现代色谱理论

第二章现代色谱理论

色谱法(Chromatography)是一种分离分析方法。它是利用各物质在两相中具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，这些物质在两相中进行多次反复的分配来达到分离的目的。

俄国植物学家M.Tswett于1906年首先提出色谱法。

色谱法分类

流动相名称固定相名称

气体气相色谱固体气固色谱

液体气液色谱液体液相色谱固体吸附剂液固色谱

液体液液色谱

键合固定相键合相色谱

多孔固体尺寸排阻色谱

离子交换剂离子交换色谱

纸纤维中的水纸色谱

固体吸附剂薄层色谱

超临界流体超临界流体色谱类似LC 超临界流体色谱

按分离机理：

吸附色谱

分配色谱

离子交换色谱

凝胶色谱法或尺寸排阻色谱（选择渗透）

亲和色谱法

第一节色谱法中常用参数

一、色谱流出曲线

1保留值

22

1ln 22σ=W σ4=b

W 死时间t 0

保留时间t R

调整保留时间t’R ：t’R =t R -t O

死体积，保留体积，调整保留体积

2 区域宽度

半峰宽

峰底宽

标准偏差σ：0.607倍峰高处的色谱峰宽度的一半

3 容量因子ｋ’

一定的温度、压力条件下，分配达平衡时，组分在两相中的总量之比称分配比k ′，又称容量因子。

k ′与K （分配系数）的关系为：

相对保留值 ：

4 柱效率

塔板理论

理论塔板数可按下式计算：

有效塔板数ｎeff

有效塔板高 m s W W K ==组分在流动相中的总量组分在固定相中的总量'β''K V V K V W V W c c K s m s m m s m s ====βK V V K k m s =='')1()2(')1(')2(')1()2(1,2R R V V k k K K ===αn

L H =22122121)(54.5)(54.5)(54.5W d W V W t n R R R ===2

22)(16)(16)(16b R b R b R W d W V W t n ===

H eff ＝L/ｎeff =H[(1+k’)/k’]2

表示色谱流出的曲线可以近似地采用对称的Gauss 正态分布曲线来描述。然而在实际工作中，色谱工作者从来就没有得到过真正的Gauss 型色谱峰。无数次的实验实验证明，正常的色谱峰都是非对称的拖尾峰。随着柱管效率的不断提高，色谱峰的非对称性越来越明显。 5 分离度

组分的保留时间的差别取决于固定相的热力学性质，差别越大，表示固定相对组分的选择性越高；两峰底宽越窄，表示柱效越高。

R s =1.5，此时，两组分的分离程度达99.87%，因此用Rs =1.5作为相领两峰完全分离的指标。当R s =1.0时，两峰分离程度达97.72%。如果两峰的高度相差10倍，当R s =1.0时，低含量组分的分离程度只有88%，因为两峰交叉“污染”时，在低含量组分中夹杂的在两峰等高时的相同高含量组分所占的比例增大。

6 各色谱参数之间的关系

保留时间和分配容量的关系

分离度、柱效率和容量因子间的关系

t R =t 0*(1+k’)=(1+k)*L/u=(1+k)*nH/u

)(2

1)2()1()

1()2(b b R R s W W t t R +-=)1()'1(m

s o R V V K u L k t t +=+=o

R o o R t

t t t t k ''=-=22222)1()1(16''+-=k k a a R n s '2'22114k k a a n R s +?-?=

t R=16Rs2[α/(α-1)]2* [(1+k’)3/k’2 ]H/u

色谱流出曲线重要信息：

（l）根据色谱峰的个数，可以判断样品中所合组份的最少个数．

（2）根据色谱峰的保留值(或位置)，可以进行定性分析．

（3）根据色谱峰下的面积或峰高，可以进行定量分析．

（4）色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据．

（5）色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(和流动相)选择是否合适的依据．

二、表征液相色谱柱填充性能的重要参数

现在高效液相色谱分析中使用的色谱柱具有以下特征：

(1) 固定相使用全多孔的、粒径5－10μm的填料。

(2) 色谱柱具有较小的内径（4－6m m），短的柱长（10－25cm）和高的入口压力（5－10MPa）。

(3) 色谱柱具有高柱效

表征液相色谱柱的填充情况常用总孔率、柱压力降和柱渗透率表示。

1总孔率εT(total porosity)

指被固定相填充后的色谱柱，在橫截面上可供流动相通过的孔隙率。

εT＝F/(u?лr2)= F?t M/(L?лr2)= (F?t M/V)

