大肠埃希菌检查法
大肠埃希菌检查法
Escherichia Coli Test Method
1.目的
建立大肠埃希菌检查法的标准操作程序。
2.范围
适用于大肠埃希菌检查的操作。
3.责任者
QC化验员。
4.程序：
4.1.简述
4.1.1. 大肠埃希菌(Escherichia coli)即大肠埃希菌，为肠埃希菌科埃希菌属的模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发现有非脱羧埃希氏菌等5个种。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。在药品中检出大肠埃希菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。大肠埃希菌除普通大肠埃希菌外尚有致病性大肠埃希菌，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。为保证人体健康，口服药品必须检查大肠埃希菌。
4.1.2. 用4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-Methylumbelliferyl-β
-D-glucuronide，MUG)和靛基质(Indole)试验检查大肠埃希菌是一项新技术，其检验步骤为：增菌培养后，转种MUG-蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如MUG、Indole试验为阳性或阴性即可报告结果。
4.1.3. 原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反应作为指示系统来鉴定目标菌。
实验证明，96％的大肠埃希菌含β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase，GUD)，约10％的沙门菌属一些菌种也含有此酶。MUG被GUD水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG鉴定大肠埃希菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。单一的MUG鉴别大肠埃希菌其漏检率达6％，鉴于98％的大肠埃希菌其靛基质试验为阳性，故将MUG与靛基质试验结合，比单用MUG可提高大肠埃希菌的检出率。如MUG与Indole 试验的反应不一致时，则需将供试液的增菌培养物用EMB琼脂平板分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别。该法理论上可使大肠埃希菌的检出率达98％。如仅用IMViC生化试验来鉴别大肠埃希菌属中的大肠埃希菌，其结果是含混的。
4.2.仪器、设备及用具
4.2.1. 无菌室
4.2.2. 净化工作台
4.2.3. 培养箱(36±1℃)
4.2.4. 高压蒸汽灭菌器
4.2.
5. 显微镜(1500X)
4.2.6. 微波炉
4.2.7. 恒温水浴（45±1℃）
4.2.8. 离心机(500～4000r/min)
4.2.9. 0.45μm±0.02μm薄膜及过滤器
4.2.10. 电冰箱
4.2.11. 匀浆仪
4.2.12. 366nm紫外灯
4.2.13. 玻璃器皿、器具
4.3.试液、指示液
4.3.1. 0.9％无菌氯化钠溶液取氯化钠9.0g，加水使溶解成1000ml，121℃灭菌20分钟。
4.3.2. 靛基质试液取氯化二甲氨基苯甲醛
5.0g，加入戊醇(或丁醇)75ml，充分振摇，使完全溶解后，再取浓盐酸25ml徐徐滴入，边加边振摇，以免聚热导致溶液色泽变深，或取对二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95％乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取浓盐酸20ml徐徐滴入。
4.3.3. 甲基红指示液取甲基红0.1g，加95％乙醇300ml，使溶解后加水至500ml，即得。
4.3.4. V-P试液
α-萘酚乙醇试液：取α－萘酚6.0g，加无水乙醇溶解使成100ml。
氢氧化钾试液：取氢氧化钾40.0g、加水使溶解成100ml。
4.3.
5. 革兰染色液
4.3.
5.1. 结晶紫染液取结晶紫1.0g、95％乙醇20ml、1％草酸铵[(NH4)2C2O4]溶液80ml。将结晶紫溶于乙醇后，与草酸铵混合，静置48h，置密闭棕色瓶，可存放数月。
4.3.
5.2. 革兰碘液碘1.0g、碘化钾2.0g、蒸馏水300ml。用少量水溶碘化钾，再加碘，待全溶后，加蒸馏水至30ml，置棕色瓶备用。
4.3.
5.3. 脱色液 95％乙醇
4.3.
5.4. 沙黄(番红)染液沙黄(SafranineO)0.25g、95％乙醇10ml、蒸馏水适量，将沙黄加入乙醇中，完全溶解后再加水至100ml。
4.3.6. 亚甲蓝指示液取亚甲蓝0.5g，加水溶解使成100ml。
4.3.7. 溴麝香草酚蓝指示液取溴麝香草酚蓝0.4g，加1mol/L氢氧化钠溶液0.64ml使溶解，再加水稀释至100ml。变色范围pH6.0～7.6(黄→红)
4.3.8. 酸性品红指示液取酸性品红0.5g，加水100ml溶解，再逐渐加1mol/L 氢氧化钠溶液16ml，每加1滴需将溶液充分摇匀后再加第二滴，直至溶液呈草黄色；于沸水中保持15分钟，静置2小时，滤过，即得。变色范围pH6.0～7.4(黄→红)。
4.3.9. 曙红钠指示液取曙红钠2.0g，加水溶解使成100ml。
4.3.10. 无菌聚山梨酯80-氯化钠溶液取聚山梨酯80 1ml加0.9％氯化钠溶液使成100ml，121℃灭菌20分钟。
4.3.11. 无菌磷酸盐缓冲液(pH7.2) 取磷酸氢二钠2
5.8g与磷酸二氢钠4.4g，加水稀释至1000ml，121℃灭菌20分钟。
4.3.12. 无菌对氨基苯甲酸试液取对氨基苯甲酸0.1g，加入含10ml水的具塞试管中，121℃灭菌20分钟。
4.3.13. 中性红指示液取中性红1.0g，研细，加95%乙醇60ml使溶解，再加水至100ml。变色范围
Ph6.8～8.0（红→黄）。
4.3.14. 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(pH7.0) 取磷酸二氢钾3.56g，磷酸氢二钠7.23g，氯化钠4.30g，蛋白胨1.0g，加水1000ml，加热使溶解，过滤。分装，灭菌。
4.4.培养基
4.4.1. 营养肉汤培养基
胨 10g 氯化钠
5.0g
牛肉浸出粉 3.0g 水
1000ml
取上述成份混合，微温溶解，调解pH为弱碱性，煮沸，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，灭菌。
4.4.2. 营养琼脂培养基
胨 10g 氯化钠
5.0g
牛肉浸出粉 3.0g 水
1000ml
琼脂 14.0g
取上述成份混合，微温溶解，调解pH为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，灭菌。
4.4.3. 胆盐乳糖培养基（BL）
胨20.0g 磷酸二氢钾1.3g
乳糖 5.0g 牛胆盐 2.0g
氯化钠 5.0g （或去氧胆酸钠）(0.5g)
磷酸氢二钾4.0g 水1000ml
除乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH 值使灭菌后为7.4±0.2，煮沸，滤清，加入乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠，分装，灭菌。
4.4.4. 4-甲基伞形酮葡萄糖化酶苷酸（4-methylumbellifery1-β
-D-glu-curonide,MUG）培养基
胨 10.0g 磷酸二氢钾（无水）0.9g
硫酸锰 0.5mg 磷酸氢二钠（无水） 6.2g
硫酸锌 0.5mg 亚硫酸钠40mg
硫酸镁 0.1g 去氧胆酸钠1.0g
氯化钠 5.0g MUG 75mg
氯化钙 50mg 水1000ml
除MUG外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，加入MUG，溶解，每管分装5ml，灭菌。
4.4.
