够正常生长，而且还有利于合成产物的速率。 1.2 无机盐对发酵培养基的影响 微生物的生长和生成的代谢产物都与无机盐有关重要关系。微生物在进行生长代谢时，构成的辅酶中有磷的参与，它是构成微生物生长，代谢的重要因素。有些菌种的发酵产物中包含磷酸根，因此在进行培养基发酵时，添加很多的磷酸盐，这利于产物快速合成。在微生物发酵中钙离子对细胞的生理状况起到了调节作用，例如，使细胞膜的通透性降低，维持细胞状态等。很多酶都用镁来作催化剂。微生物生长所需微量元素有很多，如，钴，铁，锌，锰等。经研究证明，枯草芽孢杆菌的生长中需要锰离子的参与，在发酵培养基中添加适量的氯化锰，可以提升枯草芽孢杆菌生成的发酵物中抑菌物质的活性。 2 微生物发酵受培养条件的影响
红葡萄酒的酿造工艺及优化研究..
红葡萄酒的酿造工艺及优化研究 摘要：本文就红葡萄酒的生产工艺作出探讨，就红葡萄酒酒精主体发酵与浸渍过程同步进行的发酵策略，通过适当延长发酵时间达到增加红葡萄酒中多酚及有益色素如单宁的含量，同时采用苹乳发酵策略处理原料酒，达到降糖和增加酒肥硕感的目的，通过该工艺的探讨和优化以期为红葡萄酒的生产提出有益建议。 关键词：红葡萄酒；发酵；探讨和优化
Abstract： In this paper, we will explore the production technology of red wine.In the fermentation method that a simultaneous subject fermentation and dipping process, increase the polyphenols in red wine and good pigment by extening the fermentation time appropriatly,such as the content of tannins. Meanwhile, processing the raw material of wine throught malic acid-lactic acid fermentation process, to achieve the purpose of reducing blood sugar and adding the sense of fat of wine. Through the discussion and optimization of the process,in order to raise a good suggestions for red wine production. Key words: red wine, fermentation, discussion and optimization
基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术
生物工程下游技术实验模块实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术 创建人：时间：2013-04-17 【点击数： 482】 实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术 1．实验目的 （1）掌握工程菌大规模培养及高密度发酵技术的原理。 （2）学习工程菌高密度发酵的技术方法。 2．实验原理 重组大肠杆菌的高密度培养是增加重组蛋白产率的最有效的方法，高密度发酵在增加菌密度的同时提高蛋白的表达量，从而有利于简化下游的纯化操作。重组大肠杆菌高密度培养受表达系统、培养基、培养方式、发酵条件控制等多种因素的影响，在实际操作中需要对各种因素进行优化，建立最佳的发酵工艺。发酵工艺优化的研究可通过每次改变一个因素或同时改变几个参数来进行，然后运用统计学分析寻找它们之间的相互作用。 工程菌提高分裂速度的基本条件是必须满足其生长所需的营养物质，因此，培养基成分和浓度的选择就成为首要解决的问题，在成分选择上，要尽量选取容易被工程菌利用的营养物质，例如，普通培养基中一般是以葡萄糖为碳源，而葡萄糖需经过氧化和磷酸化作用，生成1，3-二磷酸甘油醛，才能被微生物利用，即用甘油作为培养基的碳源可缩短工程菌的利用时间，增加分裂增殖的速度。目前，普遍采用6g/L的甘油作为高密度发酵培养基的碳源。另外，高密度发酵培养基中各组分的浓度也要比普通培养基高2～3倍，才能满足高密度发酵中工程菌对营养物质的需求。当然，培养基浓度也不可过高，因为过高会使渗透压增高，反而不利于工程菌的生长。 补料的流加方式直接影响着发酵的效果。分批补料培养的特点是，在培养过程中不断补充培养基，使菌体在较长时间里保持稳定的生长速率，从而达到高密度生长。但是在补料流加过程中既不能加入得过快，也不能加入得过慢。过慢则无法满足逐渐增加的菌体生长需要，同时也使培养过程中产生的抑制性副产物大量积累；而过快则使携带目的蛋白的质粒没有充裕的时间复制，降低目的蛋白的表达量；而且快速的细菌生长还易引发质粒的不稳定性。 高密度发酵是工程菌剧烈生长繁殖的过程，这期间对氧气的需求量也大大提高，这就需要及时调整通风量和搅拌速度，一般的高密度发酵通风速度达18L/min（20L发酵罐），搅拌速度达500r/min以上，需保持60%以上的溶氧饱和度。此外，还需要考虑通风速度和搅
基因工程菌发酵操作流程
