BD分析TH17细胞
流式细胞术分析TH17细胞
1.肝素钠真空抗凝采血管取人外周血全血1-2ml，血液室温放置，8小时内进行检测，否则需弃用。
2.取5个流式管，分别标记空白管、CD4抗体单染管、IL-17A抗体单染管、IL-17A同型对照抗体管、待测管，每个流式管分别加入100μl全血，用RPMI1640(不含FBS)1:1等体积稀释。
3.刺激细胞活化：向稀释后的全血样本管加入2μl BD Leukocyte Activation Cocktail with BD GolgiPlug，货号550583(刺激剂和蛋白转运抑制剂)，混匀。37o C，5%CO2培养箱或37o C水浴孵育4-6小时(不超过6个小时)。
4.细胞表面标记染色：向CD4抗体单染管、IL-17A同型对照抗体管、待测管这三管分别加入1Test体积的CD4抗体，室温避光孵育15-30分钟。
5.制备红细胞裂解液：制备1X.红细胞裂解液(BD Lysing Buffer10X，货号555899)，取10X红细胞裂解液，按照体积.1(10X红细胞裂解液)：9(dH2O)，稀释。
6.每100μl全血加入2ml1X红细胞裂解液，室温裂解15-30min，至细胞悬液呈澄清透明状。
7.裂红后，500g，离心5分钟，洗涤细胞，离心后弃上清。
8.加入1ml FBS（货号554656），500g，离心5分钟，洗涤细胞，离心后弃上清。
9.破膜固定液制备(货号554714)，554714包括Fixation/Permeabilization solution和BD Perm/Wash?Buffer(10X)。Perm/Wash?Buffer(10X)需要稀释：1体积BD Perm/Wash?Buffer(10X)，9体积distilled H20，1：9混合，配制成1XPerm/Wash?Buffer
10.细胞固定：涡旋细胞3秒钟，每管加入250μL Fixation/Permeabilization solution，涡旋混匀，4°C孵育20分钟。
11.破膜：每管直接加入1ml1X Perm/Wash Working Solution到固定的细胞中，4°C，500g离心10分钟，弃上清。
12.每管加入1ml1X Perm/Wash Working Solution，4°C500g离心10分钟，弃上清。
13.胞内染色：每管加入50ul1X Perm/Wash Working Solution，同时IL-17A抗体单染管、待测管加入1Test体积的IL-17A抗体，IL-17A同型对照抗体管加入1Test体积的IL-17A同型对照抗体，涡旋混匀，4°C避光孵育40-50分钟。
14.涡旋细胞，每管加入1ml1X Perm/Wash Working Solution，4°C500g离心10分钟，弃上清。
15.重复第14步骤一次，每管加入350ul FBS（货号554656）洗液，上机检测即可。
流式细胞仪检测技术与质量控制
流式细胞仪检测技术与质量 控制 -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
流式细胞仪检测技术与质量控制 【摘要】流式细胞术（FCM）检测HLA等位基因是最近新建立的方法，与原有的分型技术相比，技术上有很大的改进和突破。流式细胞术已广泛用于临床常规检验中，为保证检验结果的可靠性，提高准确度和室间结果的可比性，流式细胞术质量控制越来越受到重视。它在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选，同传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精密度高、准确性好等特点。 【关键词】流式细胞术；检测技术；质量控制 流式细胞仪检验技术（FCM），即流式细胞术，是以流式细胞仪作为检测手段，以免疫荧光技术作为主要标记方法的一门先进的分析技术。该方法用免疫磁珠作为载体，在同一微孔内进行反应，利用流式细胞仪检测杂交信号和区分探针的种类。本技术使用的免疫磁珠具有一定的特性，磁珠可利用颜色进行标识[1]。当免疫磁珠上两种颜色混合的比例不同时，经流式细胞仪检测后即可区分定义为不同种类的免疫磁珠，目前两种颜色的组合在流式细胞仪上最多可区分成为100种不同的免疫磁珠。