5. 曙红亚甲基蓝琼脂培养基（EMB）
营养琼脂培养基100ml 曙红钠指示液2ml
20%乳糖溶液5ml 亚甲蓝指示液 1.3-1.6ml
取营养琼脂培养基，加热溶化后，冷至60℃，按无菌操作加入灭菌的其他
3种溶液，摇匀，倾注平皿。
4.4.6. 麦康凯琼脂培养基（MacC）
胨20.0g 1%中性红指示液3ml
乳糖10.0g 琼脂14.0g
牛胆盐 5.0g 水1000ml
氯化钠 5.0g
除乳糖1%中性红指示液、牛胆盐及琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余各成分，摇匀，分装，灭菌，冷至约60℃，倾注平皿。
4.4.7. 蛋白胨水培养基
胰蛋白胨 10g
氯化钠 5g
水 1000ml
取上述成分混合，加热溶化，调节pH使灭菌后为7.3±0.1，分装于小试管，灭菌。
4.4.8. 磷酸盐葡萄糖胨水培养基
胨 7g 磷酸氢二钾（K2HPO4）
2g
葡萄糖 5g 水
1000ml
取上述成分混合，微温溶解，调节pH使灭菌后为7.3±0.1，分装于小试管，灭菌。
4.4.9. 枸橼酸盐培养基
氯化钠 5g 枸橼酸钠（无水）
2g
硫酸镁（MgSO4·7H2O） 0.2g 溴麝香草酚蓝指示液20ml
磷酸氢二钾（K2HPO4） 1g 琼脂
14g
硫酸二氢铵（NH4H2PO4） 1g 水
1000ml
除指示液和琼脂外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH使灭菌后为6.9±0.1，加入琼脂，加热溶化，加入指示液，混匀。分装于小试管，灭菌，制成斜面。注：所用琼脂应不含游离糖，用前用水浸泡冲洗。
4.4.10. 乳糖培养基
胨 20.0g 乳糖
10.0g
0.04%溴甲酚紫指示液 25ml 水
1000ml
除0.04%溴甲酚紫指示液外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH使灭菌后为7.2±0.2，加入指示液，分装于含倒管的小试管中，每管3ml。灭菌。
5%乳糖培养基
胨 0.2g
溴麝香草酚蓝指示液 6ml
氯化钠 0.2g 乳糖
5g
磷酸氢二钠 0.2g 水
100ml
除乳糖和指示液外，混合各成分，微温溶解，调节pH使灭菌后为7.4，加入乳糖/指示液，混合，分装于含小倒管的灭菌小试管中，115℃灭菌15min。
4.5.对照用菌液
取大肠埃希菌[CMCC(B)44102]的营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基内，置36±1℃培养18～24小时，取均匀培养物1 ml用0.9％灭菌氯化钠溶液稀释制成每1ml含菌10～100cfu的菌悬液，其菌数在做对照试验的同时用营养琼脂注皿或平板涂布，经培养后计数确定。
4.6.准备
4.6.1. 检验量
4.6.1.1. 每批供试品检验量，一般为10g或10ml，特殊贵重或微量包装的供试品检验量可以酌减。
4.6.1.2. 供试品均须取自2个以上的包装单位。
4.6.2. 供试液的制备
4.6.2.1. 液体供试品取供试品10ml，加无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(pH7.0)至100ml，混匀，作为供试液。
4.6.2.2. 固体、半固体或黏稠液供试品取供试品10g，加无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(pH7.0) 至100ml，用匀浆仪（3000～5000r/min、2～4min）或其他有效的方法，混匀，作为供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。
4.6.2.3. 非水溶性供试品
方法1 取供试品5g（或5ml），加至含溶化的（温度不超过45℃）5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻璃棒搅拌成团后，慢慢加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1：20的供试液。
方法2 取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯（制法见无菌检查法中供试品的无菌检查项下）和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇5-10分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作为1：10的供试液。
以上供试品如吸水膨胀，或粘度过高，可增加稀释剂的量，制成1：20～1：100供试液。
4.6.2.4. 含抑菌成分供试品
供试品按常规检查法，加入规定量的对照菌，不能检出时，表明供试品有抑菌活性。该供试液按以下方法之一或两种以上方法联合处理后，依法检查。同时做阳性和阴性对照。
稀释法取规定量的供试液接种到较大体积的培养基中，使该供试液稀释至不具抑菌作用的浓度。
离心沉法取一定量的供试液，500转/分离心3分钟，取全部上清液混合。
用于细菌检查。
薄膜过滤法取规定量的供试液于稀释剂100ml中，摇匀，以无菌操作加入装有直径为47mm、孔径不大于0.45±0.02μm微孔滤膜的薄膜过滤器内，过滤，用稀释剂冲洗滤膜，每次不少于100ml，将培养基加入滤器或取出滤膜，加入增菌培养基中。
中和法取规定量含磺胺类的供试品，于100ml增菌液(含1％对氨基苯甲酸约1～5ml)中，含砷、汞类的供试品，于硫乙醇酸盐培养基100ml中；含洗必泰供试品，于含适量聚山梨酯80等表面活性剂的100ml增菌液中(表面活性剂的用量应预试，用量过大有抑菌作用)。
沉降法取规定量供试液，自然沉降5min，取上层液于100ml增菌液中，本法适用于难溶于水的抗菌制剂。
4.7.检查方法验证
在建立供试品的大肠埃希菌检查法或原检查法的检验条件发生改变可能影响检验结果的准确性时，应对供试品的抑菌活性及检查法的可靠性进行验证。验证试验按供试液的制备和大肠埃希菌检查法所规定的方法进行。
4.7.1. 验证方法
4.7.1.1. 试验组取规定量供试液及10-100cfu试验菌加入增菌培养基中，依大肠埃希菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入增菌培养基或取出滤膜接种到增菌培养基中。
4.7.1.2. 阴性菌对照组设立阴性菌对照组是为了验证大肠埃希菌检查法的专属性。方法同试验组，验证大肠埃希菌时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌。阴性对照菌不得检出。
4.7.2. 结果判断阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和大肠埃希菌检查法进行供试品的大肠埃希菌检查；若试验组未检出试验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。
验证试验也可与供试品的大肠埃希菌检查同时进行。
4.8.操作步骤
4.8.1. 检验程序
4.8.1.1. 阳性对照试验各供试品进行大肠埃希菌检查时，应做阳性对照试验。阳性对照试验的加菌量为10-100cfu，供试品和增菌培养基用量及检查按供试品的大肠埃希菌检查。阳性对照试验应检查出大肠埃希菌。已做验证试验的供试品，在该供试品检查时不必再做阳性对照。
4.8.1.2.阴性对照试验取稀释剂10ml加入100ml（或200ml）大肠埃希菌检查用的增菌培养基中，培养，应无菌生长。
4.8.2. 增菌培养
4.8.2.1. 取胆盐乳糖(BL)培养基2份，每份各100ml。1份加入10ml供试液(相当于供试品1g、1ml、10cm2)，另1份加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照。培养18～24小时，必要时可延长48小时)，阴性对照应无菌生长。
4.8.2.2. 取上述培养物0.2ml，接种至含5mlMUG培养基的试管内，培养，于5、24小时在366nm紫外光下观察，同时取未接种的MUG培养基作本底对照。在紫
外光下若管内培养物呈现蓝白色荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照的MUG和靛基质试验应为阴性。如MUG
阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如MUG阴性、靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。
4.8.3. 分离培养如呈现MUG阳性、靛基质阴性或MUG阴性、靛基质阳性时，应将上述供试品BL增菌培养液轻轻摇动，以接种环1～2ml环培养液划线于EMB 或麦康凯琼脂平板上，培养18～24小时。若平板上无菌落生长、或生长的菌落与表1所列的菌落形态特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌。
落与表1所列菌落形态特征相符或疑似者，应挑取可疑菌落进行分离、纯化、染色镜检和IMViC试验，确认大肠埃希菌。
为了规范操作，以下是对药典要求的补充。
4.8.4. 纯培养如EMB或麦康凯琼脂平板上生长的菌落与表1所列特征相符或疑似者，以接种针轻轻接触单个疑似菌落的表面中心，沾取培养物，应挑选2～3个以上疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面，培养18～24h，作以下检查。
如平板上无单个可疑菌落，但有可疑菌团（紫黑色，或有金属光泽），应沾取可疑菌团培养物少许，或重新取增菌培养液分区划线接种于EMB琼脂平板，培养18～24h，再挑选单个疑似菌落，纯培养，作以下检查。
4.8.
5. 革兰染色、镜检
4.8.
5.1. 以接种环沾取无菌水于洁净载玻片上，取上述疑似菌落的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，制成均匀涂片，自然或微温干燥，再通过火焰2～3次(载玻片烫手)固定。
4.8.
5.2. 滴加结晶紫染液，染色1分钟，水洗。
4.8.
5.3. 滴加碘液，媒染1分钟，水洗，以滤纸吸干余水。
4.8.
5.4. 滴加95％乙醇，脱色20～30秒钟，水洗。
4.8.
5.5. 滴加沙黄染液，复染1分钟，待干后，镜检。
4.8.
5.
6. 染色结果革兰阳性菌呈蓝紫色；革兰氏阴性呈红色。大肠埃希菌为革兰阴性短埃希菌，或球埃希菌状，亦有埃希菌状。
4.8.
5.7. 注意事项
（1）玻片必须洁净，无划痕。涂片的菌量宜少，菌不可浓。否则，菌细胞成堆或连成片。不利菌细胞染色反应判断及形态观察。
（2）培养物的菌龄以16～24小时为宜。培养时间过长，革兰阳性菌易染成红色。（3）脱色是关键。脱色时间不足，菌细胞易染成阳性；脱色时间过长，菌细胞易染成阴性。
（4）可用已知革兰染色为阳性、阴性的菌种做染色的质量控制。
4.9.生化试验
4.9.1. 乳糖发酵试验取上述斜面培养物，接种于乳糖发酵管，培养24～48h，观察产酸（指示剂为酸性品红者为红色；指示剂为溴麝香草酚蓝者为黄色），产气（小倒管内有气泡，气泡无论大小）。
为避免迟缓发酵乳糖产生假阴性，亦可接中5%乳糖发酵管。绝大多数迟缓发酵乳糖的细菌，可于24h出现阳性。或适当延长培养时间。
4.9.2. 靛基质试验(Ⅰ) 取上述斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基，培养24～48小时，沿管壁加入靛基质试液数滴，轻轻摇动试管，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。98％的大肠埃希菌靛基质试验为阳性，一般24小时即可出现阳性结果。常以无菌操作先从管中取出1或2ml培养液进行检查，如靛基质阴性，余下的蛋白胨水培养物再培养24小时，作靛基质试验。
4.9.3. 甲基红试验(M) 取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48±2小时，于培养液中加入甲基红指示液2～3数滴(约每ml培养液加指示液1滴)，轻微摇动，立即观察，呈鲜红色或橘红色为阳性，呈黄色为阴性。
4.9.4. 乙酰甲基甲醇生成试验(V-P) 取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48±2小时，于每2ml培养液中加入α-萘酚乙醇试液1ml，混匀，再加40％氢氧化钾溶液0.4ml，充分振摇，在4小时(通常在30分钟)内出现红色判为阳性，无红色反应为阴性。
4.9.
