大肠埃希菌检查法
大肠埃希菌检查法
Escherichia Coli Test Method
1、目得
建立大肠埃希菌检查法得标准操作程序。
2、范围
适用于大肠埃希菌检查得操作。
3、责任者
QC化验员。
4、程序：
4、1、简述
4、1、1、大肠埃希菌(Escherichia coli)即大肠埃希菌，为肠埃希菌科埃希菌属得模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发现有非脱羧埃希氏菌等5个种。大肠埃希菌就是人与温血动物肠道内得栖居菌，随粪便排出体外。在药品中检出大肠埃希菌，表明该样品受到人与温血动物得粪便污染，即可能污染肠道病原体。大肠埃希菌除普通大肠埃希菌外尚有致病性大肠埃希菌，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。为保证人体健康，口服药品必须检查大肠埃希菌。
4、1、2、用4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-Methylumbelliferyl-β
-D-glucuronide，MUG)与靛基质(Indole)试验检查大肠埃希菌就是一项新技术，其检验步骤为：增菌培养后，转种MUG-蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如MUG、Indole试验为阳性或阴性即可报告结果。
4、1、3、原理：利用目标菌限定酶作用得底物得水解产物，产生颜色或荧光反应作为指示系统来鉴定目标菌。
实验证明，96％得大肠埃希菌含β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase，GUD)，约10％得沙门菌属一些菌种也含有此酶。MUG被GUD水解，产生荧光，由于荧光反应得敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG鉴定大肠埃希菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等得检测。单一得MUG鉴别大肠埃希菌其漏检率达6％，鉴于98％得大肠埃希菌其靛基质试验为阳性，故将MUG与靛基质试验结合，比单用MUG可提高大肠埃希菌得检出率。如MUG与Indole 试验得反应不一致时，则需将供试液得增菌培养物用EMB琼脂平板分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别。该法理论上可使大肠埃希菌得检出率达98％。如仅用IMViC生化试验来鉴别大肠埃希菌属中得大肠埃希菌，其结果就是含混得。
4、2、仪器、设备及用具
4、2、1、无菌室
4、2、2、净化工作台
4、2、3、培养箱(36±1℃)
4、2、4、高压蒸汽灭菌器
4、2、
5、显微镜(1500X)
4、2、6、微波炉
4、2、7、恒温水浴（45±1℃）
4、2、8、离心机(500～4000r/min)
4、2、9、 0、45μm±0、02μm薄膜及过滤器
4、2、10、电冰箱
4、2、11、匀浆仪
4、2、12、 366nm紫外灯
4、2、13、玻璃器皿、器具
4、3、试液、指示液
4、3、1、 0、9％无菌氯化钠溶液取氯化钠9、0g，加水使溶解成1000ml，121℃灭菌20分钟。
4、3、2、靛基质试液取氯化二甲氨基苯甲醛
5、0g，加入戊醇(或丁醇)75ml，充分振摇，使完全溶解后，再取浓盐酸25ml徐徐滴入，边加边振摇，以免聚热导致溶液色泽变深，或取对二甲氨基苯甲醛1、0g，加入95％乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取浓盐酸20ml徐徐滴入。
4、3、3、甲基红指示液取甲基红0、1g，加95％乙醇300ml，使溶解后加水至500ml，即得。
4、3、4、 V-P试液
α-萘酚乙醇试液：取α－萘酚6、0g，加无水乙醇溶解使成100ml。
氢氧化钾试液：取氢氧化钾40、0g、加水使溶解成100ml。
4、3、
5、革兰染色液
4、3、
5、1、结晶紫染液取结晶紫1、0g、95％乙醇20ml、1％草酸铵[(NH4)2C2O4]溶液80ml。将结晶紫溶于乙醇后，与草酸铵混合，静置48h，置密闭棕色瓶，可存放数月。
4、3、
5、2、革兰碘液碘1、0g、碘化钾2、0g、蒸馏水300ml。用少量水溶碘化钾，再加碘，待全溶后，加蒸馏水至30ml，置棕色瓶备用。
4、3、
5、3、脱色液 95％乙醇
4、3、
5、4、沙黄(番红)染液沙黄(SafranineO)0、25g、95％乙醇10ml、蒸馏水适量，将沙黄加入乙醇中，完全溶解后再加水至100ml。
4、3、6、亚甲蓝指示液取亚甲蓝0、5g，加水溶解使成100ml。
4、3、7、溴麝香草酚蓝指示液取溴麝香草酚蓝0、4g，加1mol/L氢氧化钠溶液0、64ml使溶解，再加水稀释至100ml。变色范围pH6、0～7、6(黄→红) 4、3、8、酸性品红指示液取酸性品红0、5g，加水100ml溶解，再逐渐加1mol/L氢氧化钠溶液16ml，每加1滴需将溶液充分摇匀后再加第二滴，直至溶液呈草黄色；于沸水中保持15分钟，静置2小时，滤过，即得。变色范围pH6、0～7、4(黄→红)。
4、3、9、曙红钠指示液取曙红钠2、0g，加水溶解使成100ml。
4、3、10、无菌聚山梨酯80-氯化钠溶液取聚山梨酯80 1ml加0、9％氯化钠溶液使成100ml，121℃灭菌20分钟。
4、3、11、无菌磷酸盐缓冲液(pH7、2) 取磷酸氢二钠2
5、8g与磷酸二氢钠4、4g，加水稀释至1000ml，121℃灭菌20分钟。
4、3、12、无菌对氨基苯甲酸试液取对氨基苯甲酸0、1g，加入含10ml水得
具塞试管中，121℃灭菌20分钟。
4、3、13、中性红指示液取中性红1、0g，研细，加95%乙醇60ml使溶解，再加水至100ml。变色范围
Ph6、8～8、0（红→黄）。
4、3、14、无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(pH7、0) 取磷酸二氢钾3、56g，磷酸氢二钠7、23g，氯化钠4、30g，蛋白胨1、0g，加水1000ml，加热使溶解，过滤。分装，灭菌。
4、4、培养基
4、4、1、营养肉汤培养基
胨 10g 氯化钠
5、0g
牛肉浸出粉 3、0g 水
1000ml
取上述成份混合，微温溶解，调解pH为弱碱性，煮沸，调节pH值使灭菌后为7、2±0、2，分装，灭菌。
4、4、2、营养琼脂培养基
胨 10g 氯化钠
5、0g
牛肉浸出粉 3、0g 水
1000ml
琼脂 14、0g
取上述成份混合，微温溶解，调解pH为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值使灭菌后为7、2±0、2，分装，灭菌。
4、4、3、胆盐乳糖培养基（BL）
胨20、0g 磷酸二氢钾1、3g
乳糖5、0g 牛胆盐 2、0g
氯化钠 5、0g （或去氧胆酸钠）(0、5g)
磷酸氢二钾4、0g 水1000ml
除乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH 值使灭菌后为7、4±0、2，煮沸，滤清，加入乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠，分装，灭菌。
4、4、4、 4-甲基伞形酮葡萄糖化酶苷酸（4-methylumbellifery1-β
