RT-PCR实验报告

逆转录pcr

rt-pcr 为反转录rcr（reverse transcription pcr ）和实时pcr（real time pcr）共同的缩写。逆转录pcr，或者称反转录pcr(reverse

transcription-pcr, rt-pcr)，是聚合酶链式反应(pcr)的一种广泛应用的变形。在rt-pcr

中，一条rna链被逆转录成为互补dna，再以此为模板通过pcr进行dna扩增。

由一条rna单链转录为互补dna(cdna)称作“逆转录”，由依赖rna的dna聚合酶（逆转

录酶）来完成。随后，dna的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖rna的dna聚合酶完成，

随每个循环倍增，即通常的pcr。原先的rna模板被rna酶 h降解，留下互补dna。

rt-pcr的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的rna。rt-pcr广泛应用

于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种rna的含量。（检测基因表达的方法，参见

northern blot法。）

rt-pcr有时候也会指代实时pcr(real-time pcr)。为了与逆转录pcr相区别，通常被写

作“定量pcr”(quantitative pcr)或者rtq-pcr(real-time quantitative pcr)。

实时pcr 实时pcr(real-time pcr)，属于定量pcr（q-pcr）的一种，以一定时间内dna的增幅量

为基础进行dna的定量分析。 real time pcr 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。

一种是在ds dna中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅dna序列中特定寡核酸序

列相结合的一种萤光探针（probe）。 real time pcr 与 reverse transcription pcr 相

结合，能用微量的rna来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种rt pcr

的组合又被称之为“定量rt-pcr（quantitative rt-pcr）”

rt-pcr技术相关试剂

oligo: 多聚体，相当于mrna引物

amv（m-mlv）：逆转录酶

dntp：脱氧核苷酸

rnase：rna酶抑制剂

pcr buffer：rt-pcr缓冲液

mgcl2：2价镁离子

pcr各步骤的目的

（一）预变性：

破坏dna中可能存在的较难破坏的二级结构。使dna充分变性，减少dna 复杂结构对

扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的dna模板，最好不要

吝

啬这个步骤。此外，在一些使用热启动taq酶的反应中，还可激活taq酶，从而使pcr

反应得以顺利进行。

（二）变性--退火--延伸循环：

①模板dna的变性：模板dna经加热至93℃左右一定时间后，使模板dna双链或经pcr

扩增形成的双链dna解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板dna与引物的退火(复性)：模板dna经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，

引物与模板dna单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：dna模板--引物结合物在taqdna聚合酶的作用下，以dntp为反应原料，

靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板dna 链互补的半保留复

制链。

（三）pcr仪扩增循环后72度延伸10分钟

用pcr仪扩增时,(变性.退火,延伸)循环完成后,继续72度延伸了10分钟的原因：

1.延伸时间取决于待扩增dna片段的长度。（当然是在反应体系一定的条件下）例如，使

用taqdna聚合酶，72度时的碱基掺入率为35-100bp/s，因此延伸速率为1kb/min。

2.根据延伸速率推得，扩增1kb以内的dna片段1min即可，而3-4kb则需要3-4min，

依次照推。通常在最后一轮要适当的将

延伸时间延长至4-10min，这样做是使pcr反应完全以提高扩增产量。

3.继续72度延伸了10分钟除了可以使pcr反应完全以提高扩增产量外，还有一个作用

是：在用普通taq酶进行pcr扩增时在产物末端加a尾的作用，可以直接用于ta克隆的进行。

什么是半定量pcr

半定量反转录－聚合酶链反应（semi-quantitative reverse transcription and

polymerase chain reaction ,sqrt-pcr）是近年来常用的一种简捷、特异的定量rna测定方

法，通过mrna反转录成cdna，再进行pcr扩增，并测定pcr产物的数量，可以推测样品中

特异mrna的相对数量。以半定量rt-pcr为基础建立起来的mrna含量测定技术，较含内标化

的rt-pcr定量测定的mrna的方法更为简便可行。这种方法不另设‘内标准,排除了俩对不

同引物之间的相互抑制和灵敏读差异，而且具有明显的剂量－效益关系和良好的重复性。步

骤： 1.抽提rna，2.反转录获得cdna，3.以cdna为模板做pcr 注意：步骤1，

rna抽提质量一定要好，注意污染。内参的选择，常用的有βactin和gapdh俩中。步骤

3，半定量rt-pcr应该再两管中进行，既内参和目的基因各一管，这样便于控制，做图的时

候可以放在一各泳道里跑！指数期和平台期一定要摸清楚！

半定量rt-pcr与荧光定量real-time pcr最大的区别就在于 semi-pcr需要跑电泳根

据条带亮度的强弱来判断模板拷贝数的高低或者是表达量的高低而real-time pcr则无需

电泳可以实时监测整个pcr的全程并且由给出的ct值及standard curve来判断gene拷贝

数的高低。

所以由上可见 semi-pcr不如real-time pcr精确。

至于rt 应该指 reverse transcription。

为了便于区分我们更偏好使用qpcr来特指 real-time pcr 同时要注意realtime-pcr的定性问题，有时候你扩增出来的很有可能只是引物二聚体。

所以要利用melting curve，如果是第一次做一个目的基因的realtime-pcr，还是要在2%的

琼脂糖凝胶中进行电泳，以确定与你要扩增的目的基因大小一致。

rt-pcr 只能通过模板pcr后扩增的结果间接的反应初始模板的量。而realtime-pcr的

结果直接可以看到初始模板的量。所以，

realitime-pcr更精确些。篇二：rt-pcr实验方法

逆转录pcr (rt-pcr)

实验四逆转录pcr (rt-pcr)【实验目的】1．了解用逆转录pcr法获取目的基因的原理。

2．学习和掌握逆转录pcr的技术和方法。【实验原理】聚合酶链式反应（pcr）过程利用模板

变性，引物退火和引物延伸的多个循环来扩增dna序列。因为上一轮的扩增产物又作为下一

轮扩增的模板，是一个指数增实验四逆转录pcr (rt-pcr) 【实验目的】

1．了解用逆转录pcr法获取目的基因的原理。

2．学习和掌握逆转录pcr的技术和方法。

【实验原理】

rt-pcr技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、表达差异，细胞中rna

病毒的含量和直接克隆特定基因的cdna序列。rt-pcr比其他包括northern印迹、rnase保

护分析、原位杂交及s1核酸酶分析在内的rna分析技术，更灵敏，更易于操作。

rt-pcr的基本原理（图4.1）。首先是在逆转录酶的作用下从rna合成 cdna，即总rna

中的mrna在体外被反向转录合成dna拷贝，因拷贝dna的核苷酸序列完全互补于模板mrna，

称之为互补dna（cdna）；然后再利用dna聚合酶，以cdna第一链为模板，以四种脱氧核苷

三磷酸（dntp）为材料，在引物的引导下复制出大量的cdna或目的片段。在rt时，有3

种引物可选择（表4.1) 。用1）和2）方法，

理论上是扩增的所有的cdna，还要用此产物做pcr的模板继续扩增。如果用3）方法，

先要去

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由图4.1不难看出，随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个

位点退火，产生短的，部分长度的cdna。这种方法经常用于获取5末端序列及从带有二级结

构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的rna模板获得cdna。为了获得最长的cdna，需

要按经验确定每个rna样品中引物与rna的比例。随机引物的起始浓度范围为50到250ng

每20μl反应体系。因为使用随机引物从总rna合成的cdna主要是核糖体rna，所以模板一

般选用poly(a)+rna。

oligo(dt)起始比随机引物特异性高。它同大多数真核细胞mrna 3端所发现的poly(a)

尾杂交。因为poly(a)+rna大概占总rna的1%到2％，所以与使用随机引物相比，cdna的数

量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性，oligo(dt)一般不需要对rna和引物的比例及

poly(a)+选择进行优化。建议每20μl反应体系使用0.5μg oligo(dt)。oligo(dt)12-18

适用于多数rt-pcr。

基因特异性引物（gsp）对于逆转录步骤是特异性最好的引物。gsp是反义寡聚核苷，可

以特异性地同rna目的序列杂交，而不象随机引物或oligo(dt)那样同所有rna退火。用于

设计pcr引物的规则同样适用于逆转录反应gsp的设计。gsp可以同与mrna 3最末端退火的

扩增引物序列相同，或gsp可以设计为与反向扩增引物的下游退火。

已经制备好的双链cdna和一般dna一样，可以插入到质粒或噬菌体中，为此，首先必需

有适当的接头(linker)，接头可以是在pcr引物上增加限制性内切酶识别位点片段，经

pcr扩增后再克隆入相应的载体；也可以利用末端转移酶在载体和双链cdna的末端接上一段

寡聚dg和dc或dt和da尾巴,退火后形成重组质粒,并转化到宿主菌中进行扩增。

本实验是要从小鼠肝脏组织中获取fas配体基因，fas配体(fasl)是一分子量约为40u

的ii型跨膜糖蛋白，属tnf家族成员。活化的t细胞可表达fas和fasl，并通过fas/fasl

系统介导细胞凋亡作用，保持机体免疫系统的自稳态。近年研究发现在部分癌细胞中fasl

表达增强，并与肿瘤的复发转移有关。我们采用rt-pcr方法克隆fasl全长cdna并构建其表

达载体，可以为进一步研究fasl的功能提供条件。在上下游引物的5’端分别加上了限制酶

切位点及其保护碱基（即hind iii和bamh i），以便可以通过双酶切将目的片段定向的克隆

到原核表达载体pgfpuv上（附录图4.3）。

为了便于后续实验可以用金属螯和层析的方法分离和纯化目的蛋白，我们改造了pgfpuv，

在其上加了6×his标签。

【试剂与器材】

（一）试剂

1.总rna（或mrna）

2.rna酶抑制蛋白（rnase inhibitor）：40 u/ml

3.dntp 混合物 (各10 mm)