5. 枸橼酸盐利用试验(C) 取上述斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基斜面上，培养2～4天，培养基斜面有菌苔生长，培养基由绿色变为蓝色时为阳性，培养基颜色无改变，无菌苔生长为阴性。
4.10.结果判定
4.10.1. 当阴性对照试验呈阴性，阳性对照试验MUG呈阳性、靛基质阳性，供试品MUG阳性、靛基质阳性，报告1g或1ml供试品检出大肠埃希菌；MUG阴性、靛基质阴性，报告1g或1ml供试品未检出大肠埃希菌。
4.10.2. MUG阳性、靛基质阴性、IMViC试验为－＋――、革兰阴性埃希菌，报告1g或1ml供试品检出大肠埃希菌；MUG阴性、靛基质阳性、IMViC试验为＋＋――、革兰阴性埃希菌，报告1g或1ml供试品检出大肠埃希菌。
4.10.3. 供试品培养物检查不符合4.10.2中的任一项，报告1g或1ml供试品未检出大肠埃希菌。
4.10.4. 当阴性对照有菌生长或阳性对照未生长或生长但非大肠埃希菌，不能做出检验报告。
4.11.注意事项
4.11.1. MUG法不必从混合菌中分离单个菌落。除大肠埃希菌外，尚有部分志贺菌属、沙门菌属的菌株；以及少数革兰阳性球菌、埃希菌和芽孢菌，其MUG
为阳性。因此，在MUG培养基成分中增加了去氧胆酸钠的量，可排除革兰阳性菌的干扰。至于志贺菌、沙门菌在胆盐乳糖培养基中较难生长，即使有生长，本法能检出亦判为不合格。
4.11.2. 配制MUG培养基时，务必校正pH值，灭菌后pH不得过7.4，否则pH 值偏高，MUG分解，本身则显荧光；分装MUG培养基的试管应挑选，试管、蛋白胨不得显荧光。
4.11.3. 培养时间供试品培养液接种于MUG培养基中，一般培养5h和24h
要观察是否产生荧光，如荧光很微弱，不能准确判断时，可延长培养至48h再观察结果。由于大肠埃希菌各菌株间的GUD的活性不完全相同，对底物和底物的浓度反应的差异；培养基中选择因子的影响；培养时间、温度；pH的改变；大量竞争菌和样品本身物质成分的干扰等，对结果的判断亦有影响。
4.11.4. 结果观察取供试品的MUG试验管、阳性对照管、阴性对照管同时在366nm紫外灯下观察，阳性对照管应有较强的蓝白色荧光，阴性对照管无荧光。供试品MUG管是否有荧光，应仔细观察比较，或将各管调换位置(阴性管居中)，适当倾斜试管。如阳性对照管荧光强烈，影响供试品管与阴性对照管的观察时，亦可移去阳性对照管。
4.11.
5. 药品中污染的大肠埃希菌，易受生产工艺及药物的影响。在曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂平板上的菌落形态特征时有变化，挑取可疑菌落往往凭经验，主观性较大，务必挑选2～3个菌落分别做IMViC试验鉴别，挑选菌落越多，检出阳性菌的机率越高，如仅挑选一个菌落做IMViC试验鉴别，则易漏检。
4.11.6. 在IMVIC试验中，以灭菌接种针沾取菌苔，首先接种于枸橼酸盐琼脂斜面上，然后接种于蛋白胨水培养基、磷酸盐葡萄糖胨水培养基中。切勿将培养基带入枸橼酸盐琼脂斜面上，以免产生假阳性结果。
4.11.7. 枸橼酸盐利用试验培养时间，原订为2天，根据试验资料，发现培养3天后，枸橼酸盐利用试验产生阳性。仅培养2天不够的，故试验培养时间改为2～4天。
4.11.8. 以IMViC试验来判断大肠埃希菌属中的大肠埃希菌是含混的，有可能把埃希菌属的其他种判为大肠埃希菌。IMViC试验为＋＋――者，除大肠埃希菌外，还有非活跃大肠埃希菌、弗格森埃希菌、赫尔曼埃希菌。IMViC试验为－＋――者，除大肠埃希菌外，还有非活跃大肠埃希菌、伤口埃希菌、蟑螂埃希菌。
4.11.9. 在各类供试品中检测大肠埃希菌及其他控制菌，按一次检出结果为准，不再抽样复验。检出的大肠埃希菌及其他控制菌培养物须保留一个月，备查。
生化试验也可采用商品化的自动分析仪器进行、仪器可以给出菌种的鉴定结果，做相应报告。
GB4789.38-2012卫生部标准大肠埃希菌检验方法
前言 本标准代替GB/T 4789.38-2008 《食品卫生微生物学检验大肠杆菌计数》。 本标准与GB/T 4789.38-2008 相比，主要变化如下： ——修改了标准的中文名称； ——修改了培养基和试剂； ——将“第二法大肠杆菌VRB-MUG 平板计数法”改为“大肠埃希氏菌平板计数法（第二法）”；——删除了“第三法大肠杆菌Petrifilm TM 测试片计数法”； ——修改了附录A。 GB 4789.38-2012 1 食品安全国家标准 食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数 1 范围 本标准规定了食品中大肠埃希氏菌（Escherichia coli）计数的方法。 本标准适用于食品中大肠埃希氏菌的计数，其中大肠埃希氏菌平板计数法（第二法）不适用于贝类产 品。 2 术语和定义 2.1 大肠埃希氏菌Escherichia coli 大肠杆菌 广泛存在于人和温血动物的肠道中，能够在44.5℃发酵乳糖产酸产气，IMViC（靛基质、甲基红、VP 试验、柠檬酸盐）生化试验为＋＋－－或－＋－－的革兰氏阴性杆菌。以此作为粪便污染指标来评价食品 的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性。 2.2 最可能数 基于泊松分布的一种间接计数方法，简称为MPN。 3 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： a）恒温培养箱：36 ℃±1 ℃； b）冰箱：2 ℃～5 ℃； c）恒温水浴箱：44.5 ℃±0.2 ℃； d）天平：感量为0.1 g； c）均质器； d）振荡器； e）无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头；f）无菌锥形瓶：容量500 mL； g）无菌培养皿：直径90 mm； h） pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸； i）菌落计数器； j）紫外灯：波长360 nm～366 nm，功率≤6 W。
大肠埃希菌
大肠埃希菌 1.概况：大肠埃希菌是肠道中重要的正常菌群，婴儿出生数小时后就进入肠道中并终生伴随，能为宿主提供一些营养作用的合成代谢产物，宿主免疫能力下降或细菌侵入肠道外组织或器官，即可成为条件致病菌，引起肠外感染，以化脓性感染和泌尿道感染最为常见，某些血清型大肠埃希菌具有致病性，能导致人类腹泻。 2.形态：中等大小的革兰阴性杆菌无芽孢，多数菌株有周身鞭毛，能运动；有菌毛包括普通菌毛和性菌毛 3.体内分布：大肠杆菌在人和动物的肠道内，大多数于正常条件下是不致病的共栖菌，在特定条件下（如侵入肠外组织或器官）可致病。但少数大肠杆菌与人和动物的大肠杆菌病密切相关，它们是病原性大肠杆菌，正常情况下极少存在于健康机体。 4.培养：兼性厌氧菌，营养要求不高，在普通的琼脂平板37℃培养24小时后，埃希菌形成圆形凸起灰白色S型菌落。在液体培养基中均匀浑浊的生长。 5.生化反应：能发酵葡萄糖等多种糖类，产酸并产气，绝大多数菌株能发酵乳糖，可与沙门菌，志贺菌等区别。吲哚、甲基红、V-P、枸橼酸盐试验（IMViC试验）为++--，IMViC试验为此结果，可判断为典型的大肠埃希菌，表明被检物已被粪便污染，有传播肠道传染病的危险 6.抗原构造：大肠杆菌抗原主要有O、K和H三种，已确定的大肠杆菌菌体（O）抗原有173种，表面（K）抗原有80种，鞭毛（H）抗原有56种。O抗原凝聚相对较慢，呈颗粒状。H抗原刺激机体主要产生IgG类抗体，H抗原的凝集出现
较快，呈絮状。K抗原位于O抗原外层，为多糖，与细菌侵袭力有关。 7.生物学特性：本属细菌对干燥、腐败、日光等因素具有一定的抵抗力，在外界条件下可以生存数周或数月。对化学消毒剂的抵抗力不强，一般常用消毒剂和消毒方法均能达到消毒目的。通常情况下，对多种抗菌药物敏感。但由于长期滥用抗生素，对常用抗生素耐药现象普遍，不仅影响该病防制效果，而且亦成为公共卫生关注的问题。 8.致病物质 定植因子：又称黏附素（adhesin），可与黏膜表面细胞的特异性受体相结合而定植于黏膜，这是大肠杆菌引起的大多数疾病的先决条件。 外毒素：大肠杆菌可产生外毒素，最为人所知的是ETEC产生的由质粒编码的不耐热肠毒素（LT）和耐热肠毒素（ST）。LT有抗原性，分子量大，65℃经30min 即被灭活，可激活肠毛细血管上皮细胞的腺苷环化酶，增加环腺苷酸（cAMP）产生，使肠黏膜细胞分泌亢进，发生腹泻和脱水；ST无抗原性，分子量小，100℃加热30min而不失活，可激活回肠上皮细胞刷状缘绒毛上的颗粒性的鸟苷环化酶，增加环鸟苷酸（cGMP）产生，同样引起分泌性腹泻。 K抗原：具有吞噬作用 9.肠道外感染： 败血症：由大肠埃希菌尿道和肠道感染引起的。 新生儿脑膜炎：大肠埃希菌和B组链球菌是婴儿中枢神经系统感染的主要致病菌，约75%大肠埃希菌新生儿脑膜炎分离株具有K1荚膜抗原