F－流动相的体积流速，cm3/s；u－流动相的平均线速，cm/s；r－柱内径的半径，cm；t M －柱的死时间；L－柱长，cm；V－色谱柱的空体积。

εT表达了色谱柱填料的多孔性能，当使用全多孔硅胶固定相时，εT约为0.85，使用非多孔的玻璃珠（或硅胶）固定相时，εT约为0.40，可认为是柱中颗粒之间的孔率，用ε表示。由此可知，对非多孔填料柱，其εT＝ε，对全多孔填料柱，其εT＝2ε。

色谱柱的自由截面积q= εT?лr2, 即流动相通过色谱柱时能使用的截面积。

则u=F/q=F/(εT?лr2)

2柱压力降ΔP(column pressure decreasing)

ΔP可用达西(Darcy)方程式计算：

ΔP=η?L?u/(k o?d p2) = φ?η?L?u/d p2 =P i-P o

η－流动相的粘度，mPa?s；k o－色谱柱的比渗透系数；d p－固定相颗粒直径，μm；φ－色谱柱的阻抗因子；P i、P o－色谱柱的入口和出口压力，MPa。

比渗透系数k o、阻抗因子φ和孔率ε关系：

k o=1/φ=ε3/[180(1-ε)2]

则

u=ΔP?d p2/(φ?η?L)= k o?ΔP?d p2/(η?L)

3柱渗透率K F(column permeability)

表示流动相通过柱子的难易程度。在HPLC中，使用液体流动相，粘度大于气体，固定相粒子又小，为保证柱子在较低压力下正常操作，总希望柱渗透率要大。

K F= k o?d p2 = d p2 /φ= d p2?ε3/[180(1-ε)2]≈d p2/1000

(ε＝0.40, φ=1000)

K F=u?η?L/ΔP= F?η?L/(εT?лr2?ΔP)= η?L2/(ΔP?t M)

保留时间

t M= η?L2/( K F?ΔP) =η?L2?φ/( d p2?ΔP)

（K F= d p2 /φ）

t R= t M(1+k’)

t R与上述这些参数都有关，影响色谱分离过程动力学。

第二节高效液相色谱的速率理论

一、液相色谱速率理论

1956年荷兰学者van Deemter等在研究气液色谱时，提出了色谱过程动力学理论—速率理论。他们吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而在动力学基础上较好地解释了影响板高的各种因素。该理论模型对气相、液相色谱都适用。Van Deemter方程的数学简化式为：

H＝A＋B/u+Cu

H min=A+2(BC)1/2

U opt=(B/C)1/2

在HPLC中，溶质在色谱柱中的谱带扩展是由涡流扩散、分子扩散和传质阻力三方面的因素决定的。

在HPLC中，对理论塔板高度的贡献为：

H＝H E＋H L＋H S＋H MM＋H SM

1．涡流扩散（Eddy diffusion）项H E

当样品注入由全多孔微粒固定相填充的色谱柱后，在液体流动相驱动下，样品分子不可能沿直线运动，而是不断改变方向，形成紊乱似涡流的曲线运动。导致峰形的扩展。

峰形的扩展与液体流动相的性质、线速度、样品的性质、固定相的性质无关，仅与固定相的粒度和柱填充的均匀程度有关。

其对理论塔板高度提供的贡献为

H E＝A＝2λd P

式中，d P是固定相平均粒径：λ是不均匀因子，它表达了色谱柱填充的均匀程度，当全多孔球形固定相的粒度为40～5 μm时，λ值约为1～2。

2 ．分子扩散（Molecular diffusion）项H L

当样品以塞状（或点状）进样注入色谱柱后，沿色谱柱的轴向，即流动相向前移动的方向，会逐渐产生浓差扩散，也可称作纵向扩散，而引起色谱峰形的扩展。

对理论塔板高度的贡献

H L=B/u=2νD M/u

式中ν—柱中填料间的弯曲因子（ν≈0.6）；D M—溶质在液体流动相中的扩散系数（D M ≈10-5 cm2/s）；u—液体泳动相在色谱柱中的平均线速（cm/s）。

样品在色谱柱中滞留的时间愈长，色谱谱带的分子扩散也愈严重。由于D M的数值很小，因此H L项对总板高的贡献也很小，在大多数情况下，可假设H L≈0，此点也是在高效液相色谱分析中，当注入样品呈现点状进样时，存在无限直径效应的根本原因。