1 材料与方法 1.1 标本收集 收集近3年本院治疗的30例患者，对30例患者行流式细胞仪检测，30例受检者中，男性患者16例，女性患者14例，最大年龄60岁，最小年龄17岁，患者平均年龄39岁。 2 检测方法 2.1 采用特定的免疫磁珠作为载体，将已知序列特异性探针（SSO）固定在免疫磁珠上，每一种特异性探针固定在已知颜色比例的免疫磁珠上。由于免疫磁珠上颜色比例的不同，在流式细胞仪红色激光束下可进行区分，根据事先设计的标记情况，通过流式细胞仪检测后可确认特定颜色比例免疫磁珠上携带的特异性探针的种类，从而达到将探针区分的目的。 2.2利用标记的特异性引物对目的DNA进行扩增，将PCR扩增产物与免疫磁珠上的序列特异性探针（SSO）在同一孔内进行特异性杂交，再加入荧光显色剂，然后利用流式细胞仪绿色激光束检测杂交信号，红色激光束区分探针的种类，利用软件分析杂交结果得出样本HLA基因型别。 3 方法学评价该方法与PCR-SSO有相似的地方，但是技术上有重大的突破。本方法灵敏度非常高，在
BD分析TH17细胞
流式细胞术分析TH17细胞 1.肝素钠真空抗凝采血管取人外周血全血1-2ml，血液室温放置，8小时内进行检测，否则需弃用。 2.取5个流式管，分别标记空白管、CD4抗体单染管、IL-17A抗体单染管、IL-17A同型对照抗体管、待测管，每个流式管分别加入100μl全血，用RPMI1640(不含FBS)1:1等体积稀释。 3.刺激细胞活化：向稀释后的全血样本管加入2μl BD Leukocyte Activation Cocktail with BD GolgiPlug，货号550583(刺激剂和蛋白转运抑制剂)，混匀。37o C，5%CO2培养箱或37o C水浴孵育4-6小时(不超过6个小时)。 4.细胞表面标记染色：向CD4抗体单染管、IL-17A同型对照抗体管、待测管这三管分别加入1Test体积的CD4抗体，室温避光孵育15-30分钟。 5.制备红细胞裂解液：制备1X.红细胞裂解液(BD Lysing Buffer10X，货号555899)，取10X红细胞裂解液，按照体积.1(10X红细胞裂解液)：9(dH2O)，稀释。 6.每100μl全血加入2ml1X红细胞裂解液，室温裂解15-30min，至细胞悬液呈澄清透明状。 7.裂红后，500g，离心5分钟，洗涤细胞，离心后弃上清。 8.加入1ml FBS（货号554656），500g，离心5分钟，洗涤细胞，离心后弃上清。 9.破膜固定液制备(货号554714)，554714包括Fixation/Permeabilization solution和BD Perm/Wash?Buffer(10X)。Perm/Wash?Buffer(10X)需要稀释：1体积BD Perm/Wash?Buffer(10X)，9体积distilled H20，1：9混合，配制成1XPerm/Wash?Buffer 10.细胞固定：涡旋细胞3秒钟，每管加入250μL Fixation/Permeabilization solution，涡旋混匀，4°C孵育20分钟。 11.破膜：每管直接加入1ml1X Perm/Wash Working Solution到固定的细胞中，4°C，500g离心10分钟，弃上清。 12.每管加入1ml1X Perm/Wash Working Solution，4°C500g离心10分钟，弃上清。
快速体外分离、长期培养人Th17细胞
快速体外分离、长期培养人Th17细胞方法 1.Subject 全血 2.CD4+T细胞浓缩 采用RosetteSep（StemCell Technologies，Canada）进行阴性选择得到浓缩CD4+T细胞。建立标准密度梯度离心，分离出淋巴细胞 3.CD4+T细胞刺激 将浓缩的CD4+T细胞悬浮在RPMI1640培养基中（Sigma），包含青霉素/链霉素，L-谷氨酰胺，HEPES缓冲液和10%小牛血清（R10），浓度为1×106个细胞/ ml.含 3×106个细胞的3mlR10，在15ml Falcon管中，用每毫升含4μL（1mg/ml）PMA和2μL（1mg/ml）伊沃诺霉素（AG Scientific，San Diego，CA）的细胞溶液刺激。继而加入总量3μL的包含CD49d （1mg/ml）和CD28（0.5mg/ml）的共刺激抗体（BD Biosciences）。随后细胞在37℃、5%CO2条件下孵化3个半小时。阴性对照采用相似方法，但用R10替换PMA和伊沃诺霉素。为了用细胞内细胞因子标记法测量IL-17产量，浓缩的CD4+T细胞用10μL Brefeldin A（1mg/ml）刺激。 