基因工程菌发酵操作流程 1.检查发酵车间是否达到发酵要求(所以设备处于待用状态)。 2.通知蒸汽车间按时送符合要求蒸汽。 3.种子罐基础培养基的领料及定容配制。 4.种子罐的PH、DO电极的校正安装和补料口堵头更换。 5.种子罐进料，调PH。 6.种子罐基础培养基在位灭菌，同时灭移种管道上段。 7.种子罐冷却后可连接酸、碱、消泡剂补料瓶。 8.种子罐培养基温度、PH(需进一步校准)、罐压、消泡达到发酵条 件。通知菌种室准备菌种转接。 9.无菌操作将种子罐所需MgSO4、Amp转入菌种转换罐。 10.种子罐扩增培养发酵阶段需平稳控制罐压、PH、DO、温度、消泡。 11.大罐基础培养基领料及配制。 12.大罐PH、DO电极校正安装及补料口堵头的更换。 13.大罐进料、定容、调PH；碱罐碱液的配制。 14.大罐基础培养基在位灭菌，同时对移种管道、进料管道、补料管 道、碱罐及碱管道上段的灭菌。 15.大罐基础培养基温度降至发酵温度后再次校准PH、DO。连接补 料瓶调节至发酵条件。 16.无菌操作将大罐所需MgSO4、Amp转入菌种转换罐并转入种子罐。 17.利用压力差将种子罐里的种子液移接到大罐。 18.补碱时，将管道上阀门打开。程序设为自动，控制流量。
19.补料罐补料培养基的领料定容配制。 20.补料罐补料培养基在位灭菌，同时对管道上段灭菌。 21.补料时，将管道上阀门打开。程序设为自动，设置流量。 22.诱导剂领料，在配料罐中加水配制定容。 23.将诱导剂打入种子罐，灭菌后保持罐压。 24.利用压力差将种子罐里的诱导剂移接到大罐。 25.一段时间后，大罐的PH、DO呈上升形态即为发酵结束，可放罐 离心。
基因工程菌的发酵控制
基因工程菌的发酵控制 近年来，基因工程已开始由实验室走向工业生产，一些珍稀药物如胰岛素、干扰素、人生长激素等已先后面市，但从许多研究中发现，基因重组菌的培养与发酵有其自身的特点。从培养工程的角度应考虑诸如营养源浓度的控制（碳源、氮源等）、最适生长条件的控制等因素；从生物学上应考虑诸如质粒稳定性的控制、质粒拷贝数的控制、转录效率和翻译效率的提高及代谢产物向菌体外的分泌等主要因素。 1 、营养源浓度的控制 由于大多数基因重组菌不能把所需的基因产物分泌到胞外，而只能靠破碎细胞后提取，因此要获得基因产物，首先必须得到大量菌体。为此基因重组菌的发酵一般采用高浓度菌体培养的方法，如大肠杆菌培养时最高可达125g 干菌体/L 发酵液，酿酒酵母可达145g 干菌体/L 发酵液。但要得到高浓度菌体，必须要提供高浓度的营养物质，而营养源浓度过高，渗透压也就高，反过来又会抑制重组菌的生长。此外，许多基因重组菌常是维生素或氨基酸的营养缺陷型菌株，为维持菌体生长，也必须添加必需量的生长因子营养物。常采用在调节pH 的同时补加氨基酸混合液和葡萄糖的方法。使整个培养期间，葡萄糖和氨基酸的浓度几乎保持恒定，菌体持续以最高生长速度生长，得到高浓度菌体。 2 、质粒的不稳定性及其控制 在重组菌工业化生产过程中，质粒的不稳定性是一个极为重要而独特的问题。带有质粒的细胞生长较慢，生长速率与所带质粒的大小成反比。此外，高水平克隆基因产物的生成也会导致生长缓慢或生长异常（表达越高，生长越慢）。由于质粒的不稳定性，在繁殖传代过程中还会有一部分细胞部分甚至完全丢失质粒，导致所需产物的产量下降。 质粒不稳定包括分离性不稳定和结构性不稳定两种类型。前者是细胞分裂过程中质粒没有分配到子细胞中而导致整个质粒的丢失；后者是由于重组质粒DNA 发生缺失、插入或重排而引起的质粒结构变化。 为了在工业化生产时使质粒的丢失降低到最低程度，除了构建合适的重组菌外，还应对重组菌进行一系列发酵试验，选择最佳的发酵条件。 使质粒稳定的主要措施：首先是组建合适载体和选择适当宿主，关于这两项措施应在构建携带质粒工程菌时即应加以考虑。在发酵过程中可以： （1 ）、施加选择压力 利用某些生长条件，只让那些具有一定遗传特性的细胞才能够生长。在重组菌发酵时，常采取这种方法来消除重组质粒的不稳定性，以提高菌体纯度和发酵生产率。
第7章 基因工程菌大规模培养
第7章基因工程菌的培养 7.1 工程菌的稳定性 一、工程菌不稳定的表现 工程菌的不稳定实际上包括质粒的不稳定及其表达产物的不稳定两个方面。具体表现为：质粒的丢失、重组质粒发生DNA片段脱落和表达产物的不稳定。 二、引起工程菌不稳定的一些因素及对策 工程菌稳定与否，取决于质粒本身的分子组成、宿主细胞的生理和遗传特性及环境条件等三个方面 工程菌不稳定的因素：控制基因的过量表达，菌体的比生长速率，培养温度，培养基的组成 1、培养基的组成 质粒在丰富培养基比在低限培养基中更加不稳定。合成培养基往往有利于宿主细胞的生长，但不利于外源基因的表达。 2、培养温度 进行工程菌培养时必须探索其最佳培养温度。通常低温有利于重组质粒的稳定遗传。 3、菌体的比生长速率 如果宿主菌的比生长速率比工程菌的大，质粒将严重丢失，导致工业上倒罐；如果宿主菌的比生长速率比工程菌小，大量繁殖时因竟争性利用基质，宿主细胞将会受到抑制，对发酵影响不大。 4、控制基因的过量表达 外源基因表达水平越高，重组质粒就越不稳定。可以采用两阶段培养法，即在发酵前期控制外源基因不过量表达，使质粒稳定遗传，到后期通过提高质粒的拷贝数和转录、转译效率使外源基因高效表达。 控制外源基因过量表达的方法： 1)如构建含可诱导启动子的工程菌，这种工程菌发酵生产时，可选择培养条件使启动子受阻遏制一定时间， 在此期间质粒稳定遗传，然后通过去阻遏（诱导）使质粒高效表达； 2)采用温度敏感型质粒，温度较低时质粒拷贝数少，当温度升高到一定时质粒大量复制、拷贝数剧增。 