4.oligo(dt)12-18：2.5 ?mol/l

5.10*逆转录合成缓冲液（10?rt buffer）：250 mmol/l tris-hcl (ph8.3)，375 mmol/l

kcl，15 mmol/l mgcl2

6.amv逆转录酶 5u/?l

7.基因特异性5’和3’引物各20 ?mol/l

8.tap dna聚合酶 5u/?l

9.10*pcr缓冲液：500mmol/l kcl，100mmol/l tris?cl，在25℃下，ph9.0，1.0% triton

x-100，15mmol/l mgcl2。

（二）器材

1）pcr仪，

2）pcr管，

3）微量移液器

【操作方法】

（一）逆转录：

1)建立rt反应体系：

2)涡旋混匀，42℃反应1小时，95℃加热5分钟，然后置于冰上。

（二）pcr扩增：

1)建立pcr反应体系：

2)将上述反应体系涡旋混匀, 按下列程序运行循环：

step2-4运行30个循环，其中复性温度主要依据引物的不同而不同。

（三）取10-20ul pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，余下的pcr产物-20℃保存。

【注意事项与提示】

1.逆转录反应过程，需建立无rnaase环境，以避免rna的降解。

2.成功的逆转录反应决定于高质量的模板rna。高质量的rna至少应保证全长并且不含

逆转录酶的抑制剂，如edta或sds。此外，rt-pcr所遇到的一个潜在的困难是rna中沾染的

基因组dna。使用较好的rna分离方法，如trizol reagent，会减少rna制备物中沾染篇三：

rt-pcr实验方法总结

rt-pcr实验方法总结

rt-pcr实验有三步：抽提rna，rt，pcr。

要求：

1.做rt前必需测rna浓度，逆转录体系对rna量还是有一些要求，常用500ng或1ug。

2. rt按要求做，一般不会出太大问题。

3. pcr，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cdna存在，不

是单改变mg2+浓度、退火温度能解决的。

1）rt和pcr时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须

在rt时，引物设计有3种方法即a：random 9mers；b：oligo dt-adaptor primer；和

c：特异的下游引物。如果用a和b方法，是扩增的所有的cdna（理论上），还要用此产物做

pcr 的模板继续扩增。

如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？

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? pcr试剂 pcr对照特异性

pcr试剂盒

pcr克隆试剂盒

rna rnase 检测/ 去除

rt-pcr试剂 rt-pcr标准品定量pcr试剂定量pcr标记总rna分离纯化盒 pcr

产物纯化核酸酶聚合酶反转录酶 rt-pcr实验方法大全

发布日期:2007-7-10 热门指数:10516 分享 | 收藏

rt-pcr实验有三步：抽提rna，rt，pcr。

要求：

1.做rt前必需测rna浓度，逆转录体系对rna量还是有一些要求，常用500ng或1ug。

2. rt按要求做，一般不会出太大问题。

3. pcr，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cdna存在，不

是单改变mg2 浓度、退火温度能解决的。

1）rt和pcr时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须

在rt时，引物设计有3种方法即a：random 9mers；b：oligo dt-adaptor primer；和

c：特异的下游引物。如果用a和b方法，是扩增的所有的cdna（理论上），还要用此产物做

pcr 的模板继续扩增。

问题：

在做rt-pcr遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中

可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的

条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组

织中都表达，篇四：rt-pcr实验方法总结大全

rt-pcr实验方法总结大全

rt-pcr实验有三步：抽提rna，rt，pcr。

要求：

1.做rt前必需测rna浓度，逆转录体系对rna量还是有一些要求，常用500ng或1ug。

2. rt按要求做，一般不会出太大问题。

3. pcr，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cdna存在，不

是单改变mg2+浓度、退火温度能解决的。

1）rt和pcr时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须

在rt时，引物设计有3种方法即a：random 9mers；b：oligo dt-adaptor primer；和

c：特异的下游引物。如果用a和b方法，是扩增的所有的cdna（理论上），还要用此产物做

pcr 的模板继续扩增。

问题：

在做rt-pcr遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中

可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的

条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组

织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来）

