感受态细胞制备及各种感受态的特点

感受态细胞制备

制备感受态常用得方法就是电击法与CaCl2制备法,以下介绍CaCｌ2制备法:

1、可以从－８0℃冰柜中,取出一支冻存菌株,于事先照过紫外得超净台中,用无菌得接种环轻轻蘸取菌种后,在无抗平板(由于Rocetta含有氯霉素抗性,需要涂布在氯霉素抗性得平板,后面得都就是如此)上划线,并将菌种迅速放回－80℃保存,在划线板上做好相应标记,于３7℃培养过夜。

2、从37℃培养过夜得新鲜平板上挑取一个单克隆,接种于2mlEP管中,3７℃,２20ｒｐm震荡培养约6个小时至对数生长中后期;将该菌悬液以1:1０0得比例接种于5０ml LB液体培养基(２瓶)中,3７℃振荡培养2、5小时至ＯD600＝0。5。

注意:接种比例不得大于1:１0。

3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、预冷得离心管(50ml)中,在冰上放置5~1０ｍin; 注意:划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板与多接一根试管,划板、接种、转接均要严格按照无菌操作。

4、4℃５000g离心５分钟。用预冷得去离子水洗涤沉淀,4℃ 500０ｇ离心５分钟;

Nｏte:此步主要就是为了洗去培养基中得盐等

5、沉淀加入2ｍl预冷得0、05mol/L CaＣｌ2—１5％甘油混合溶液,轻吹散,冰浴5分钟,4℃5００0ｇ离心5分钟;

6、沉淀加入2ｍl预冷得0.05ｍol/L CａCl２—15％甘油混合溶液,轻吹散,即成为感受态细胞悬液。分装成50～1００μl得小份,贮存于－70℃可保存半年。

含15％甘油得0.０5mol/L CaCｌ2制备方法:

称取0。28g CaCl２(无水,分析纯),溶于５０ml重蒸水中,加入１5ｍl甘油,定容至100ｍl,高压灭菌。

感受态细胞得特征

感受态:通过特殊处理使细胞处于能够吸收外源ＤＮA得状态。感受态细胞得特征:

(1)细胞表面暴露出一些可接受外来ＤNA得位点(以溶菌酶处理,可促使受体细胞得接受位点充分暴露)。(2)细胞膜通透性增加(用钙离子处理,可使膜通透性增加,使DNＡ直接穿过质膜进入细胞)。(3)受体细胞得修饰酶活性最高,而限制酶活性最低,使转入得ＤＮA分子不易被切除或破坏、

实验室常用得感受态细胞

1。DH5α菌株?克隆菌株:DH5α就是一种常用于质粒克隆与高拷贝质粒得稳定复制得菌株。

E、ｃoli ＤH5α在使用pＵC系列质粒载体转化时,其φ80lacZΔM15基因产物可与载体编码得β—半乳糖苷酶氨基端实现α－互补,可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株、ReｃA１与ｅｎd A1得突变有利于克隆DNA得稳定与高纯度质粒DＮA得提取。

基因型:F－、φ80dｌaｃＺΔM15、Δ(ｌacZYA-argF)U169、deoR、reｃＡ1、eｎdＡ1、ｈs ｄR１7(ｒk—,ｍk+)、pｈoA、ｓｕpE44、λ—、ｔhｉ—1、gyｒA９6、relA1

2。TOP10菌株?克隆菌株:该菌株适用于高效得DNA克隆与质粒扩增,能保证高拷贝质粒得稳定遗传。?基因型:F－、ｍcrＡΔ(ｍrr－hsdＲMＳ—mcrＢC)、φ80 、laｃＺΔM15、△l ａｃⅩ74、reｃA1、araΔ1３9Δ(aｒａ—lｅu)７６９7、ｇalU 、gａｌK 、rｐｓ、(S ｔrｒ) enｄA1、ｎupG

3。BL21(DE3) 菌株:

蛋白表达菌株:该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子得表达载体(如ｐET系列)得基因。该菌株用于Ｔ7 RNA聚合酶为表达系统得高效外源基因得蛋白表达宿主,T7噬菌体RNA聚合酶基因得表达受控于λ噬菌体DE3区得acＵV5启动子,该区整合于BＬ２1得染色体上。该菌株适合于非毒性蛋白得表达、

基因型:F－、ompT、hsdＳ(ｒB-ｍB—)、ｇａl、ｄｃm(DE3)

4。BL２１(DＥ３) pLysＳ菌株?蛋白表达菌株:该菌株含有质粒pLysS,因此具有氯霉素抗性。ＰLｙsS含有表达T７溶菌酶得基因,能够降低目得基因得背景表达水平,但不干扰目得蛋白得表达。该菌适合表达毒性蛋白与非毒性蛋白。

基因型:Ｆ—、ｏmpT、hsdS(r B-m B—)、gａl、ｄcm(DE３)、pLyｓＳ、Ｃamr

５、Rocetta感受态特征:

蛋白表达菌株

Rosetta系列菌株来源于BL２1系列宿主菌,该系列菌株含有原本在大肠杆菌中稀少得真核细胞密码子,增加了真核细胞得蛋白表达水平。

（1）Rocetta (ＤE3)