7.2 高密度培养 为了大量获得基因工程产品，通常采用高密度培养技术，即提高菌体的发酵密度，最终提高产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量)的一种培养技术，通常指分批补料发酵技术。这样不仅可减少培养体积、强化下游分离提取，还可缩短生产周期、减少设备投资，最终降低生产成本。 一、重组大肠杆菌的高密度培养 重组大肠杆菌高密度发酵成功的关键是补料策略，即根据工程菌的生长特点及产物的表达方式采取合理的营养流加方案。在重组大肠杆菌高密度发酵中，合理流加碳源降低“葡萄糖效应”是成功的关键。常见的流加技术有：恒速流加、变速流加、指数流加和反馈流加。 1、恒速流加 限制性基质以恒定流速流加进入发酵罐中供细胞生长和代谢用的一种培养技术。通常以补料前的耗糖速率作为流加补料速率。 特点： 1)相对于发酵罐中的菌体来说，营养物的浓度逐渐降低; 2)比生长速率也慢慢降低; 3)菌体密度呈线性增加。 2、变速流加 限制性基质以变速或梯度增加流速流加进入发酵罐中供细胞生长和代谢用的一种培养技术。 特点： 1)这样可以克服恒速流加中营养物的浓度逐渐降低的缺陷，菌体在较高密度下通过流加更多营养物 质来促进菌体的生长，并对产物的表达有利。 2)比生长速率不断改变。
基因工程菌大规模培养
第7章基因工程菌的培养 工程菌的稳定性 一、工程菌不稳定的表现 工程菌的不稳定实际上包括质粒的不稳定及其表达产物的不稳定两个方面。具体表现为：质粒的丢失、重组质粒发生DNA片段脱落和表达产物的不稳定。 二、引起工程菌不稳定的一些因素及对策 工程菌稳定与否，取决于质粒本身的分子组成、宿主细胞的生理和遗传特性及环境条件等三个方面 工程菌不稳定的因素：控制基因的过量表达，菌体的比生长速率，培养温度，培养基的组成 1、培养基的组成 质粒在丰富培养基比在低限培养基中更加不稳定。合成培养基往往有利于宿主细胞的生长，但不利于外源基因的表达。 2、培养温度 进行工程菌培养时必须探索其最佳培养温度。通常低温有利于重组质粒的稳定遗传。 3、菌体的比生长速率 如果宿主菌的比生长速率比工程菌的大，质粒将严重丢失，导致工业上倒罐；如果宿主菌的比生长速率比工程菌小，大量繁殖时因竟争性利用基质，宿主细胞将会受到抑制，对发酵影响不大。 4、控制基因的过量表达 外源基因表达水平越高，重组质粒就越不稳定。可以采用两阶段培养法，即在发酵前期控制外源基因不过量表达，使质粒稳定遗传，到后期通过提高质粒的拷贝数和转录、转译效率使外源基因高效表达。 控制外源基因过量表达的方法： 1)如构建含可诱导启动子的工程菌，这种工程菌发酵生产时，可选择培养条件使启动子受阻遏制一定时间， 在此期间质粒稳定遗传，然后通过去阻遏（诱导）使质粒高效表达； 2)采用温度敏感型质粒，温度较低时质粒拷贝数少，当温度升高到一定时质粒大量复制、拷贝数剧增。 高密度培养 为了大量获得基因工程产品，通常采用高密度培养技术，即提高菌体的发酵密度，最终提高产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量)的一种培养技术，通常指分批补料发酵技术。这样不仅可减少培养体积、强化下游分离提取，还可缩短生产周期、减少设备投资，最终降低生产成本。 一、重组大肠杆菌的高密度培养 重组大肠杆菌高密度发酵成功的关键是补料策略，即根据工程菌的生长特点及产物的表达方式采取合理的营养流加方案。在重组大肠杆菌高密度发酵中，合理流加碳源降低“葡萄糖效应”是成功的关键。常见的流加技术有：恒速流加、变速流加、指数流加和反馈流加。 1、恒速流加 限制性基质以恒定流速流加进入发酵罐中供细胞生长和代谢用的一种培养技术。通常以补料前的耗糖速率作为流加补料速率。 特点： 1)相对于发酵罐中的菌体来说，营养物的浓度逐渐降低; 2)比生长速率也慢慢降低; 3)菌体密度呈线性增加。 2、变速流加 限制性基质以变速或梯度增加流速流加进入发酵罐中供细胞生长和代谢用的一种培养技术。 特点： 1)这样可以克服恒速流加中营养物的浓度逐渐降低的缺陷，菌体在较高密度下通过流加更多营养物 质来促进菌体的生长，并对产物的表达有利。 2)比生长速率不断改变。
基因工程菌的发酵
基因工程菌的发酵 近年来，重组DNA技术(基因工程)已开始由实验室走向工业生产，走向实用。它不仅为我们提供了一种极为有效的菌种改良技术和手段，也为攻克医学上的疑难杂症——癌、遗传病及艾滋病的深入研究和最后的治愈提供了可能；为农业的第三次革命提供了基础；为深入探索生命的奥秘提供了有力的手段。现在由工程菌产生的珍稀药物，如胰岛素、干扰素、人生长激素、乙肝表面抗原等等部已先后面市，基因工程不仅保证了这些药物的来源，而且可使成本大大下降。但是从许多研究中发现，工程菌在保存过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性，因而工程菌不稳定性的解决已日益受到重视并成为基因工程这一高技术成就转化为生产力的关键之一。 第一节工程菌的来源和应用 一、何谓基因工程 基因工程（genetic engineering）是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法，根据人们的意愿，主要是在体外进行基因切割、拼接和重新组合，再转入生物体内，产生出人们所期望的产物，或创造出具有新的遗传特征的生物类型，并能使之稳定地遗传给后代。 