从这两种组织中提取的rna的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这

有关呢？请高手指教！解答：

1.rt-pcr有两种做法：

条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再pcr。

但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比

较利于pcr的进行，当然也可能是我买的kit不太好。（promega）。

2.rt-pcr应具备的条件

高质量的rna（保留后可做5‘，3’race）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量

的话还应考虑rna的浓度或是cdna的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将

rna的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样）；体系的均一性等。

3.race

我做过race（3’race是宝生物的kit；5‘race是gibico），但现在再进行另一个同源

基因的3‘race时却怎么也p不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个已

经获得了全序列（race的方法），而另一个基因的3’utr却增么也扩不出来，我推测是不是

该基因的3‘utr太长的缘故，我都快绿了，有无

rt-pcr的常用内标b－actin 和gapdh的使用有选择性吗？比如不同的细胞，不同的刺

激。

有关内参：

rt-pcr内参照可以在一个管子里做（那样也是图好看一些），最好分开两管，把除了引

物之外的mixture统一配，拍照后，算目的基因和内参的比值，这就是基因表达的相对浓度。

问：我曾经作过同一管的pcr，内有actin 和目的基因引物。虽然可见到两条均一条带

但图片质量不理想（而且酶量、mg2+加倍）。请教mxbdna2003 ，你是如何处理同一管的pcr

的各成分的浓度？

答： it should determined the amount of rna. but it not for the quantitity of

the pcr. it just was convienent to guess the amount ot the template<(for rt and

pcr) and bettrer for publication and editor if he don not know the preocedure much. but the amount just using accurate piptte

is wrong. it shoud be remembered to do the inner control of housekeeping gene

everytime.

在同一管中做rt，其实没有什么问题，不需要taq魅加量，taq酶本来就是过量的^-^，

（平时做pcr的时候，完全可以再省一些taq酶的，半斤八两就可以了，我想这肯定再很多

贴子里应该都谈到了。mg就跟不能变了，一变整个体系就变了。能看到均一条带就很好了。

关键是摸，十八摸（太少，只争朝夕，开个玩笑）虽然用不着，但是摸上3、5摸总是必

要的，首先遥分开摸，然后再一起摸，直到摸的好了，还要考虑比较的不同的模板中的量，

所以我们不建议再同一管中进行，因为还有互相竞争抑制的问题，即使不同基因之间。

有关内参的建议：

一定要做内参的，每一次，我想。不作内参的结果是不可信的

电泳可以不一起跑，没有关系，计算的是相对表达程度，着我在好几封帖子里都谈了，

再说一边我得观点，1、半定量和定量rt-pcr做的都是基因相对表达量，不是绝对表达量，

除非你能准确知道来自多少细胞，但是细胞还有死的呢。2、以电泳为基础的半定量rt-pcr

本身是不可信的，作为实验的粗筛是可以的，但不能作为最终结果的，3、半定量rt-pcr应

该再两管中进行，除非内参基因和目的基因表达相同，长度差不多，gc含量相似，或者实在穷的要省pcr管和taq。

关于平台期和线性期的问题，实际上线性期是指数期，只不过碰巧2的冥和2的倍数是相同的。看上去任何一个时期都可以，实际上是不对的，因为牵涉到酶促动力学的问题，这个我也不懂，有一些专门的文章，好像，涉及到很多化学的东西。我们学医的，也没必要知道那些，但是其中主要是因为模板引物酶原料和buffer之间的关系，这种反应单靠改变其中一种成分没有用的，酶一直是过量，再加酶也没用，引物ntp都是这样。烟鬼正传，最好选线性期的开始阶段，但是要在你的凝胶成像分辨范围内，所以选一个这两种的契合点。给你一张图你就明白了，再开始的时候酸的是切线，这图我在 *** 帖过。

关于引物设计，再可能的情况下，除了常规要求之外，最好兼顾跨内含子（不过，根据要求，还可以专门设计隔内含子的，这样还可以用于基因组pcr）、长度小于500bp－600bp 等等。

引物当然要设计成一样的退火温度，即使不再一管中，也要一样的，要在一台机器里啊。我的引物占了冰箱一格，大部分是一个温度，这样任何几个都可以拿来披，也不用查。

我反复说过了，别用软件，就用眼睛看，软件涉及的在好，有些基因在它出软件的时候，还没发现呢，跟不要说在基因组的位置和序列了，怎么考虑内含子的问题呢？

18s的引物也和著名的βactin一样是设计的，只要拿到序列就可以了，但是限制是只能用总rna为模板，但是比actin和bubulin等可准多了，更不要说gapdh这个破烂了。18s 除了在细胞中更相同（量）外，主要是它占的比例远远高于看家基因，所以定量更加准确，我想，不知对不对，请几位主任和eeflying指教。我认为，就像你用某一种东西的数量去概括，因该选那种多的东西，说一座房子是由2000块砖造成的，比说又29根梁更准确吧。更不要说没有看家基因不看家的缺点，因为他是服务于整个基因组表达谱什么的。

