流感病毒的快速检测要求方法

流感病毒的快速检测方法

一、RT-PCR快速诊断方法

（一）生物安全要求

（二）病毒核酸提取

（三）RT-PCR

（四）PCR 产物纯化

（五）流感病毒RT-PCR检测引物

二、免疫荧光方法检测流感病毒

（一）原理

（二）标本处理

（三）间接免疫荧光法

（四）结果判断

三、实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）快速诊断检测

（一）基本原理

（二）实验试剂

（三）实验步骤

四、快速诊断试剂盒

流感的快速检测方法，与传统的病毒分离鉴定相比具有快速、简便的特点。因此常用于流感暴发时早期病原学检测用。流感的快速诊断包括直接和间接免疫荧光法、ELISA、RT-PCR、Real-Time PCR快速诊断速方法、流感快速诊断试剂盒等。这里介绍RT-PCR、Real-Time PCR、免疫荧光快速诊断速诊断方法和几种流感快速诊断试剂盒优缺点。无论那种快速诊断都无法代替传统的病毒分离鉴定方法。

一、RT-PCR快速诊断方法

核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组的有力方法，即使基因组含量很低或死病毒也可以检测到。本章将介绍检测流感病毒的聚合酶链式反应（PCR）。

流感病毒的基因组是负链RNA，在进行PCR扩增前必须合成与病毒RNA 互补的DNA，即为cDNA。逆转录酶（RT）就是用于合成cDNA的多聚酶，因此，扩增流感病毒基因组的过程称为RT-PCR。

RT-PCR需要一对型别特异引物，四种脱氧核苷酸（dNTPs），RNA模板，逆转录酶及Taq DNA 多聚酶；首先由逆转录酶将病毒的RNA逆转录合成cDNA，然后再进行聚合酶链反应经25～30个循环，使DNA产物达到倍增的效果。

（一）生物安全要求

生物安全级别与个人防护要求：生物安全二级实验室，防护要求与二级实验室的要求相同。并应遵守相应的生物安全规定。进行高致病性禽H5 RT-PCR快速检测时可以在生物安全二级实验室里进行，核酸提取在生物安全三级实验室的生物安全柜里完成。

