11-微生物学检验在医院感染防控中的应用

微生物学检验在医院感染防控中的应用

江西省肿瘤医院院感科袁水斌

现代临床微生物学是一门由临床医学、基础医

学和预防医学相结合的交叉学科。微生物学检验是医院感染监控的重要手段,在医院感染的诊断、监测、病原学调查、清洁消毒灭菌效果评价,以及抗菌药物的合理使用等方面具有极其重要的作用。

现代医院感染管理的核心内容则是医院感染的预防、监测和控制。

微生物检验在医院感染防控中的应用

一、临床病原微生物检测和指导临床合理正确

使用抗菌药物。

二、医院感染的监测和病原菌耐药趋势分析三、环境卫生学检测

四、参与可疑医院感染暴发流行病学调查五、参与医院感染管理的教育和培训

一、临床病原微生物检测和指导临床合理正确使用抗菌药物。

1、对微生物标本做出快速、准确的检测，及时报告临床医生；

2、进行有关抗菌药物耐药性方面的各种试验，受理抗菌药物合理应用的咨询；

3、密切结合临床，与临床医师讨论、研究及处理有关感染性疾病的问题；

4、参与医院抗菌药物临床合理应用的管理和相关规范的制定。

病原学检测和诊断的基本要求

（1）◆确保临床标本合格：

恰当的标本采集是感染性疾病诊断的最为重要的一个步骤。要求临床医生正确采集能代表感染部位的临床标本，广泛采用保护性拭子、合格的容器及运送培养基，避免标本中微生物受毒性物质作用而死亡。

◆全面了解机体的正常菌群：

了解人体的正常菌群是细菌检验的必要前提，要了解正常菌群的概念、分布和种类，条件致病菌与内源性感染、菌群失调症与二重感染的概念，既不要将所有标本分离出来的细菌都当成致病菌，也不能将正常寄居菌所导致的内源性感染轻易放过。

◆细菌的分离鉴定要三定一结合：

即定性、定量和定位分析，并结合病情。要求根据临床和标本的具体情况确定检验程序，选择培养基及合适的鉴定试验。要判定分离细菌是致病菌、条件致病菌、还是非致病菌（定性），同时要有一个细菌数量的大致估计，必要时进行半定量和定量培养。在人体有菌部位分离的细菌，其意义大小要参考微生物的定性和定量分析作出判断；如在无菌部位（如血液、脑脊液）分离出细菌，无论是何种微生物和数量多少，均具有重要意义（定位分析）。

病原学检测和诊断的基本要求（2）

◆提供快速、准确的病原学诊断：

在临床提病人诊断信息、标本适当及尽可能的流行病学资料基础上，进行微生物检验和抗微生物药物敏感性试验，要求及时、全面地分析检验结果，给临床提供准确的病原学诊断，以便对病人作出恰当的处理。尽管目前微生物的分离鉴定仍作为病原学检测的金标准，的但这种“以活菌生长”为基础的传统的细菌学鉴定方法速度较慢，不能适应临床需要，要求以标本的直接检查为基础，如形态、染色、抗原检测及核酸检测（核酸杂交、PCR 和16S rRNA 分析），检测致病基因（致病岛、毒力岛）和耐药基因。尽可能在快速诊断方面下工夫。

◆及时报告临床科室：

要使实验室数据有效地转化为临床有用的信息，病原微生物诊断报告应实行三段报告制度，即在涂片或培养阳性结果出现时、敏感试验结果出来时以及最终结果出来后都要及时报告。

病原学检测和诊断的基本要求（3）

◆加强质量控制，增加检验项目：

临床微生物室必须加强质量控制，保证各种标本的检验质量，为临床提供可靠依据，并满足临床需要的各种检验项目。

临床微生物室应根据本单位的实际情况增加检验项目，临床要求关注的一些项目有：

1）呼吸道标本的细菌学筛选和半定量培养方法；

2）呼吸道非典型病原体的检测，包括衣原体、支原体和军团菌；3）非结核分枝杆菌的培养与药敏；

4）免疫抑制或器官移植患者特殊病原体的检测，如巨细胞病毒，卡氏肺孢子菌等；

5）抗生素相关腹泻的病原体（主要是艰难梭菌）的检测；6）侵袭性真菌的快速检测和药敏试验等。

密切联系临床，参与临床会诊和感染病例讨论会

◆获取临床信息，做出及时、准确的微生物报告临床感染性疾病往往涉及多种病原体，

没有任何单个的试验能够检出所有潜在病原体。因此，临床信息是选择试验方法的重要参考依据。临床医生在开化验单时应写明有关病人的推测性诊断，以便实验人员能据此选择合理的检验程序和试验方法，并能指导临床正确采集恰当的标本；当实验室开始有实验结果时，必须及时通知临床医生，以便让他们重新评价诊疗方案。