致泻大肠埃希氏菌与大肠杆菌
一、大肠菌群是指：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。 二、大肠杆菌是大肠菌群众多细菌的一个种类而已。大肠杆菌（E. coli）为埃希氏菌属(Escherichia)代表菌。一般多不致病，为人和动物肠道中的常居菌，在一定条件下可引起肠道外感染。某些血清型菌株的致病性强，引起腹泻，统称致病性大肠杆菌。 三、致泻大肠埃希氏菌生物学特性 大肠埃希氏菌更习惯称为大肠杆菌，分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属，统称为致泻性大肠杆菌，一般包括五种：即肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）和粘附性大肠杆菌（EAEC）。 大肠埃希氏菌为两端钝圆的短小杆菌，一般大小约0.5μ-0.8μm*1.0μm-3.0μm,因生长条件不同，个别菌体可呈近似球状或长丝状。此菌多单独存在或成双，但不呈长链状排列。约有50%左右的菌株具有周生鞭毛而能运动，但多数菌体只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱；多数菌株生长有比鞭毛细、短、直且数量多的菌毛，有的菌株具有荚膜或微荚膜；不形成芽胞，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。 此菌合成代谢能力强，在含无机盐、胺盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37℃，在42-44℃条件下仍能生长，生长温度范围为15-46℃。在普通营养琼脂上生长表现3种菌落形态：光滑型、粗糙型、粘液型。大肠埃希氏菌兼性厌氧，在有氧条件下生长良好，最适生长pH为6.8-8.0，所用培养基pH为7.0-7.5,若pH值低于6.0或高于8.0则生长缓慢。 大肠埃希氏菌发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖和甘露醇产酸产气，分解蔗糖因菌株而异，录素酶试验阴性，IMVi试验++--，有些菌株如碱性异型菌群，微产碱，不产气，无动力，易与志贺菌混淆。大肠埃希氏菌的抗原构造主要由菌体抗原(O)，鞭毛抗原(H)和荚膜抗原(K)三部分组成。现巳知有171个O抗原、99个K抗原和56个H抗原。 此菌对理化因素的抵抗力，在无芽胞菌中是最强的一种，在室温可存活数周，在土壤、水中存活数月，耐寒力强，但是在30分钟内快速冷冻，将37℃降至4℃的过程，可杀死此菌。加热60℃，30分钟，此菌可灭活。此菌对青霉素有中等抵抗力，对一般消毒剂都比较敏感对漂白粉，酚、甲醛等较敏感，水中1ppb氯可杀死此菌。此菌耐胆盐，在一定程度上能抵抗煌绿等染料的抑菌作用 三、肠致泻性大肠埃希菌： 大肠杆菌是人和动物肠道中的正常菌群，一般对人无害。本菌为革兰阴性的短杆菌，其抗原结构有3种，即菌体抗原(O抗原)、包膜抗原(K抗原)和鞭毛抗原(H抗原)。O抗原是血清分型的基础，目前已发现有170多种，其中一些特殊的血清型具有病原性，能引起人类腹泻，故称为致泻性大肠杆菌，而由其引起之肠炎称致泻性大肠杆菌肠炎。世界各地广泛存在本菌感染，婴儿腹泻中检出率较高，在成人中亦可呈散在或暴发流行。临床表现为旅游者腹泻或食物中毒。新生儿病房及托儿机构可引起交叉感染而发生流行。 大肠埃希氏菌(E. coli)通常称为大肠杆菌，一般认为是非致病菌。但一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性，尤其对婴儿和幼畜（禽），常引起严重腹泻和败血症，它是一种普通的原核生物，根据不同的生物学特性、发病机制、临床特征、流行病学特征、O 抗原血清型及细菌的毒力测定可将致泻性大肠杆菌分为5类：致病性大肠杆菌(EPEC)、产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)、侵袭性大肠杆菌(EIEC)、出血性大肠杆菌(EHEC)和肠集聚粘附性大
微生物检验实验室致病性大肠埃希菌标准操作规程
微生物检验实验室致病性大肠埃希菌标准操作规程 1. 概述 致病性大肠埃希菌包括肠产毒型大肠埃希菌、肠致病型大肠埃希菌、肠侵袭型大肠埃希菌、肠出血型大肠埃希菌和肠凝聚型大肠埃希菌5群。与普通大肠埃希菌的生化反应相似，应结合血清反应（O、H和K抗原）、毒性试验（ST和LT肠毒素）和临床症状，分别鉴定5型致病性大肠埃希菌。 2. 标本类型 粪便标本。 3. 鉴定 3.1 形态染色与一般大肠埃希菌相同。 3.2 培养特性在麦康凯琼脂平板上形成不透明、粉红色或无色菌落。 3.3 生化反应与普通大肠埃希菌相似。 3.4 鉴别要点在山梨醇麦康凯琼脂平板上形成无色菌落。IMViC++--， 3.5 不发酵或迟发酵山梨醇，为本菌的主要特征。 3.6 操作步骤 3.6.1 氧化酶试验参见氧化酶试验标准操作规程。 3.6.2 致病型大肠埃希菌的鉴定 肠致病型大肠埃希菌（EPEC）婴幼儿水样或蛋花汤样便，鉴定为大肠埃希菌后用EPEC分型血清作O:H分型。
肠产毒型大肠埃希菌（ETEC）水样便，鉴定为大肠埃希菌后需要测定ST和LT两种肠毒素及血清分型。ST的检查可用兔肠段结扎试验，免疫学或分子生物学方法（DNA 探针）检测。 肠侵袭型大肠埃希菌（EIEC）细菌性痢疾样便，生化特性与志贺菌相似，不发酵或迟发酵乳糖，赖氨酸脱羧酶阴性，无动力，符合EIECO:H血清分型，豚鼠眼结膜试验、HELA细胞侵入试验阳性。 肠出血型大肠埃希菌(EHEC) 早期为水样便后为血便，有50多个血清型，最具代表性的是O157：H7不发酵或迟发酵山梨醇，在山梨醇麦康凯琼脂平板上形成无色菌落，可用EHECO:H诊断血清进行分型。 4. 药敏 参见药物敏感性试验标准操作规程及CLSI M100-S20最新版本文件。 5. 质量控制 参见质量管理程序。 6. 检验结果解释与分析 疑似致病性大肠埃希菌感染，分离菌应先鉴定为大肠埃希菌，再通过不同的方法鉴定到种型，如分离到上述4种腹泻病原菌，应立即向临床发出报告。 7. 临床意义
大肠埃希菌的检查
药品中大肠埃希菌的检验 (1)按细菌总数测定方法制备供试液。 (2)取供试品l：10稀释液10mL，接种在制好的100mL胆盐乳糖培养基中,在37℃恒温箱中培养18～24 h，进行增菌培养。 (3)用接种环挑取上述培养物接种在麦康凯琼脂平板(MacC)或伊红美蓝琼脂平板(EMB)上，置37℃培养18～24 h，进行分离培养。观察有无鲜桃红色或微红色、中心深桃红色、圆形、扁平、边缘整齐、表面光滑、湿润的菌落形成。 (4)挑取2～3个疑似大肠埃希菌菌落，分别接种在营养琼脂斜面培养基上，在37℃下培养18～24 h，进行纯培养。 (5)将疑似大肠杆菌的培养物涂片进行革兰染色，经镜检证明为G－无芽孢短杆菌的，应继续做生化试验。 (6)生化试验 ①乳糖发酵试验。将上述纯培养物接种在乳糖发酵管中，在37℃下培养24～ 48 h。凡大肠埃希菌，可发酵乳糖产酸产气。 ②靛基质试验。将上述纯培养物接种在蛋白胨水培养基中，在37℃下培养(48±2)h．加入0 .3～0 .5 mL靛基质试液(对二甲基氨基苯甲醛)，观察液面。液面呈玫瑰红色为阳性反应，呈试剂本色为阴性反应。 ③甲基红试验将纯培养物接种在磷酸盐葡萄糖胨水培养基内，在37℃下培养(48±2)h，在1 rnL培养液中加入l滴甲基红试剂，立即观察结果。呈鲜红色或橘红色为阳性反应。呈黄色为阴性反应。 ④乙酰甲基甲醇生成试验(VP试验)。将纯培养物接种在磷酸盐葡萄糖胨水培养基内，在37℃下培养(48±2)h，在2mL培养液中加入α一萘酚乙醇液1 mL_，混匀，再加入质量分数为40％的氢氧化钾溶液0.4mL后观察结果。培养液应在加入试剂后的4 h内呈红色为阳性反应，无红色为阴性反应。 ⑤枸橼酸盐利用试验。将纯培养物接种在枸橼酸盐斜面培养基上,在37℃下培养(48±2)h,观察结果。斜面有菌生长，培养基由绿色变为蓝色为阳性反应，斜面无菌生长培养基仍呈绿色为阴性反应。 (7)判断结果。经染色镜检证实为G–无芽孢短杆菌，乳糖发酵试验产酸产气，IMVC试验结果为++––或–+––的，可确认供试品中含有大肠埃希菌。
五种致泻性大肠埃希氏菌多重PCR检测试剂盒...