4.IL-17捕捉复合物的准备 IL-17捕捉复合物由2个生物素标记的抗体组成，2个抗体通过一个抗生物素蛋白分子连接。直接连在T细胞表面CD45分子的抗体与IL-17抗体配对。2μL生物素标记的CD45抗体（clone H130）（Caltag，Invirtrogen，CA）和20μL生物素标记的IL-17抗体（0.5mg/ml）（clone：eBio64DEC17）（ebiosciences，CA）混合加入eppendorf管，并彻底漩涡。然后，加入2μL未作标记的5mg/ml的生物素（Invitrogen，CA），并立即充分混匀。复合物在室温下孵化10分钟，使用前再次漩涡。 5.IL-17体外捕获分析 被刺激过的细胞用含有2%小牛血清（2%FCS/PBS）的冰冻PBS（Cellgro ，Mediatech，V A）,冲洗，以500×克离心10分钟成小球，上清液被完全吸出。然后细胞被悬浮在100μL2%的FCS/PBS，将20μL捕获的IL-17复合体加入。冰上孵化15分钟后，加入9mlR10。将试管放入转动器，在37℃和5%CO2条件下额外孵化1个半小时。 6.IL-17+细胞分选 被捕获的IL-17细胞可以用2种技术分选：一种是FACS Aria细胞分选器（BD），另一种是磁珠技术（Miltenyi，Germany）。FACS Aria细胞分选器，细胞被一种太平洋蓝活性胺标记来区分活的和死的细胞。然后用FACS/PBS冲洗细胞，细胞表面用10μL的CD3-FITC，5μL的CD4-Alexa700（BD BIOsciences）和20μL（0.25μg）IL-17A-PE（clone：eBio64CAP17）抗体标记。细胞在暗室诗文条件下孵化15分钟，分析前用2%FCS/PBS冲洗一次。 磁珠法捕获的细胞用IL-17A-PE标记15分钟。用2%FCS/PBS冲洗一次将多余的抗体移除，然后参看说明将细胞在4℃条件下加抗-PE磁珠孵化。简而言之，再次冲洗细胞并使之悬浮在500μL缓冲液中。悬浮液用洗液管加入MS柱（Miltenyi，German）并放到磁体上，用500μL的PBS洗3次。将虑柱从磁体上拿下，被选择的细胞收集在一个15mL的Falcon管。被选择的细胞再次通过磁性分离进一步浓缩。 Aria分选或磁珠净化得到的Th17细胞，培养在包含50单位的人IL-2（NIH/Roche，switzerland）(R10-50)的R10培养基,. 2天后，细胞被250.000照射feeders（3000 rad）和抗-CD3/抗-CD8双特异性单克隆抗体（1μg）刺激。每3周细胞被照射feeders（3000 rad）
流式细胞仪检测技术与质量控制
流式细胞仪检测技术与质量控制 【摘要】流式细胞术（FCM）检测HLA等位基因是最近新建立的方法，与原有的分型技术相比，技术上有很大的改进和突破。流式细胞术已广泛用于临床常规检验中，为保证检验结果的可靠性，提高准确度和室间结果的可比性，流式细胞术质量控制越来越受到重视。它在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选，同传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精密度高、准确性好等特点。 【关键词】流式细胞术；检测技术；质量控制 流式细胞仪检验技术（FCM），即流式细胞术，是以流式细胞仪作为检测手段，以免疫荧光技术作为主要标记方法的一门先进的分析技术。该方法用免疫磁珠作为载体，在同一微孔内进行反应，利用流式细胞仪检测杂交信号和区分探针的种类。本技术使用的免疫磁珠具有一定的特性，磁珠可利用颜色进行标识[1]。当免疫磁珠上两种颜色混合的比例不同时，经流式细胞仪检测后即可区分定义为不同种类的免疫磁珠，目前两种颜色的组合在流式细胞仪上最多可区分成为100种不同的免疫磁珠。
1 材料与方法 1.1 标本收集 收集近3年本院治疗的30例患者，对30例患者行流式细胞仪检测，30例受检者中，男性患者16例，女性患者14例，最大年龄60岁，最小年龄17岁，患者平均年龄39岁。 2 检测方法 2.1 采用特定的免疫磁珠作为载体，将已知序列特异性探针（SSO）固定在免疫磁珠上，每一种特异性探针固定在已知颜色比例的免疫磁珠上。由于免疫磁珠上颜色比例的不同，在流式细胞仪红色激光束下可进行区分，根据事先设计的标记情况，通过流式细胞仪检测后可确认特定颜色比例免疫磁珠上携带的特异性探针的种类，从而达到将探针区分的目的。 2.2利用标记的特异性引物对目的DNA进行扩增，将PCR扩增产物与免疫磁珠上的序列特异性探针（SSO）在同一孔内进行特异性杂交，再加入荧光显色剂，然后利用流式细胞仪绿色激光束检测杂交信号，红色激光束区分探针的种类，利用软件分析杂交结果得出样本HLA基因型别。 3 方法学评价该方法与PCR-SSO有相似的地方，但是技术上有重大的突破。本方法灵敏度非常高，
