海洋天然产物hymenialdisine及其类似物与CDK5作用模式的研究[设计+开题+综述]

开题报告

生物技术

海洋天然产物hymenialdisine及其类似物与CDK5作用模式

的研究

一、选题的背景与意义：

海洋天然产物与陆生天然产物相比具有更加复杂多样、新颖奇特的结构以及多元化的生物活性和机制。在浩瀚的海洋中存在着大量超乎人们想象的化学结构新颖、生物活性多样、作用机制独特的次生代谢产物,将成为发现重要先导药物的主要源泉和研制开发新药的基础。近年来统计资料表明:从海绵中发现的天然产物约占已发现的海洋天然产物总数的38%左右,从海绵中已发现大量的抗细菌、抗真菌、抗肿瘤、抗病毒和免疫调节等活性物质。海绵生物活性物质按照化学结构类型可分为多糖类、聚醚类、大环内脂类、萜类、生物碱类、多肽类、甾醇和不饱和脂肪酸等。如hymenialdisine和debromohymenialdisin是首次从小轴海绵(Axinella sp)中分离得到的含吡咯七元环内酰胺的生物碱类化合物，是天然的CDK5的选择性抑制剂。海绵中存在结构和数量如此丰富的有潜力开发成药物的生物活性物质,使得对海绵的化学成分的研究成为海洋天然产物研究的一个热点和重点领域。

在500多个蛋白激酶中，细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs)是研究最多的一个Ser/Thr蛋白激酶家族。CDKs的单体呈非活性构象，首先与其相应的细胞周期蛋白（cyclins）结合成Cyclins/CDKs。组成全酶后仍无活性,CDKs作为催化亚单位，其活性状态由CDKs分子中的Thr、Tyr残基的磷酸化和去磷酸化修饰决定,首先CDKs分子上游的CDK 激活激酶(CAK)催化其分子上ATP结合点附近的一个保守的苏氨酸被磷酸化,后再由CAK激活激酶(CAKAK)催化使Thr残基磷酸化和Tyr残基去磷酸化,CDK即被激活,而活化的Thr残基去磷酸化则使CDK失活。目前已发现十多种CDKs，包括控制细胞周期进程的CDK1,2,3,4,6，控制细胞转录的CDK7,8,9和调控神经元损伤的CDK5。CDKs的活性异常会导致疾病。

CDK5具有一个特殊的功能即调控神经元损伤，当CDK5过度激活而且分布部位发生改变时，CDK5激酶的大量激活参与τau的磷酸化，促进τau蛋白堆积从而参与了阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease，AD)、帕金森氏病(Parkinson’s disease, PD)、亨廷顿氏病(Huntingto n’s disease, HD)以及脊髓侧索硬化症(amyotrophic lateralsclerosis, ALS)等众多神经退行性疾病的发生发展。故以CDK5为靶标，以海样天然产物hymenialdisine作为先导化

合物，拟综合采用分子对接、QSAR等计算机辅助药物分子设计的方法，了解CDK5 ATP结构口袋的特性，指导CDK5抑制剂的设计。研究针对抑制CDK5过度激活的药物, 可能是有望从根本上治疗神经退行性疾病的有效途径。

二、研究的基本内容与拟解决的主要问题：

（一）研究的基本内容：

1.将活性最高的hymenialdisine衍生物结构进行分子力学MM2优化，得到低能构象

2.将小分子抑制剂(配体)放置于CDK5(受体)的活性位点处，寻找合理的取向和构像，完成分子对接，得到合理的药效构象

3.在合理药效的基础上构建其它抑制剂结构

4.用CoMFA和CoMSIA软件计算参数，建立三维定量构效关系3D-QSAR模型

5.了解CDK5 ATP结构口袋的性质，指导CDK5抑制剂的设计

（二）拟解决的主要问题：

以CDK5为靶标，以海样天然产物hymenialdisine作为先导化合物，采用分子对接方法从分子水平阐明抑制剂与CDK5的作用机制，建立3D-QSAR模型了解CDK5 ATP结构口袋的特性，指导CDK5抑制剂的设计。

三、研究的方法与技术路线：

（一）研究方法：

1.分子对接

分子对接方法(Molecular Docking Method)已成为药物设计方法中比较成熟的直接药物设计方法。分子对接是将小分子配体放置于受体的活性位点处，并寻找其合理的取向和构象。药物(配体)一激酶（受体）相互作用是一个综合平衡的过程，并且药物还必须取得一定构像，以“适应”受体结合部位的“空腔”形状和构像变化。同时，为配合与药物的结合，受体的构像也会发生相应的变化，这就是所谓的“诱导契”。影响复合物分子稳定性的主要因素是疏水作用和键合力大小，而影响键合力的因素有作用位点空间位的互补、静电相互作用和氢键等，所以分子对接的过程主要包括分子间的空间互补和电学性质互补。

