金属离子对α-熊果苷美白效果影响研究

成绩：

江西科技师范大学毕业设计（论文）

题目（中文）：金属离子对α-熊果苷美白效果的影响研究（外文）：The Research of Metal Ions Effect

on The Whitening of Alpha Arbutin 院（系）：化学化工学院

专业：应用化学

学生姓名：许苗

学号：20110556

指导教师：徐莱

2015年5月2日

目录

1引言 (1)

2熊果苷简介 (1)

2.1熊果苷结构 (1)

2.2α-熊果苷的理化性质和生理功能 (2)

3酪氨酸酶及酪氨酸酶抑制剂 (3)

3.1酪氨酸酶的简介 (3)

3.2酪氨酸酶的结构与性质、功能 (3)

3.3酪氨酸酶对黑色素合成的调节 (4)

3.4酪氨酸酶抑制剂 (5)

3.4.1酶抑制剂分类 (5)

3.4.2酪氨酸抑制剂的来源 (5)

4α-熊果苷对酪氨酸酶的抑制作用 (5)

5金属离子（镁、铜）对α-熊果苷美白功效的影响 (6)

6金属离子对α-熊果苷美白效果的实验研究 (7)

6.1实验方法理论依据 (7)

6.2实验仪器和药品 (7)

6.3实验步骤 (8)

6.3.1金属离子溶液的配制 (8)

6.3.2磷酸缓冲溶液（PBS）的配制 (8)

6.3.3L-酪氨酸溶液和酪氨酸酶溶液的配制 (8)

6.3.4α-熊果苷溶液的配制 (8)

6.3.5金属离子对α-熊果苷美白效果的影响实验 (8)

6.3.6吸光度的测定（分光光度法） (9)

6.4结果与讨论 (9)

7结语 (11)

参考文献 (11)

金属离子对α-熊果苷美白效果的影响研究

摘要：目的：研究基质原料中金属离子对α-熊果苷的美白功效的影响。方法：采用分光光度法，通过测量吸光度的大小来算抑制率，再通过抑制率的大小来看金属离子对熊果苷的美白效果影响。结果：铜离子与α-熊果苷共存时会抑制熊果苷的美白作用，镁离子对熊果苷的美白影响作用不大。结论：含α-熊果苷的化妆品不宜有铜离子共存。

关键词：α-熊果苷，美白功效，金属离子，酪氨酸酶，抑制率

1引言

熊果苷是人黑色素细胞中酪氨酸酶的抑制剂，所以作为美白剂添加至美白类化妆品中起到美白功效，因而熊果苷是目前国内外常用于美白化妆品中的主要原料。其中α-熊果苷和β-熊果苷均可在化妆品中作为美白添加剂，它们在化妆品中能起到很好的美白作用。研究表明[1]α-熊果苷的美白效果优于β-熊果苷的美白效果，并且α-熊果苷的使用安全性也优于β-熊果苷。随着研究深入，α-熊果苷将来会具有更广阔的应用前景。所以本文重点研究α-熊果苷的美白功效影响。

α-熊果苷的美白效果是体现在其抑制酪氨酸酶的催化作用上，而酪氨酸酶分子中本身就含有金属铜离子，当化妆品中添加金属离子后，金属离子会对酶促反应产生一定的影响，进而影响α-熊果苷美白效果。本文主要是研究金属离子对α-熊果苷美白效果的影响，这对α-熊果苷在美白效果的研究有促进作用，为日后研究更为安全高效的美白添加剂做基奠。

2熊果苷简介

2.1熊果苷结构

熊果苷，化学名称为对羟基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷，物理性质是一种白色针状结晶物质，具有易溶于热水、甲醇、乙醇及丙二醇、丙三醇的水溶液，不溶于乙醚、氯仿、石油醚的特点等。熔点:198—201℃,在酸性条件下不稳定,易被水解。熊果苷属于氢醌葡萄糖苷类化合物，即氢醌的葡萄糖基化衍生物，有两种差向异构体，即：α-熊果苷（α-arbutin）和β-熊果苷（β-arbutin）。二者为立体异构体，分子结构如图1。