五种致泻性大肠埃希氏菌多重PCR检测试剂盒 研发背景 大部分的大肠杆菌是人或动物倡导的共生菌，但其中也有部分菌株可引起腹泻等疾病。致泻大肠杆菌不但可引起传染性疾病而且可引起食源性疾病的暴发。根据发病机制、临床特征、流行病学特征、O抗原血清及细菌的毒力测定，可将致泻大肠杆菌分为5类：致病性大肠杆菌（EPEC）、产毒性大肠杆菌（ETEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、粘附性大肠杆菌（EAEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）。目前针对致泻大肠杆菌的常规实验室检测方法仍然较为薄弱，需要研究快速、简便、准确的分子生物学方法。 【检验原理】 五种致泻性大肠杆菌（EPEC、EHEC、EAEC、EIEC、ETEC）共含有11种毒力基因，针对这11种毒力基因，天津生物芯片试剂盒使用11对特异引物，与样本中基因组的相应靶位点特异性结合，PCR反应后，不同类型的样本产生不同的扩增片段，从而达到对五种致泻性大肠杆菌快速分型检测的目的。 【使用方法】 1.试剂配制（试剂准备区） 从试剂盒中取出PCR反应液在室温融化，将PCR反应液充分震荡混匀，所有试剂在使用前2000rpm离心10s。设所需要的管数n（n=样本数+1管阴性对照品），每个测试反应体系试剂配置如下表。计算所需要的n管反应的各试剂的使用量，加入至适当体积的无菌离心管中，充分混合均匀，分装至无菌PCR反应管中，每管24μl。 2.PCR扩增（扩增和产物分析区）
将样本、阴性对照品使用前恢复至室温，2000rpm离心10s。向每个PCR反应管中分别加入样本、阴性对照品各1μl，震荡混匀，于2000rpm离心10s。将PCR管放入PCR仪中，使用以下程序进行扩增反应，整个扩增反应约需2小时： Step 1 94℃ 5min Step 2 94℃ 30s Step 3 63℃ 30s 30 个循环 Step 4 72℃ 90s Step 5 72℃ 5min 3.结果判断（扩增和产物分析区） 从PCR管中取出2μl PCR产物与9μl阳性对照品一起进行浓度为2%的琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下阳性对照品从上至下应有11条带，分别为1487bp、1111bp、910bp、766bp、655bp、544bp、400bp、324bp、244bp、171bp和102bp。 样品观察到1487bp、910bp、544bp条带即为毒力基因uidA、bfpB和escV阳性，即为典型EPEC菌株。 观察到1487bp、544bp、324bp、244bp条带即为毒力基因uidA、escV、stx2A和stx1A 阳性，即为典型的EHEC菌株。 观察到1487bp、655bp和171bp条带即为毒力基因uidA、elt和estlb阳性，即为典型的ETEC菌株。 观察到1487bp和766bp条带即为毒力基因uidA和invE阳性，即为典型的EIEC菌株。 观察到1487bp、1111bp、400bp和102bp条带即为毒力基因uidA、pic、aggR和astA 阳性，即为典型的EAEC菌株。 阴性对照品结果应为阴性。 产品特点
大肠埃希菌检查(新)
实训一大肠埃希菌的检查 一、实训目标 1．熟悉药品中大肠埃希菌的检验原理。。 2．掌握由口服药品中分离鉴定大肠埃希菌的程序及步骤。 3．学会分析检验结果，识别大肠埃希菌的特征。 4．掌握检验数据的处理，能够规范书写检验原始记录及检验报告书。 二、实训原理 大肠埃希菌是肠道中存在的正常菌群，故常来源于人和动物的粪便，所以常作为粪便污染的指标。一旦被检药物中查出大肠埃希菌，表明该药品已被粪便污染，可能存在肠道致病菌和寄生虫卵，患者服用该药物后有引起感染的危险。因此，大肠埃希菌被列为重要的卫生指标菌。国家药品卫生标准规定口服药品不得检出大肠埃希菌。 中国药典采用了MUG－Indole快速测定药品中大肠埃希菌。 在MUG试验中，将MUG（4-甲基伞形酮葡糖苷酸）作为目标菌的基本营养物加入培养基中，被大肠埃希菌的β-葡萄糖醛酸酶直接分解产物又作为一种指示系统，在366 nm紫外光下呈现兰白色荧光，即MUG阳性；若无荧光，即MUG阴性。 靛基质（Indole）试验中，大肠埃希菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。 因此根据大肠埃希菌的这一性质，对MUG呈阳性者，再加对-甲氨基苯甲醛试剂数滴，轻摇试管，培养液上层呈现玫瑰红色者(阳性)，报告检出大肠埃希菌。如果两者都为阴性，报告未检出大肠埃希菌。如果一阴一阳，需要进一步的培养和生化试验检查。 本方法对大肠埃希菌的检出率达98％。 培养温度：控制菌培养温度为30～35℃。 三、实训步骤 （一）实训用设备、仪器与试药的准备 100ml量筒、10ml吸量管、500ml烧杯、250ml锥形瓶、150ml锥形瓶、玻棒、大试管、6cm培养皿、吸耳球、小试管、1ml吸量管 乳糖胆盐培养基、MUG培养基、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、蛋白胨、1.0mol/l HCl溶液、1.0mol/lNaOH溶液、EMB、对二甲氨基苯甲醛、戊醇、盐酸 稀释液与培养基的配制 1）PH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液（200ml/2组） 磷酸二氢钾 0.7g 磷酸氢二钠 1.5g 氯化钠 0.9g 蛋白胨 0.2g 蒸馏水 200ml 配制：取上述成分混合，溶解，分装锥形瓶2个（用150ml锥形瓶），约90ml/个，包扎，标记，121。，15min灭菌。 乳糖胆盐培养基（400ml/2组） 2)乳糖胆盐培养基 12g 蒸馏水 400 ml PH=7.6 配制：称取，溶解，调节PH值，分装锥形瓶4个（用250ml锥形瓶），约100ml/个，包扎，标记，115。，15min灭菌
细菌性痢疾诊断标准GB 106002
细菌性痢疾诊断标准GB 106002-1995 前言 细菌性痢疾(以下简称菌痢)是由志贺菌(又称痢疾杆菌)引起的急性肠道传染病，是常见多发病，其发病率在我国法定报告的甲、乙类传染病中居首位，而且往往引起暴发或流行，对劳动力影响很大。根据《中华人民共和国传染病法》及《中华人民共和国传染病法实施细则》，特制定本标准。 本标准的附录A、附录B是标准的附录。 本标准的附录C、附录D是提示的附录。 本标准由中华人民共和国卫生部提出。 1 范围 本标准规定了细菌性痢疾和阿米巴痢疾的诊断标准及防治原则。 本标准适用于各级医疗、卫生防疫机构作为细菌性痢疾和阿米巴痢疾的诊断及防治依据。 2 引用标准 下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。 GB 4789.4—94 食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验 GB 4789.5—94 食品卫生微生物学检验志贺氏菌检验 GB 4789.6—94 食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验 3 细菌性痢疾诊断标准及处理原则 3.1 诊断原则 须依据流行病学史，症状体征及实验室检查进行综合诊断。确诊则须依赖于病原学的检查。 3.2 诊断标准 3.2.1 流行病学史：病人有不洁饮食或与菌痢病人接触史。 3.2.2 症状体征 3.2.2.1 急性非典型菌痢 症状轻，可仅有腹泻、稀便。 3.2.2.2 急性普通型(典型)菌痢 急性起病、腹泻(除外其他原因的腹泻)、腹痛、里急后重、可伴发热、脓血便或粘液便、左下腹部压痛。 3.2.2.3 急性中毒型菌痢 发病急、高热、呈严重毒血症症状，小儿起病时可无明显腹痛腹泻症状，常需经灌肠或肛拭做粪检，才发现是菌痢。根据主要临床表现有以下类型：
大肠埃希菌检查法.docx