2.比较分子场分析（CoMFA）法

药物分子与受体之间的可逆相互作用主要是通过非共价作用，如范德华相互作用、静电相互作用、氢键相互作用和疏水相互作用等。作用于同一个受体的一系列药物分子，他们与受体之间的各种作用力场应该有一定的相似性，比较分子场分析（CoMFA）法就是研究这些药物分子周围的力场分布，并把它们与药物分子活性定量地联系起来。

CoMFA的基本步骤:

1.化合物分子的活性构象，按照一定的规则，把它们重叠在一个包含全部化合物分子的空间网格上。

2.化合物周围各种作用场的空间分布。

3.使用偏最小二乘法（PLS）确定QSAR关系式。

4.用三维等值线图（Contour Maps）显示计算结果。

3.比较分子相似性指数分析(CoMSAI)法

在药物分子与受体之间的可逆相互作用主要是通过非共价键结合,如范德华相互作用、静电相互作用、氢键相互作用和疏水相互作用实现的。作用于同一个受体的一系列药物分子,它们与受体之间的各种作用力场应该有一定的相似性。这样,在不了解受体三维结构的情况下,研究这些药物分子周围的力场分布,并把它们与药物分子活性定量地联系起来,既可以预测受体的某些性质,又可依此建立一个定量模型设计新化合物,并定量地预测化合物的活性。COMSIA建立模型引入依赖于距离的高斯Gaussian函数,可避免分子表面附近格点处势能的急剧变化以及异常值的出现,使接触面上势能的变化比较缓和,从而降低了取向、位置、格点划分对分析结果的影响。因此CoMSIA方法可以克服CoMFA方法的一些内在缺陷,获得比CoMFA方法更稳定的3D-QSAR模型。

（二）技术路线：

四、研究的总体安排与进度：

2010年9月到2010年10月：

查阅文献、资料。

2010年11月到2011年2月：

进行实验，填写开题报告、写论文综述和外文文献的翻译。

2011年3月到2011年4：

整理实验结果，撰写论文，并在指导老师指导下对论文进行修正和定稿。

2011年5月:

毕业论文答辩。

五、主要参考文献：

[1] Blunt JW., Brent RC., Munro MHG., et al. Marine natural products Nat Prod. Rep, 2004, 21: 1-49.

[2] 张浩, 靳艳, 张卫. 南海海绵Axinella sp中两个含吡咯七元环内酰胺生物碱的分离鉴定[J]. 中药材, 2006, 29（12）: 1299-1301.

[3] 田翠孟. 细胞周期蛋白依赖性激酶与肿瘤关系的研究进展[J]. 实用肿瘤杂志, 2010, 25(4):

499-500.

[4] 陈洁, 王中峰. 细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶5在中枢神经系统发育和神经退行性疾病中的作用[J].

生理学报, 2010, 62(4): 295-308.

[5] Lew J., Huang QQ., Qi Z. A brain-specific activator of cyclin-dependent kinase5. Nature, 1994, 371(6496):

423-426.

[6] 李红丽, 杨忠, 孙榆等. 老年性学习记忆减退与大鼠脑发育过程中周期素依赖性蛋白激酶5的表达[J]. 中国临床康复, 2005, 9(24): 247-249.

[7] 曲忠森, 李亮, 钟士江等. 糖尿病大鼠脑细胞周期依赖性蛋白激酶5和蛋白激酶A参与调解τau蛋白磷

酸化[J]. 生物化学与生物物理进展， 2007, 34（12）: 1308-1313.

[8] 王英鹏, 宋俊峰, 饶志仁. CDK5与神经退行性疾病[J].生理科学进展, 2004, 35(1): 46-47.

[9] Churchet I. τau therapeutic strategies for the treatment of Alzheimer’s disease. Curr Top Med Chem, 2006, 6: 579-595.

[10] 陈娟, 冯友梅, 汪义鹏等. 细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶-5过度表达神经细丝磷酸化的影晌[J]. 中

国临床康复, 2005, 9(29): 208-210.

[11] Noble W., Olm V., Takata K., et al. Cdk5 is a key factor in τau aggregation and tangle formation in vivo. Neuron, 2003, 38: 555-565.

[12] Tasdemir D., Mallin R., Greenstein M. Aldisine alkaloids from the philippine sponge Stylissamassa are potent inhibitors of mitogerr activated protein kinase kinase-1 (MEK-1). J.M ed. Chem, 2002, 45( 2): 529-532.