新型的CD_4_T细胞_Th17细胞
[8]Grunds tro m S,And ers on P,Scheipers P,et a l.Bcl23and NFkap2 paB p502p50homod i m ers act as transcri pti onal rep ress ors i n tol2 erant CD4+T cells[J].J Bi ol Ch e m,2004,279(9): 846028468. [9]Y e S,W atts GF,M anda li a S,et al.Preli m i nary report:geneti c vari2 ati on i n t he hum an s tro m el ysi n pro m oter is associat ed w i th p rogers2 si on of coronary at heroscl erosis[J].BrH eart J,1995,73(3):2092 215. [10]H i rash i k iA,Ya m ada Y,M urase Y,et a l.Associ ati on of gen e po l y2 m orphis m s w i th coronary artery d is ease i n lo w2or h i gh2ris k s ub2 jects defined by conven ti onal ri sk factors[J].J Am Coll Cardio,l 2003,42(8):142921437. [11]Zh ou X,H uang J,Chen J,et al.H ap l otype anal ys i s of t he m atrix m etall op rotei nas e23gene and m yocard i al i n farcti on i n a Ch i n ese H an popu l ati on.Th e Beiji ng A t eroscl erosis Study[J].Thro m b H ae most,2004,92(4):8672873. [12]Poll anen PJ,Leh ti m ak iT,M i kkelsson J,et al.M atri xm etall oprotei2 nase3and9gene pro m oter pol ymorph is m s:j oi n t acti on of t w o l oci as a ris k factor for coronary artery co m p li cated p l aques[J].A t h er2 oscl erosis,2005,180(1):73278. [13]H oppm ann P,K och W,Schom i g A,et al.The5A/6A pol ymor2 ph is m of the stro m el ys i n21gene and res t en os i s after percu t an eou s coronary i n terventi on s[J].Eur H eart J,2004,25(4):3352341. [14]Y e S,Gale C R,M artyn C N.Vari ation i n t he m atri x m etalloprotei n2 ase21gen e and ris k of coronary heart disease[J].Eu r H eart J, 2003,24(18):166821671. [15]H l at ky MA,Ash l ey E,Querter m ou s T,et al.M atrix m etalloprotei n2 ase circu l ati ng l evels,gen eti c pol y m orph i s m s,and suscep ti b ili ty to acu t e m yocard i al i nfarcti on a m ong patients w it h coronary artery d isease[J].Am H eart J,2007,154(6):104321051.