3．固定相的传质阻力（The resistance to mass transfer in the stationary phase）项H s

溶质分子从液体流动相转移进入固定相和从固定相移出重新进入液体流动相的过程，会引起色谱峰形的明显扩展。

在流动相中溶质分子的迁移速度依赖于它在液液色谱的液相固定液中的溶解和扩散，或依赖于它在液固色谱的固相（吸附剂）上的吸附和解吸。

固定相的传质阻力引起的色谱峰形的扩展

1-进样后起始峰形；2-载体；3-固定液（液膜厚度为d f）；4-液体流动相；5-溶解在固定液表面溶质分子到达峰的前沿；6-溶解在固定液内部溶质分子到达峰的后部尾；7-样品移出色谱柱时的峰形。

固定相的传质阻力对板高的贡献，对液液色谱可表示为

H s=q? [k’/(1+k’)2]?(d f2/D L)? u

式中q—构型因子（对均匀液膜或薄壳材料q=2/3；对大孔固定相q=1/2、对球形非多孔固定相q=1/30）；k’ —容量因子；d f—固定液液膜（或薄壳）厚度；D L—溶质在固定液中的扩散系数，cm2/s。

对液固色谱可表示为

H s=2t a[k’/(1+k’)]2u=2t d[k’/(1+k’)2]u

式中t a—样品分子在液体流动相的平均停留时间；t d—样品分子被吸附在固定相表面的平均停留时间。

4．移动流动相的传质阻力（The resistance to mass transfer in the moving mobile phase）项H MM

在固定相颗粒间移动的流动相，对处于不同层流的流动相分子具有不同的流速，溶质分子在紧挨颗粒边缘的流动相层流中的移动速度要比在中心层流中的移动速度慢，因而引起峰形扩

展。与此同时，也会有些溶质分子从移动快的层流向移动慢的层流扩散（径向扩散），这会使不同层流中的溶质分子的移动速度趋于一致而减少峰形扩展。

移动流动相的传质阻力对板高的贡献可表示为：

H MM＝Ω(d P2/D M)u

式中，Ω为色谱柱的填充因子，对柱长较短、内径较粗的柱子Ω数值较小。

5．滞留流动相的传质阻力（The resistance to mass transfer in the stagnant mobile phase）项H SM

柱中装填的无定形或球形全多孔固定相，其颗粒内部的孔洞充满了滞留流动相，溶质分子在滞留流动相的扩散会产生传质阻力。对仅扩散到孔洞中滞留流动相表层的溶质分子，其仅需移动很短的距离，就能很快的返回到颗粒间流动相的主流路，而扩散到孔洞中滞留流动相较深处的溶质分子，就会消耗更多的时间停留在孔洞中，当其返回到主流路时必然伴随谱带的扩展。

滞留流动相的传质阻力对板高的贡献可表示为：

H SM= [(1-Φ+k’)2/30(1-Φ)(1+k’)2]?[d P2/γo?D M]u

式中Φ-孔洞中滞留流动相在总流动相中占有的百分数；γo–颗粒内部孔洞的弯曲因子。

速率理论是从动力学观点出发，依据基本的实验事实研究各种色谱操作条件（液体流动相的性质及流速、固定相基体的粒径、固定液的液膜厚度、色谱柱填充的均匀程度、固定相的总孔率等）对理论塔板高度的影响，从而解释在色谱柱中色谱峰形扩展的原因，前述影响色谱峰形扩展的各种因素，可用范第姆特（Van Deemter）方程式表达。

它的简化表达式为：H＝A＋B/u+Cu

U opt=(B/C)1/2

HPLC和GC的H-u曲线比较

由低的H min值可看出HPLC色谱柱要比GC

的填充柱具有更高的柱效。由低的u opt值可

看出H-u曲线具有平稳的斜率，表明采用高

的液体流动相流速时，色谱柱效无明显损

失，这为HPLC的快速分离奠定了基础。

二、诺克斯方程式

在高效液相色谱发展过程，早期多使用37～55 μm的薄壳型固定相，后又发展了5～

10 μm无定形或球形全多孔固定相，现又发展了3～5 μm球形非多孔固定相。由于固定相粒度的差异，使制备出的色谱柱性能呈现明显的不同，为了在相同条件下，比较不同粒度固定相填充的色谱柱的性能，基汀斯（J.C. Giddings）首先提出了描述色谱柱性能的折合参数的概念。诺克斯（J.H. Knox）使用折合参数提出了和范氏方程式相似的诺克斯方程式，进一步阐明影响色谱峰形扩展的因素，并用于比较、判断不同粒度固定相填充的色谱柱性能的优劣。

1、描述色谱柱性能的折合参数

基汀斯提出的无量纲折合参数有：

折合柱长λ＝L/d p

折合理论塔板高度h=H/ d p

折合线速V=u? d p /D M

折合柱径ζ＝d c/d p

d c为色谱柱内直径。

在上述折合参数中λ、h 、V、ζ是用填充固定相颗粒的平均粒度d p求归一化。而V则表示流动相在柱内的平均线速度u与流动相在颗粒内扩散线速度（D M / d p）的比值，即用流动相在颗粒内的扩散线速度对u 进行归一化。