[13]何勤飞.海洋天然产物hymenialdisine衍生物的合成[D]. 四川大学, 2007

毕业论文文献综述

生物技术

CDK5靶向的海洋天然产物hymenialdisine及其衍生物

摘要：海洋天然产物具有化学结构新颖、生物活性多样、作用机制独特的特性，已成为发现重要先导药物的主要源泉和研制开发新药的基础。本文介绍了海洋天然产物中存在激酶抑制剂，其中hymenialdisine作为一种激酶抑制剂阻碍CDK5的活性过度表达，具有潜力开发成老年痴呆症药物或其前体。因其分子中含有不稳定的溴原子取代基，不具备作为药物分子所要求的稳定结构，故对其结构进行改造有望获得高稳定性、高选择性、高抑制活性的衍生物，高选择性的激酶抑制剂作为药物开发的先导化合物，其毒副作用较低，有利于提高药物后期开发的成功率。

关键词：海洋天然产物；CDK5；hymenialdisine；衍生物；激酶抑制剂

海洋是目前资源最丰富、保存最完整、最具有新药开发潜力的新领域。近年来海洋天然产物越来越引起科学家们的关注，海洋天然产物与陆生天然产物相比具有更加复杂多样、新颖奇特的结构以及多元化的生物活性和机制。在浩瀚的海洋中存在着大量超乎人们想象的化学结构新颖、生物活性多样、作用机制独特的次生代谢产物,将成为发现重要先导药物的主要源泉和研制开发新药的基础。

1 海洋天然产物的最大来源者—海绵

海绵品种繁多、分布广泛、次生代谢产物复杂多样,是已知海洋天然产物的最大来源。近年来统计资料表明:从海绵中发现的天然产物约占已发现的海洋天然产物总数的38%左右,从海绵中已发现大量的抗细菌、抗真菌、抗肿瘤、抗病毒和免疫调节等活性物质[1]。海绵生物活性物质按照化学结构类型可分为多糖类、聚醚类、大环内脂类、萜类、生物碱类、多肽类、甾醇和不饱和脂肪酸等。如hymenialdisine和debromohymenialdisin是首次从小轴海绵(Axinella sp)中分离得到的含吡咯七元环内酰胺的生物碱类化合物，是天然的CDK5的选择性抑制剂[2]。海绵中存在结构和数量如此丰富的有潜力开发成药物的生物活性物质,使得对海绵的化学成分的研究成为海洋天然产物研究的一个热点和重点领域。

2 细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)

细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)是细胞周期调节的核心,与细胞周期蛋白(Cyclins)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CKIs)等组成细胞周期调控网络系统。

CDKs的单体呈非活性构象，首先与其相应的细胞周期蛋白（cyclins）结合成Cyclins/CDKs。组成全酶后仍无活性,CDKs作为催化亚单位,其活性状态由CDKs分子中的Thr、Tyr残基的磷酸

化和去磷酸化修饰决定,首先CDKs分子上游的CDK激活激酶(CAK)催化其分子上ATP结合点附近的一个保守的苏氨酸被磷酸化,后再由CAK激活激酶(CAKAK)催化使Thr残基磷酸化和Tyr残基去磷酸化,CDK即被激活,而活化的Thr残基去磷酸化则使CDK失活[3]。目前已发现十多种CDKs，包括控制细胞周期进程的CDK1,2,3,4,6，控制细胞转录的CDK7,8,9和调控神经元损伤的CDK5。都有一个催化核心,均属丝/苏氨酸蛋白激酶家族,此催化核心的磷酸化和去磷酸化决定了细胞周期的运行。

2.1 细胞周期蛋白依赖性激酶5（CDK5）功能异常导致神经系统功能障碍

细胞周期蛋白依赖性激酶5(cyclin-dependent kinase 5,CDK5)是细胞周期素依赖的蛋白酶家族中一个特殊成员,既非细胞周期素依赖，也不调节细胞周期，它具有一个特殊的功能即调控神经元损伤。

尽管CDK5与其它CDKs在分子结构上很相似，但其活化方式却明显不同于其CDKs家族成员。单体形态的CDK5在真核细胞体内各组织均有分布，但只有脑组织中的CDK5呈现高度的激酶活性[4]。CDK5要与p35、p39等激活因子相结合而被激活，而这些激活因子只特异地分布在中枢神经系统（central nervous system,CNS）中[5]，因此CDK5只在神经元中被激活，在CNS 中发挥着尤为重要的作用。

CDK5功能异常可导致神经系统功能障碍。除了对正常调控神经功能外，CDK5活性失调或异常分布均对神经元有毒害作用。如CDK5缺失导致脑皮质层状细胞性组构缺陷；CDK5缺陷小鼠运动神经元出现染色质融解、细胞气球样变、核偏位伴随神经丝堆积，表明CDK5缺失神经元存在轴浆运输障碍，因此CDK5功能正常对运动神经元的生存至关重要；在果蝇中，CDK5活性升高或降低均可导致轴突靶向错误和对腹部运动神经靶向识别错误；CDK5的表达下调导致老年性学习记忆减退[6]。