基因工程的核心技术是DNA的重组技术。重组即利用供体生物的遗传物质或人工合成的基因，经过体外或离体的限制酶切割后与适当的载体连接起来形成重组DNA分子，然后在将重组DNA分子导入到受体细胞或受体生物构建转基因生物，该种生物就可以按人类事先设计好的蓝图表现出另外一种生物的某种性状。除DNA 重组技术外，基因工程还应包括基因的表达技术，基因的突变技术，基因的导入技术等。 基因工程一般分为4个步骤： 一是取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”；二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA；三是把重组DNA引入某种细胞；四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。DNA 分子很小，其直径只有20埃，约相当于五百万分之一厘米，在它们身上进行“手术”是非常困难的，因此基因工程实际上是一种“超级显微工程”，对DNA的切割、缝合与转运，必须有特殊的工具。要把目的基因从供体DNA长链中准确地剪切下来，可不是一件容易的事。1968年，沃纳·阿尔伯博士、丹尼尔·内森斯博士和汉密尔·史密斯博士第一次从大肠杆菌中提取出了限制性内切酶，它能够在DNA上寻找特定的“切点”，认准后将DNA分子的
发酵工程课程实验教学大纲(生物制药方向) (1)
《发酵工程》课程实验教学大纲（生物制药方向） 课程名称（中文）发酵工程 课程编号04118 课程性质独立设课课程属性专业课 教材及实验指导书名称《发酵工程实验》 学时学分：总学时60 总学分 3 实验学时36 实验学分 2 应开实验学期三年级四～五学期 适用专业制药工程 先修课程微生物学、生物化学、化工原理 一、课程简介及基本要求 发酵工程是整个生物工程的核心，是工业微生物实现实验室与工厂化生产的具体操作，是生物技术在生产实践中应用的原理及方法的一部分，是基因工程及酶工程等生物技术工业化的过程与方法。因此，通过对《发酵工程》的学习，不仅掌握发酵工程原理及发酵优化控制过程，而且对系统了解生物技术及其工业化应用都具有深远的意义。 通过《发酵工程》的学习，使学生进一步系统了解发酵工程从培养基配制到发酵罐生产，产品工程放大等一系列的操作原理及过程。 二、课程实验目的要求（100字左右） 发酵工程是一门实践性很强的工程学科，需要一定学时的实验教学实践，为今后从事相关工作打下良好的实践基础，通过《发酵工程》实验学习，不仅能够掌握发酵工艺操作的具体过程及反应过程控制方法，而且进一步了解目前发酵行业的具体产品生产工艺，对发酵生产能够进行指导与分析。 三、适用专业 制药工程（生物制药方向）。 四、主要仪器设备 操净工作台，摇床，7L和50L不锈钢通风发酵罐、离心机、生化培养箱 五、实验方式与基本要求 1．本课程以实验为主，为单独设课，所以开课后，任课教师需向学生讲清课程的性质、任务、要求、课程安排和进度、平时考核内容、期末考试办法、实验守则及实验室安全制度等。 2．该课以设计性实验为主，教材中只给出设计题目，实验前学生必须进行预习，设计报告经教师批阅后，方可进入实验室进行实验。 3．实验4人1组，在规定的时间内，由学生独立完成，出现问题，教师要引导学生独立分析、解决，不得包办代替。
大肠杆菌高密度发酵
课程设计说明书 课程名称：发酵工程 设计题目：大肠杆菌的高密度发酵 院系：生物与食品工程学院 学生姓名：****** 学号：201006030051 专业班级：10生物工程（2）班 指导教师：*****
课程设计任务书设计题目大肠杆菌的高密度发酵 学生姓名所在院系生物与食品工 程学院 专业、年级、班10生物工程 设计要求： 1、树立正确的设计指导思想，严谨负责、实事求是、刻苦钻研、勇于探索的作风和学风。 2、根据所给资料，按照任务书中提出的范围和要求按时独立完成，不得延误，不得抄袭他人成果。 3、说明书应字迹清楚文字通顺，并附有各项设计成果表，摘引其他书籍或杂志的材料必须注明出处。 4、设计标准要求规范、实用、切合实际。 5、设计应严格按有关设计规范进行。 6、设计结束后，以个人为单位提交设计说明书一份（后附流程图）。 学生应完成的工作： 1、明确设计标准适用的范围，给出产品以清晰明确的定义。 2、确定引用标准和技术要求，确定特定的理化指标及标准。 3、确定理化指标所采用的测定方法，一般首选国标或公认经典方法。新方法需经多试验或单一实 验法验证。 4、给出检验规则。 5、对产品的外观、流通保藏过程中操作给出规范。 参考文献阅读：[1] Fuchs C, Koste D, Wiebusch S, et al. Scale-up of dialysis fermentation for high cell densityCultivation of Escherichian coji[J]。Biotechnol, 2002, 93: B. 2002, 93: 243~251 [2] 刘子宇，李平兰，郑海涛等.微生物高密度培养的研究进展[J].中国乳业，2005，12:47~51 [3] Riesenberg D. High cell-density cultivation of Escherichian coli. Curr. Opin. Biotechnol.1991，2: 380~384 工作计划： 2013.5.27----2013.5.30 接受设计任务，查阅相关文献。 2013.5.30----2013.6.3 整理文献资料，进行产品标准的应用设计。 2013.6.3— 2013.6.9 整理设计内容，完成课程设计报告。 任务下达日期：2013年5月27日 任务完成日期：2013年6月9日 指导教师（签名）：学生（签名）：