（二）病毒核酸提取

1. 实验材料及仪器

(1) QIAGEN公司的Rneasy Mini Kit（Catalog# 74104）

(2) β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol）

(3) 70% 乙醇

(4) 无菌1.5ml 离心管

(5) 10μl、20μl、200μl、1000μl加样器和枪头

(6) 可调14K微型离心机

(7) 旋转混合器

2. 操作步骤

(1) 取1支无菌、无RNA酶的1.5ml Eppendorf管，加入500μl RLT。

(2) 取采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或

细胞培养液）100μl，加入上述Eppendorf管中。

(3) 加5μl β-巯基乙醇，充分混匀。

(4) 加600μl 70%乙醇，于旋转混合器混匀。

(5) 从试剂盒中取出带滤膜的离心柱，并标上标本号。

(6) 将第4步的混合液体分两次（每次600μl）吸入于滤柱中，12000rpm

离心15秒，弃收集管中的离心液。

(7) 滤柱仍放回收集管上，将第4步的混合液全部吸入滤柱中，12000rpm

离心15秒，弃收集管中液体。

(8) 于滤柱中加入700μl RW1，12000rpm 离心15秒。

(9) 从试剂盒中取出一支新的2ml收集管，将离心后的滤柱转到新的收集

管上，于柱子中加入500μl RPE，12000rpm 离心15秒弃收集管中液

体。

(10) 滤柱放回收集管上，于滤柱中加入500μl RPE，13000～14000rpm 离

心2分钟。

(11) 从试剂盒中取出一支1.5ml Eppendorf管，将滤柱转到新的1.5ml管上，

于滤柱中加入30～50μl 无RNA酶的水，室温静置1～3分钟。

(12) 12000rpm 离心1分钟，弃滤柱。收集的离心液即为提取病毒的RNA，

可以直接用于逆转录实验，或在-20℃以下保存，-30℃可保存3～4个

月。

3. 注意事项

(1) 试剂盒中的RPE液用前需加44ml无水乙醇，使终体积达到55ml。

(2) 所有用过的枪头、收集管放入2%次氯酸钠消毒缸中过夜。

（三）R T-PCR

1. 一步法RT-PCR

(1) 实验材料

1) QIAGEN One Step RT-PCR Kit Cat No 210212

2) RNase inhibitor 40u/μl（Promega）

3) 上游引物200ng/μl

4) 下游引物200ng/μl

5) 模板RNA（Templet RNA）

(2) 实验步骤

1) PCR反应配置（在清洁区缓冲间，加RNA模板应在核酸室）

无RNA酶水（Rnase Free Water）28.75μl

5×Buffer 10μl

10mM dNTP 2μl

Enzyme Mix 2μl

Rnase inhibitor 0.25μl

上游引物1μl

下游引物1μl

RNA 模板5μl

总量：50μl

2) 将PCR 反应管放入PCR扩增仪

3) RT-PCR 反应条件：此循环的反应条件仅共参考，如果引物更换，

相应的反应条件需要做适当调整。

→60℃ 1 min

→42℃10 min

→50℃30 min

→95℃15 min

→94℃30 sec

→52℃30 sec

→72℃ 1 min

→返回第5部，循环34次

→72℃10 min

→4℃保存

4) PCR产物检测

琼脂糖凝胶配置：用1×TBE 将琼脂糖配成1.2%～1.5%溶液，加热使之完全溶解。冷却到50～60℃时加入溴化乙锭（Ethidium Bromide EB，10ug/μl），终浓度为0.5μg/ml。

PCR产物检测：将凝胶放入电泳槽,加入1×TBE Buffer ，使它淹没过胶面。每份标本取4μl PCR产物，与1μl 5×Loading Buffer 充分混匀后全加入凝胶孔中。于同一凝胶的第一孔加入5μl分子量标准样品。加完样后，盖上电泳槽盖子，接通电源，稳压100v，电泳时间约30～40min。