-D-glu-curonide,MUG）培养基
胨 10、0g 磷酸二氢钾（无水）0、9g
硫酸锰 0、5mg 磷酸氢二钠（无水）6、2g
硫酸锌 0、5mg 亚硫酸钠40mg
硫酸镁 0、1g 去氧胆酸钠1、0g
氯化钠 5、0g MUG 75mg
氯化钙 50mg 水1000ml
除MUG外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后为7、3±0、1，加入MUG，溶解，每管分装5ml，灭菌。
4、4、
5、曙红亚甲基蓝琼脂培养基（EMB）
营养琼脂培养基100ml 曙红钠指示液2ml
20%乳糖溶液5ml 亚甲蓝指示液1、3-1、6ml
取营养琼脂培养基，加热溶化后，冷至60℃，按无菌操作加入灭菌得其她3种溶液，摇匀，倾注平皿。
4、4、6、麦康凯琼脂培养基（MacC）
胨20、0g 1%中性红指示液3ml
乳糖10、0g 琼脂14、0g
牛胆盐 5、0g 水1000ml
氯化钠 5、0g
除乳糖1%中性红指示液、牛胆盐及琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后为7、2±0、2，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余各成分，摇匀，分装，灭菌，冷至约60℃，倾注平皿。
4、4、7、蛋白胨水培养基
胰蛋白胨 10g
氯化钠 5g
水 1000ml
取上述成分混合，加热溶化，调节pH使灭菌后为7、3±0、1，分装于小试管，灭菌。
4、4、8、磷酸盐葡萄糖胨水培养基
胨 7g 磷酸氢二钾（K2HPO4）
2g
葡萄糖 5g 水
1000ml
取上述成分混合，微温溶解，调节pH使灭菌后为7、3±0、1，分装于小试管，灭菌。
4、4、9、枸橼酸盐培养基
氯化钠 5g 枸橼酸钠（无水）
2g
硫酸镁（MgSO4·7H2O） 0、2g 溴麝香草酚蓝指示液20ml
磷酸氢二钾（K2HPO4） 1g 琼脂
14g
硫酸二氢铵（NH4H2PO4） 1g 水
1000ml
除指示液与琼脂外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH使灭菌后为6、9±0、1，加入琼脂，加热溶化，加入指示液，混匀。分装于小试管，灭菌，制成斜面。注：所用琼脂应不含游离糖，用前用水浸泡冲洗。
4、4、10、乳糖培养基
胨 20、0g 乳糖
10、0g
0、04%溴甲酚紫指示液 25ml 水
1000ml
除0、04%溴甲酚紫指示液外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH使灭菌后为7、2±0、2，加入指示液，分装于含倒管得小试管中，每管3ml。灭菌。5%乳糖培养基
胨 0、2g
溴麝香草酚蓝指示液 6ml
氯化钠 0、2g 乳糖
5g
磷酸氢二钠 0、2g 水
100ml
除乳糖与指示液外，混合各成分，微温溶解，调节pH使灭菌后为7、4，加入乳糖/指示液，混合，分装于含小倒管得灭菌小试管中，115℃灭菌15min。
4、5、对照用菌液
取大肠埃希菌[CMCC(B)44102]得营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基内，置36±1℃培养18～24小时，取均匀培养物1 ml用0、9％灭菌氯化钠溶液稀释制成每1ml含菌10～100cfu得菌悬液，其菌数在做对照试验得同时用营养琼脂注皿或平板涂布，经培养后计数确定。
4、6、准备
4、6、1、检验量
4、6、1、1、每批供试品检验量，一般为10g或10ml，特殊贵重或微量包装得供试品检验量可以酌减。
4、6、1、2、供试品均须取自2个以上得包装单位。
4、6、2、供试液得制备
4、6、2、1、液体供试品取供试品10ml，加无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(pH7、0)至100ml，混匀，作为供试液。
4、6、2、2、固体、半固体或黏稠液供试品取供试品10g，加无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(pH7、0) 至100ml，用匀浆仪（3000～5000r/min、2～4min）或其她有效得方法，混匀，作为供试液。必要时加适量得无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。
4、6、2、3、非水溶性供试品
方法1 取供试品5g（或5ml），加至含溶化得（温度不超过45℃）5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物得烧杯中，用无菌玻璃棒搅拌成团后，慢慢加入45℃得pH7、0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1：20得供试液。
方法2 取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯（制法见无菌检查法中供试品得无菌检查项下）与无菌玻璃珠得适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯得用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加入45℃得pH7、0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇5-10分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作为1：10得供试液。
以上供试品如吸水膨胀，或粘度过高，可增加稀释剂得量，制成1：20～1：100供试液。
4、6、2、4、含抑菌成分供试品
供试品按常规检查法，加入规定量得对照菌，不能检出时，表明供试品有抑菌活性。该供试液按以下方法之一或两种以上方法联合处理后，依法检查。同时做阳性与阴性对照。
稀释法取规定量得供试液接种到较大体积得培养基中，使该供试液稀释至不具抑菌作用得浓度。
离心沉法取一定量得供试液，500转/分离心3分钟，取全部上清液混合。用于细菌检查。
薄膜过滤法取规定量得供试液于稀释剂100ml中，摇匀，以无菌操作加入装有直径为47mm、孔径不大于0、45±0、02μm微孔滤膜得薄膜过滤器内，过滤，用稀释剂冲洗滤膜，每次不少于100ml，将培养基加入滤器或取出滤膜，加入增菌培养基中。
中与法取规定量含磺胺类得供试品，于100ml增菌液(含1％对氨基苯甲酸约1～5ml)中，含砷、汞类得供试品，于硫乙醇酸盐培养基100ml中；含洗必泰供试品，于含适量聚山梨酯80等表面活性剂得100ml增菌液中(表面活性剂得用量应预试，用量过大有抑菌作用)。
沉降法取规定量供试液，自然沉降5min，取上层液于100ml增菌液中，本法适用于难溶于水得抗菌制剂。
4、7、检查方法验证
在建立供试品得大肠埃希菌检查法或原检查法得检验条件发生改变可能影响检验结果得准确性时，应对供试品得抑菌活性及检查法得可靠性进行验证。验证试验按供试液得制备与大肠埃希菌检查法所规定得方法进行。
4、7、1、验证方法
4、7、1、1、试验组取规定量供试液及10-100cfu试验菌加入增菌培养基中，依大肠埃希菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入增菌培养基或取出滤膜接种到增菌培养基中。