发酵工艺研究
毕业论文（设计） 题 目 普那霉素发酵工艺研究 姓 名 管其君 学 号 3010402011 分院(系) 生物与化学工程分院 专业班级 生物工程（1）班 指导教师 金志华 2005年 6 月 14 日 宁波理工学院
摘要 分析了普那霉素发酵过程中种龄、初始pH值、发酵时间等工艺条件变化对普那霉素产量的影响规律，确定了最佳的发酵工艺条件。考察了不同碳氮源浓度的培养基对普那霉素产量的影响，优化了培养基成分。此外，在发酵液中添加大孔吸附树脂来解除终产物抑制方面作了尝试，发现添加大孔吸附树脂显著提高了普那霉素的产量，发酵水平达到1.49g/L。 关键词：普那霉素；始旋链霉菌；发酵；优化；大孔吸附树脂
Abstract The effects of seed age, initial pH, fermentation time on pristinamycins fermentation were studied and the most suitable fermentation conditions were determined. Also, the effects of medium containing with different concentration of carbon source and nitrogen source on pristinamycins fermentation were studied and the optimized medium was confirmed. By adding macroporous adsorbent resins into medium, the pristinamycins production was increased further, and the output of pristinamycins reached 1.49g/L Keywords: pristinamycins; Streptomyces prinstinaespiralis; fermentation; optimization; macroporous adsorbent resins
赖氨酸发酵工艺研究指导书
赖氨酸的发酵调控研究 一、实验目的 1、了解赖氨酸发酵常用的发酵菌种。 2、掌握L-赖氨酸发酵的工艺控制过程和方法。 3、能熟练运用发酵过程的基本原理，根据实验的不同要求，正确的设计实验方 案，并按照实验方案进行实验研究 二、实验原理 赖氨酸的生产方法有水解法(已淘汰)、合成法、酶法和直接发酵法。直接发酵法合成的赖氨酸是一种次级代谢产物。微生物合成赖氨酸是诱导物的诱导调节、自身产物的反馈调节、自身产物的分解调节、以及细胞膜透性的调节等次级代谢调节综合作用的结果。谷氨酸棒杆菌合成赖氨酸的自身产物调节作用如图1所示。 图1 谷氨酸棒杆菌合成赖氨酸的自身产物调节作用
三、材料与分析方法 1、菌种 谷氨酸棒杆菌（编号10065，中国微生物菌种保藏管理中心）。 2、培养基 （1）斜面培养基：牛肉膏1.1%，蛋白胨1.0%，葡萄糖0.5%，NaCl 0.5%，琼脂0.2%，pH7.0，在0.1Mpa压力下灭菌20min。 （2）种子培养基：糖蜜2.0%，豆饼水解液0.5%，(NH4)2SO4 0.4%，CaCO3 0.5%，K2HPO4 0.1%，MgSO4 0.04%，pH7.0,，于250mL三角瓶内装25mL种子培养基, 在0.1Mpa压力下灭菌20min。 （3）发酵培养基：糖蜜20%，豆饼水解液1.0%，玉米浆（氮源）0.6%，(NH4)2 SO4 2%，K2HPO4 0.1%，MgSO4 0.05%，FeSO4 0.2%，MnSO4 0.2%，pH7.0，于250mL三角瓶装液25mL发酵液，在0.1Mpa压力灭菌20min。 3、分析方法 （1）丝氨酸的测定 采用变色酸-分光光度法测定（见附录1）。 （2）赖氨酸的测定 发酵液中赖氨酸含量的测定采用茚三酮比色法，并加以改进。吸取发酵液4mL, 6000r/min离心10min去菌体及杂质。取上清液2mL，加茚三酮试剂（A液：茚三酮1.25g溶于94mL乙二醇甲醚中；B液：CuCl2·2H2O 1.97g溶于32mL 0.1mol/L柠檬酸溶液中；将A、B两液混合，用蒸馏水定容到250mL）4mL，混合，在沸水浴加热20min，冷却后测定475nm处的吸光度值，通过查赖氨酸标准曲线得知发酵液中赖氨酸的浓度。 （3）菌体形态观察、菌种培养特性和菌种主要生理生化特性检查 参照《工业微生物试验技术手册》的方法.。 （4）高丝氨酸脱氢酶活力的测定 从图1 可知，天冬氨酸半醛在高丝氨酸脱氢酶的作用下可以转化为丝氨酸，因此，本实验以一定反应条件下，单位时间内生成的丝氨酸的量所需的酶作为一个酶活力单位（U）1U=1ug/min。 ①粗酶液的制备 取5ml发酵液5500g离心15min，用pH 7.5的0.25mmol的Tris-HCL缓冲液洗涤两次，超声波破碎10min，10000g离心15min得上清液即为粗酶提取液；