结果分析：用UV～254暗箱式紫外透射仪观察电泳结果，在透射波长254nm 下观察结果效果较好。或者用凝胶成像系统观察电泳结果。

5) 注意事项：含EB的琼脂糖经处理后放入科研垃圾袋内统一处理。

含有EB的凝胶处理方法：

→加1倍体积的0.5mol/L KMnO4,小心混匀。

→加入1倍体积的2.5 mol/L HCl,小心混匀。于室温放置数小时。

→加入1倍体积的2.5 mol/L NaOH,小心混匀后即可丢弃。

2. 二步法RT-PCR

(1) 实验材料

1) 逆转录酶：AMV Reverse Transcriptase，Catalog# M5101 Paromeg

2) 5×RT Buffer

3) 2.5mM dNTP

4) Rnase inhibitor 40u/μl（Promega）

5) 上游引物200ng/μl

6) 下游引物200ng/μl

7) 无RNA酶的水（Rnase Free Water）

8) Ex-Taq 酶5u/μl DRR 001A 250u （Takara）

9) 10×PCR Buffer

(2) 实验步骤

1) 逆转录反应（在清洁区缓冲间，加RNA模板在核酸提取室）

无RNA酶的水 6.8μl

5×RT Buffer 4μl

2.5mM dNTP 2μl

上游引物1μl

Rnase inhibitor 0.2μl

逆转录酶1μl

RNA 模板5μl

总量：20μl

将上述反应液混匀，42℃水浴作用1小时。然后94℃ 3min ，放置冰上（下步PCR反应或-20℃待用）

2) PCR反应配置（在清洁区缓冲间，加cDNA模板应在PCR扩增室）

无RNA酶的水35.5μl

10×PCR Buffer 5μl

2.5mM dNTP 2μl

上游引物1μl

下游引物1μl

Ex-Taq 酶0.5μl

cDNA 模板5μl

总量：50μl

3) 将PCR 反应管放入PCR扩增仪

4) PCR 反应条件：此循环的反应条件仅共参考，如果引物更换，相应

的反应条件需要做适当调整。

→94℃ 3 min

→94℃40 sec

→52℃40 sec

→72℃ 2 min

→返回第2部，循环30 次

→72℃7 min

→4℃保存

PCR 产物检测：同一步法

（四）P CR 产物纯化

1. 实验材料

QIAquick Gel Extraction Kit Cat No 28704

2. 操作步骤

(1) PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳；

(2) 用干净的手术刀切割目的DNA片段，将切下的DNA胶放入1.5ml离

心管（切胶在暗箱或紫外透射仪下操作）；

(3) 加3倍胶体积的Buffer QG（即100mg DNA胶加300μl Buffer QG）；

(4) 水浴50℃孵育10min，直到DNA胶完全溶解（每隔2～3min 用旋

转混合器混匀）；

(5) 加一个胶体积的异丙醇（100mg DNA胶加100μl异丙醇）；

(6) 从试剂盒中取出带滤膜的离心柱收集管，并标上标本号；

(7) 将上述DNA液吸入带滤膜的离心柱，13000rpm离心1min，弃收集管

中废液，再将带滤膜的离心柱放回收集管；

(8) 于带滤膜的离心柱中加0.5ml Buffer QG，13000rpm离心1min，弃收

集管中废液；

(9) 带滤膜的离心柱中加入0.75ml Buffer PE，放置2～5min，13000rpm

离心1min，弃收集管中废液，再将带滤膜的离心柱放回收集管上，

13000rpm离心1min；

(10) 将带滤膜的离心柱转移到一新的1.5ml离心管上；

(11) 于带滤膜的离心柱中加20～30μl TE（或Rnase Free Water），室温

3～5min，12000rpm离心1min，弃小柱，收集的离心液即为纯化的

PCR产物，可直接用于测序。

（五）流感病毒RT-PCR检测引物

A型检测引物：5’ CCG,AGA,TCG,CAC,AGA,GAC,TTG,AAG,AT

5’ GGC,AAG,TGC,ACC,AGC,AGA,ATA,ACT B型检测引物5’ GGG,ACA,TGA,ACA,ACA,AAG,ATG

5’ TGT,CAG,CTA,TTA,TGG,AGC,TG

H1亚型鉴定引物5’ ACT,ACT,GGA,CTC,TGC,TGG,AAC

5’ CAA,TGA,AAC,CGG,CAA,TGG,CTC,C H3亚型鉴定引物5’ ATC,AGG,GAG,AGT,CAC,AGT,CTC

5’ ATG,CTT,CCA,TTT,GGA,GTG,ATG,C H5亚型鉴定引物5’ GAG,TGA,AGC,CTC,TCA,TTT,TG

5’ GTA,CTT,CTT,GGT,TGG,TAT,TAT,TGT,ACG,TCC H5亚型鉴定引物5’ GGG,TGA,GCT,CAT,GTA,CA

5’ YTG,AGT,CCC,CTT,TCT,TGA

H5亚型鉴定引物5’ GCC,ATT,CCA,CAA,ACA,CCC

5’ CTC,CCC,TGC,TCA,TTG,CTA,TG

N1鉴定引物5’ AAG,G GG,TTT,TCA,TAC,AGG,TAT,GGT

5’ TCT,GTC,CAT,CCA,TTA,GGA,TCC

N2鉴定引物5’ GGA,AAT,CGT,TCA,TAT,TAG,CCC,ATT,G

5’ AGC,ACA,CAT,AAC,TGG,AAA,CAA,TGC

二、免疫荧光方法检测流感病毒

（一）原理

流感病毒主要感染呼吸道上皮细胞，因此在病人呼吸道标本的脱落细胞中含有流感病毒抗原，通过直接检查上皮细胞内病毒特异性抗原即可诊断。

（二）标本处理

标本采集最好用负压抽取法收集的呼吸道分泌物。

1. 在标本中加入维持培养液至总体积为4 ml。

2. 使用吸管吹打悬浮液数次。

3. 2000 rpm离心5分钟。

4. 保留上清液做培养。

5. 用10 ml pH7.2 PBS清洗细胞沉淀，弃上清。

6. 用0.5 ml pH

7.2 PBS 重新悬起沉淀。

（三）间接免疫荧光法

1. 在特富龙涂层的12孔显微载玻片的每个孔上加入10 μl细胞悬浮液。

2. 用载玻片干燥器干燥载玻片或室温自然干燥。

3. 用100%冰丙酮室温10分钟固定载玻片。

4. 室温晾干载玻片。

5. 每孔加10 μl 流感相应亚型的特异性抗体（1:1000）

6. 玻片在湿盒中37 ℃放置45分钟。

7. pH7.2 PBS洗涤1分钟。

8. 室温晾干载玻片。

9. 每孔加入10 μl 1:20 兔抗鼠荧光素结合物（二抗），及0.1 % 伊纹氏蓝

（Evans Blue）做负染。

10. 玻片在湿盒中37 ℃放置45分钟。

11. pH7.2 PBS洗涤1分钟。

12. 室温晾干载玻片。

13. 加上盖玻片，加上甘油。

14. 在400X 荧光显微镜镜下检查。

（四）结果判断

阳性讯号为细胞质内苹果绿色荧光，阴性细胞显示为深红色的细胞质部分。

观察到三个以上荧光阳性即可判为阳性。

三、实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）快速诊断检测

（一）基本原理

实时荧光定量（Real-time）RT-PCR术，是指在RT-PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个RT-PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量或定性分析的方法。