而CDK5的过度表达会引发老年痴呆，阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）的特征性病理改变是神经元内神经原纤维缠结(NFTs)和神经元外老年斑(SPs)的沉积所造成的[7]。NFTs 是由过度磷酸化的细胞骨架蛋白(如δ，神经细丝)组成，SPs主要由Aβ构成, NFTs包含双股螺旋纤维(PHF)和直丝(SF)。PHF是NFTs的主要组成纤维,由两股亚单位以螺旋方式相互盘曲而成。PHF以缠结片段或分散细丝方式被分离。SF和PHF共有τau抗原决定簇。τau蛋白是构成PHF 唯一必须的成分,异常磷酸化的τau蛋白堆积是NFTs构成过程中最早期细胞骨架改变之一[8]。

不同蛋白激酶和磷酸化酶系统对τau蛋白的超磷酸化作用能引发τau蛋白的结构和构型

改变,进而影响它与微管蛋白结合和微管聚集能力。在正常大脑,τau蛋白磷酸化和去磷酸化之间的平衡调节着细胞骨架稳定性,影响轴突形态。在病理情况下如神经退行性变时,这种失

衡可导致成熟神经元损伤。在AD病人脑中发现最早改变的是τau蛋白磷酸化。τau蛋白一些潜在性磷酸化位点能被CDK5和GSK-3β磷酸化,故CDK5和GSK-3β是引起AD样τau蛋白异常过度化的重要激酶，并被建议为药物治疗AD的新靶点[9]。

陈娟等[10]在细胞水平观察细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶5过度表达对神经细丝磷酸化的影响。培养N2a细胞，分为2组，一组为转染组，一组为未转染组。转染组用脂质体转染技术将CDK5基因转入N2a细胞株中，并建立稳定表达CDK5的N2a/CDK5细胞株，免疫沉淀法及酶活性测定检测CDK5活性，免疫荧光和免疫印迹技术检测它的表达和神经细丝的磷酸化状态。结果：在N2a细胞株转染组中，CDK5表达增加，并使抗体SMl31显色增强，SMl32显色减弱，提示神经细丝被过度磷酸化。与此同时，CDK5活性较未转染组提高3.5倍。由此可得出细胞水平的CDK5过度表达会导致CDK5过度激活和神经细丝过度磷酸化，而过度磷酸化的神经细丝导致神经原纤维缠结从而引发阿尔茨海默病。

因此，通过小分子化合物对激酶GSK-3β和CDK5的抑制切断疾病生成和发展的生化途径，是目前开发治疗老年痴呆疾病药物的研究方向之一[11]。

当CDK5过度激活而且分布部位发生改变时，CDK5激酶的大量激活参与τau的磷酸化，促进τau蛋白堆积从而参与了阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森氏病(Parkinson’s disease, PD)、亨廷顿氏病(Huntington’s disease, H D)以及脊髓侧索硬化症(amyotrophic lateralsclerosis, ALS)等众多神经退行性疾病的发生发展[8]。因此,研究针对CDK5过度激活的药物, 可能是有望从根本上治疗神经退行性疾病的有效途径。

3 海洋天然产物中的激酶抑制剂

为了更好的利用这些海绵资源,寻找有药用前景的海洋天然产物,张浩等[2]对中国南海三亚海域采集到的小轴海绵(Axinella sp)的化学成分进行了研究,对其天然产物进行了分离纯化和结构鉴定。海绵经溶剂萃取、分配、ODS柱层析等分离手段得到了两个生物碱纯化合物,采用理化性质和波谱技术相结合的方法进行化合物的结构鉴定,确定这两个化合物分别hymenialdisine(1)和debromohymenialdisin(2)见图1。它们都是首次从中国海洋生物中分离得到的含吡咯七元环内酰胺的生物碱类化合物,是MAPK途径抑制剂,具有较高生物活性。

R=Br,hymenialdisine(1)

R=H,debromohymenialdisine(2)

图1 hymenialdisine和debromohymenialdisine的结构式

3.1 hymenialdisine

hymenialdisine对与早老痴呆疾病相关的激酶GSK-3β和CDK5有很强的抑制活性,对激酶CDK家族的其它成员(CDK1-6/cyclins),以及许多其它激酶例如激酶Erk1、Erk2、CK1、MEK等也具有低纳摩尔浓度的抑制活性[2],很有潜力开发成因激酶GSK-3β和CDK5的活性过度表达导致的老年痴呆症药物或其前体。

3.2 debromohymenialdisine

debromohymenialdisine可以抑制G2 DNA损伤检查点和检查点激酶1(Chk1)和2(Chk2)。不同于其他检查点抑制剂DBH不抑制ATM或ATM-Rad3-关联蛋白,很有可能作为治疗骨关节炎的药物或其前体[2]。

3.3 hymenialdisine衍生物

对具有生物活性的天然产物进行结构改造是寻找高选择性和高活性的药物侯选物的便捷、有效的途径之一。

根据文献报道[12]，比较hymenialdisine和debromo-hyrnenialdisine对MEK-l的抑制活性可知，含溴与不含溴原子对MEK-1的抑制活性相差90倍；比较diacetyl-hyrnenialdisine（3）与diacetyl-debromo-hyrnenialdisine（4）（见图2）对GSK-3β的抑制活性可知，含溴的类似物抑制活性为不含溴的类似物的4倍，而对CDK5的抑制，含溴的类似物比不含溴的类似物的活性高2倍。