克拉维酸发酵工艺研究
克拉维酸发酵中试工艺研究1 （之温度控制对溶氧及其效价影响） 摘要:本文在500L 自动控制发酵罐上进行了克拉维酸发酵过程温度控制优化试验。分别将发酵过程全程 温度控制在 24℃--26℃下进行发酵时, 通过对发酵各阶段的重要参数的对比分析, 发现温度对棒状链霉 菌的生长和代谢有重要影响, 降低对数生长期发酵温度可明显缓解前期供氧不足的矛盾。进而通过对发酵 过程的变温控制, 使克拉维酸的发酵相对稳定，且产量提高20--70%。 关键词:克拉维酸;发酵;变温控制;溶氧；效价； 克拉维酸( clavulanic acid, CA) 是一种β -内酰胺酶，抑制剂, 本身抗菌活性很弱。但当CA 与β-内酰胺类抗生素制成复方后可以增强β-内酰胺类抗生素的抗菌活性和增大其抗菌谱, 有助于克服β-内酰胺类抗生素耐药性。CA 是由棒状链霉菌( Str ep tomy ces clavuligerus)产生的一种次级代谢产物。在研究中我们发现CA 发酵在进入对数生长期后溶氧易于跌零, 影响 CA 生物合成。据文献报道温度对棒状链霉菌生长和CA 合成对CA 发酵的影响并研究如何通过变温控制提高CA的发酵水平。 1.材料和方法 1.1菌种实验室正常筛选菌种（出处保密，编号为BS-1） 1.2试剂 硫酸氢四丁基胺、NaH2PO4 ·2H 2O、乙腈( 色谱级) 、NaOH、Ac标准品。 1.3培养基 （1）种子培养基主要成分为甘油、豆粉、糊精; pH 8. 0, 121℃灭菌20min。 （2）一级种子培养基主要成分为淀粉、豆粉、磷酸二氢钠、酵母粉、豆油、碳酸钙、硫酸镁、消沫剂。
（3）二级种子培养基主要成分为淀粉、豆粉、磷酸二氢钠、豆油、氯化锌、氯化铁、氯化锰、氯化铜、消沫剂。 （4）发酵罐培养基主要成分为淀粉、豆粉、磷酸二氢钠、氯化钠、氯化铁、氯化镁、氯化锌、氯化钙、豆油、消沫剂。 1. 4 培养 （1）种子培养在无菌的条件下, 向装量为 600ml/ 3000m l三角瓶中接入3. 5ml 孢子液。在25℃, 180r/ min 条件下摇床培养 67h, （2）一级种子罐培养摇瓶菌丝转入6.5L/10L一级种子罐，接种量为15ml.培养18h。 （3）二级种子罐培养在无菌条件下,从一级种子转65L/150L二级种子罐，接种量为6.5L，培养16h。 （4）发酵培养在无菌条件下, 从二级种子罐转入300L/500L 发酵罐中进行培养，转后365L。采取分批补料工艺, 从16h 左 右开始补加甘油, 用20% 氨水自动调控pH 在7. 0±0. 05 范 围之内。以溶氧15% 作为最低限制性溶氧值, 每间隔6h 取样 进行离线参数测量, 包括pH 、菌浓、黏度等参数并涂片观察 菌丝状态;从25h以后开始进行效价测量。当大比例的菌丝开 始自溶、效价停滞时放罐。 1. 5 测定方法 （1）菌体浓度的测定采用菌丝占溶液体积的百分比表示。取10ml 发酵液反复的离心( 3500r/ min, 10m in) 和洗涤, 直 到离心后的固含物中不含有杂质为止, 记下菌丝的体积百分 比作为菌体浓度; 发酵液第一次离心得到的上清液留用。 （2）克拉维酸测定采用高效液相色谱法 色谱柱SB-C18 ( 4. 6m m×100m m, 3. 5 m) ；流速1.5ml/ min,温度 33℃, 注射量 20ul；检测波长 210；压力 60--100bar；
SHMT基因工程菌的构建方案设计
SHMT基因工程菌的构建 第四组 一、实验相关知识 1、丝氨酸羟甲基转移酶是丝氨酸合成中的关键酶，能催化甘氨酸和丝氨酸的相互转化，具体的催化反应如下： SHMT 甘氨酸+N5,N10-亚甲基四氢叶酸L-丝氨酸+四氢叶酸 在丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）作用下，甘氨酸同亚甲基四氢叶酸反应生成L-丝氨酸。该反应需要5-磷酸吡哆醛作为辅酶。N5,N10-亚甲基四氢叶酸上亚甲基可以来自于甘氨酸、甲醛、甲酸、蛋氨酸、胆碱和肌氨酸，它们同四氢叶酸反应生成N5,N10-亚甲基四氢叶酸。本实验以甘氨酸和甲醇为前体物发酵生产L-丝氨酸时，菌体积累L-丝氨酸与菌体含有的SHMT的活性直接相关，但由于SHMT的催化作用理论上是双向的，有必要了解在相同的培养条件或者在本文所用的菌株SHMT是否具有双向催化作用。 2、基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。