pe有专门的用于实时pcr的内参试剂盒，就是用18s，不过我们看懂使用的那条序列，不知有没有人用过，告知其序列和genbank号。

正好问一下，我查了一些序列，一直没有去合成，主要是因为手上的actin的荧光探针还没有完，当初和成了一堆。

有那位高手用过18s的内参，请问您的序列（我指的是模板的序列）？

原位杂交最好用rna做探针，效果好一些，反正你有钱卖roche的盒子，而且量也能保证，因为转录过程嘛，沿着一条线突突地跑就是了。正义反义也容易理清。

我觉得做rt-pcr的方法和条件及应注意的事项就是那么几条,许多专业书都有详细的描述,但是许多人还是历经多次磨难，有时就是得不出结果。因此，我认为因为每个人所要克隆的片断不同，引物不同等，因此对不同的人来说还是有他自己的特殊性,我的以下经历说明：做实验时各人的情况不同,做不出时还是要好好动一下脑子。记得我开始我的ｒｔ－pcr时，按常规方法，提取总ｒｎａ后，首先用自己设计的下游引物进行逆转录，不断改变反应条件，进行了ｎ次均没有结果。后来考虑到本人的克隆的pcr的片断位于我们实验另一位同学克隆的片断当中，而该同学已经用rt-pcr克隆出她的片断（尽管她用这些ｒｔ－ｐｃｒ产物做模版再进行ｐｃｒ时也没办法重复出她的产物），因此，我先用她的引物和条件扩增出她的片断，然后用她的ｒｔ－ｐｃｒ产物作模板（有点改进，逆转录反应换用了９mers随机引物），用我的引进物进行一般pcr，终于得到我的产物，测序结果完全正确。尽管我的这个经历别人很人遇到，但足可以说明实验可以有自己的模式，书本的知识和别人的经验很重要，但有时也不定要受到书本框框和别人经验的限制

请问：

1 引物的特异退火温度怎样设定？可以根据gc 和at含量算出吗？可以用引物报告单上的tm值吗？

2 pcr时20微升体系中cdna应加多少比较合适？mgcl2应加多少？各个成分的量有无确

定标准？

3 pcr结果跑电泳，actin有，但跑不出目的条带，有几种原因？与cdna的量少有关吗？

mg离子太多是否会抑制taqase的活性？

一般来说引物报告单伤得是对的,也可以自己算,实际上重要的各条引物一致,剩下的可

以摸的.

20中是指体积还是量?只要不明显改变体系的离子强度,加1,2ul都可以的.mg要调的,

但我总觉得没有书里讲的那么玄乎,我都是常年不变的.

如果内参照有,目的没有,至少证明不是美丽惹的祸.原因书里应该都说了.

在所有rna实验中，最关键的因素是分离得到全长的rna。而实验失败的主要原因是核

糖核酸酶（rna酶）的污染。由于rna酶广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。因而

rna制剂中只要存在少量的rna酶就会引起rna在制备与分析过程中的降解，而所制备的rna

的纯度和完整性又可直接影响rna分析的结果，所以rna的制备与分析操作难度极大。

在实验中，一方面要严格控制外源性rna酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性

的rna酶。rna酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。

外源性的rna酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物

学实验中使用的rna酶也会造成污染。这些外源性的rna酶可污染器械、玻璃制品、塑料制

品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的rna酶。

一、防止rna酶污染的措施

1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。

2. 塑料器皿可用0.1% depc水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，

故不能使用）。

3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% h2o2

室温10min，然后用0.1% depc水冲洗，晾干。

4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% depc，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去

残留的depc。不能高压灭菌的试剂，应当用depc处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm

滤膜过滤除菌。

5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。

6. 设置rna操作专用实验室，所有器械等应为专用。

二、常用的rna酶抑制剂

1. 焦磷酸二乙酯（depc）：是一种强烈但不彻底的rna酶抑制剂。它通过和rna酶的活

性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。

2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的rna酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使rna

酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对rna酶有强烈的变性作用。

3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和rna酶结合形成过渡

态类物质，几乎能完全抑制rna酶的活性。

4. rna酶的蛋白抑制剂（rnasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。rnasin

是rna酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种rna酶结合，使其失活。

5. 其它：sds、尿素、硅藻土等对rna酶也有一定抑制作用。

mrna的分离与纯化

真核细胞的mrna分子最显著的结构特征是具有5’端帽子结构（m7g）和3’端的poly(a)