R=Br,diacetyl-hymenialdisine（3）

R=H, diacetyl-debromo-hymenialdisine（4）

图2 diacetyl-hymenialdisine和diacetyl-debromo-hymenialdisine的结构式虽然从上述的构效关系数据可知，溴原子的存在可使hyrnenialdisine获得高抑制活性，但是hymenialdisine分子中的溴原子取代基不稳定，不具备作为药物分子所要求的稳定结构，

同时对激酶的抑制也缺乏选择性。因此，对hymenialdisine进行结构修饰，用亲脂性的药效基团替代溴原子合成结构稳定的类似物，也可通过调控取代基的结构获得高选择性，并保持hyrnenialdisill e己有的高抑制活性。

何勤飞[13]通过制备吡咯a-位为不同芳香基团取代的hymenialdisine衍生物来获得结构稳定并具有高选择性和高抑制活性的药物侯选物。用亲脂性的药效基团苯基、苄基替代了溴原子，通过合成反应完成了2-苯基取代及2-苄基取代的hymenialdisine双键异构化的衍生物见图3，该化合物结构稳定，具有较好的亲脂性。

R=Ph, 2-苯基取代的hymenialdisine衍生物

R=Rn, 2-苄基取代的hymenialdisine衍生物

图3 2-苯基取代及2-苄基取代的hymenialdisine衍生物的结构式

5.小结

hymenialdisine是首次从中国海洋生物中分离得到的含吡咯七元环内酰胺的生物碱类化合物,是MAPK途径抑制剂,具有较高生物活性。hyrnenialdisine分子中存在的溴原子使其获得高抑制活性，但是溴原子取代基不稳定，不具备作为药物分子所要求的稳定结构，同时对激酶的抑制也缺乏选择性。因此，对hymenialdisine进行结构修饰，选择不同亲脂性的药效基团替代溴原子合成结构稳定并具有高选择性和高抑制活性的药物具有重要的意义。在CNS 中CDK5过度激活会参与众多神经退行性疾病的发生发展过程，故以CDK5为靶标，以海样天然产物hymenialdisine及其类似物作为先导化合物，拟综合采用分子对接和QSAR等计算机辅助药物分子设计的方法，了解CDK5 ATP结构口袋的特性，指导CDK5抑制剂的设计。

参考文献

[1] Blunt JW., Brent RC., Munro MHG., et al. Marine natural products Nat Prod. Rep, 2004, 21: 1-49.

[2] 张浩, 靳艳, 张卫. 南海海绵Axinella sp中两个含吡咯七元环内酰胺生物碱的分离鉴定[J]. 中药材, 2006, 29(12): 1299-1301.

[3] 田翠孟. 细胞周期蛋白依赖性激酶与肿瘤关系的研究进展[J].实用肿瘤杂志, 2010, 25(4): 499-500.

[4] 陈洁, 王中峰. 细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶5在中枢神经系统发育和神经退行性疾病中的作用[J]. 生

理学报, 2010, 62(4): 295-308.

[5] Lew J., Huang QQ., Qi Z., et al. A brain-specific activator of cyclin-dependent kinase5. Nature, 1994, 371(6496): 423-426.

[6] 李红丽, 杨忠, 孙榆等. 老年性学习记忆减退与大鼠脑发育过程中周期素依赖性蛋白激酶5的表达[J]. 中国临床康复, 2005, 9(24): 247-249.

[7] 曲忠森, 李亮, 钟士江等. 糖尿病大鼠脑细胞周期依赖性蛋白激酶5和蛋白激酶A参与调解τau蛋白磷酸

化[J]. 生物化学与生物物理进展, 2007, 34(12): 1308-1313.

[8] 王英鹏, 宋俊峰, 饶志仁. CDK5与神经退行性疾病[J]. 生理科学进展, 2004, 35(1): 46-47.

[9] Churchet I. τau therapeutic strategies for the treatment of Alzheimer’s disease. Curr Top Med Chem, 2006, 6: 579-595.

[10] 陈娟, 冯友梅, 汪义鹏等. 细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶-5过度表达神经细丝磷酸化的影晌[J]. 中国临床康复, 2005, 9(29): 208-210.

[11] Noble W., Olm V., Takata K., et al. Cdk5 is a key factor in τau aggregation and tangle formation in vivo. Neuron, 2003, 38: 555-565.

[12] Tasdemir D., Mallin R., Greenstein M. Aldisine alkaloids from the philippine sponge Stylissamassa are potent inhibitors of mitogerr activated protein kinase kinase-1 (MEK-1). J.M ed. Chem, 2002, 45(2): 529-532.