基因工程是生物工程的一个重要分支，它和细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程共同组成了生物工程。所谓基因工程是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。 3、丝氨酸是一种非必需氨基酸，它在脂肪和脂肪酸的新代谢及肌肉的生长中发挥着作用，因为它有助于免疫血球素和抗体的产生，维持健康的免疫系统也需要丝氨酸。丝氨酸在细胞膜的制造加工、肌肉组织和包围神经细胞的鞘的合成中都发挥着作用。 [大肠杆菌] 细菌染色体DNA 的制备（预习方案）一．实训目的 .学习并掌握细菌基因组的基本知识和提取方法 二．实训原理及相关知识 1.大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）革兰氏阴性短杆菌，大小 0.5×1～3微米。周身鞭毛，能运动，无芽孢。能发酵多种糖 类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后 即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，几占粪便干重的1/3。国 家规定，每升饮用水肠杆菌数不应超过3个大肠杆菌的抗原成
酱油发酵工艺研究
酱油发酵工艺研究 一、工艺分类 综观目前我国酱油发酵工艺的实际情况，大致可将其分为以下四类： 1、高盐稀态发酵 严格意义上的高盐稀态发酵应该指从日本引进的本酿造工艺，如北京和田宽、石家庄珍极、绍兴至味、昆山龟甲万等。 2、淋浇发酵 原先在南方一带普遍使用的大罐淋浇工艺，后来被上海一家酿造厂用于将低盐固态发酵工艺进行改进，在发酵后期进行淋浇，试图改善风味，并逐渐在全国推广。 3、低盐固态发酵 这是我国20世纪70年代普遍推行的一种工艺，通常以脱脂大豆及麸皮为原料，经蒸煮、曲霉制曲后与浓度低于15。骼盐水混合成固态酱醅，进行保温发酵。我国80％的酱油酿造企业采用此工艺。 4、传统酱缸发酵 我国酱园保留下来的传统工艺，即用大缸发酵，日晒夜露，夏日晒酱，秋冬出油。目前部分规模较小的企业尚在坚持，如：浙江沈荡酱园、淮安浦楼酱园、宿迁三园酱园、江阴华西食品酿造公司等。 二、各种工艺说明 1、高盐稀态发酵工艺 高盐稀态发酵工艺的关键点在于发酵阶段即处于高盐度稀醪状态，盐水19～20波美度，加入盐水的体积是原料体积的1.1～1.2倍(习惯上称为11—12水)，酱醪盐分在17％一18％。由于盐分大，故可以使发酵温度降低，有利于多种耐盐微生物作用；发酵周期长，通常在180 d左右，有利于发酵更彻底；同时添加乳酸菌、酵母，产生有机酸、醇、酯等物质，为呈现香气、提高风味备足了条件。其最大特点就是香气种类较多，达300余种，是其他工艺无法替代的。 那么，如何界定高盐稀态发酵工艺呢? 有三点：一是原料配比。原料为脱脂大豆和小麦，配比中小麦含量不能过分小于脱脂大豆。二是发酵温度控制在35℃以下，有利于酵母生长。三是应当有耐盐酵母参与发酵，能测出乙醇含量。符合以上条件生产出来的产品才能色泽清淡，纯香袭人，在凉拌、蘸食时方能突出食物的原味，才能以高盐稀态发酵工艺命名。食品工业上加工烤鳗、烤紫菜、烤雪饼等醇香食品时，也必须用这样的酱油。
基因工程菌发酵生产L-苯丙氨酸工艺优化
基因工程菌发酵生产L-苯丙氨酸工艺优化 时间：2005-5-17 10:56:24 作者：不详来源：中国发酵工业网点击数： 本站另注：L-苯丙氨酸已在国内江苏部分厂家有发酵工业规模化生产，但仍然推荐此文供大家研究参考，了解工艺配方和分析方法。 L-苯丙氨酸(L-phe)是人和动物体内不能合成的8种氨基酸之一,人们称其为必须氨基酸。L-phe在生物体内是转化成L-酪氨酸的原料,因而L-phe成为一些氨基酸输液和氨基酸饮膳所必须的成分。而且,L-phe是合成药物麦角胺、抗生物质和维生素B6的重要原料。同时,L-phe也是合成一些抗癌药物的中间体[1]。在食品工业中,L-phe最主要的用途是合成二肽甜味剂,俗称蛋白糖。基于L-phe广泛的应用前景,近年来L-phe成为氨基酸行业单品中产量增长最快的一种。目前,L-phe的生产方法有酶法、发酵法等,直接发酵法具有可利用廉价原料直接生产L-phe的优点,发酵法生产 L-phe,国外报道产酸率为2.8%,L-phe在我国还未实现规模生产[2]。本实验对构建的重组L-phe基因工程菌 E.coLiHB101. 进行发酵实验,研究了其发酵工艺条件及营养物质的流加对产物L-phe积累的影响。 1实验材料与方法 1.1发酵用菌株基因重组工程菌E.coLiHB101. 。 1.2培养基 1.2.1种子培养基蛋白胨1%;氯化钠1%;酵母粉0.5%;葡萄糖2%;调pH=7.5;抗菌素Km(硫酸卡那霉素)。 1.2.2发酵培养基Na2HPO4·12H2O20g/L;Na-citrate6g/L;Na-gLutamat e0.4g/L;酪氨酸0.6g/L;葡萄糖 20g/L;Km40mg/L。 1.2.3补料培养基CaCL2·2H2O0.6g/L;酪氨酸500mg/L;葡萄糖500g/L;MgSO4·7H2O1g/L;VB1500mg/L;氨水28%。 1.3培养方法1.3.1摇瓶培养250mL锥形瓶内装LB培养基25mL,接种菌种斜面后,于旋转摇床上,在37℃培养12h。 1.3.2深层培养 在2L自控发酵罐(美国进口)中装入1L发酵培养基。灭菌后接入5%的摇瓶种子。通气量为1000L/L·min时,于38.5℃下搅拌培养。搅拌转速根据溶氧(DO)调节;使用28%的氨水调节pH=7.0±0.2;采用流加葡萄糖工艺补料,补料速率由测定葡萄糖来控制。 1.4测定方法 1.4.1菌体浓度 通过测定培养液或其稀释液在波长660nm处的吸光度OD660确定菌体浓度。一个OD660单位相当于 0.267g/L(菌体干重)。当OD660<0.3时,有良好的线性关系。 1.4.2残糖浓度 用费林试剂法测定[3]。 1.4.3发酵液中L-phe浓度分析 用荧光法进行测定[4]。 2结果与讨论 2.1生长因子对苯丙氨酸积累的影响 通过添加不同浓度的酪氨酸,实验由图1示出:随着酪氨酸添加量的增加,产酸率提高,从发酵成本和产酸率两方面分析,得出酪氨酸的最适添加量为1.0～1.2g/L,既可得高产酸率3.68%,又可使成本不致过高。