◆疑难微生物报告的解释与咨询

近年来，不少感染性疾病特别是医院感染的病原谱和药敏谱发生很大变化。以往罕见的微生物频频出现在检验报告单上，药敏试验的方法、受试品种、结果解释也有不少改变。临床医师常常难以正确理解和利用临床微生物检验资料。面对这一现状，临床微生物科应积极与临床沟通，帮助解决临床医师在判读微生物检验和药敏结果报告单时的困难。指出正常菌群、污染菌和感染菌的鉴别与判断；少见菌或罕见菌的意义；培养阴性时的可能原因；药敏试验结果的判断标准和局限性；特殊耐药细菌的耐药特点等，必要时在报告上增加注解。

二、医院感染病原学的监测和病原菌耐药趋势分析

1、按月或季或年统计的指标

◆各类临床标本细菌或真菌培养的阳性率及各病区病原菌分布情况。

◆各科细菌培养送检人数和名单，用于计算抗菌药物使用患者细菌培养总送检率，限制级抗菌药物和特殊使用级抗菌药物使用患者细菌培养送检率

◆常见（前五位或前十位）临床病原细菌和真菌的耐药趋势。敏感率、中介率和耐药率均统计出来并用EXECEL 作图。

◆多重耐药菌MRSA 、ESBLs 、

MDR-AB 、MDR-PA

、VRE

等的菌株占同种细菌

比例和各种多重耐药菌株的耐药趋势图。

2、定期总结和反馈病原菌及其耐药监测资料，追踪病原菌变迁及耐药趋势变化。如分离的主要病原菌种类、数量、对常用抗菌药物的耐药性情况；并向主管部门和临床科室报告，使临床医生在患者感染发生前或病原菌培养阴性的情况下，有的放矢地采用预防措施或有效治疗。以指导临床合理用药，减少耐药菌株的产生和医院感染的发生。

3、建立多重耐药菌的监测报告和预警机制

（1）实验室在检测出多重耐药菌时在报告单上注明多重耐药标识符号以提示临床医生采取相应的处置措施。

（2）定期追踪各种多重耐药菌检出数量变化及耐药趋势情况。

医院感染病原学的监测举例

医院感染病原学的监测举例

限制使用级抗菌药物送检率分析举例

2013年全年接受限制级抗菌药物治疗的住院患者3589人，病原微生物培养送检2374人，送检率为66.15%

100

200

300

400

500

600

内一内二内三内四内五内六腹一腹二肝科骨科乳腺胸外头一头二妇瘤放一放二放三放四

2013年限制级抗菌药物使用患者细菌培养送检情况

用药人数送检人数培养送检率%

2011年至2013年各季度抗菌药物使用者细菌培养送检率持续改进

三、医院环境卫生学检测

临床微生物科是医院感染控制委员会的重要成员，微生物检验在医院感染的监测中起重要作用。若在临床微生物检验中发现有医

院感染问题，要及时与医院感染控制部门、病房医师和护士长联系，并注意发展动态。医院感染中的一些特殊耐药菌如ＧＲＥ、ＭＲＳＡ、产ＥＳＢＬ肠杆菌科细菌等常通过交叉感染传播，曲霉菌、军团菌等常在空调、供水系统、雾化装置存在并导致感染，对可能携带这些致病菌的来源常规监测并提醒临床注意，通常可有效预防传播扩散并节省大量抗感染

正确、科学地实施清洁消毒与隔离技术对预防和控制医院感染非常重要，正确的指导、督查清洁消毒隔离工作也是临床微生物科的工作之一。当发生医院感染暴发流行或特殊耐药细菌感染时，临床微生物专业人员应参与制订消毒隔离措施，对相关的人员管理、废弃物的处理等环节提出微生物专业意见。

三、医院环境卫生学检测

1、医务人员手的微生物学监测

2、物体表面的微生物学监测

3、重点场所的空气微生物学监测

4、使用中的各种消毒剂的监测

5、血液净化系统的微生学检测

6、内窥镜消毒灭菌效果的微生物检测

7、压力蒸汽灭菌器和低温等离子灭菌效果监测8、医疗用品的微生学监测

内容：

三、医院环境卫生学检测-----医务人员手的微生物学监测

采样时间：在接触患者、进行诊疗活动前采样。

方法：1、被检者五指并拢，用浸有含相应中和剂的无菌检验洗脱液浸湿的棉拭子在双手指曲面从指跟到指端往返均匀涂擦5次，边擦边转动拭子，每只手涂擦面积约30cm 2，涂擦过程中同时转动棉拭子；