4、7、1、2、阴性菌对照组设立阴性菌对照组就是为了验证大肠埃希菌检查法得专属性。方法同试验组，验证大肠埃希菌时得阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌。阴性对照菌不得检出。
4、7、2、结果判断阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法与大肠埃希菌检查法进行供试品得大肠埃希菌检查；若试验组未检出试验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中与法等方法或联合使用这些方法消除供试品得抑菌活性，并重新进行方法验证。
验证试验也可与供试品得大肠埃希菌检查同时进行。
4、8、操作步骤
4、8、1、检验程序
4、8、1、1、阳性对照试验各供试品进行大肠埃希菌检查时，应做阳性对照试验。阳性对照试验得加菌量为10-100cfu，供试品与增菌培养基用量及检查按供试品得大肠埃希菌检查。阳性对照试验应检查出大肠埃希菌。已做验证试验得供试品，在该供试品检查时不必再做阳性对照。
4、8、1、2、阴性对照试验取稀释剂10ml加入100ml（或200ml）大肠埃希菌检查用得增菌培养基中，培养，应无菌生长。
4、8、2、增菌培养
4、8、2、1、取胆盐乳糖(BL)培养基2份，每份各100ml。1份加入10ml供试液(相当于供试品1g、1ml、10cm2)，另1份加入与供试液等量得稀释剂作阴性对照。培养18～24小时，必要时可延长48小时)，阴性对照应无菌生长。
4、8、2、2、取上述培养物0、2ml，接种至含5mlMUG培养基得试管内，培养，
于5、24小时在366nm紫外光下观察，同时取未接种得MUG培养基作本底对照。在紫外光下若管内培养物呈现蓝白色荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG
阴性。观察后，沿培养管得管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照得MUG与靛基质试验应为阴性。如MUG阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如MUG阴性、靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。
4、8、3、分离培养如呈现MUG阳性、靛基质阴性或MUG阴性、靛基质阳性时，应将上述供试品BL增菌培养液轻轻摇动，以接种环1～2ml环培养液划线于EMB或麦康凯琼脂平板上，培养18～24小时。若平板上无菌落生长、或生长得菌落与表1所列得菌落形态特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌。
落与表1所列菌落形态特征相符或疑似者，应挑取可疑菌落进行分离、纯化、染色镜检与IMViC试验，确认大肠埃希菌。
为了规范操作，以下就是对药典要求得补充。
4、8、4、纯培养如EMB或麦康凯琼脂平板上生长得菌落与表1所列特征相符或疑似者，以接种针轻轻接触单个疑似菌落得表面中心，沾取培养物，应挑选2～3个以上疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面，培养18～24h，作以下检查。
如平板上无单个可疑菌落，但有可疑菌团（紫黑色，或有金属光泽），应沾取可疑菌团培养物少许，或重新取增菌培养液分区划线接种于EMB琼脂平板，培养18～24h，再挑选单个疑似菌落，纯培养，作以下检查。
4、8、
5、革兰染色、镜检
4、8、
5、1、以接种环沾取无菌水于洁净载玻片上，取上述疑似菌落得营养琼脂斜面新鲜培养物少许，制成均匀涂片，自然或微温干燥，再通过火焰2～3次(载玻片烫手)固定。
4、8、
5、2、滴加结晶紫染液，染色1分钟，水洗。
4、8、
5、3、滴加碘液，媒染1分钟，水洗，以滤纸吸干余水。
4、8、
5、4、滴加95％乙醇，脱色20～30秒钟，水洗。
4、8、
5、5、滴加沙黄染液，复染1分钟，待干后，镜检。
4、8、
5、
6、染色结果革兰阳性菌呈蓝紫色；革兰氏阴性呈红色。大肠埃希菌为革兰阴性短埃希菌，或球埃希菌状，亦有埃希菌状。
4、8、
5、7、注意事项
（1）玻片必须洁净，无划痕。涂片得菌量宜少，菌不可浓。否则，菌细胞成堆或连成片。不利菌细胞染色反应判断及形态观察。
（2）培养物得菌龄以16～24小时为宜。培养时间过长，革兰阳性菌易染成红色。（3）脱色就是关键。脱色时间不足，菌细胞易染成阳性；脱色时间过长，菌细胞易染成阴性。
（4）可用已知革兰染色为阳性、阴性得菌种做染色得质量控制。
4、9、生化试验
4、9、1、乳糖发酵试验取上述斜面培养物，接种于乳糖发酵管，培养24～48h，观察产酸（指示剂为酸性品红者为红色；指示剂为溴麝香草酚蓝者为黄色），产气（小倒管内有气泡，气泡无论大小）。
为避免迟缓发酵乳糖产生假阴性，亦可接中5%乳糖发酵管。绝大多数迟缓发酵乳糖得细菌，可于24h出现阳性。或适当延长培养时间。
4、9、2、靛基质试验(Ⅰ) 取上述斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基，培养24～48小时，沿管壁加入靛基质试液数滴，轻轻摇动试管，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。98％得大肠埃希菌靛基质试验为阳性，一般24小时即可出现阳性结果。常以无菌操作先从管中取出1或2ml培养液进行检查，如靛基质阴性，余下得蛋白胨水培养物再培养24小时，作靛基质试验。
4、9、3、甲基红试验(M) 取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48±2小时，于培养液中加入甲基红指示液2～3数滴(约每ml培养液加指示液1滴)，轻微摇动，立即观察，呈鲜红色或橘红色为阳性，呈黄色为阴性。
4、9、4、乙酰甲基甲醇生成试验(V-P) 取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48±2小时，于每2ml培养液中加入α-萘酚乙醇试液1ml，混匀，再加40％氢氧化钾溶液0、4ml，充分振摇，在4小时(通常在30
分钟)内出现红色判为阳性，无红色反应为阴性。
4、9、
5、枸橼酸盐利用试验(C) 取上述斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基斜面上，培养2～4天，培养基斜面有菌苔生长，培养基由绿色变为蓝色时为阳性，培养基颜色无改变，无菌苔生长为阴性。
4、10、结果判定
4、10、1、当阴性对照试验呈阴性，阳性对照试验MUG呈阳性、靛基质阳性，供试品MUG阳性、靛基质阳性，报告1g或1ml供试品检出大肠埃希菌；MUG阴性、靛基质阴性，报告1g或1ml供试品未检出大肠埃希菌。
4、10、2、 MUG阳性、靛基质阴性、IMViC试验为－＋――、革兰阴性埃希菌，报告1g或1ml供试品检出大肠埃希菌；MUG阴性、靛基质阳性、IMViC试验为＋＋――、革兰阴性埃希菌，报告1g或1ml供试品检出大肠埃希菌。
4、10、3、供试品培养物检查不符合4、10、2中得任一项，报告1g或1ml
供试品未检出大肠埃希菌。
4、10、4、当阴性对照有菌生长或阳性对照未生长或生长但非大肠埃希菌，不能做出检验报告。
4、11、注意事项