大肠埃希菌检查法 ESCheriChia COliTeSt MethOd 1. 目的 建立大肠埃希菌检查法的标准操作程序。 2. 范围 适用于大肠埃希菌检查的操作。 3. 责任者 QC化验员。 4. 程序： 4.1. 简述 4.1.1. 大肠埃希菌(ESCheriChia coli)即大肠埃希菌，为肠埃希菌科埃希菌属 的模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发现有非脱羧埃希氏菌等5个种。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。在药品中检出大肠 埃希菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。大 肠埃希菌除普通大肠埃希菌外尚有致病性大肠埃希菌，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。为保证人体健康，口服药品必须检查大肠埃希菌。 4.1.2. 用4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-MethylumbelliferyI- β -D-glucuronide , MUG和靛基质(Indole)试验检查大肠埃希菌是一项新技术，其检验步骤为：增菌培养后，转种MUG蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如MUG Indole试验为阳性或阴性即可报告结果。 4.1.3. 原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反应 作为指示系统来鉴定目标菌。 实验证明，96%的大肠埃希菌含β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase ，GUD) 约10%的沙门菌属一些菌种也含有此酶。MUGS GUD水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG鉴定大肠埃希菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。单一的MUG鉴别大肠埃希菌其漏检率达6%,鉴于98%的大肠埃希菌其靛基质试验为阳性，故将MUGf靛基质试验结合，比单用MU可提高大肠埃希菌的检出率。如MUGf Indole 试验的反应不一致时，则需将供试液的增菌培养物用EMB琼脂平板分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别。该法理论上可使大肠埃希菌的检出率达98%。 如仅用IMViC生化试验来鉴别大肠埃希菌属中的大肠埃希菌，其结果是含混的。 4.2. 仪器、设备及用具 4.2.1. 无菌室 4.2.2. 净化工作台 4.2.3. 培养箱(36 ± 1C ) 4.2.4. 高压蒸汽灭菌器 4.2. 5. 显微镜(1500X)
大肠杆菌及其检验
大肠杆菌及其检验 大肠杆菌的生物学特性 ?简介： 大肠埃希氏菌习惯称为大肠杆菌，分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属，并且大肠杆菌株ATCC 11775是该属的模式菌种。 附：肠杆菌科各属 大肠杆菌的不同菌株间DNA相关性为80%，而与同科的志贺氏菌属（除鲍氏志贺氏菌外）的DNA相关性可达80-87%。 大肠杆菌为人和动物肠道中的常居菌，一般多不致病，在一定条件下可引起肠道外感染。 ?形态与染色 大小0.4～0.7×1～3um,无芽胞,大多数菌株有动力。 有普通菌毛与性菌毛，有些菌株有多糖类包膜，革兰氏阴性杆菌。 附：有动力是什么意思？请看动力试验。 革兰氏阴性杆菌是什么意思？请看革兰氏染色介绍。 大肠杆菌扫描电镜照片 大肠杆菌透射电镜照片 大肠杆菌分裂照片 最新：大肠杆菌革兰氏染色照片 ?培养特性 由于此菌合成代谢能力强，在含无机盐、胺盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。 最适生长温度为37℃，在42-44℃条件下仍能生长，生长温度范围为 15-46℃。 在普通营养琼脂上生长表现3种菌落形态：
（1）光滑型：菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、光滑、呈灰色，在生理盐水中容易分散。 （2）粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐，易在生理盐水中自凝。 （3）粘液型：常为含有荚膜的菌株。 此菌兼性厌氧，在有氧条件下生长良好，最适生长pH为6.8-8.0，所用培养基pH为7.0-7.5,若pH值低于6.0或高于8.0则生长缓慢。 附：菌落形态有什么用处？菌落形态学 生化反应 大部分菌株发酵乳糖产酸产气，并发酵葡萄糖、麦芽胞、甘露醇、木胶糖、阿拉伯胶等产酸产气。 IMViC试验为“+、+、-、-”。即为典型大肠杆菌。 ?抗原构造 比较复杂，主要由菌体O抗原、鞭毛H抗原、夹膜K抗原组成。 ?抵抗力 该菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强，55℃经60分钟或60℃加热15分钟仍有部分细菌存活。 在自然界的水中可存活数周至数月，在温度较低的粪便中存活更久。对磺胺类、链霉素、氯霉素等敏感，但易耐药，是由带有R因子的质粒转移而获得的。 致泻性大肠杆菌简介 大肠杆菌为人和动物肠道中的常居菌，一般多不致病，在一定条件下可引起肠道 外感染。 某些血清型菌株的致病性强，引起腹泻，与人类疾病有关的大肠杆菌，统称为致泻性大肠杆菌（enterovirulent E. coli ）。 一般包括四种： 肠毒素性大肠杆菌（ETEC） 致病性大肠杆菌（EPEC）
大肠埃希菌
Shandong Liaocheng Ehua Medicine CO., LTD 大肠埃希菌(Escherichia coli)即大肠杆菌，为肠杆菌科埃希菌属的模式种。用4-甲基伞形酮葡糖苷酸（MUG）和靛基质（Indole）试验检查大肠埃希菌，检验步骤为：增菌培养后，转种MUG-蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如MUG、Indole 试验为阳性或阴性即可报告结果。 原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反应作为指示系统来鉴定目标菌。实验证明，96%的大肠埃希菌含β-葡糖苷酸酶（GUD）。MUG被GUD水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色的反应强，易于观察。通常将MUG与靛基质试验结合，来检测大肠杆菌。如MUG与Indole试验的反应不一致时，则需将供试液的增菌培养物用EMB琼脂平板分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别。 2．仪器、设备及用具 2.1无菌室微生物检查应有单独的无菌室，每个无菌室应有独立的净化空气系统。 2.2 净化工作台 2.3 培养箱（36℃±1℃）。 2.4 高压蒸汽灭菌器。 2.5 显微镜（1500×）。 2.6 恒温水浴（45℃±1℃）。 2.8 离心机（500~4000r/min）。 2.9 电冰箱。 2.10 匀浆仪。 2.11 366nm紫外灯。 2.12 玻璃器皿、器具[参照细菌、霉菌和酵母菌计数2.2.2]。 3．试液、指示液。 3.1 0.9%无菌氯化钠溶液。 3.2 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。 3.3 pH7.2无菌磷酸盐缓冲液。 3.4 靛基质（Kovacs）试液。 3.5甲基红试液。
大肠埃希氏菌鉴定试剂盒
大肠埃希氏菌干制生化鉴定试剂盒 E.coli Dehydration Biochemical Identification Kit 大肠埃希氏菌干制生化鉴定试剂盒用途：用于大肠埃希氏菌的IMViC生化鉴定。大肠埃希氏菌干制生化鉴定试剂盒组成: 干制生化鉴定试剂:4种/盒×10 盒; 0.5麦氏浊度比浊管:1支; 配套试剂:Kovacs氏靛基质试剂1瓶、甲基红试剂1瓶、V-P甲、乙液试剂各1瓶; 使用说明书:1份 实验操作步骤: 1. 从铝箔袋中取出试剂盒,打开盒盖,在试剂盒的长条槽中加入0.5mL无菌水; 2. 用接种环从平板上挑取新鲜培养的单个纯菌落至适量无菌水中,制成0.5麦氏浊度的均一菌悬液; 3. 接种菌悬液分别至试剂盒的4个圆孔中,每孔接种量0.2mL,盖上盒盖,36℃±1℃培养24h。 结果判定:
注:菌悬液浓度不宜过大,否则可能产生假阳性结果。保存条件和保质期:室温避光保存1年。 其他相关试剂盒： 名称用途及用法 大肠埃希氏菌干制生化鉴定试剂盒 E.coli Dehydration Biochemical Identification Kit 用于大肠杆菌的IMVC 生化系统鉴定(GB4789.38-2012)，包括蛋白胨水、MR、VP和西蒙氏枸橼酸盐共 4 种生化鉴定试验和配套试剂(靛基质、甲基红、VP甲乙液) 阪崎肠杆菌干制生化鉴定试剂盒Enterobacter sakazakii Dehydration Biochemical Identification Kit 用于阪崎肠杆菌的生化鉴定(GB4789.40-2010)，包括氨基酸对照、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶、西蒙氏柠檬酸盐、D-山梨醇、L-鼠李糖、D-蜜二糖、D-蔗糖和苦杏仁苷共10种生化鉴定试验和配套试剂(无菌石蜡) 志贺氏菌干制生化鉴定试剂盒Shigella Dehydration Biochemical Identification Kit 用于志贺氏菌的生化鉴定(GB4789.5-2012)，包括氨基酸对照、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、靛基质、尿素、水杨苷、七叶苷、甘露醇、棉子糖、ONPG、甘油、葡萄糖铵、西蒙氏柠檬酸盐、粘液酸对照、粘液酸、三糖铁、半固体共17 种生化鉴定试验和配套试剂(无菌石蜡、靛基质)