[13]何勤飞.海洋天然产物hymenialdisine衍生物的合成[D]. 四川大学, 2007.

本科毕业设计

（20_ _届）

海洋天然产物hymenialdisine及其类似物与CDK5作用模式

的研究

目录

中英文摘要

1 引言 (1)

1.1 细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinases, CDKs） (1)

1.1.1 细胞周期蛋白依赖性激酶5(cyclin-dependent kinase5, CDK5) (1)

1.2 来自海洋的A TP竞争性抑制剂 (1)

(1)

2

2

2

2

3

(3)

2.2 分子对接 (8)

8

8

9

9

10

10

10

14

18

19

摘要: CDK5是神经系统中重要的蛋白激酶之一，是神经损伤和神经退行性病变的治疗靶点，可作为防治中枢神经系统疾病的靶分子。CDK抑制剂具有良好的ATP竞争性抑制活性，由于大多数激酶ATP结合位点的保守性，使激酶抑制剂缺乏较好的选择性，所以选择性一直是激酶抑制剂研究中的重要难题和研究热点。针对CDK5受体抑制剂hymenialdisine及其类似物，本文采用分子对接、比较分子场分析法(CoMFA)和比较分子相似性指数分析法(CoMSIA)进行化合物活性数据和三维结构参数之间关系的研究，构建了对接模型、CoMFA及CoMSIA模型。对接结果显示激酶抑制剂与CDK5的结合主要是通过氢键作用来实现的。CoMFA模型的交叉验证相关系数q2为0.518，非交叉验证相关系数r2为0.885；CoMSIA的q2和r2分别为0.507和0.928。两组模型均具有较好的预测能力，为激酶抑制剂的结构与活性和选择性的关系及优化改造提供了重要的理论依据和指导意义。

关键词：CDK5；hymenialdisine；分子对接；CoMFA；CoMSIA

Abstract:CDK5is an important protein kinase in the nervous system, and is a nerve injury and neurodegenerative disease therapeutic target, which can be used as target molecules for prevention and treatment of central nervous system diseases.CDK inhibitors have a good ATP competitive inhibitory activity.Since the conservation in most kinase ATP binding site leads to the lack of good selectivity of kinase inhibitors. The selectivity has been an important research problem and research focus in kinase inhibitors. For CDK5 receptor inhibitors hymenialdisine and its analogues, molecular docking, CoMFA and CoMSIA were used to research the relationship between compound activity data and three-dimensional structure parameters. Docking, CoMFA and CoMSIA models were bulit. Docking result displayed that the combination of kinase inhibitors and CDK5 mainly achieves by hydrogen bonds. The q2 of leave-one-out cross validation in CoMFA model is 0.518 and r2 of the no validation in CoMFA is 0.885. The q2 and r2 of CoMSIA model is 0.507 and 0.928, respectively. Two models have good predictive ability, which will provide important theoretical basis and guida nc e fo r the rel atio nshi p betwe en st ruc tu re a nd ac tiv ity and sel ec ti vity of kinase in hi b ito rs. Keywords: CDK5; hymenialdisine; molecular docking; CoMFA; CoMSIA

1 引言

1.1 细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinases, CDKs）

细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)是细胞周期调节的核心，与细胞周期蛋白(Cyclins)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CKIs)等组成细胞周期调控网络系统。CDKs的单体呈非活性构象，首先与其相应的细胞周期蛋白（cyclins）结合成Cyclins/CDKs。组成全酶后仍无活性，CDKs 作为催化亚单位，其活性状态由CDKs分子中的Thr、Tyr残基的磷酸化和去磷酸化修饰决定。首先CDKs分子上游的CDK激活激酶(CAK)催化其分子上ATP结合点附近的一个保守的苏氨酸被磷酸化，后再由CAK激活激酶(CAKAK)催化使Thr残基磷酸化和Tyr残基去磷酸化，CDK即被激活，而活化的Thr残基去磷酸化则使CDK失活[1]。目前已发现十多种CDKs，包括控制细胞周期进程的CDK1,2,3,4,6，控制细胞转录的CDK7,8,9和调控神经元损伤的CDK5。都有一个催化核心，均属丝/苏氨酸蛋白激酶家族，此催化核心的磷酸化和去磷酸化决定了细胞周期的运行。

1.1.1 细胞周期蛋白依赖性激酶5(cyclin-dependent kinase5, CDK5)

细胞周期蛋白依赖性激酶5(cyclin-dependent kinase5, CDK5)是小丝氨酸/苏氨酸周期素依赖性激酶家族成员，虽与其他成员序列具有同源性，也可以与细胞分裂周期素D1、D2结合，但结合后没有激酶活性。既非细胞周期素依赖，也不调节细胞周期，却在中枢神经系统的发育和神经元正常功能的维持中发挥重要作用，并与一些神经退行性疾病有密切联系，是神经系统中重要的蛋白激酶之一，是防治中枢神经系统疾病的靶分子。