4、11、1、 MUG法不必从混合菌中分离单个菌落。除大肠埃希菌外，尚有部分志贺菌属、沙门菌属得菌株；以及少数革兰阳性球菌、埃希菌与芽孢菌，其MUG 为阳性。因此，在MUG培养基成分中增加了去氧胆酸钠得量，可排除革兰阳性菌得干扰。至于志贺菌、沙门菌在胆盐乳糖培养基中较难生长，即使有生长，本法能检出亦判为不合格。
4、11、2、配制MUG培养基时，务必校正pH值，灭菌后pH不得过7、4，否则pH值偏高，MUG分解，本身则显荧光；分装MUG培养基得试管应挑选，试管、
蛋白胨不得显荧光。
4、11、3、培养时间供试品培养液接种于MUG培养基中，一般培养5h与24h 要观察就是否产生荧光，如荧光很微弱，不能准确判断时，可延长培养至48h
再观察结果。由于大肠埃希菌各菌株间得GUD得活性不完全相同，对底物与底物得浓度反应得差异；培养基中选择因子得影响；培养时间、温度；pH得改变；大量竞争菌与样品本身物质成分得干扰等，对结果得判断亦有影响。
4、11、4、结果观察取供试品得MUG试验管、阳性对照管、阴性对照管同时在366nm紫外灯下观察，阳性对照管应有较强得蓝白色荧光，阴性对照管无荧光。供试品MUG管就是否有荧光，应仔细观察比较，或将各管调换位置(阴性管居中)，适当倾斜试管。如阳性对照管荧光强烈，影响供试品管与阴性对照管得观察时，亦可移去阳性对照管。
4、11、
5、药品中污染得大肠埃希菌，易受生产工艺及药物得影响。在曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂平板上得菌落形态特征时有变化，挑取可疑菌落往往凭经验，主观性较大，务必挑选2～3个菌落分别做IMViC试验鉴别，挑选菌落越多，检出阳性菌得机率越高，如仅挑选一个菌落做IMViC试验鉴别，则易漏检。
4、11、6、在IMVIC试验中，以灭菌接种针沾取菌苔，首先接种于枸橼酸盐琼脂斜面上，然后接种于蛋白胨水培养基、磷酸盐葡萄糖胨水培养基中。切勿将培养基带入枸橼酸盐琼脂斜面上，以免产生假阳性结果。
4、11、7、枸橼酸盐利用试验培养时间，原订为2天，根据试验资料，发现培养3天后，枸橼酸盐利用试验产生阳性。仅培养2天不够得，故试验培养时间改为2～4天。
4、11、8、以IMViC试验来判断大肠埃希菌属中得大肠埃希菌就是含混得，有可能把埃希菌属得其她种判为大肠埃希菌。IMViC试验为＋＋――者，除大肠埃希菌外，还有非活跃大肠埃希菌、弗格森埃希菌、赫尔曼埃希菌。IMViC试验为－＋――者，除大肠埃希菌外，还有非活跃大肠埃希菌、伤口埃希菌、蟑螂埃希菌。
4、11、9、在各类供试品中检测大肠埃希菌及其她控制菌，按一次检出结果为准，不再抽样复验。检出得大肠埃希菌及其她控制菌培养物须保留一个月，备查。
生化试验也可采用商品化得自动分析仪器进行、仪器可以给出菌种得鉴定结果，做相应报告。
GB4789.38-2012卫生部标准大肠埃希菌检验方法
前言 本标准代替GB/T 4789.38-2008 《食品卫生微生物学检验大肠杆菌计数》。 本标准与GB/T 4789.38-2008 相比，主要变化如下： ——修改了标准的中文名称； ——修改了培养基和试剂； ——将“第二法大肠杆菌VRB-MUG 平板计数法”改为“大肠埃希氏菌平板计数法（第二法）”；——删除了“第三法大肠杆菌Petrifilm TM 测试片计数法”； ——修改了附录A。 GB 4789.38-2012 1 食品安全国家标准 食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数 1 范围 本标准规定了食品中大肠埃希氏菌（Escherichia coli）计数的方法。 本标准适用于食品中大肠埃希氏菌的计数，其中大肠埃希氏菌平板计数法（第二法）不适用于贝类产 品。 2 术语和定义 2.1 大肠埃希氏菌Escherichia coli 大肠杆菌 广泛存在于人和温血动物的肠道中，能够在44.5℃发酵乳糖产酸产气，IMViC（靛基质、甲基红、VP 试验、柠檬酸盐）生化试验为＋＋－－或－＋－－的革兰氏阴性杆菌。以此作为粪便污染指标来评价食品 的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性。 2.2 最可能数 基于泊松分布的一种间接计数方法，简称为MPN。 3 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： a）恒温培养箱：36 ℃±1 ℃； b）冰箱：2 ℃～5 ℃； c）恒温水浴箱：44.5 ℃±0.2 ℃； d）天平：感量为0.1 g； c）均质器； d）振荡器； e）无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头；f）无菌锥形瓶：容量500 mL； g）无菌培养皿：直径90 mm； h） pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸； i）菌落计数器； j）紫外灯：波长360 nm～366 nm，功率≤6 W。
大肠埃希菌
大肠埃希菌 1.概况：大肠埃希菌是肠道中重要的正常菌群，婴儿出生数小时后就进入肠道中并终生伴随，能为宿主提供一些营养作用的合成代谢产物，宿主免疫能力下降或细菌侵入肠道外组织或器官，即可成为条件致病菌，引起肠外感染，以化脓性感染和泌尿道感染最为常见，某些血清型大肠埃希菌具有致病性，能导致人类腹泻。 2.形态：中等大小的革兰阴性杆菌无芽孢，多数菌株有周身鞭毛，能运动；有菌毛包括普通菌毛和性菌毛 3.体内分布：大肠杆菌在人和动物的肠道内，大多数于正常条件下是不致病的共栖菌，在特定条件下（如侵入肠外组织或器官）可致病。但少数大肠杆菌与人和动物的大肠杆菌病密切相关，它们是病原性大肠杆菌，正常情况下极少存在于健康机体。 4.培养：兼性厌氧菌，营养要求不高，在普通的琼脂平板37℃培养24小时后，埃希菌形成圆形凸起灰白色S型菌落。在液体培养基中均匀浑浊的生长。 5.生化反应：能发酵葡萄糖等多种糖类，产酸并产气，绝大多数菌株能发酵乳糖，可与沙门菌，志贺菌等区别。吲哚、甲基红、V-P、枸橼酸盐试验（IMViC试验）为++--，IMViC试验为此结果，可判断为典型的大肠埃希菌，表明被检物已被粪便污染，有传播肠道传染病的危险 6.抗原构造：大肠杆菌抗原主要有O、K和H三种，已确定的大肠杆菌菌体（O）抗原有173种，表面（K）抗原有80种，鞭毛（H）抗原有56种。O抗原凝聚相对较慢，呈颗粒状。H抗原刺激机体主要产生IgG类抗体，H抗原的凝集出现
较快，呈絮状。K抗原位于O抗原外层，为多糖，与细菌侵袭力有关。 7.生物学特性：本属细菌对干燥、腐败、日光等因素具有一定的抵抗力，在外界条件下可以生存数周或数月。对化学消毒剂的抵抗力不强，一般常用消毒剂和消毒方法均能达到消毒目的。通常情况下，对多种抗菌药物敏感。但由于长期滥用抗生素，对常用抗生素耐药现象普遍，不仅影响该病防制效果，而且亦成为公共卫生关注的问题。 8.致病物质 定植因子：又称黏附素（adhesin），可与黏膜表面细胞的特异性受体相结合而定植于黏膜，这是大肠杆菌引起的大多数疾病的先决条件。 外毒素：大肠杆菌可产生外毒素，最为人所知的是ETEC产生的由质粒编码的不耐热肠毒素（LT）和耐热肠毒素（ST）。LT有抗原性，分子量大，65℃经30min 即被灭活，可激活肠毛细血管上皮细胞的腺苷环化酶，增加环腺苷酸（cAMP）产生，使肠黏膜细胞分泌亢进，发生腹泻和脱水；ST无抗原性，分子量小，100℃加热30min而不失活，可激活回肠上皮细胞刷状缘绒毛上的颗粒性的鸟苷环化酶，增加环鸟苷酸（cGMP）产生，同样引起分泌性腹泻。 K抗原：具有吞噬作用 9.肠道外感染： 败血症：由大肠埃希菌尿道和肠道感染引起的。 新生儿脑膜炎：大肠埃希菌和B组链球菌是婴儿中枢神经系统感染的主要致病菌，约75%大肠埃希菌新生儿脑膜炎分离株具有K1荚膜抗原