该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充大肠杆菌缺乏得６种稀有密码子(AUＡ、AGＧ、AGA、ＣUA、CＣＣ、GGA)对应得tRNA,这样Ｒｏcetta菌株提供了“万能”得翻译,从而避免因大肠杆菌密码子使用频率导致得表达限制,提高外源基因尤其就是真核基因在原核系统中得表达水平。ｔRNA基因由它们得天然启动子驱动。

基因型: F- 、oｍpT、hsｄSB (r B －m B － )、gal、ｄcm、lacY1(DＥ3)、pRARＥ(aｒｇU,argW,

ｉleX,glｙT,leuW,ｐrｏL)(Ｃｍｒ )

补充:稀有密码子对蛋白表达得影响:数氨基酸都有一个以上得密码子,对Ｅ.coli密码子应用情况分析表明一些密码子很少使用,尤其就是精氨酸密码子AＧA, ＡＧG , ＣGG ,CGＡ;异亮氨酸得密码子AUA;亮氨酸得密码子CUA与甘氨酸得密码子GGA与脯氨酸得密码子ＣＣＣ很少被用到。目得基因中含有过多得稀有密码子被认为就是低表达水平与产生不完全产物得一个原因、当在氨基端附近出现多个稀有密码子得时候,情况更为严重,许多研究表明,精氨酸得密码子AGA与AGG得高频出现可能大大影响蛋白得产量、当这些密码子出现在N－端附近时候,这种影响将达到最大。?多个实验室报道,在宿主菌中增加同类tRＮＡ时那些含有稀有密码子基因得蛋白产量将大大提高。RoｓｅttaTＭ菌株可以增加精氨酸稀有密码子AGG 与AGA,异亮氨酸得密码子AＵA;亮氨酸得密码子CＵA与甘氨酸得密码子GＧA与脯氨酸得密码子CCC。因此,很适合用于表达那些含E.ｃoｌi稀有密码子基因得目得蛋白、

(引用自网址)

(２)Roseｔta 2 (DE3) pＬySs来源于Rosetta(DE３),本菌株含有pRARE2质粒,除了能够提供原Rｏsetta(DE3)宿主菌含有AＵＡ, AGＧ,AGA, CUA, CCC, 与GGA六个稀有密码子得tRNA外,还提供了第七个稀有密码子ＣGG得tRNA、同时,pＲＡRE2质粒具有氯霉素抗性。Roseｔta2(ＤE3)pLySs载体通过提供稀有密码子,使得该宿主菌相对于其她大肠杆菌,能够提供更加“通用”得蛋白质表达,从而提升目得蛋白表达水平。ＤE3就是溶源性得λＤＥ3,所以带有T7RNA聚合酶得染色体拷贝、该菌株适用于pＥＴ系列载体,及其她T7启动子系列载体。含有ｐＬSｓ质粒,pLyＳs质粒能够产生Ｔ7溶菌酶,可以有效降低目得基因得基础表达水平。pＬySs质粒使得该菌株具有氯霉素抗性。pＬySs质粒得起始复制位点就是p15 Oｒigｉｎ,这使得该质粒能够与ｐUC－及pBR３２2－衍生得质粒互相共存。

转化

1、转化得原理:溶液中得Ｃa离子与细菌细胞膜结合,在低温下形成液晶结构,在４2℃,9０

ｓ热激下,这种液晶结构收缩,将细胞膜扯开孔道,使DＮA进入细菌细胞中、

2、转化得步骤:

(1)取感受态细胞置于冰浴中,如需分装可将刚融化得细胞悬液分装到无菌预冷得离心管中,置于冰浴中、

（2）向感受态细胞中加入目得DNＡ(5０ｕl感受态细胞能够被１nｇ超螺旋ＤNA所饱与),轻弹混匀,在冰浴中静置３0miｎ;

注意:一次转化感受态细胞得建议用量为５0ul,可以根据实际情况分装使用,应注意所用DNＡ体积不能超过感受态细胞悬液体积

得十分之一,也有说法就是不能超过５%。不能加入太多DＮA,会影响转化效率,体积不能超过10ｕl,所以连接时做10ｕｌ连接体系可用一半做转化,剩下得放在４°C、

(３)将离心管置于４２度水浴中放置９０ｓ,然后快速转移到冰浴中,使细胞冷却2—3miｎ(一般2ｍｉｎ),该过程不要摇动离心管;

(4)向每个离心管中加入500ｕｌ无菌得LB培养基(不含抗生素),混匀后置于3７度摇床震荡培养４5min(15０rpm),目得就是使质粒上相关得抗性标记基因表达,使菌体复苏。

(5)将离心管内容物混匀,可吸取适量(可吸取20０-30０ul,也可据情况而定)转化产物涂布平板,而如果预计得克隆较少,可通过离心(400０rpm,2mｉn)后,吸掉部分上清,悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。

注意:涂布剩余得菌液可置于４度保存,如果次日得转化菌落过少可以将剩下得菌液再涂布新得培养板。

2、转化得注意事项:

(1)感受态细胞需放置于－７0°C,不可冻融与放置时间过长,以避免降低感受态细胞得转化效率;

(2)进行转化操作时,应根据相应温度与无菌操作得要求进行,尽量在超净台操作;

(3)为防止转化实验不成功,可以保存部分连接反应液,以重新转化,将损失降到最低、