[16]Y a m ada Y,Iza wa H,Ic h i h ara S,et a l.Pred icti on of t h e ri sk ofm y2 ocard i al infarcti on from pol y m orph i s m s i n cand i date genes[J].N Engl J M ed,2002,347(24):191621923. [17]Samnegard A,Sil vei ra A,Lundman P,et a l.Seru m m atri x m et a ll o2 p rotei nas e23con centrati on i s i n fluenced by MMP2316125A/6A pro m oter genot ype and as soci ated wit h m yocard i al i n farcti on[J].J IntM ed,2005,258(5):4112419. [18]Gn asso A,Motti C,Irace C,et al.G enetic vari ati on i n hum an stro m elys i n gen e p ro m ot er and co m m on carotid geo m etry in healthy m ale sub jects[J].A rteri oscl er Th ro m b Vasc Bi o,l2000,20(6): 160021605. [19]Raura maa R,Va i sanen SB,Luong LA,et a l.Stro m el ys i n21and i n2 terleuk i n26gen e pro m oter po l y m orph is m s are deter m i nan ts of a2 s ymp t o m ati c caroti d artery at h eroscl erosis[J].A rteri oscler Thromb Vasc Bi o,l2000,20(12):265722662. [20]Rundek T,E l k i nd MS,P itt m an J,et al.Caroti d i nti m a2m ed i a thickness i s associ ated wit h all elic vari an ts of s tro m el ysi n21,i n ter2 leuk i n26,and h epatic li pase genes:t h e Northern Manh attan Pro2 s pecti ve Cohort Study[J].Stroke,2002,33(5):142021423. [21]Gh ilardiG,Bi ond iML,D e M on tiM,et al.M atrixm etall op rotei nas e2 1and m atri x m etall op rotei nas e23gen e p ro m ot er pol y m orph i s m s are associat ed w it h caroti d artery stenosis[J].Stroke,2002,33(10): 240822412. [22]A r m strong C,Ab illei ra S,Si tzerM,et al.Po l y m orph is m s i n MM P Fa m il y and TI M P genes and caroti d art ery i n ti m a2m ed ia th i ckness [J].Stroke,2007,38(11):289522899. [23]F l ex A,Gaetan i E,Papal eo P,et al.Proi n fla m m atory geneti c pro2 fil es i n sub jects w it h h i story of i sche m i c strok e[J].Stroke,2004, 35(10):227022275. 