微生物检验实验室致病性大肠埃希菌标准操作规程
微生物检验实验室致病性大肠埃希菌标准操作规程 1. 概述 致病性大肠埃希菌包括肠产毒型大肠埃希菌、肠致病型大肠埃希菌、肠侵袭型大肠埃希菌、肠出血型大肠埃希菌和肠凝聚型大肠埃希菌5群。与普通大肠埃希菌的生化反应相似，应结合血清反应（O、H和K抗原）、毒性试验（ST和LT肠毒素）和临床症状，分别鉴定5型致病性大肠埃希菌。 2. 标本类型 粪便标本。 3. 鉴定 3.1 形态染色与一般大肠埃希菌相同。 3.2 培养特性在麦康凯琼脂平板上形成不透明、粉红色或无色菌落。 3.3 生化反应与普通大肠埃希菌相似。 3.4 鉴别要点在山梨醇麦康凯琼脂平板上形成无色菌落。IMViC++--， 3.5 不发酵或迟发酵山梨醇，为本菌的主要特征。 3.6 操作步骤 3.6.1 氧化酶试验参见氧化酶试验标准操作规程。 3.6.2 致病型大肠埃希菌的鉴定 肠致病型大肠埃希菌（EPEC）婴幼儿水样或蛋花汤样便，鉴定为大肠埃希菌后用EPEC分型血清作O:H分型。
肠产毒型大肠埃希菌（ETEC）水样便，鉴定为大肠埃希菌后需要测定ST和LT两种肠毒素及血清分型。ST的检查可用兔肠段结扎试验，免疫学或分子生物学方法（DNA 探针）检测。 肠侵袭型大肠埃希菌（EIEC）细菌性痢疾样便，生化特性与志贺菌相似，不发酵或迟发酵乳糖，赖氨酸脱羧酶阴性，无动力，符合EIECO:H血清分型，豚鼠眼结膜试验、HELA细胞侵入试验阳性。 肠出血型大肠埃希菌(EHEC) 早期为水样便后为血便，有50多个血清型，最具代表性的是O157：H7不发酵或迟发酵山梨醇，在山梨醇麦康凯琼脂平板上形成无色菌落，可用EHECO:H诊断血清进行分型。 4. 药敏 参见药物敏感性试验标准操作规程及CLSI M100-S20最新版本文件。 5. 质量控制 参见质量管理程序。 6. 检验结果解释与分析 疑似致病性大肠埃希菌感染，分离菌应先鉴定为大肠埃希菌，再通过不同的方法鉴定到种型，如分离到上述4种腹泻病原菌，应立即向临床发出报告。 7. 临床意义
尿路感染大肠埃希菌耐药分析
尿路感染大肠埃希菌耐药分析
尿路感染大肠埃希菌耐药分析 闫雳 ［作者单位］安徽省萧县人民医院检验科，235200 ［摘要］目的：探讨尿路感染中大肠埃希菌的耐药性变迁，为临床合理用药提供试验依据。方法：对2008~2010年度尿标本检出的234份大肠埃希菌进行超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）检测和药敏试验，并对药敏结果进行分析。结果：大肠埃希菌的产酶率呈增高趋势；药敏结果显示大肠埃希菌除对亚胺培南耐药率为0外，对其他常用抗菌药物均出现了不同程度的耐药性，且ESBLS(+)的细菌耐药率普遍高于ESBLs(-)细菌。结论：尿路感染的大肠埃希菌耐药现象严重，尤其是ESBLs(+)株，要不断加强耐药性检测，为临床合理用药提供参考。 ［关键词］尿路感染；大肠埃希菌；药敏试验；超广谱β-内酰胺酶 [中图分类号]R446.5 R378.2.1 [文献标识码] A The analysis of drug resistance of Escherichia coli in urinary tract infections Yan Li (Department of Clinical Laboratory,Xiaoxian People's Hospital,Xiaoxian Anhui 235200,China) \ [Abstract]Objective:To exploring the resistance changes of the Escherichia coli (E.coli) in urinary tract infection, and provid proofs about the reasonable use of drugs in clinic.Methods：Two hundred and thirty –foue strains of E.coli in 2008 to 2010 annual urine specimen with extended-spectrum β -lactamase (ESBLs) detection and drug susceptibility test,were detected,,and the drug susceptibility results were analyzed..Results:the rate of enzy production of E.coli showed a rising trend;the drug sensitivity test shows that the resistance exists in normal antibiotics was in different dgrees expect for Imipenem,,and the rate of medical resisitance in ESBLs(+) bacteria was higher than in ESBLs(-).Conclusions:The resistant of urinary tract infection which caused by E. coli. especially in ESBLs (+) strains, is so serious. It should be strengthen in the detections of the medical resistance ,which provide the references for the clinicl rational drug use. [Keywords] urinary tract infection; Escherichia coli; susceptibility test; extended-spectrum β-lactamase;
大肠埃希菌的检查
药品中大肠埃希菌的检验 (1)按细菌总数测定方法制备供试液。 (2)取供试品l：10稀释液10mL，接种在制好的100mL胆盐乳糖培养基中,在37℃恒温箱中培养18～24 h，进行增菌培养。 (3)用接种环挑取上述培养物接种在麦康凯琼脂平板(MacC)或伊红美蓝琼脂平板(EMB)上，置37℃培养18～24 h，进行分离培养。观察有无鲜桃红色或微红色、中心深桃红色、圆形、扁平、边缘整齐、表面光滑、湿润的菌落形成。 (4)挑取2～3个疑似大肠埃希菌菌落，分别接种在营养琼脂斜面培养基上，在37℃下培养18～24 h，进行纯培养。 (5)将疑似大肠杆菌的培养物涂片进行革兰染色，经镜检证明为G－无芽孢短杆菌的，应继续做生化试验。 (6)生化试验 ①乳糖发酵试验。将上述纯培养物接种在乳糖发酵管中，在37℃下培养24～ 48 h。凡大肠埃希菌，可发酵乳糖产酸产气。 ②靛基质试验。将上述纯培养物接种在蛋白胨水培养基中，在37℃下培养(48±2)h．加入0 .3～0 .5 mL靛基质试液(对二甲基氨基苯甲醛)，观察液面。液面呈玫瑰红色为阳性反应，呈试剂本色为阴性反应。 ③甲基红试验将纯培养物接种在磷酸盐葡萄糖胨水培养基内，在37℃下培养(48±2)h，在1 rnL培养液中加入l滴甲基红试剂，立即观察结果。呈鲜红色或橘红色为阳性反应。呈黄色为阴性反应。 ④乙酰甲基甲醇生成试验(VP试验)。将纯培养物接种在磷酸盐葡萄糖胨水培养基内，在37℃下培养(48±2)h，在2mL培养液中加入α一萘酚乙醇液1 mL_，混匀，再加入质量分数为40％的氢氧化钾溶液0.4mL后观察结果。培养液应在加入试剂后的4 h内呈红色为阳性反应，无红色为阴性反应。 ⑤枸橼酸盐利用试验。将纯培养物接种在枸橼酸盐斜面培养基上,在37℃下培养(48±2)h,观察结果。斜面有菌生长，培养基由绿色变为蓝色为阳性反应，斜面无菌生长培养基仍呈绿色为阴性反应。 (7)判断结果。经染色镜检证实为G–无芽孢短杆菌，乳糖发酵试验产酸产气，IMVC试验结果为++––或–+––的，可确认供试品中含有大肠埃希菌。