2、将棉拭子接触操作者的部分剪去，投入10mL 含相应中和剂的无菌洗脱液试管内，充分混匀后, 用无菌吸管吸取1mL 待检样品接种于灭菌平皿，再加入已溶化的45℃～48℃的营养琼脂15ml ～18 ml ，边倾注边摇匀，待琼脂凝固，臵35℃±l ℃混箱培养48h ，计数菌落数。

手细菌菌落数(cfu/cm 2)= （平皿菌落数×10）÷（30 ×2）

= 平皿菌落数÷6

0≤计算的数值＜1时，报告为：手细菌菌落数＜1cfu/cm 2

1≤计算的数值≤10时，报告为：手细菌菌落数：实际计算值cfu/cm 2

计算的数值＞10时，报告为: 手细菌菌落数＞10cfu/cm 2

注：填写报告单结果时应注明“合格”或”不合格“，或附上相应项目的标准要求参考值

卫生手消毒后医务人员手表面的菌落总数应≤10cfu/cm 2外科手消毒后医务人员手表面的菌落总数应≤ 5cfu/cm 2

三、医院环境卫生学检测-----物体表面的微生物学监测

采样时间: 在消毒处理后或怀疑与医院感染暴发有关时进行采样。

采样方法: 用5cm ×5cm 灭菌规格板放在被检物体表面，用浸有0.03mol/L 磷酸盐缓冲液（PBS ）或生理盐水采样液的棉拭子1支，在规格板内横竖往返各涂抹5次，并随之转动棉拭子，连续采样4个规格板面积，被采表面＜100cm 2的，取全部表面；被采表面≥100cm 2的，取100cm 2。

剪去或用酒精灯烧去手接触部分，将棉拭子放入装有10ml 无菌检验用生理盐水洗脱液的试管中，充分混匀后取1. ml 接种营养琼平皿，将冷至40℃～45℃的熔化营养琼脂培养基每皿倾注15mL ～18mL ，35℃±1℃恒温箱培养48h ，计数菌落数。怀疑与医院感染暴发有关时，进行目标微生物的检测，加种羊血哥仑比亚琼脂平皿和麦康凯平皿等。门把手等小型物体则采用棉拭子直接涂抹物体表面采样。采样物体表面有消毒剂残留时，采样液应含相应中和剂。

物体表面菌落总数（cfu/cm 2）

=（平皿菌落数×10）÷100 =平皿菌落数÷10或= （平皿菌落数×10）÷实际采样面积

0≤计算的数值＜1时，报告为：物表细菌菌落数＜1cfu/cm 2

1≤计算的数值≤10时，报告为：物表细菌菌落数：实际计算值cfu/cm 2

计算的数值＞10时，报告为: 物表细菌菌落数＞10cfu/cm 2

如是灭菌物品，无细菌生长时，则报告：无菌生长

小型物体表面的结果计算，用cfu/件表示：（平皿菌落数×稀释倍数）/件1、物体表面细菌监测采样液配制:

（1）0.03mol/L 的pH7.2~7.4磷酸盐缓冲液(PBS)配制：

磷酸氢二钠(不含结晶水) 2.84g 磷酸二氢钾(不含结晶水) 1.36g

加入1000mL 蒸馏水中, 溶解后分装试管10mL/支，126℃高压灭菌20min 备用（2）生理盐水：氯化钠8.5g 溶于1000ml 蒸馏水中，溶解后分装试管10mL/支，126℃高压蒸汽灭菌20min 备用。

2、手表面细菌监测采样液配制：

无菌检验用洗脱液：1克吐温80，10克蛋白胨，8.5克氯化钠

加蒸馏水1000mL 配制而成。溶解后分装试管10mL/支，126℃高压蒸汽灭菌20min 备用。

三、医院环境卫生学检测-----空气微生物学监测

1、洁净手术室或层流洁净病房

采样时间：洁净手术室（Ⅰ类环境）在洁净系统自净后与从事医疗活动前样；

洁净手术室和洁净辅助用房检测前，系统应已运行15min，其他洁净房间应已运行40min，在确认风速、换气次数和静压差在正常范围后，再检测空气中的细菌菌落数。

监测方法：平皿暴露法空气中菌落数=房间所有平皿上细菌总数÷平皿数当送风口集中布臵时，应对手术区和周边区分别检测；当送风口分散布臵时，按全室统一布点检测。测点可均匀布臵，但应避开送风口下方，同时设培养基对照和操作过程对照。整个操作应符合无菌操作的要求。