收稿日期:2008203217修回日期:2008205207 新型的CD4+T细胞:Th17细胞 王国栋,张爱元,邵静波 (潍坊市人民医院心内一科,山东潍坊261041) 中图分类号:R392.11文献标识码:A文章编号:100622084(2008)1722603204 摘要:Th17是近年来发现的一种CD4+T细胞亚型,在自身免疫性疾病中发挥重要的作用,其分泌产生几种致炎细胞因子,包括新发现的细胞因子白细胞介素17。Th17产生的细胞因子与Th1、Th2不同并且与其相互对抗。Th17细胞很可能对防御胞外病原菌的感染及自身免疫性疾病产生影响。影响Th17细胞从T细胞前体分化的因素也很快被发现,本文综述了Th17细胞诱导分化的影响因素、产生的细胞因子、在自身免疫病中的作用。 关键词:C D 4 +T细胞;Th17细胞;白细胞介素17 A N e w Sub s et of CD4+T C ell s:Th17WA NG Gu o2d ong,Z HA NG Ai2yuan,S HAO J i ng2bo.(De part2 m e n t of Card iol ogy,Wei fang P eo p le c s H os pit a l,Wei fang261041,China) Ab stract:Th17,a novel s ubset of CD4+T cells was i den ti fi ed t hat p l ays a cruci a l ro l e i n i n fla m2 m ation and au t oi m m un e d iseas e,wh ich p roduces s everal proi n fl a mm at ory cytok i n es,i ncl ud i ng t he novel cytok i ne i n t erl euk i n I L217.The cytok i nes produ ced by Th17are d ifferent fro m t hose by Th1or Th2, they are antagon i zed.Th17cells are prob ab l y eff ecti ve i n p rotection agai ns t extracell u lar b acteria,bu t al so p l ay a rol e i n a m p lification of au t o i m m une d i sorders.And t h e factors t hat s pecif y d ifferenti ati on of I L217producing effect or T cells fro m n ai ve T cell p recu rsors are be i ng rapidly d i scovered.Th is articl e discussed t h e fact ors on Th17i ndu ced generati on and d ifferenti ation,t he cytok i ne profili ng,the f un cti on of the cell li neage involved i n au t o i m m une d i seases. K ey word s:CD4+T cel;l Th17cel;l In t erleuk i n217 天然CD4+T细胞是一种具有很多亚群的前体,具 有抗原识别特异性,是主要组织相容性复合物ò类分子限制性T细胞。根据产生淋巴因子的种类和生物学功能的不同,CD4+T细胞主要分为辅助性T细胞1型(T help ce ll1, Th1)、2型(T help ce ll2,Th2)和调节性T细胞(regulatory T cells,T reg)[1]。Th1型细胞主要产生干扰素C(interferon2C, I FN2C)、白细胞介素2(i n terleu2 k i n22,I L22)和肿瘤坏死因子B (tumor necr osis f actor B,T NF2B),参与细胞免疫和迟发型超敏反应,协助B细胞产生Ig G2,在抗 细胞内微生物感染和细胞免疫所引起的炎性反应中发挥作用。Th2型细胞主要产生I L24、I L25、I L210和