大肠埃希菌检查(新)
实训一大肠埃希菌的检查 一、实训目标 1．熟悉药品中大肠埃希菌的检验原理。。 2．掌握由口服药品中分离鉴定大肠埃希菌的程序及步骤。 3．学会分析检验结果，识别大肠埃希菌的特征。 4．掌握检验数据的处理，能够规范书写检验原始记录及检验报告书。 二、实训原理 大肠埃希菌是肠道中存在的正常菌群，故常来源于人和动物的粪便，所以常作为粪便污染的指标。一旦被检药物中查出大肠埃希菌，表明该药品已被粪便污染，可能存在肠道致病菌和寄生虫卵，患者服用该药物后有引起感染的危险。因此，大肠埃希菌被列为重要的卫生指标菌。国家药品卫生标准规定口服药品不得检出大肠埃希菌。 中国药典采用了MUG－Indole快速测定药品中大肠埃希菌。 在MUG试验中，将MUG（4-甲基伞形酮葡糖苷酸）作为目标菌的基本营养物加入培养基中，被大肠埃希菌的β-葡萄糖醛酸酶直接分解产物又作为一种指示系统，在366 nm紫外光下呈现兰白色荧光，即MUG阳性；若无荧光，即MUG阴性。 靛基质（Indole）试验中，大肠埃希菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。 因此根据大肠埃希菌的这一性质，对MUG呈阳性者，再加对-甲氨基苯甲醛试剂数滴，轻摇试管，培养液上层呈现玫瑰红色者(阳性)，报告检出大肠埃希菌。如果两者都为阴性，报告未检出大肠埃希菌。如果一阴一阳，需要进一步的培养和生化试验检查。 本方法对大肠埃希菌的检出率达98％。 培养温度：控制菌培养温度为30～35℃。 三、实训步骤 （一）实训用设备、仪器与试药的准备 100ml量筒、10ml吸量管、500ml烧杯、250ml锥形瓶、150ml锥形瓶、玻棒、大试管、6cm培养皿、吸耳球、小试管、1ml吸量管 乳糖胆盐培养基、MUG培养基、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、蛋白胨、1.0mol/l HCl溶液、1.0mol/lNaOH溶液、EMB、对二甲氨基苯甲醛、戊醇、盐酸 稀释液与培养基的配制 1）PH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液（200ml/2组） 磷酸二氢钾 0.7g 磷酸氢二钠 1.5g 氯化钠 0.9g 蛋白胨 0.2g 蒸馏水 200ml 配制：取上述成分混合，溶解，分装锥形瓶2个（用150ml锥形瓶），约90ml/个，包扎，标记，121。，15min灭菌。 乳糖胆盐培养基（400ml/2组） 2)乳糖胆盐培养基 12g 蒸馏水 400 ml PH=7.6 配制：称取，溶解，调节PH值，分装锥形瓶4个（用250ml锥形瓶），约100ml/个，包扎，标记，115。，15min灭菌
大肠埃希菌检查法.docx
大肠埃希菌检查法 ESCheriChia COliTeSt MethOd 1. 目的 建立大肠埃希菌检查法的标准操作程序。 2. 范围 适用于大肠埃希菌检查的操作。 3. 责任者 QC化验员。 4. 程序： 4.1. 简述 4.1.1. 大肠埃希菌(ESCheriChia coli)即大肠埃希菌，为肠埃希菌科埃希菌属 的模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发现有非脱羧埃希氏菌等5个种。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。在药品中检出大肠 埃希菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。大 肠埃希菌除普通大肠埃希菌外尚有致病性大肠埃希菌，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。为保证人体健康，口服药品必须检查大肠埃希菌。 4.1.2. 用4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-MethylumbelliferyI- β -D-glucuronide , MUG和靛基质(Indole)试验检查大肠埃希菌是一项新技术，其检验步骤为：增菌培养后，转种MUG蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如MUG Indole试验为阳性或阴性即可报告结果。 4.1.3. 原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反应 作为指示系统来鉴定目标菌。 实验证明，96%的大肠埃希菌含β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase ，GUD) 约10%的沙门菌属一些菌种也含有此酶。MUGS GUD水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG鉴定大肠埃希菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。单一的MUG鉴别大肠埃希菌其漏检率达6%,鉴于98%的大肠埃希菌其靛基质试验为阳性，故将MUGf靛基质试验结合，比单用MU可提高大肠埃希菌的检出率。如MUGf Indole 试验的反应不一致时，则需将供试液的增菌培养物用EMB琼脂平板分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别。该法理论上可使大肠埃希菌的检出率达98%。 如仅用IMViC生化试验来鉴别大肠埃希菌属中的大肠埃希菌，其结果是含混的。 4.2. 仪器、设备及用具 4.2.1. 无菌室 4.2.2. 净化工作台 4.2.3. 培养箱(36 ± 1C ) 4.2.4. 高压蒸汽灭菌器 4.2. 5. 显微镜(1500X)
肠侵袭性大肠埃希杆菌感染
疾病名：肠侵袭性大肠埃希杆菌感染 英文名：enteroinvasive escherichia coli infection 缩写： 别名：enteroinvasive escherichia coli enteritis；肠侵袭性埃希大肠杆菌感染；肠侵袭性埃希氏大肠杆菌感染；侵袭性大肠杆菌肠炎 ICD号：A48.8 分类：感染内科 概述：肠侵袭性大肠埃希杆菌(enteroinvasive E.coli，EIEC)首先于1967年日本报告自患痢疾样腹泻的大儿童和成人中发现，常误为菌痢。 流行病学：主要在大儿童及成人中致病。新生儿对此菌易感性差。至今未有在小婴儿中暴发的报道。曾有在学校、部队、社团及医院内流行的情况，但较多为散发病例。 病因：由EIEC引起的肠道传染病。EIEC是1967年从“痢疾”病人大便中分离获得的一组致腹泻大肠埃希杆菌。EIEC与志贺菌有类似的生化特性，无动力，对乳糖不发酵或发酵缓慢，有共同抗原，均为侵袭性致病菌，也称痢疾样大肠埃希杆菌，可侵入上皮细胞，并在其中生长繁殖，引起炎性反应。要注意对两者进行鉴别，鉴别培养基有枸橼酸盐培养基、醋酸钠培养基。常见之O血清型有：O28、O29、O32、O112、O124、 O136、O143、O144、O152、O164、O167等。EIEC不产生肠毒素，主要侵犯结肠，形成肠壁溃疡。致病毒力强，只要10～100个细菌即可发病。污染水和食物可引起暴发流行，也可因接触传播，形成散发病例。成人、儿童均可发病。 发病机制：EIEC侵袭肠黏膜上皮细胞，细菌死亡后释放出内毒素，破坏细胞形成炎症和溃疡，引起腹泻。临床较少见，主要侵犯较年长儿童和成人。临床表现类似菌痢。