尾巴。绝大多数哺乳类动物细胞mrna的3’端存在20-30个腺苷酸组成的poly（a）尾，通

常用poly（a+）表示。这种结构为真核mrna的提取，提供了极为方便的选择性标志，寡聚

（dt）纤维素或寡聚（u）琼脂糖亲合层析分离纯化mrna的理论基础就在于此。

mrna的分离方法较多，其中以寡聚（dt）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。

此法利用mrna 3’末端含有poly（a+）的特点，在rna流经寡聚（dt）纤维素柱时，在高盐

缓冲液的作用下，mrna被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水

的情况下，mrna被洗脱，经过两次寡聚（dt）纤维柱后，即可得到较高纯度的mrna。

寡聚(dt)纤维素柱纯化mrna

一、试剂准备

1．3m醋酸钠（ph 5.2）

2．0.1m naoh

3．1×上样缓冲液：20mm tris-hcl(ph 7.6)；0.5m nacl；1m edta（ph 8.0）；0.1%sls(十

二烷基氨酸钠。配制时可先配制tris-hcl(ph 7.6)、nacl、edta（ph 8.0）的母液，经高压

消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至65℃时，加入经65℃温育（30min）

的10%sls至终浓度为0.1%。

4．洗脱缓冲液：10mm tris-hcl(ph 7.6)；1mm edta(ph 8.0)；0.05% sds 5．无水乙醇、70%乙醇

6．depc

二、操作步骤

1．将0.5-1.0g寡聚（dt）-纤维悬浮于0.1m的naoh溶液中。

2．用depc处理的1ml注射器或适当的吸管，将寡聚（dt）-纤维素装柱0.5-1ml，用3

倍柱床体积的depc h2o洗柱。

3．使用1×上样缓冲液洗柱，直至洗出液ph值小于8.0。

4．将rna溶解于depc h2o中，在65℃中温育10min左右，冷却至室温后加入等体2×

上样缓冲液，混匀后上柱，立即收集流出液。当rna上样液全部进入柱床后，再用1×上样

缓冲液洗柱，继续收集流出液。

5．将所有流出液于65℃加热5min，冷却至室温后再次上柱，收集流出液。

6．用5-10倍柱床体积的1×上样缓冲液洗柱，每管1ml分部收集，od260测定rna含量。

前部分收集管中流出液的od260值很高，其内含物为无poly(a)尾的rna。后部分收集管中流

出液的od260值很低或无吸收。

7．用2-3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱poly(a+)rna，分部收集，每部分为1/3-1/2柱体

积。

8．od260测定poly(a+)rna分布，合并含poly(a+)rna的收集管，加入1/10体积3m naac

（ph5.2）、2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃放置30min。

9．4℃离心，10000g×15min，小心吸弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀。[注意：此时

poly(a+)rna的沉淀往往看不到]。4℃离心，10000g×5min，弃上清，室温晾干。

10. 用适量的depc h2o溶解rna。

三、注意事项

1．整个实验过程必须防止rnase的污染。

2．步骤（4）中将rna溶液置65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个，一个是

破坏rna的二级结构，尤其是mrna poly(a+)尾处的二级结构，使poly(a+)尾充分暴露，从

而提高poly(a+)rna的回收率；另一个目的是能解离mrna与rrna的结合，否则会导致rrna

的污染。所以此步骤不能省略。

3．十二烷基肌氨酸钠盐在18℃以下溶解度下降，会阻碍柱内液体流动，若室温低于18℃

最好用licl替代nacl。

4．寡聚（dt）-纤维素柱可在4℃贮存，反复使用。每次使用前应该依次用naoh、灭菌 ddh2o、

上样缓冲液洗柱。

5．一般而言，107哺乳动物培养细胞能提取1-5μg poly(a+)rna，约相当于上柱总rna

量的1%-2%。

rna酶保护试验((rnase protection assay,rpa)是通过液相杂交的方式,用反义rna探

针与样品杂交，以检测rna表达的技术。与northern杂交和rt-pcr比较，rpa有以下几个

优点：

1．检测灵敏度比northern杂交高。由于northern杂交步骤中转膜和洗膜都将造成样

品和探针的损失，使灵敏度下降，而rpa将所有杂交体系进行电泳，故损失小，提高了灵敏

度。

2．由于pcr扩增过程中效率不均一和反应“平台”问题，基于pcr产物量进行分析所

得数据的可靠性将下降，而rpa没有扩增过程，因此，分析的数据真实性较高。

3．由于与反义rna探针杂交的样品rna仅为该rna分子的部分片段，因此，部分降解

的rna样品仍可进行分析。

4．步骤较少，耗时短。与northern杂交相比，省去了转膜和洗膜的过程。

5． rna-rna杂交体稳定性高，无探针自身复性问题，无须封闭。

6．一个杂交体系中可同时进行多个探针杂交，无竞争性问题。

7．检测分子长度可以任意设置，灵活性大。

rpa的缺点是需要同位素标记探针。

一、试剂准备

1． gacu pool：取100mm atp、ctp、gtp各2.78μl、100mm utp 0.06μl，加depc h2o

至100μl。

2. 杂交缓冲液 ipes 0.134g、0.5m edta（ph8.0）20μl、5m nacl 0.8ml、甲酰胺8ml，

加depc h2o至10ml。

3. rnase消化液：5m nacl 120μl、1m tris-hcl(ph7.4) 20μl、0.5m edta（ph8.0）

20μl、rnase a(10mg/ml) 8μl、rnase t1(250u/μl) 1μl，加depc h2o至2ml

二、操作步骤

1．反义rna可由含t7或sp6启动子的重组质粒为模板制备，也可以用含启动子的pcr

产物为模板制备，本文介绍后者。

（1）设计含t7启动子的pcr引物

由于pcr产物将作为合成反义rna的模板，所以一对引物中的下游引物5’-端要含t7

启动子序列: t7启动子序列为：5’-taatacgactcactataggg 引物设计的其他要求与一般pcr引物的设计相同。pcr产物的长度决定了反义rna探针