1. 荧光基团主要有TaqMan荧光探针和SYBR荧光染料

(1) TaqMan荧光探针：PCR扩增时，在加入一对引物的同时加入一个特

异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光

基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号可

被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将与PCR

产物杂交形成双链的探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团

分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，

就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全

同步。

(2) SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，

SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入

双链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号

的增加与PCR产物的增加完全同步。

2. 相关的几个概念

(1) Ct值：C代表CyCle，t代表threshold。Ct值是指反应管内的荧光信

号到达设定的阈值时所经历的循环数。

(2) 阈值（threshold）：PCR反应前15个循环荧光信号作为荧光本底信号，

荧光阈值的缺省设置是6～15个循环荧光信号标准偏差的10倍。

(3) 基线（baseline）：指PCR反应指数扩增前平均本底荧光信号值，通常

取6～15个循环的平均荧光信号值。

(4) Ct值与起始模板的关系：每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对

数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数

的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐

标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，可从标准曲线上计

算出该样品的起始拷贝数。

（二）实验试剂

1. 引物：A型流感通用引物、H5、H7、H9分型引物

2. RT-PCR酶

3. RT-PCR反应液

4. Taq酶

5. 无RNA酶的水

6. 阳性对照（非感染性体外转录RNA）

7. 阴性对照

8. 无RNA酶的水

（三）实验步骤

1. 核酸提取

方法同RT-PCR的快速诊断。

2. RT-PCR反应体系配置

(1) 配置反应体系

从试剂盒中取出相应的RT-PCR反应液、Taq酶，反应液在室温下融化后，2000rpm离心5秒钟。设所需PCR数为n（n = 样本数+ 1管阴性对照+ 1管阳性对照），每个测试反应体系配制如下表：

计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，向其中加入n/2颗RT-PCR 酶颗粒，充分混合均匀，向每个PCR管中各分装10μl。

(2) 加模板

在各设定的PCR管中分别加入RNA溶液各10μl，盖紧管盖，放入荧光PCR 荧光检测仪内，记录样本摆放顺序。

3. RT-PCR反应

(1) 循环条件设置

(2) 仪器检测通道选择F1通道

1) 结果分析条件设定

读取F1通道的检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准。或可根据仪器噪音情况进行调整。

2) 质控标准

阴性对照的检测结果为阴性。

阳性对照的Ct值应小于等于28.0。

否则，此次实验视为无效。

4. 结果判断

1) Ct值无数值的样本为阴性样本。

2) Ct值≤30.0的样本为阳性。

3) Ct值大于30.0的样本建议重做。重做结果无数值者为阴性，否则为

阳性。

5. 问题解决

(1) 若阴性对照出现扩增，可以考虑由于环境污染而造成的假阳性。此时

应设立空白对照检测：在实验当天取一盛有500μl纯水的1.5ml离心

管置于工作台，并于实验结束后作为待检样品检测，检测结果应为阴

性。若出现阳性则说明发生环境污染，此时应对室内进行通风、擦洗

工作台及实验用品，并对实验用离心管、吸头重新高压灭菌，更换所

有自备试剂。

(2) 阳性对照Ct值大于30，则应考虑RNA降解，此时应对实验用离心管、

吸头重新高压灭菌，并严格按操作流程进行实验。

四、快速诊断试剂盒

流感快速诊断试剂盒可以用于暴发疫情标本的快速检测，目前全世界有10种市场化的流感快速诊断试剂盒，其中9种为检测流感病毒的NP抗原，1种检测流感病毒的NA抗原。快速诊断试剂盒的优点是：能在30分钟内提供快速诊断试验结果；能够帮助检测流感爆发；可以在临床中使用；适用于多种情况，操作简便。但是这些试剂盒的缺点是：比病毒培养或RT-PCT准确性要低；有一些诊断试验不能区分甲型和乙型流感病毒的感染；没有诊断试验能区分甲型流感病毒的各亚型；没有毒株、分子生物学和抗原特征的信息。各种诊断试剂盒的使用参照试剂盒说明书。

现有的试剂盒可以分为以下三类：

1. 只检测甲型流感病毒

Directigen Flu A

2. 检测和区分甲型和乙型流感病毒Directigen Flu A + B；FLU OIA A/B FLU OIA A/XPECT FLU A/B；NOW FLU A/B

Flu A .B；B；Influ B Quick

3. 检测但不能区分甲型和乙型流感病毒QuickVue Influenza Test

FLU OIA

ZstatFlu

信息来源：《全国流感/人禽流感监测实施方案（2005～2010年度）》