图1α﹣熊果苷和β﹣熊果苷结构比较

α-熊果苷和β-熊果苷均可在化妆品中作为美白添加剂，它们都在化妆品中起到很好的美白作用。但有研究表明[1-3]α-熊果苷在比较低的浓度下即可抑制酪氨酸酶的活性，其对酪氨酸酶的抑制作用优于β熊果苷。α-熊果苷的美白功效是其同分异构体β-熊果苷的10倍左右。同时也有研究表明α-熊果苷的安全性也远远优于β-熊果苷。有报道称：β-熊果苷在较强的酸碱性及较高的温度下易分解产生对苯二酚(即氢醌)[4]，虽然对苯二酚具有抑制黑色素形成的作用，能有效治疗色素障碍性皮肤病，但其稳定性差且为有毒物质，见光易被氧化成棕褐色，易引起皮肤过敏性反应。所以α-熊果苷作为安全高效的美白添加剂具有十分广阔的应用前景。

2.2α-熊果苷的理化性质和生理功能

α-熊果苷(α－arbutin)，学名4-羟基苯基-α-吡喃葡萄糖苷，分子式：C12h16O7，分子结构图(图1)，熔点：195-196℃，可以从植物细胞中获取或者通过微生物发酵方法生产制得。

熊果苷最初可应用于药物中，具有抗炎、抑菌、镇咳、祛痰、平喘的作用，故临床应用广泛。含熊果苷的药物常用于治疗气管炎、感染性泌尿系统疾病、皮肤病、过敏及炎症性疾病[5]。熊果苷除了具有多种药理作用外,还是人体黑色素细胞中酪氨酸酶的抑制剂，原因是熊果苷分子中具有两种结构性功能基团：其一：酚基。酚基有对黑色素合成酶的抑制作用，能有效地抑制皮肤中的生物酪氨酸酶(tyrosinase)活性,阻断黑色素的形成。所以熊果苷能减少皮肤色素沉积，祛除色斑和雀斑，作为美白剂添加至美白类化妆品中可起到美白功效；其二：葡萄糖残基，葡萄糖残基有亲水性，可以在一定程度上起到保湿美白的作用。故而熊果苷是目前国内外常用于美白化妆品中的主要原料。

3酪氨酸酶及酪氨酸酶抑制剂

3.1酪氨酸酶的简介

酪氨酸酶，英文名是tyrosinase（简称TYR）是一种含铜的多酚氧化还原酶，是生物体合成黑色素等色素的关键酶抑制其活力即可抑制黑色素的生成。广泛分布于微生物、动植物及人体中。富含酪氨酸酶的食物有鲐鲅鱼、蓝圆参、竹荚鱼、金枪鱼、带鱼、鲈鱼、鳓鱼、黄花鱼、鲭鱼、鲤鱼、鲍鱼。茶叶、白酒、水果酒、啤酒、陈醋、大酱、腐乳、臭豆腐、松花蛋等。

3.2酪氨酸酶的结构与性质、功能

图2酪氨酸酶活性中心的双核铜中心结构

酪氨酸酶是一种含铜氧化酶，又称多酚氧化酶。在酪氨酸酶的结构中含有双核铜活化位点（见图2），每个亚基中有2个金属铜离子（分别表示为A、B铜离子），A、B两个铜离子又分别和蛋白质里的组氨酸（简写为His）的残基氮原子形成三个配位键。另外两个外源氧原子又以过氧键的形式和A、B铜离子分别形成两个配位键，并可用作A、B两个铜离子的桥联配体[3]。至此，两个铜离子分别形成正四棱锥的构型，3d9的电子构象，又因外源氧的桥接形成了酪氨酸酶的催化氧化反应活性中心[6]。

因为酪氨酸酶与黑色素的形成有关，所以还密切影响着某些色素障碍性皮肤病的发生与治疗，例如白化病、皮肤色素沉着过多症、恶性黑色素肿瘤等。

3.3酪氨酸酶对黑色素合成的调节

酪氨酸酶同时具备单酚脱氢酶以及双酚加氧酶的双重催化特性[7]。在酶促反应中酪氨酸酶以氧化态（Eoxy）、还原态（Emet）、和脱氧态（Edeoxy）三种形式存在，其中氧化态酶可以与单酚（P）或者二酚（Q）结合作用底物，得到