控制菌(大肠埃希菌)检查操作规程
控制菌（大肠埃希菌）检查操作规程 1.目的 建立一个控制菌大肠埃希菌控制菌大肠埃希菌检查标准工作程序，规范QC控制菌大肠埃希菌检查人员的控制菌大肠埃希菌检查的操作。 2.范围 适用于本公司的口服制剂完成内包后外包前的中间体和局部给药制剂产品的内包装材料的控制菌大肠埃希菌的检测。 3.责任者 QC控制菌大肠埃希菌检查人员；质量管理部 4.内容 4.1检测准备 4.1.1 QC人员接到控制菌大肠埃希菌检查的《工作进程计划单》后，核对《取样指令》，确定控制菌大肠埃希菌检查所需容器具、试液、培养基等项目和数量，执行微生物检查准备工作操作程序和培养基配制操作规程，进行控制菌大肠埃希菌检查前的准备工作。 4.1.2 为了保证被检品在取样后规定的时间内完成检验，取样前应准备好检验需要的各种器皿（清洗→干燥→包裹）、培养基和稀释剂等（配制→分装→包裹），并灭菌备用。 4.2 供试液的制备 4.2.1 供试液供试液是指按照供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法将供试品制成供试验用的均匀液体。 4.2.2 供试液的制备根据供试品的理化特性与生物需特性，采取适宜的方法制备供试液。如果使用了乳化剂、分散剂、中和剂和灭活剂，其用量应证明是有效的，并对微生物的生长和存活无影响性。 4.2.2.1 可溶性液体供试品
取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为供试液。可溶性液体制剂可用混合的供试品原液作为供试液。 4.2.2.2 非水溶性液体供试品 油剂可先加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀，然后再加0.9%无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100m，混匀，作为供试液。 4.2.2.3 水溶性固体、半固体或黏稠性供试品 称取供试品10g，置PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml中，用匀浆仪或其他适宜方法，混匀，作为1：10供试液。必要时可加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。 4.2.2.4 非水溶性供试品 取供试品5g(5m1)，加入含溶化的（温度不超过45℃）5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使其充分乳化，作为1:20供试液。 4.2.2.5肠溶及结肠溶制剂供试品 取供试品10 g，加PH6.8无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂）或PH7.6无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂）至100ml，置45℃水浴中，振摇，使溶解，作为1:10的供试液。 4.2.2.7具抑菌成分供试品 当供试品抑菌活性时，应消除供试液的抑菌活性后，再依法检查，一般使用培养基稀释法，取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少，至不含抑菌作用。取低稀释级供试液（原液或1:10的供试液）2份，每份各1ml，分别注入5个或5个以上平皿中（每皿0.2ml或<0.2ml），每个平皿倾注培养基约15ml，混匀，凝固后，倒置培养，按每1ml分注的平皿点计菌落数之和计数，即为每1ml的菌落数，共得2组数据，再以2组数的平均数乘以稀释倍数的值报告菌数。 4.2.2.8 供试液的制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃，时间为30min。
大肠埃希菌检查法
大肠埃希菌检查法 Escherichia Coli Test Method 1.目的 建立大肠埃希菌检查法的标准操作程序。 2.范围 适用于大肠埃希菌检查的操作。 3.责任者 QC 化验员。 4.程序： 4.1.简述 4.1.1.大肠埃希菌(Escherichia coli)即大肠埃希菌，为肠埃希菌科埃希菌属的模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发现有非脱羧埃希氏菌等 5个种。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。在药品中检出大肠埃希菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。大肠埃希菌除普通大肠埃希菌外尚有致病性大肠埃希菌，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。为保证人体健康，口服药品必须检查大肠埃希菌。 4.1.2.用 4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-Methylumbelliferyl-β -D-glucuronide，MUG)和靛基质(Indole)试验检查大肠埃希菌是一项新技术，其检验步骤为：增菌培养后，转种 MUG-蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如 MUG、Indole试验为阳性或阴性即可报告结果。 4.1.3.原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反应作为指示系统来鉴定目标菌。 实验证明，96％的大肠埃希菌含β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase，GUD)，约 10 ％的沙门菌属一些菌种也含有此酶。MUG 被 GUD 水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG 鉴定大肠埃希菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。单一的MUG 鉴别大肠埃希菌其漏检率达 6％，鉴于98％的大肠埃希菌其靛基质试验为阳性，故将MUG与靛基质试验结合，比单用MUG可提高大肠埃希菌的检出率。如MUG与Indole 试验的反应不一致时，则需将供试液的增菌培养物用 EMB琼脂平板分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别。该法理论上可使大肠埃希菌的检出率达98％。如仅用 IMViC生化试验来鉴别大肠埃希菌属中的大肠埃希菌，其结果是含混的。 4.2.仪器、设备及用具 4.2.1.无菌室 4.2.2.净化工作台 4.2.3.培养箱(36±1℃) 4.2.4.高压蒸汽灭菌器