控制菌(大肠埃希菌)检查操作规程
控制菌（大肠埃希菌）检查操作规程 1.目的 建立一个控制菌大肠埃希菌控制菌大肠埃希菌检查标准工作程序，规范QC控制菌大肠埃希菌检查人员的控制菌大肠埃希菌检查的操作。 2.范围 适用于本公司的口服制剂完成内包后外包前的中间体和局部给药制剂产品的内包装材料的控制菌大肠埃希菌的检测。 3.责任者 QC控制菌大肠埃希菌检查人员；质量管理部 4.内容 4.1检测准备 4.1.1 QC人员接到控制菌大肠埃希菌检查的《工作进程计划单》后，核对《取样指令》，确定控制菌大肠埃希菌检查所需容器具、试液、培养基等项目和数量，执行微生物检查准备工作操作程序和培养基配制操作规程，进行控制菌大肠埃希菌检查前的准备工作。 4.1.2 为了保证被检品在取样后规定的时间内完成检验，取样前应准备好检验需要的各种器皿（清洗→干燥→包裹）、培养基和稀释剂等（配制→分装→包裹），并灭菌备用。 4.2 供试液的制备 4.2.1 供试液供试液是指按照供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法将供试品制成供试验用的均匀液体。 4.2.2 供试液的制备根据供试品的理化特性与生物需特性，采取适宜的方法制备供试液。如果使用了乳化剂、分散剂、中和剂和灭活剂，其用量应证明是有效的，并对微生物的生长和存活无影响性。 4.2.2.1 可溶性液体供试品
取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为供试液。可溶性液体制剂可用混合的供试品原液作为供试液。 4.2.2.2 非水溶性液体供试品 油剂可先加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀，然后再加0.9%无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100m，混匀，作为供试液。 4.2.2.3 水溶性固体、半固体或黏稠性供试品 称取供试品10g，置PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml中，用匀浆仪或其他适宜方法，混匀，作为1：10供试液。必要时可加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。 4.2.2.4 非水溶性供试品 取供试品5g(5m1)，加入含溶化的（温度不超过45℃）5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使其充分乳化，作为1:20供试液。 4.2.2.5肠溶及结肠溶制剂供试品 取供试品10 g，加PH6.8无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂）或PH7.6无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂）至100ml，置45℃水浴中，振摇，使溶解，作为1:10的供试液。 4.2.2.7具抑菌成分供试品 当供试品抑菌活性时，应消除供试液的抑菌活性后，再依法检查，一般使用培养基稀释法，取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少，至不含抑菌作用。取低稀释级供试液（原液或1:10的供试液）2份，每份各1ml，分别注入5个或5个以上平皿中（每皿0.2ml或<0.2ml），每个平皿倾注培养基约15ml，混匀，凝固后，倒置培养，按每1ml分注的平皿点计菌落数之和计数，即为每1ml的菌落数，共得2组数据，再以2组数的平均数乘以稀释倍数的值报告菌数。 4.2.2.8 供试液的制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃，时间为30min。
肠致泻性大肠埃希氏菌实验活动风险评估报告
肠致泻性大肠埃希氏菌 实验活动风险评估报告 一、生物学特性 (一)种类和细菌分型 大肠埃希氏菌是人和动物肠道中的正常菌群，一般对人无害。本菌为革兰阴性的短杆菌，其抗原结构有3种，即菌体抗原（O抗原）、包膜抗原（K抗原）和鞭毛抗原（H抗原）。O抗原是血清分型的基础，目前已发现有170多种，其中一些特殊的血清型具有病原性，能引起人类腹泻，故称为肠致泻性大肠埃希氏菌。根据发病机制、临床特征、流行病学特征、抗原血清型及细菌的毒力测定可将肠致泻性大肠埃希氏菌分为5类：肠致病性大肠埃希氏菌（EnteropahogenicE.Coli,EPEC)、肠产毒性大肠埃希氏菌（Enterotoxingen-icE.Coli,ETEC)、肠侵袭性大肠埃希氏菌（EnteroinvasiveE.Coli,EIEC)、肠出血性大肠埃希氏菌（EnterohemorrhagicE.Coli,EHEC)和肠集聚黏附性大肠埃希氏菌（Entero-aggregativeE.coli,EAggEC)。 (二)来源 大肠埃希氏菌属包括多种细菌，临床上以大肠埃希氏菌最为常见。大肠埃希氏菌(E.coli通称大肠杆菌，是所有哺乳动物大肠中的正常寄生菌，一方面能合成维生素B及维生素K供机体吸收利用，另一方面能抑制腐败菌及病原菌和真菌的过度增殖。但当它们离开肠道的寄生部位，进人到机体其他部位时，能感染发病。有些菌型有致病性，引起肠道或尿路感染性疾患。肠致泻性大肠埃希氏菌是指能使人、动物（尤其是婴儿和幼龄动物）感染及人食物中毒的一群大肠埃希氏菌。在自然界中，本菌分布广泛，主要的寄居场所是人和其他恒温动物的肠道中，是一类条件性致病菌。 (三）传染性 大肠埃希氏菌所引起的食源性疾病主要由食人被污染的食物和水而引起，可以导致肠道外感染，如泌尿系感染、菌血症、胆囊炎、肺炎及新生儿脑膜炎等，也会造成从轻微股泻到霍乱样严重腹泻，乃至引起致死性的并发症。肠侵袭性大肠杆菌由人一人传染而致病，推测为粪一口途径感染。 (四)传播途径 肠道内感染以粪一口途径为主，可通过食用污染的食品、水而传播，引起食源性细菌性腹泻。人与动物的密切接触也可传播。苍蝇、蟑螂等昆虫因其生活习性特殊，在一些细菌性腹泻的传播中发挥了重要作用。通过医务人员的手或污染公共物品可造成医院内感染从而引起医院内腹泻传播。多数大肠埃希氏菌在肠道内不致病，但如移位至肠道外的组织，则可引起感染，即肠道外感染。 (五)易感性
埃希氏大肠菌及检验
埃希氏大肠菌及检验 一、定义： 大肠埃希氏菌更习惯称为大肠杆菌，分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属，并且大肠杆菌株ATCC 11775是该属的模式菌种。大肠杆菌的不同菌株间DNA相关性为80%，而与同科的志贺氏菌属（除鲍氏志贺氏菌外）的DNA相关性可达 80-87%。与人类疾病有关的大肠杆菌，统称为致泻性大肠杆菌（此名称不易与致病性大肠杆菌相混淆），一般包括五种：即肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）和粘附性大肠杆菌（EAEC）。文献报道还有几种，象：凝集性大肠杆菌、即产VT毒素又具有侵袭性的大肠杆菌等，但目前尚未达成统一共识。 二、生物学特性： 基本形态特征： 此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般大小约0.5μ-0.8μm*1.0μm-3.0μm,因生长条件不同，个别菌体可呈近似球状或长丝状。此菌多单独存在或成双，但不呈长链状排列。约有50%左右的菌株具有周生鞭毛而能运动，但多数菌体只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱；多数菌株生长有比鞭毛细、短、直且数量多的菌毛，有的菌株具有荚膜或微荚膜；不形成芽胞，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。 培养特征： 由于此菌合成代谢能力强，在含无机盐、胺盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37℃，在42-44℃条件下仍能生长，生长温度范围为 15-46℃。在普通营养琼脂上生长表现3种菌落形态：（1）光滑型：菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、光滑、呈灰色，在生理盐水中容易分散。（2）粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐，易在生理盐水中自凝。（3）粘液型：常为含有荚膜的菌株。此菌兼性厌氧，在有氧条件下生长良好，最适生长pH为 6.8-8.0，所用培养基pH为 7.0-7.5,若pH值低于6.0或高于 8.0则生长缓慢。 生化反应与血清学反应 大肠杆菌属于卫生学意义的大肠菌群和粪大肠菌群的范畴，因此，必须符合大肠菌群和粪大肠菌群的有关定义，在检测大肠菌群、粪大肠菌群的基础上，可以应用I（吲哚）、M（甲基红）、Vi（3羟基-2-丁酮）、C（柠檬酸）即IMViC 生化试验对大肠杆菌作进一步鉴定，其IMViC结果为++--或-+--。生化反应是鉴定大肠杆菌的主要方法之一，然而，大肠杆菌之间生化反应的差异非常常见，象：许多菌种非/迟发酵乳糖，但并不说明它们遗传上有明显不同，生化反应非典型的大肠杆菌菌株与典型菌株的DNA相关性在85%-100%。附表1为大肠杆菌生化反应特性表。其中H2S、脲酶、阿糖酸、吲哚、ONPG试验常为首选生化反应，其