的长度，具体设计时可考虑100-400bp长。最好采用巢式pcr，即先扩增出一较长的片段，

再以该片段为模板扩增出较短的片段，以保证探针的特异性，如下图所示：

上游引物

下游引物ⅱ t7 启动子序列

下游引物ⅰ

（2）pcr篇五：rt-pcr实验步骤

rt-pcr实验步骤

一、总rna提取

1. 取200mg组织，放到1.5mlep管中，加入1mltrizol剪碎。

2. 震荡30s。

3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。

4. 12000×g，4℃离心，15min。

5. 吸上层无色水相，移入另一ep管中（约0.5ml）。

6. 加等体积异丙醇，-20℃，30min。

7. 12000×g，4℃离心，10min。在管底部可见微量rna沉淀

8. 弃上清，加75%乙醇1ml，振荡。

9. 7500×g，4℃离心，10min。

10. 弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5-10min。

11. 沉淀溶于20μldepc水，取1μl加入79μldepc水测od260/od280

12. 计算浓度与纯度，-70℃保存。

二、逆转录合成cdna第一链

反应体系如下

混匀快速离心一次

反应条件如下

-20℃冰箱冻存

三、pcr反应

混匀快速离心一次

反应条件如下

pcr产物-20℃冰箱保存

取pcr产物8μl 加5×loading buffer 2μl 2%琼脂糖凝胶电泳120v。 100ma 30min

溴化乙锭染色，凝胶成象仪成象并保存结果。

rt-pcr实验方法总结1,2

rt-pcr实验有三步：抽提rna，rt，pcr。

要求：

1.做rt前必需测rna浓度，逆转录体系对rna量还是有一些要求，常用500ng或1ug。

2. rt按要求做，一般不会出太大问题。

3. pcr，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cdna存在，不

是单改变mg2+浓度、退火温度能解决的。

1）rt和pcr时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须

在rt时，引物设计有3种方法即a：random 9mers；b：oligo dt-adaptor primer；和

c：特异的下游引物。如果用a和b方法，是扩增的所有的cdna（理论上），还要用此产物做

pcr 的模板继续扩增。

问题：

在做rt-pcr遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织

中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性

的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种

组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来）

从这两种组织中提取的rna的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这

有关呢？请高手指教！

解答：

1.rt-pcr有两种做法：

条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再pcr。

但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比

较利于pcr的进行，当然也可能是我买的kit不太好。（promega）。

2.rt-pcr应具备的条件

高质量的rna（保留后可做5‘，3’race）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量

的话还应

考虑rna的浓度或是cdna的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将rna

的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样）；体系的均一性等。

3.race

我做过race（3’race是宝生物的kit；5‘race是gibico），但现在再进行另一个同

源基因的3‘race时却怎么也p不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个

已经获得了全序列（race的方法），而另一个基因的3’utr却增么也扩不出来，我推测是不

是该基因的3‘utr太长的缘故，我都快绿了，有无

rt-pcr的常用内标b－actin 和gapdh的使用有选择性吗？比如不同的细胞，不同的刺

激。

有关内参：

rt-pcr内参照可以在一个管子里做（那样也是图好看一些），最好分开两管，把除了引

物之外的mixture统一配，拍照后，算目的基因和内参的比值，这就是基因表达的相对浓度。

问：我曾经作过同一管的pcr，内有actin 和目的基因引物。虽然可见到两条均一条带

但图片质量不理想（而且酶量、mg2+加倍）。请教mxbdna2003 ，你是如何处理同一管的pcr

的各成分的浓度？

答： it should determined the amount of rna. but it not for the quantitity of

the pcr. it just was convienent to guess the amount ot the template<(for rt and

pcr) and bettrer for publication and editor if he don not know the preocedure much.

but the amount just using accurate piptte is wrong. it shoud be remembered to do the

inner control of housekeeping gene everytime.