V =u? d p /D M =u/( D M / d p) = (L/t M) ? (d p /D M) =(λ? d p2)/ (t M? D M)

它提供可用统一的参数来比较由不同粒度固定相所填充色谱柱的性能。

2、诺克斯方程式

诺克斯采用上述折合参数的概念，提出了和范第米特方程式相似的诺克斯方程式，指出色谱柱的折合理论塔板高度是由涡流扩散、分子扩散和传质阻力三方面因素提供的，表达为：

h = h f+ h d+ h m

涡流扩散分子扩散传质阻力

h f：涡流扩散项

hf＝A V1/3

式中，V为折合线速；A为常数，反映柱填充的均匀程度，好的色谱柱，A值约为0.3～1.0，差的色谱柱，A值约为2～5。

h d：分子扩散项

h d =[2D eff(1+k’)]/(u?d p)=B/V

其中，D eff 为有效扩散系数，可表示为

D eff= γ?D M/(1+k’) +k’ ?γo?D s/(1+k’)

式中γ—色谱柱内颗粒间的弯曲因子；γo—柱中全多孔颗粒内的弯曲因子。

对每种确定的溶质，其B值约为1.5～2.0，但B值会随k’的变化而改变。

h m传质阻力项

h m=q? [k’/(1+k’)2] ?(D M/D S)V=CV

式中，q是构型因子，约为1/30，对确定的溶质，C值约为0.01～0.3之间。

诺克斯方程式的简化表达式为:

h＝A V1/3 +B/V +CV

诺克斯方程式的重要特点在于，当用同种材料、不同粒度的固定相装填色谱柱时，通过绘制h-V图，可获相似的曲线，并可在相同的基点上，比较不同粒度色谱柱的性能，对色谱柱性能的优劣作出判断。

第三节“无限直径”效应和柱外效应

一、“无限直径”效应

在速率理论中已经指出，由于高效液相色谱柱装填了5～10 μm的微粒固定相，并且溶质在液体流动相中的扩散系数很小(DM－10-5 cm2/s)，当溶质以点进样方式注入色谱柱后，溶质在色谱柱中的分子扩散很小，因而产生从样品注入柱中心起直至样品离开柱的整个分离过程中样品分子不接触柱内壁的现象，即产生可保持高柱效的“无限直径”效应（infinite diameter effect）。

对5 μm、10 μm固定相，使用柱内径d c为4.6 mm的色谱柱，柱长L从100mm到250mm，都可保持“无限直径”效应，柱压力降ΔP在10.0 MPa以下，柱效n可达5×103以上。对20 μm固定相使用柱内径成为7～10mm的色谱柱，柱长L从500～1000mm，都可保持“无限直径”效应，且柱效n可达3×103以上的中等水平。

拉尔德（Laird G.R.）等已证明当溶质达到柱内壁时，柱效显著下降，会丧失“无限直径”效应，塔板高度可增大2～3倍。

二、柱外效应

柱外效应（extra-column effect）系指由色谱柱以外的因素，引起的色谱峰形扩展的效应。柱外因素常指从进样口到检测池之间，除色谱柱以外的所有死空间，如进样器（I）、连接管（C）、检测器（D）等的死体积，都会导至色谱峰形加宽、柱效下降。总的柱外效应（OC）引起峰形扩展所提供的方差应为各个独立影响因素提供的方差之和。

σ2(OC)=σ2(I)+σ2(C)+ σ2(D)

１进样器死体积因素引起的峰形扩展

２毛细管连接管死体积因素引起的峰形扩展

３检测器死体积因素引起的峰形扩展

通常一般检测池池体积多为5～10 μL，因此由检测池死体积引起的峰形扩展并不明显。但应注意到当使用小于5 μm的固定相，或柱长小于50 mm，或柱内径小于2 mm时，检测池的死体积必须小于或等于2 μL，才会引起较小的柱外峰形扩展。

柱外效应存在的直观标志，可由k’值小的组分（如k’＜3 ）的峰形拖尾或峰宽增加而呈现出来。也可通过绘制H-u曲线看出，k’值小的组分的H-u曲线形状与k’值大的组分明显不同。此外非保留峰的理论塔板高度大于保留峰时也是存在柱外效应的一个标志。通常柱外效应对k’值较大的组分影响并不明显，应当指出当使用微填充柱或毛细管柱或柱效愈高时，柱外效应的影响也愈显著。