尽管CDK5与其它CDKs在分子结构上很相似，但其活化方式却明显不同于其CDKs家族成员。单体形态的CDK5在真核细胞体内各组织均有分布，但只有脑组织中的CDK5呈现高度的激酶活性。CDK5要与p35、p39等激活因子相结合而被激活，而这些激活因子只特异地分布在中枢神经系统（central nervous system，CNS）中，因此CDK5只在神经元中被激活，在CNS中发挥着尤为重要的作用。CDK5活性失调或异常分布均对神经元有毒害作用,τau蛋白的过度磷酸化导致神经纤维缠结从而参与阿尔茨海默氏病(Alzheimer’sdisease, AD)、帕金森氏病(Parkinson’s disease, PD)、亨廷顿氏病(Huntington’s disease, HD)以及脊髓侧索硬化症(amyotrophic lateralsclerosis, ALS)等众多神经退行性疾病的发生发展过程[2]。

在过度表达人p25的转基因小鼠中，CDK5的激活因子p35裂解成p25，p25过度产生从而形成p25-CDK5复合体，致使CDK5过度激活并增强其稳定性及激酶活性，分布部位也发生改变并重新定位，促进τau蛋白的异常磷酸化效应，导致细胞骨架破坏及神经元凋亡或死亡[3-4]。因此CDK5可以作为神经损伤和神经退行性病变的治疗靶点，研究针对预防p25过度产生，以及CDK5过度激活的药物，可能是有望从根本上治疗神经退行性疾病的有效途径。

1.2 来自海洋的ATP竞争性抑制剂

海洋是目前资源最丰富、保存最完整、最具有新药开发潜力的新领域。近年来海洋天然产物越来越引起科学家们的关注，海洋天然产物与陆生天然产物相比具有更加复杂多样、新颖奇特的结构以及多元化的生物活性和机制。在浩瀚的海洋中存在着大量超乎人们想象的化学结构新颖、生物活性多样、作用机制独特的次生代谢产物，将成为发现重要先导药物的主要源泉和研制开发新药的基础[5-6]。目前已发现CDKs小分子抑制剂大多是ATP的竞争性抑制剂。

1.2.1 海洋天然产物hymenialdisine (HMD)及其类似物

蛋白激酶在细胞信号转导中扮演重要角色，共同的底物是ATP，因此提高激酶ATP竞争性抑制剂的选择性是降低其毒副作用的根本。在众多的激酶抑制剂中，ATP竞争性抑制剂以其亲和性高和作用位点明确而备受关注，也是目前研究最多的激酶抑制剂类型[7-8]。CDK抑制剂具有良好的ATP竞争性抑制活性，但由于激酶ATP位点的保守性，使激酶抑制剂缺乏较好的选择性，所以选择性一直是激酶抑制剂研究中的重要难题和研究热点[9]。CDKs的晶体结构解析，抑制剂的合成和活性评价，CDKs与抑制剂作用模式分析可以用于研究CDKs抑制剂。海洋天然产物hymenialdisine (HMD)及其类似物抑制细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs），糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)，酪蛋白激酶1(CK1)和检查点激酶1（Chk1）的活性[10]。hymenialdisine 对与早老痴呆疾病相关的激酶GSK-3β和CDK5有很强的抑制活性，很有潜力开发成因激酶GSK-3β和CDK5的活性过度表达导致的老年痴呆症药物或其前体。hymenialdisine是ATP的一种竞争性抑制剂，与ATP竞争性结合这些激酶，是一种潜在应用治疗神经退行性疾病的新的激酶抑制剂。

1.3 分子对接

分子对接方法(Molecular Docking Method)已成为药物设计方法中比较成熟的直接药物设计方法，已成为计算机辅助药物研究领域的一项重要技术。是通过研究小分子配体与生物大分子受体相互作用，预测其结合模式和亲和力进而实现基于结构的药物设计的一种重要方法[11]。

分子对接是将小分子对接到受体的活性位点处，寻找小分子配体与生物大分子受体作用的合理取向和构像，使配体和受体的几何形状和相互作用达到最佳匹配。配体(药物)与受体的相互作用是一个综合平衡的过程，药物必须取得一定构象以“适应”受体结合部位的“空腔”形状和构像变化。同时，受体为配合与药物的结合，其构象也发生相应的变化，这就是所谓的“诱导契”[12]。

分子对接的方法[13]：

a.刚体对接

对接过程中，配体与受体的构象不发生变化，仅仅改变其空间位置与姿态。适合处理大分子间的对接，如蛋白质和蛋白质或蛋白质和核酸等大分子间的对接。

b.半柔性对接

对接过程中，配体的构象可以在一定程度上发生变化，但通常大分子是刚性的，构象不发生变化。适合处理大分子和小分子间的对接，如蛋白质分子与配体小分子的对接。

c.柔性对接

对接过程中，配物和受体的构象允许发生自由变化。一般用于精确考查分子间的识别情况。分子的柔性主要来自于可旋转健的旋转。这种变化包括三个平动自由度、三个转动自由度以及底物分子的部分二面角的变化。