流式细胞术样品制备技术(完整)
流式细胞术样品制备技术 流式细胞术对细胞的分析检测必须基于单细胞的基础上，这是流式细胞术的基本要求。因此就必须把实体组织制备成单细胞悬液。在应用FCM技术中，制备出合格的单分散细胞是流式细胞术样本制备技术中重要的一环。它要求这种分散细胞方法既要使细胞成为单个细胞，又能保持细胞的固有生物化学成分及生物学特性。 流式细胞术样品制备大致可分为下面五个步骤：①取材：取手术或活检组织必须具有代表性，如取手术肿瘤组织，必须取瘤细胞生长旺盛部位；组织等标本必须在取材后保持样本的新鲜；一般在室温1个小时之处理好样本或及时用固定剂或低温对组织进行保存；②对细胞的待测生物化学成分进行荧光染色；③按照厂家提供的软件程序对样本进行获取、检测和存储；④再依照软件提供的程序对检测结果进行定量分析；⑤检测分析结果在生物、医学上的意义进行分析和评价。 第1节样本单细胞悬液的制备方法 一新鲜实体组织样本的制备 FCM对单细胞快速进行各种参数分析必须基于单细胞基础上，根据各种组织成分的特点，可选择不同的分散细胞方法，以期达到单细胞产额高、损伤少的目的。尽管标本制备已形成了标准化的程序，但实际操作中总会出现这样或那样的问题。在实体组织分散为单个细胞过程中，解离的方法可能瞬间地或持久地影响细胞的性质、形态、结构、功能等。所以，在对各种不同组织进行分散选择方法时，应尽量减少对细胞的这种影响。目前常用的分散组织细胞的方法有如下3种。 （一）酶消化法 1 作用原理： 对实体组织分散的作用原理主要有3方面：①可以破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等；②可以水解组织间的粘多糖等物质；③可以水解组织细胞间的紧密联结装置的蛋白质物质。酶消化法是实体瘤、培养细胞分散为单细胞的主要方法之一。常用的酶类试剂有：蛋白酶类——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解离组织中的细胞。胰蛋白酶能水解脂键和肽键；胶原酶能降解几种分子类型的胶原；溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷键；弹性蛋白酶能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维。不同酶对细胞和细胞间不同组分有特异作用，可根据分散组织类型来确定使用的酶类。 2 注意事项： ①酶需要溶解于适当的溶液中，而这些溶液不致于造成酶效价降低；②要注意酶的使用浓度和消化时间；③要注意酶活性的PH值。如胃蛋白酶在碱性环境中失去活性，胰蛋白酶在中性溶剂中活性不佳等；④要随时注意影响酶活性的其它因素，如酶的生产批号等。 3 方法学程序 （1）将适合于酶消化的组织置于离心管中； （2）将选好的酶溶液1-2ml加入盛有被消化组织的试管中； （3）一般消化20-30分钟（恒温37℃或室温），消化期间要间断振荡或吹打； （4）终止消化，收集细胞悬液，以300目尼龙网过滤，除去细胞团块，以低速成离心除去细胞碎片；
实验七-流式细胞仪检测技术
实验七流式细胞仪检测技术 免疫细胞是一组不均一的细胞群体。各种特定的细胞群其细胞表面表达有各自特异的表面标志分子，利用这些特异的表面标志，可以鉴定、分离和纯化相应的细胞群。随着单克隆抗体技术的诞生和免疫标记技术（特别是荧光标记技术）的发展，以及计算机科学的应用，使利用仪器的方法检测特异的细胞膜表面分子成为可能。本章介绍的荧光激活细胞分类技术就是采用单克隆抗体技术和免疫荧光标记技术，并结合光学检测和计算机分析技术而产生的鉴定和分离特定细胞亚群的技术。 实验原理 流式细胞仪（flow cytometer）是一种能够探测和计数以单细胞液体流形式穿过激光束的细胞检测装置，由于在检测中使用的细胞标志示踪物质为荧光标记物，因此，用来分离、鉴定细胞的流式细胞仪有被称为荧光激活细胞分类仪（fluorescence activated cell sorter,FACS）,是分离和鉴定细胞群及亚群的一种强而有力的应用工具。其原理是在一组混合的细胞群中，加入特异的针对特定靶细胞表面分子的荧光标记单克隆抗体，这种特异单克隆抗体与其对应的抗原靶分子结合，结合后的荧光标记抗体停留在特定细胞的表面，称为荧光抗体标记的靶细胞；将含有被标记细胞的混合细胞群混悬在一定容积的上样缓冲液中，再通过FACS的进样吸管孔，仪器就会将细胞悬液制成以单细胞排列的微细流束。