大肠埃希菌检查法
大肠埃希菌检查法 Escherichia Coli Test Method 1.目的 建立大肠埃希菌检查法的标准操作程序。 2.范围 适用于大肠埃希菌检查的操作。 3.责任者 QC 化验员。 4.程序： 4.1.简述 4.1.1.大肠埃希菌(Escherichia coli)即大肠埃希菌，为肠埃希菌科埃希菌属的模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发现有非脱羧埃希氏菌等 5个种。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。在药品中检出大肠埃希菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。大肠埃希菌除普通大肠埃希菌外尚有致病性大肠埃希菌，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。为保证人体健康，口服药品必须检查大肠埃希菌。 4.1.2.用 4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-Methylumbelliferyl-β -D-glucuronide，MUG)和靛基质(Indole)试验检查大肠埃希菌是一项新技术，其检验步骤为：增菌培养后，转种 MUG-蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如 MUG、Indole试验为阳性或阴性即可报告结果。 4.1.3.原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反应作为指示系统来鉴定目标菌。 实验证明，96％的大肠埃希菌含β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase，GUD)，约 10 ％的沙门菌属一些菌种也含有此酶。MUG 被 GUD 水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG 鉴定大肠埃希菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。单一的MUG 鉴别大肠埃希菌其漏检率达 6％，鉴于98％的大肠埃希菌其靛基质试验为阳性，故将MUG与靛基质试验结合，比单用MUG可提高大肠埃希菌的检出率。如MUG与Indole 试验的反应不一致时，则需将供试液的增菌培养物用 EMB琼脂平板分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别。该法理论上可使大肠埃希菌的检出率达98％。如仅用 IMViC生化试验来鉴别大肠埃希菌属中的大肠埃希菌，其结果是含混的。 4.2.仪器、设备及用具 4.2.1.无菌室 4.2.2.净化工作台 4.2.3.培养箱(36±1℃) 4.2.4.高压蒸汽灭菌器
大肠埃希菌检查用培养基适用性检查验证方案汇总
1.概述:培养基是微生物试验的基础，直接影响微生物试验结果。适宜的培养基制备方法、贮藏条件和质量控制是提供优质培养基的保证。供试品微生物限度检查中所使用的培养基应进行适用性检查。 2.验证目的：本次验证的目的是确认大肠埃希菌检查用的麦康凯琼脂培养基、麦康凯液体培养基的质量，以及其制备程序、保存条件等是否满足微生物限度检查用要求。 3.验证依据：《中国药典》2015年版四部“1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法”、“9203药品微生物实验室质量管理指导原则”。 4.验证项目：麦康凯琼脂培养基、麦康凯液体培养基的适用性检查。 5.适用范围：成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。 6.验证周期：除另有规定外，在实验室中，若采用已验证的配制和灭菌程序制备培养基且过程受控，那么同一批脱水培养基的适用性检查试验可以只进行一次。如果培养基的制备过程未经验证，那么每一灭菌批培养基均要进行适用性检查试验。 7.验证小组人员及职责： 7.1验证小组人员: 7.2验证人员职责及要求 7.2.1按验证方案及相关文件实施验证。 7.2.2认真观察并做好验证原始记录。 7.2.3对实施验证的结果负责。 7.3验证中各部门的职责 7.3.1验证领导组职责 7.3.1.1制订验证总计划，负责全公司验证工作的管理。 7.3.1.2确定验证项目及验证项目负责人。
7.3.1.3负责验证方案的批准工作。 7.3.1.4负责验证资料及结果的审核工作。 7.3.1.5负责验证报告的批准工作。 7.3.2验证项目小组职责 7.3.2.1负责验证方案的起草工作。 7.3.2.2参与验证方案的讨论、确认工作。 7.3.2.3负责验证方案的实施。 7.3.2.4负责验证结果的分析、统计、报告工作。 7.3.2.5参与验证结果的评价工作。 7.3.3质量部职责 7.3.3.1负责公司验证日常管理工作。 7.3.3.2负责验证方案的审核工作。 7.3.3.3负责验证过程中仪器、仪表、计量器具的校验工作。 7.3.3.4负责检验仪器及检验方法的验证。 7.3.3.5负责验证中各项检测工作，提供验证的检验记录、检验报告，对验证过程中的各项检验工作负责。 7.3.3.6负责对验证人员的培训、考核工作。 7.3.3.7负责验证资料和报告的审核工作。 7.3.3.8负责验证文件回收、归档管理工作。 8.合格标准： 8.1被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5-2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致； 8.2被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好。 9.验证实施条件
致泻大肠埃希氏菌检验 编制说明
《食品安全国家标准食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验》(征求意见稿)编制说明 一、标准起草的基本情况（包括简要的起草过程、主要起草单位、起草人等）； 1、简要起草过程 ⑴确立标准制定的基本原则，收集国际和国内致泻大肠埃希氏菌检验方法的新标准。 ⑵比较与研究我国原国家标准及国际标准相关内容，并结合方法的研究工作，制定出标准的讨论稿。 ⑶将标准讨论稿提交专家组审查。 ⑷发出《征求意见稿》征求意见，汇总专家意见，根据专家意见对标准文本进行完善。 ⑸提交《食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验》（送审稿）、《编制说明》和《征求意见汇总表》供食品安全国家标准审评委员会审议。 2、标准起草单位、起草人 本标准起草单位为河南省疾病预防控制中心，协助单位有国家食品安全风险评估中心、江西省疾病预防控制中心、黑龙江省疾病预防控制中心和陕西省疾病预防控制中心。主要起草人廖兴广、张秀丽、何晓青、郭运昌，参加人员有孙吉昌、李薇薇、遇晓杰、裴晓燕、炊慧霞、白莉、马国柱、崔莹。 二、标准的重要内容及主要修改情况 1、标准的重要内容 本标准正文包括8部分，第1部分为范围，第2部分为术语和定义、缩略语，第3部分为设备和材料，第4部分培养基和试剂，第5部分为检验程序，第6部分为操作步骤，第7和8部分为附录A和附录B。附录A培养基和试剂为本标准的规范性附录，附录B五种致泻大肠埃希氏菌PCR鉴定方法为本标准的资料性附录。 2、修订内容 本标准与GB/T 4789.6-2003相比，主要修订了如下内容： （1）修改了标准的中英文名称。依据国家标委会统一要求，由2003版的国家食品卫生标准改为食品安全国家标准，标准属性由推荐性标准改为强制性标准，英文相应修改。 （2）修改了标准的范围：鉴于食物中毒样品的特殊性，现场采样有可能样品量不够、样品种类繁多，不是都能按照本标准执行，故删去适用范围中“食物中毒样品”。 （3）增加了术语和定义、缩略语。标准中引入致泻大肠埃希氏菌PCR鉴定方法，基于5类致泻大肠埃希氏菌特征性毒力基因的检测，对标准中出现的术语和基因名词进行说明和解释，有助于标准使用者理解。 （4）按照食品安全国家标准微生物检验方法统一格式，删除了规范性引用文件。 （5）修改了设备和材料。增加了全自动微生物生化鉴定系统、PCR仪、水平电泳仪和凝胶成像仪；删除了与修改后文本中试验无关的仪器和实验动物。 （6）修改了培养基和试剂。删除了赖氨酸脱羧试验培养基、Honda产毒培养基、Elek