（1）沉降法采样时，用直径9cm的培养皿，在空气中暴露30min, 35℃±1℃恒温箱培养48h, 培养皿中的菌落数(CFU)代表空气中沉降下来的细菌数，以个/皿表示。（2）采样点可布臵在地面上或不高于地面0.8m的任意高度上；

（3）在手术区检测时无手术台；当手术台已固定时，检测高度应在台面之上0.25cm。

级别面积

（m2）多点布控常规布控平均菌落数标准

( cfu/30min·φ90皿)

百级≤30手术区5点，周边区8点东南西北中（5点）手术区＜0.2；周边区＜0.4千级≤30手术区3点，周边区6点东南西北中（5点）手术区＜0.75；周边区＜1.5万级＜30手术区3点，周边区4点里中外（3点）手术区＜2；周边区＜4

三、医院环境卫生学检测-----空气微生物学监测

2、非洁净手术室或医用房间（Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ类环境）

采样时间：在消毒或规定的通风换气后与从事医疗活动前采样

检测方法：室内面积≤30m2，设内、中、外对角线三点，内、外点应距墙壁1m 处；室内面积＞30m2，设四角及中央五点，四角的布点位臵应距墙壁1m处。

采样高度为距地面0.8m～1.5m；采样时将平皿盖打开，扣放于平皿旁，暴露规定时间（Ⅱ类环境暴露15min，Ⅲ、Ⅳ类环境暴露5min)后盖上平皿盖及时送检，35℃±1℃恒温箱培养48h。必要时分离致病性微生物，进行鉴定。

空气菌落数= 房间所有平皿上细菌总数÷平皿数

Ⅱ类环境报告：平均每个平皿的菌落数cfu/15min·φ90皿（合格者≤4 ）

Ⅲ、Ⅳ类环境报告：平均每个平皿的菌落数cfu/5min·φ90皿（合格者≤4 ）

·

Ⅰ类环境层流洁净手术室，层流洁净病房。

Ⅱ类环境非洁净（普通）手术室；产房；导管室；血液病病区、烧伤病区等保护性隔离病区；重症监护病区；新生儿室等。

Ⅲ类环境母婴同室；消毒供应中心的检查包装灭菌区和无菌物品存放区；血液透析中心（室）；其他普通住院病区等。

Ⅳ类环境普通门（急）诊及其检查、治疗（注射、换药等）室；感染性疾病科门诊和病区。

三、医院环境卫生学检测-----使用中的各种消毒剂的监测

1、消毒剂的采样和稀释

用无菌吸管或注射器按无菌操作方法吸取1.0mL被检消毒液，加入9mL 含中和剂的各类稀释液（中和剂基础液为0.03mol/L的pH7.2~7.4的PBS ）

2、中和剂的选择

◆醇类与酚类消毒剂用普通营养肉汤中和；

◆含氯消毒剂、含碘消毒剂和过氧化物消毒剂用含0.1%硫代硫酸钠的PBS

液中和；

◆洗必泰、季铵盐类消毒剂用含0.3%吐温80和0.3%卵磷脂的PBS液中和；

◆醛类消毒剂用含0.3%甘氨酸的PBS液中和；

◆含有表面活性剂的各种复方消毒剂可在中和剂中加入吐温80至3（W/V)；

3、检测方法：用无菌吸管吸取一定稀释比例（如1∶10)的中和后混合液1.

mL 加到无菌空平皿中，再将冷至40℃～45℃的熔化营养琼脂培养基每皿倾注15mL～20mL，35℃±1℃恒温箱培养72h，计数菌落数；必要时分离致病性微生物，进行目标微生物的检测。

消毒液染菌量(cfu/ml)＝平均每皿菌落数×10

4、结果判断：使用中灭菌用消毒液：无菌生长；使用中皮肤黏膜消毒液染

菌量：≤10cfu/mL，其它使用中消毒液染菌量≤100cfu/mL。

三、医院环境卫生学检测-----血液净化系统的微生学检测微生物检测方法：采样后应在30min内检测，用无菌吸管透析用水或透析液1. mL 加到无菌空平皿中，再将冷至40℃～45℃的熔化营养琼脂培养基每皿倾注15mL～20mL，35℃±1℃恒温箱培养72h，计数菌落数；必要时分离致病性微生物，进行目标微生物的检测。

透析用水（末端）：每月测一次，

透析液：每台透析机一年至少测一次透析液。

内毒素测定方法：（凝胶鲎试剂法，按说明书操作）

透析用水内毒素测定每三个月一次。

结果判断：

1、透析用水和透析液所含细菌总数应不得超过100cfu/mL

2、在水外理装置的输出端水的内毒素应不超过IEU/mL;

血液透析装置入口水细菌内毒素,应不得超过5EU/mL.