当每一个细胞通过仪器的激光束照射时，带在细胞上的荧光就会被相应的激光束激活并发出对应的荧光，通过敏感的光电倍增管即可检测到从细胞表面发出的荧光。根据测得的散射光（scattered light ）可得到细胞大小及颗粒状态的信息；而从荧光的发射强度(fluorescence emissions)则提供了结合在细胞上的抗体信息，进而也被反映了该细胞表面相应分子的表达情况。 在流式细胞仪分离装置中，返回到计算机的信号，可用来产生一种电荷，这种电荷以特定准确的时间通过FACS的吸管孔，在与吸管孔的液体流相相遇时，可将液体流打碎成只含一个细胞的微滴。含有电荷的微滴就会从主液体流中偏移，穿过一双极板。带正电荷的微滴被吸引至阴极，而带负电荷的被吸引至阳极。以这种方式，特定的细胞亚群由于标记着不同的荧光抗体而带有不同的电荷，从而将目的细胞从混合的细胞群中分拣出来。 实验应用 流式细胞仪主要有两个最基本的用途：第一是可以定量分析鉴定活细胞表面表达的特异
流式细胞仪检测技术与质量控制精编WORD版
流式细胞仪检测技术与质量控制精编W O R D 版 IBM system office room 【A0816H-A0912AAAHH-GX8Q8-GNTHHJ8】
流式细胞仪检测技术与质量控制【摘要】流式细胞术（FCM）检测HLA等位基因是最近新建立的方法，与原有的分型技术相比，技术上有很大的改进和突破。流式细胞术已广泛用于临床常规检验中，为保证检验结果的可靠性，提高准确度和室间结果的可比性，流式细胞术质量控制越来越受到重视。它在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选，同传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精密度高、准确性好等特点。 【关键词】流式细胞术；检测技术；质量控制 流式细胞仪检验技术（FCM），即流式细胞术，是以流式细胞仪作为检测手段，以免疫荧光技术作为主要标记方法的一门先进的分析技术。该方法用免疫磁珠作为载体，在同一微孔内进行反应，利用流式细胞仪检测杂交信号和区分探针的种类。本技术使用的免疫磁珠具有一定的特性，磁珠可利用颜色进行标识[1]。当免疫磁珠上两种颜色混合的比例不同时，经流式细胞仪检测后即可区分定义为不同种类的免疫磁珠，目前两种颜色的组合在流式细胞仪上最多可区分成为100种不同的免疫磁珠。 1 材料与方法 1.1 标本收集 收集近3年本院治疗的30例患者，对30例患者行流式细胞仪检测，30例受检者中，男性患者16例，女性患者14例，最大年龄60岁，最小年龄17岁，患者平均年龄39岁。 2 检测方法
2.1 采用特定的免疫磁珠作为载体，将已知序列特异性探针（SSO）固定在免疫磁珠上，每一种特异性探针固定在已知颜色比例的免疫磁珠上。由于免疫磁珠上颜色比例的不同，在流式细胞仪红色激光束下可进行区分，根据事先设计的标记情况，通过流式细胞仪检测后可确认特定颜色比例免疫磁珠上携带的特异性探针的种类，从而达到将探针区分的目的。 2.2利用标记的特异性引物对目的DNA进行扩增，将PCR扩增产物与免疫磁珠上的序列特异性探针（SSO）在同一孔内进行特异性杂交，再加入荧光显色剂，然后利用流式细胞仪绿色激光束检测杂交信号，红色激光束区分探针的种类，利用软件分析杂交结果得出样本HLA基因型别。 3 方法学评价该方法与PCR-SSO有相似的地方，但是技术上有重大的突破。本方法灵敏度非常高，在96孔微板上可进行大规模的检测，实现了所有探针的杂交于液相条件下在同一个孔内进行，而且采用免疫磁珠作为载体，具有快速、简便、可靠的优点，平均每个孔在流式细胞仪上检测的时间不到30s。目前已有商品化的试剂供应，同时该技术也广泛应用于其他方面（如传染病指标等）的检测和研究。 4 讨论 流式细胞术常规测定由一系列繁琐的步骤组成，大体可分为样本采集和处理、免疫荧光染色、流式细胞仪检测、数据分析及结果报告解释，做好这些步骤中每一环节的工作可以确保室内质量控制（1Qc）和室间质量控制（EQA）顺利达标。 标本采集和制备，用于流式细胞分析的样本种类很多，包括外周血、骨髓穿刺液、肺泡灌洗液、胸腹水、脑脊液及组织等，每种样本都有不同的采集、保存、运输和制备要求。原则上标本应在采集后立刻进行处理和荧光染色，尤其对检测细胞活性的标本，需要在采集后1小时内染色测定。在某些特殊情况下不能及时进行标本制备和检测而需要保存