1.4 定量构效关系（QSAR）

QSAR是从一系列相似结构的分子出发来构造活性与结构的模型，然后运用这种模型去预测化合物的活性性质，用于优化活性、选择性、药代，映射受体结构，推断机理，设计数据库，从而为新分子的设计提供理论依据。

1.4.1 二维定量构效关系（2D-QSAR）

二维定量构效关系(2D-QSAR)方法是将分子整体的结构性质作为参数，对分子生物活性进行回归分析，建立化学结构与生物活性相关性模型的一种药物设计方法，常见的方法有Ha nsch、Free-Wilson、分子连接性方法等，最经典且应用最广泛的是Hansch方法。二维定量不能精确描述分子三维结构与生物活性之间的关系，因此，1979年，Crippen提出“距离几何学方法（distance geometry, DG）”；1980年Hopfinger等人提出“分子形状分析方法（mo lecular shape analysis,MSA）”；1988年Cramer等人提出了“比较分子场分析法（CoMFA）”。比较分子场分析法是应用最广泛的基于定量构效关系的药物设计方法；1990年，出现了在比较分子场分析法基础上发展的“比较分子相似性指数分析法（CoMSIA）”以及在距离几何学方法基础上发展的“虚拟受体方法”等新的三维定量构效关系方法。

1.4.2 三维定量构效关系（3D-QSAR）

三维定量构效关系（3D-QSAR）方法是在定量构效分析中引入生物活性分子的三维结构信息，建立具有较高预测能力的模型，映射受体部位的特征[14]。

1.4.

2.1 比较分子场分析法(COMFA)

比较分子场分析法(CoMFA)的基本设想是：分子表面与网格接触的各点可以构成假想受体活性部位的空间和表面，被研究分子的构象应该是与受体相结合时所采取的构象，即药效构象[15-16]。基本原理是：结构相似的系列化合物以相同的方式作用于受体的结合部位,其作用强弱与化合物周围分子力场包括静电场和立体场的变化以及受体的生物活性密切相关。通过分析系列化合物CoMFA模型的静电场及立体场的分布特征，可反映药物分子与受体之间非键相互作用的特性，获得受体生物活性的结构调控因素，从而指导药物分子设计或结构修饰[17]。

CoMFA方法主要反映了药物分子与受体之间非键相互作用，是应用较广泛的间接药物设计方法，采用

Lennard-Jones 6-12和Coulomb势能函数计算立体场能和静电场能。可用于同类型结构抑制剂的优化改造，

以提高抑制剂的活性。近年来，常与对接方法联用，通过分析化合物活性变化趋势与分子对接结果，能很

直观地分析影响化合物活性的一些重要因素，更利于设计高活性的抑制剂[18]。

1.4.

2.2 比较分子相似性指数分析法（COMSIA）

比较分子相似性指数分析法（CoMSIA）的基本原理和过程与CoMFA类似，不同的是CO MSIA引入了更多的分子场包括疏水场、氢键供体场、氢键受体场，能更好地描述药物与受体的相互作用特征，更加全面地揭示影响生物活性的分子结构信息，同时能量函数采用与距离相关的更加平滑的高斯函数，避免分子表面附近网格点处巨大的势能跳跃，使势能的变化比较缓和，获得比CoMFA方法更稳定的3D-QSAR模型[19]。

2 计算方法

2.1 化合物及活性数据的选择

本文选择的化合物来源于文献[20]，共有52个化合物。化合物基本结构及相应的生物活性数据见表1。此类化合物都是HMD的类似物，均具有一定的结构相似性，但取代基团具有一

定的结构多样性。建模所选择的化合物均具有CDK5的活性数据和相同的骨架结构，活性之间具有较好的可比性。这些化合物对CDK5的抑制活性均以IC50值表示，IC50值均转换为

pIC50(pIC50=-logIC50)。

表1 hymenialdisine (HMD)及其类似物的结构与活性数据

Table1 Structures and activity indices of hymenialdisine (HMD) and analogues

No Compound Structure pIC50

(CDK5) No Compound Structure pIC50

(CDK5)

1 1.43

2 2 1.252

3 0.951

4 1.102

5 1.208

6 0.600

7 0.273

8 -0.960

9 0.752 10 0.752

(CDK5) (CDK5) 11 0.719 12 0.672 13 -0.093 14 0.147

0.167 16 0.963 15

0.728 18 -0.004 17

19 -0.708 20 -0.911

(CDK5) (CDK5)

-1.017 21 -1.916 22

23 -0.580 24 -1.100 25 -0.274 26 -0.534 27 -1.083 28 -1.352 29 -1.365 30 -0.839