YY0572-2005《血液透析和相关治疗用水》标准

三、医院环境卫生学检测-----内窥镜消毒灭菌效果检测

采样时间：在消毒灭菌后、使用前进行采样

采样方法：监测采样部位为内窥镜的内腔面。用无菌注射器抽取10mL含相应中和剂的洗脱液，从待检内镜活检口注入，用无菌试管从活检出口收集，及时送检，2小时内检测。

菌落计数：将送检液充分震荡混匀，取1mL，加入直径90mm无菌平皿，再加入已经熔化的45℃-48℃营养琼脂15mL-18mL，边倾注边摇匀，待琼脂凝固，于35 ±1℃培养48小时后计数。必要时分离致病性微生物，进行目标微生物的检测。

结果判断：菌落数/件=平皿菌落数×10 cfu/件

（1）计算菌落数为0时，报告为：48小时无菌生长

（2）0＜计算菌落数≤20时，报告为：实际菌落数cfu/件

（3）计算菌落数＞20时，报告为：菌落数＞20cfu/件

消毒后的内镜合格标准为：

消毒后内窥镜细菌总数合格者应<20cfu/件，且不能检出致病菌；

灭菌后内镜合格标准为：无菌检测合格。三、医院环境卫生学检测-----灭菌效果生物监测

压力蒸汽灭菌器和过氧化氢低温等离子灭菌器

采样时间：与被消毒或灭菌物品同时监测

布点方法：小型灭菌器选1个包装物品放入指示剂，置底层中央；中型灭菌器选3个包装物品放入指示剂，上层中内放1个，下层前后各放1个；大型灭菌器选5个包装物品放入指示剂，上层、中层的中央各放1个，下层的前、中、后部各放1个。

监测方法：采用嗜热脂肪芽胞杆（ATCC7953,ATCC12980）作为生物指示剂，或直接用商品自含式生物指示剂，随物品一起灭菌后于35 ±1℃培养48小时后观察结果。

结果判断：灭菌达标，培养基不变色。

若孢子生长，培养基颜色变黄，指示灭菌失败。

自含式生物指示剂：每一支热塑性小培养管中含有带细菌孢子的

滤纸片和密封的玻璃安瓿。安瓿中装有特殊配方的大豆酪蛋白水

解培养基（胰蛋白胨大豆肉汤）和颜色指示剂。

三、医院环境卫生学检测-----医疗用品的微生物监测无菌验证试验参照中国药典2010年版二部附录ⅪН测定法（一般由产品厂家做）。

三、医院环境卫生学检测-----医疗用品的微生物监测

产品要求：

高度危险性器材应无菌；

中度危险性器材的菌落总数应≤20cfu/件，克或100cm 2，不得检出致病性微生物。低度危险性器材的菌落总数应≤200cfu/件，克或100cm 2，不得检出致病性微生物。

四、参与可疑医院感染暴发流行病学调查

当发生可疑医院感染暴发流行或特殊耐药细菌感染时，临床微生物专业人员通过流行病学调查和细菌学分型试验，追踪感染源并加以控制。并参与制订消毒隔离措施，对相关的人员管理、废弃物的处理等环节提出微生物专业意见、。

临床科室常首先向院感科报告疑似院感暴发事件，院感科必须及时响应，组织医务科、护理部、微生物实验室人员一起参与到当事科室的院感事件发生的各环节的原因分析、病原学查找及处置措施等，微生物检验人员应大力配合，进行病原学检测和抗菌药物试验，并指导临床医生正确选用抗菌药物。

五、临床微生物科参与医院感染管理的教育和培训

1、讲解临床微生物标本的采集、保存、运送的要求和注意事项，对标本采集前要求病人应该做些什么准备，采集标本应选择什么

时机、什么部位，每天采几次、采多少量以及采样部位应该如何消毒等一系列问题进行解释；

2、对人体常见的正常菌群、定植菌、污染菌和感染菌等内容进行培训；

3、对各种细菌耐药酶的检测及其含义和在选用抗生素方面的意义与临床进行经常性的沟通等等。

可采用多种方法如讲座、座谈讨论会、简讯、墙报园地甚至参与查房等形式。也可以融合到医院感染管理的继续教育培训项目之中。