醌、H2O和脱氧态酶，脱氧态酶结合氧得到氧化态酶，从而进入循环。而还原态酶只能与Q结合，不具有单酚酶活性。这三种形式的存在和转化显示了酪氨酸酶具有单酚酶和二酚酶的活力[8]。

人皮肤颜色的深浅主要取决于皮肤黑素细胞的量和合成黑色素的能力。酪氨酸酶在有氧的条件下催化分两个阶段完成：①酪氨酸酶催化L-酪氨酸羟基化转变成L-DOPA(单酚酶活性），L-DOPA进一步氧化形成多巴醌（二酚酶活性）②生成的多巴醌（DQ)再经过一系列反应，最后形成黑色素[6]。（见图3）。

图3黑色素的合成

3.4酪氨酸酶抑制剂

因为酪氨酸酶是黑色素生成过程中的主要限速酶，其活性与黑色素的合成量成正相关。研发能抑制酪氨酸酶活性的物质将成为治疗色素沉着性疾病的重要手段。因而，酪氨酸酶抑制剂在日用化工研究中成为广泛研究的课题。此外，因酪氨酸酶还参与果蔬的褐变反应，所以酪氨酸酶抑制剂也可以作为食品保鲜剂。

3.4.1酶抑制剂分类

酶抑制剂从抑制类型上来分可以分为可逆抑制剂和不可逆抑制剂。可逆抑制剂是抑制剂与酶分子以非共价键结合而引起酶活力的降低或丧失，并且可用物理的方法，如透析、超滤、柱层析等，除去抑制剂而使酶活力恢复者，反之不能使酶活力恢复者即为不可逆抑制剂。不可逆抑制作用的特点是随时间的延长会逐渐地增加抑制，最后达到完全抑制；可逆抑制剂又可以分为:竟争型抑制剂、非竞争型抑制剂、反竞争型抑制剂及混合型抑制剂等4种抑制类型[9]。

3.4.2酪氨酸抑制剂的来源

通过众多学者研究发现酪氨酸酶抑制剂有很多种来源，基本可以归纳为：动

物来源[10]如多肽、蛋白质等；植物来源[11]主要化学成分为糖苷累、黄酮及多酚类、醛类等几大类如熊果苷且其为竞争性抑制类型；微生物来源[12]如曲酸；海洋生物来源[13]如念珠藻的甲醇提取物和海洋软体动物中提出的糖类物质CN；以及一些化学合成物如：维生素C，维生素A等。

目前已有一些酪氨酸酶抑制剂作为化妆品添加剂投放市场，有广阔的应用前景，如曲酸、果酸、熊果苷、维生素C、动物胎盘提取液、芦荟提取液等，可以保护皮肤，消除黑斑，具有增白效果。而熊果苷是从植物中分离得到的天然活性物质。

4α-熊果苷对酪氨酸酶的抑制作用

熊果苷是源于绿色植物的天然活性物质，它能迅速渗入肌肤，在不影响细胞增殖浓度的同时，能有效地抑制皮肤中的酪氨酸酶活性，阻断黑色素的生成，它通过自身与酪氨酸酶直接结合，加速黑色素的分解与排泄，从而减少皮肤色素沉积[14]有祛除色斑和雀斑，而且对黑色素细胞不产生毒害性、刺激性、致敏性等副作用，同时还有杀菌、消炎的作用。

通过研究α-熊果苷对酪氨酸酶催化动力学的影响，发现α-熊果苷对酪氨酸酶催化过程具有双重效应，对单酚酶抑制但对二酚酶产生激活[15]（如图4）。虽然国内外已有关于α-熊果苷抑制酪氨酸酶的报道，但主要是对单酚酶的抑制作用。事实上，酪氨酸酶催化底物合成黑色素的速率主要由单酚酶决定，因为单酚酶催化时间具有典型的延迟特征，而二酚酶催化过程没有时间延迟，所以