乳酸菌高密度规模发酵工艺优化
乳酸菌高密度规模发酵工艺优化 随着人们对抗生素滥用的重视,益生菌越来越广泛地应用于饲料、食品和医药行业,乳酸菌作为一种微生物资源因此受到越来越多的关注。乳酸菌高密度规模发酵是为提高菌体的发酵密度而使用的技术手段和特殊的培养装置,使菌体密度相较于普通培养方式能有显著的提高,最终提高菌细胞的产出率的一种扩大培养方式。 在实际生产过程中,乳酸菌菌体密度是乳酸菌发酵产品的重要指标。本试验以嗜酸乳杆菌和乳酸乳球菌为研究对象,筛选适合其增殖的培养基,研究适合乳酸菌的培养条件,优化乳酸菌中试高密度发酵工艺以及冷冻干燥保护剂组成。 本文的研究结果如下:(1)两株乳酸菌的形态学特征乳酸乳球菌在MRS培养基上可以形成明显的白色菌落,直径在1mm左右,圆形边缘整齐,不透明,表面光滑无皱褶。在添加碳酸钙的固体培养基中,菌落周围由于产酸形成透明的水解圈。 显微镜下观察,细菌成球形,不形成链状。嗜酸乳杆菌在MRS培养基上可以形成明显的菌落。 菌落圆形、白色、凸起,表面光滑、边缘较光滑,直径在1mm左右。在添加碳酸钙的固体培养基中,菌落周围形成透明水解圈。 在显微镜下观察,细菌成短杆状。两株乳酸菌通过革兰氏染色均为紫色,是革兰氏阳性菌。 (2)乳酸菌培养条件前期发酵条件优化前期实验室工作通过对两株乳酸菌的条件优化摸索,确定了以乳清粉为中试培养基,并确定乳酸乳球菌的最适培养温度在37℃C左右、初始培养基pH值在6.5、接种量在2%-7%之间,而接种量对最大活菌数的影响并不显著。培养28h可获最多的活菌,最大活菌数为 1.92±0.15
×108CFU/mL;嗜酸乳杆菌的最适培养温度在37℃C左右、初始培养基pH值在 6-6.5、接种量在5%-7%之间。 嗜酸乳杆菌在乳清粉培养基中培养32h可获得最大活菌数为1.53±0.15 × 1 08 CFU/mL。(3)高密度规模化发酵工艺优化随着乳清粉含量的增加,通过离心获得的乳酸菌干重是不断增加的。 当乳清粉含量增加至60%时,细胞干重(DCW/L)增加至13.21 g/L。通过乳清粉的添加,可以显著提高发酵罐中乳酸菌的细胞干重。 而从菌粉获得率计算,当乳清粉含量增加至60%时,嗜酸乳杆菌获得率增加 至23.42%。(4)冷冻干燥保护剂优化通过对离心获得的菌体添加10%的脱脂奶粉和10%的葡萄糖,或添加10%脱脂奶粉和10%海藻糖能够达到较高的复苏率。 通过进一步筛选得到四种具有显著保护性能的保护剂,并通过对乳酸乳球菌冷冻干燥保护剂的四因素三水平正交实验,结果得出这四种因素对于冷冻干燥后复苏率的影响,从大到小的顺序依此是葡萄糖>硫酸锰>脱脂奶粉>海藻糖。这四个因素对于冷冻干燥后的复苏率的影响都是极显著的,是影响该实验结果的主要因子。 通过正交实验,确定了一种冻干保护性较强的冻干保护剂组合,这种冻干保 护剂配比为每公斤菌体添加葡萄糖90g、海藻糖90g、硫酸锰60g、脱脂奶粉30g。冷冻干燥后的菌粉在储藏时应保持低温的环境,本次实验制备的两种菌粉在-20℃C环境下密封保存4周后,存活率仍能超过50%。 (5)乳酸菌耐受实验两株冻干菌粉对于人工消化液均有一定的耐受能力,乳 酸乳球菌在人工胃液中模拟消化3h存活率9.3%。在人工肠液中,经过4h的模拟消化过程,乳酸乳球菌的存活率为8.6%。
那他霉素发酵工艺的研究(本科毕业)
那他霉素发酵工艺的研究 摘要：该实验以钠他霉素为菌种进行一系列的发酵，通过其单因素实验和正交实验，来确定了其最佳的培养基配方及发酵条件:葡萄糖 3.5%，大豆蛋白胨1.85%，酵母粉0.40%，初始pH值7.0，接种3%，50mL放入的250mL的三角瓶中，25℃，转速300r/min，发酵120h。最终在此配方和发酵条件下，纳他霉素产量可达到1.2g/L。 关键字：纳他霉素培养基发酵优化 前言 纳他霉素（Natamycin），也称游链霉素，是一种天然的多烯大环内酯类抗生素[1]。它是由纳塔尔链霉菌（Streptomyces Natalensis）经过发酵得到的一种次级代谢产物，能够有效抑制酵母菌和丝状真菌的生长及真菌毒素的产生，作为一种无毒害、低剂量的生物防腐剂，已被广泛应用于食品防腐和真菌引起的疾病的治疗[2]。目前，国际上已许可使用的生物防腐剂仅为乳酸链球菌素（Nisin）、纳他霉素（Natamycin）及聚赖氨酸（ε-poly-lysine）三种[3]。我国目前允许使用的仅为乳酸链球菌素和纳他霉素。钠他霉素作为一种新型的防腐剂，因为有其高效的杀菌效果以及无毒无害的安全保证，因此被各个行业所亲睐[4]。近几年在全球经济的发展迅速，人们的生活水平普遍提高了，因此对那些无毒无害的食品越来越亲睐，从而促进了各个行业开始寻找这种防腐剂。又因为钠他霉素高效的杀菌效果以及无毒无害的安全，所以钠他霉素就孕育而生。目前有30 多个国家已经将钠他霉素作为天然食品添加剂和防腐剂使用。 1 材料与方法 1．1材料 1.1．1菌种 生产菌株:褐黄抱链霉菌S.giLvosPoreus，ATCC13326。 1.1.2主要药品 无水葡萄糖分析纯上海生工生物工程有限公司 麦芽浸粉 RT 天津市化学试剂一厂