在同一管中做rt，其实没有什么问题，不需要taq魅加量，taq酶本来就是过量的^-^，

（平时做pcr的时候，完全可以再省一些taq酶的，半斤八两就可以了，我想这肯定再很多

贴子里应该都谈到了。mg就跟不能变了，一变整个体系就变了。能看到均一条带就很好了。

关键是摸，十八摸（太少，只争朝夕，开个玩笑）虽然用不着，但是摸上3、5摸总是必

要的，首先遥分开摸，然后再一起摸，直到摸的好了，还要考虑比较的不同的模板中的量，

所以我们不建议再同一管中进行，因为还有互相竞争抑制的问题，即使不同基因之间。

有关内参的建议：

一定要做内参的，每一次，我想。不作内参的结果是不可信的

电泳可以不一起跑，没有关系，计算的是相对表达程度，着我在好几封帖子里都谈了，

再说一边我得观点，1、半定量和定量rt-pcr做的都是基因相对表达量，不是绝对表达量，

除非你能准确知道来自多少细胞，但是细胞还有死的呢。2、以电泳为基础的半定量rt-pcr

本身是不可信的，作为实验的粗筛是可以的，但不能作为最终结果的，3、半定量rt-pcr

应该再两管中进行，除非内参基因和目的基因表达相同，长度差不多，gc含量相似，或者实

在穷的要省pcr管和 taq。

关于平台期和线性期的问题，实际上线性期是指数期，只不过碰巧2的冥和2的倍数是

相同的。看上去任何一个时期都可以，实际上是不对的，因为牵涉到酶促动力学的问题，这

个我也不懂，有一些专门的文章，好像，涉及到很多化学的东西。我们学医的，也没必要知

道那些，但是其中主要是因为模板引物酶原料和buffer之间的关系，这种反应单*改变其中

一种成分没有用的，酶一直是过量，再加酶也没用，引物ntp都是这样。烟鬼正传，最好选

线性期的开始阶段，但是要在你的凝胶成像分辨范围内，所以选一个这两种的契合点。给你

一张图你就明白了，再开始的

时候酸的是切线，这图我在 *** 帖过。

关于引物设计，再可能的情况下，除了常规要求之外，最好兼顾跨内含子（不过，根据

要求，还可以专门设计隔内含子的，这样还可以用于基因组pcr）、长度小于500bp－600bp 等等。

引物当然要设计成一样的退火温度，即使不再一管中，也要一样的，要在一台机器里啊。我的引物占了冰箱一格，大部分是一个温度，这样任何几个都可以拿来披，也不用查。

我反复说过了，别用软件，就用眼睛看，软件涉及的在好，有些基因在它出软件的时候，还没发现呢，跟不要说在基因组的位置和序列了，怎么考虑内含子的问题呢？

18s 的引物也和著名的βactin一样是设计的，只要拿到序列就可以了，但是限制是只能用总rna为模板，但是比actin和bubulin等可准多了，更不要说gapdh这个破烂了。18s 除了在细胞中更相同（量）外，主要是它占的比例远远高于看家基因，所以定量更加准确，我想，不知对不对，请几位主任和 eeflying指教。我认为，就像你用某一种东西的数量去概括，因该选那种多的东西，说一座房子是由2000块砖造成的，比说又29根梁更准确吧。更不要说没有看家基因不看家的缺点，因为他是服务于整个基因组表达谱什么的。

pe有专门的用于实时pcr的内参试剂盒，就是用18s，不过我们看懂使用的那条序列，不知有没有人用过，告知其序列和genbank号。

正好问一下，我查了一些序列，一直没有去合成，主要是因为手上的actin的荧光探针还没有完，当初和成了一堆。

有那位高手用过18s的内参，请问您的序列（我指的是模板的序列）？

原位杂交最好用rna做探针，效果好一些，反正你有钱卖roche的盒子，而且量也能保证，因为转录过程嘛，沿着一条线突突地跑就是了。正义反义也容易理清。

我觉得做rt-pcr的方法和条件及应注意的事项就是那么几条,许多专业书都有详细的描述,但是许多人还是历经多次磨难，有时就是得不出结果。因此，我认为因为每个人所要克隆的片断不同，引物不同等，因此对不同的人来说还是有他自己的特殊性,我的以下经历说明：做实验时各人的情况不同,做不出时还是要好好动一下脑子。

记得我开始我的ｒｔ－pcr时，按常规方法，提取总ｒｎａ后，首先用自己设计的下游引物进行逆转录，不断改变反应条件，进行了ｎ次均没有结果。后来考虑到本人的克隆的pcr的片断位于我们实验另一位同学克隆的片断当中，而该同学已经用rt-pcr克隆出她的片断（尽管她用这些ｒｔ－ｐｃｒ产物做模版再进行ｐｃｒ时也没办法重复出她的产物），因此，我先用她的引物和条件扩增出她的片断，然后用她的ｒｔ－ｐｃｒ产物作模板（有点改进，逆转录反应换用了９mers随机引物），用我的引进物进行一般pcr，终于得到我的产物，测序结果完全正确。