α-熊果苷即使对二酚酶具有激活作用也并不影响其对酪氨酸酶催化合成黑色素的总体抑制效应，并不与其具有美白功效矛盾。

酪氨酸多巴多巴醌黑色素

Tyrosinase

Tyrosinase (单酚)(二酚)α－熊果苷α－熊果苷

抑制促进

图4α－熊果苷美白效果原理示意图

5金属离子（镁、铜）对α-熊果苷美白功效的影响

化妆品原料中含有油性原料、固体粉末原料、表面活性剂、保湿剂、防腐剂、着色剂、添加剂、金属离子等。α-熊果苷作为一种美白添加剂，因而也是化妆品原料中的一种，故其美白作用可能会受这类物质影响，而本文将研究的是金属离子对α-熊果苷美白效果的影响。黑色素的形成是在酪氨酸酶不断的氧化催化过程中形成的，而每个酪氨酸酶分子中有两个含有铜离子的活性中心，这两个铜离子能与氨基酸残基结合，主要是氨基酸中的羟基与酶的活性中心上的铜离子发生键合反应。所以金属离子也在黑色素的形成中起到了一定的催化作用。α-熊果苷的美白效果是体现在其抑制酪氨酸酶活性减弱共催化作用上的。而酪氨酸酶分子中本身就含有金属铜离子，并且该离子在酶活性中心，金属离子会对酶促反应产生一定的影响，而化妆品中也会存在一些微量金属离子。

对部分金属离子对α-熊果苷美白功效影响进行实验研究可以得知金属离子与α-熊果苷之间的影响关系。因酪氨酸酶中含有金属铜离子，故本文将选取金属铜离子及与其化学性质相似的金属镁离子进行实验研究。

6金属离子对α-熊果苷美白效果的实验研究

6.1实验方法理论依据

黑色素生成反应属于酶催化反应，在酪氨酸被酪氨酸酶催化反应的过程中有生成多巴色素—多巴醌，该物质在475nm 波长处有最大吸收。根据酶活性定义，

酪氨酸酶的反应活性可以定义为每分钟酶促反应在475nm波长处吸光度增大0.001为一个活力单位，即1U/min，故可采用分光光度法。测定经过一个固定时间恒温反应后的反应液的吸光度值，通过反应体系中添加任何效应物实验对照，得出反应物对酶活性的抑制率[16]。

抑制率I的计算公式如下

:

公式中，I为抑制率，如果I小于0，则为激活率；A为反应体系中在475nm 处的吸光值。A0为反应体系中没有添加任何效应物时在475nm处的吸光值，Ax 为反应体系中添加任何效应物时在475nm处的吸光度值；若I为负值，则表现为激活作用，激活率为计算结果的绝对值。

6.2实验仪器和药品

仪器：分光光度计（Unico2100型）、分析天平（Sartorius BS214D）、容量瓶（50mL、100mL、250mL）、数显恒温水浴箱（HH.S11-Ni2）、移液管（1mL、10mL）、烧杯和量筒若干。

药品：α﹣熊果苷、磷酸氢二钠（AR）、磷酸二氢钠（AR）、L-酪氨酸、酪氨酸酶、硫酸铜、硫酸镁。

6.3实验步骤

6.3.1金属离子溶液的配制

按照下列浓度，配制各基质原料的溶液备用，（浓度为质量百分数）。硫酸铜0.001%、硫酸镁0.001%

6.3.2磷酸缓冲溶液（PBS）的配制

用分析天平称取磷酸氢二钠13.3905g，用去离子水溶解后转移至250mL容量瓶中定容得A液；另取磷酸二氢钠6.9442g，用去离子水溶解后转移至250mL 容量瓶中定容得B液；再分别移取A、B两溶液各50mL至250mL容量瓶中，用去离子水定容即得pH=6.8的磷酸缓冲溶液。

6.3.3L-酪氨酸溶液和酪氨酸酶溶液的配制

称取L-酪氨酸0.015g，用PBS缓冲溶液定容于50mL容量瓶中，即得L-酪氨酸溶液，备用。

称取酪氨酸酶0.0423g，用PBS缓冲溶液定容于20mL容量瓶中，即得酪氨酸酶溶液。（酶易失活，在冰水浴中保存。）

6.3.4α-熊果苷溶液的配制

称取α-熊果苷0.27g，用PBS缓冲溶液定容于100mL容量瓶中，既得

α-熊果苷溶液

6.3.5金属离子对α-熊果苷美白效果的影响实验

实验通过构建酪氨酸酶催化L－酪氨酸合成黑色素的反应体系[17]，其组成如表1所示。

表1反应液的组成（单位：mL）

试剂1234

L-酪氨酸 1.0 1.0 1.0 1.0

磷酸缓冲液 2.00 1.0 1.0

α-熊果苷0 1.00 1.0

金属离子0 1.0 1.00

酪氨酸酶 1.0 1.0 1.0 1.0

1号：无α-熊果苷，无金属离子A0

2号：全加（α-熊果苷+镁离子或铜离子）I1

3号：只加金属离子，不加α-熊果苷I2

4号：只加α-熊果苷，不加金属离子I3

6.3.6吸光度的测定（分光光度法）

用移液管分别按表1剂量准确移取1、2、3、4四组样液（除酪氨酸酶外）混合，置于37℃水浴中恒温10min后，各加入1.0mL酪氨酸酶溶液，迅速混匀并放置在37℃水浴中反应10min。然后，将反应液迅速转移至比色皿中，测出反应液在475nm波长处的吸光度A0、A1、A2、A3（均用缓冲溶液作参比）。6.4结果与讨论

表2金属离子对α-熊果苷美白效果影响实验数据

吸光度A A0A1(铜）A1(镁）A2（铜）A2（镁）A3

1 1.687 1.0000.821 1.898 1.7820.853

2 1.688 1.0060.82

3 1.916 1.7700.854

则得出金属离子对α-熊果苷美白效果影响实验的结果见表3。

表3金属离子对α-熊果苷美白效果影响实验结果金属离子

抑制率/%

I

1I

2

I

3

铜离子40.5-13.349.4

镁离子51.3-5.249.4

根据表3的实验数据作图，所得结果见图5。

图5金属离子（镁、铜）对α-熊果苷美白功效影响抑制率

图5中I3为α-熊果苷的单抑制率，I2的抑制率都为负值说明两种金属离子对酪氨酸酶具有激活作用，I1则为α-熊果苷和金属离子（铜、镁）的协同作用。从图5可以看出铜离子对α-熊果苷的美白效果是产生负作用的，而镁离子则对α-熊果苷的美白作用产生正作用。

本实验得出这个结论分析原因可能是因为金属离子的加入使得酪氨酸酶的结构发生改变，还可能是酪氨酸酶结构本身就含有铜离子，而α-熊果苷的美白效果正是作用在酪氨酸酶结构上的，所以铜离子的激活作用较大。因此，在添加α-熊果苷至化妆品中时，应当充分的考虑其配伍性，从而保证其添加至化妆品时能够充分发挥美白功效。

7结语

通过建立一种测试化妆品基质原料对α-熊果苷美白功效影响的实验方法，因此可以得出结论铜离子对酪氨酸酶有激活作用，对α-熊果苷的美白效果产生负作用；镁离子对酪氨酸酶有抑制作用，与α-熊果苷表现出共抑制作用。由此可知化妆品基质原料对α-熊果苷的美白功效因基质原料不同而不同。

由于金属离子会对α-熊果苷的美白功效造成影响，所以需要考虑化妆品中金属离子的来源性。一般化妆品在制作过程中是极少会加入金属离子，故化妆品中存在的金属离子很有可能是盛装溶液的容器中残留的金属离子以及制作原料中未祛除干净的杂质离子。

α-熊果苷作为一种新型化妆品美白剂，具有很好的美白性能。可作为美白添加剂也在稳定性和美白效果上会受到多方面的影响，本论文为其应用提供了一定的实验依据和理论指导，因此研究金属离子α-熊果苷美白效果受到的影响是很有意义的。可化妆品中金属离子的存在还有很多方面的原因，所以金属离子对α-熊果苷的美白效果的研究期待能有更多的学者和专家做更深入的研究，得出更准确的结果。

参考文献

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The Research of Metal Ions Effect

on The Whitening of Alpha Arbutin

Abstract:Objective:To study the effect of metal ions in the matrix material ofα-arbutin whitening effect.Methods:spectrophotometry,the absorbance is measured to calculate the size of the inhibition rate,whitening effect by the size of the inhibition rate in terms of metal ions on arbutin.Results:The copper ions andα-Arbutin inhibits coexistence arbutin whitening,whitening effect of magnesium ions on arbutin minor role.Conclusion:cosmetics should not containα-Arbutin copper ions coexist.

Key words:α-arbutin,whitening effect,the metal ion,the tyrosinase inhibition rate