大肠埃希菌
肠出血型大肠埃希菌 新华网： 两周来在德国蔓延的肠出血性大肠杆菌(EHEC)感染29日和30日又夺去3名重症患者的生命，在此次疫情中已有13人因感染EHEC不治身亡。与此同时，德国医师协会告诫民众不必过于恐慌，只要采取必要的防范措施，这一来势汹汹的病魔还是“可控的”。 据德国媒体报道，新死亡病例中的两例发生在德西部的北威州，两名死者均为女性，其中一名91岁，另一名是中年妇女。这是德国北部以外地区首次报告EHEC死亡病例。此外，德北部的梅前州30日也报告了该州首例EHEC死亡病例，死者是一名87岁老妇。 此前的死亡病例分别发生在德国北部的石荷州、汉堡、不来梅和下萨克森，其中绝大多数是女性患者。德国各地报告的EHEC确诊或疑似病例总数目前已超过1400例。据德国负责流行病预防研究的权威机构罗伯特·科赫研究所30日最新统计，EHEC所造成的溶血性尿毒综合征重症患者已达329人。在正常情况下，德国每年最多会发现约60个溶血性尿毒综合征病例。 另据本次EHEC感染病例最多的汉堡市埃彭多夫大学医院30日报告，汉堡市周末接治的EHEC病例及溶血性尿毒综合征重症病例较前几天均明显减少。当地卫生官员希望这是EHEC感染已过高峰的一个迹象。 这家医院的负责人说，目前该院接治的EHEC病例中有25%至30%出现溶血性尿毒综合征并发症，发展到这一严重综合征的平均时间是出现腹泻症状后的5至7天，其中有三分之一的重症患者已丧失肾功能，必须接受透析治疗。重症患者中还有超过一半的人表现出神经系统紊乱症状，焦躁不安，有语言障碍或出现癫痫病般的抽搐。 由于EHEC病菌对很多抗生素具有抗药性，而且使用抗生素有时反而会使病菌产生更大的毒性，目前德国一些医院除对重症患者施用“血浆析离”这一标准疗法外，已开始小范围试用注射单克隆抗体“Eculizumab”的新疗法。汉诺威医学院30日报告说，该院自25日开始对一些肾衰竭的溶血性尿毒综合征患者施用这种新疗法，近日已取得初步成效，但比较准确地判定新疗法的有效性还需几周时间。 在当前EHEC传染源仍未最终确定的情况下，罗伯特·科赫研究所30日再次告诫民众不要生吃黄瓜、西红柿和通常用来做色拉的生菜等带叶蔬菜。德国消费者保护部长艾格纳也指出，在专家尚未就传染源下定论的情况下，人们还是应该警惕生吃上述蔬菜。 德国医师协会副主会长蒙哥马利30日对此间媒体说，尽管EHEC病菌来势汹汹，但人们不必过于惊慌。只要消费者严格执行防疫部门推荐的防范措施，特别是勤洗手和不生吃可疑蔬菜，病菌传播还是可以得到控制的。 还有专家指出，相对于非典和甲型流感等飞沫传染的疾病，EHEC病菌主要通过食物和染病人畜的排泄物传播，因此人们只要严格注意个人、食品和餐具的卫生，避免病从口入，就能有效防范EHEC病菌。 罗伯特·科赫研究所所长布格尔则对媒体说，仅清洗蔬菜还不足以提供保护，为消灭病菌，加热消毒是更好的办法，为此蔬菜有必要在超过70摄氏度的温度条件下炖2至10分钟。
大肠埃希菌检查用培养基适用性检查验证方案汇总
1.概述:培养基是微生物试验的基础，直接影响微生物试验结果。适宜的培养基制备方法、贮藏条件和质量控制是提供优质培养基的保证。供试品微生物限度检查中所使用的培养基应进行适用性检查。 2.验证目的：本次验证的目的是确认大肠埃希菌检查用的麦康凯琼脂培养基、麦康凯液体培养基的质量，以及其制备程序、保存条件等是否满足微生物限度检查用要求。 3.验证依据：《中国药典》2015年版四部“1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法”、“9203药品微生物实验室质量管理指导原则”。 4.验证项目：麦康凯琼脂培养基、麦康凯液体培养基的适用性检查。 5.适用范围：成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。 6.验证周期：除另有规定外，在实验室中，若采用已验证的配制和灭菌程序制备培养基且过程受控，那么同一批脱水培养基的适用性检查试验可以只进行一次。如果培养基的制备过程未经验证，那么每一灭菌批培养基均要进行适用性检查试验。 7.验证小组人员及职责： 7.1验证小组人员: 7.2验证人员职责及要求 7.2.1按验证方案及相关文件实施验证。 7.2.2认真观察并做好验证原始记录。 7.2.3对实施验证的结果负责。 7.3验证中各部门的职责 7.3.1验证领导组职责 7.3.1.1制订验证总计划，负责全公司验证工作的管理。 7.3.1.2确定验证项目及验证项目负责人。
7.3.1.3负责验证方案的批准工作。 7.3.1.4负责验证资料及结果的审核工作。 7.3.1.5负责验证报告的批准工作。 7.3.2验证项目小组职责 7.3.2.1负责验证方案的起草工作。 7.3.2.2参与验证方案的讨论、确认工作。 7.3.2.3负责验证方案的实施。 7.3.2.4负责验证结果的分析、统计、报告工作。 7.3.2.5参与验证结果的评价工作。 7.3.3质量部职责 7.3.3.1负责公司验证日常管理工作。 7.3.3.2负责验证方案的审核工作。 7.3.3.3负责验证过程中仪器、仪表、计量器具的校验工作。 7.3.3.4负责检验仪器及检验方法的验证。 7.3.3.5负责验证中各项检测工作，提供验证的检验记录、检验报告，对验证过程中的各项检验工作负责。 7.3.3.6负责对验证人员的培训、考核工作。 7.3.3.7负责验证资料和报告的审核工作。 7.3.3.8负责验证文件回收、归档管理工作。 8.合格标准： 8.1被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5-2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致； 8.2被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好。 9.验证实施条件
一起侵袭性大肠埃希菌食物中毒调查分析
一起侵袭性大肠埃希菌食物中毒调查分析 目的查明本起群体性食物中毒的原因，为今后预防和控制类似事件提供借鉴。方法根据流行病学调查、临床表现、实验室检验和食物中毒诊断标准进行分析。结果在4份患者肛拭样品及4份剩余食品中检出生物学形状一致的鸭沙门氏菌4株。结论该起事件为侵袭性大肠埃希菌（EIEC O29：K？）污染食物引起的食物中毒。 标签：大肠埃希菌；食物中毒；实验室检验；流行病学调查 2011年7月12日弥勒县巡检司镇发生一起因在饭店举办婚宴引起的食物中毒。根据流行病学调查、患者临床表现、现场卫生学调查，在排除化学性因素后进行实验室微生物检验，证实为一起侵袭性大肠埃希菌引起的食物中毒。现将调查结果报道如下： 1 资料与方法 1.1 一般资料 2011年7月12日，巡检司镇某教师举行婚礼，共宴请298人集体在某饭店就餐。因该饭店较小，接待婚宴后，未接待其他客人。就餐时间从17时开始，晚餐后22时10分出现首例患者，发病87例，发病率29.2%。多数为农民、教师；最大77岁，最小2岁；其中男29例、女58例；发病时间最短2 h，最长23 h。临床表现主要症状为头昏、头痛、发热（最高温度40℃）、畏寒、腹痛、腹泻、粘液便、呕吐、四肢酸痛、全身乏力。 1.2 卫生情况 此饭店为巡检司镇所在地的一个较大私营饭店，食品加工场所卫生条件一般，砧板生、熟无标识，无专用的凉拌冷荤间，使用水源为自备井水。加工间比较狭小，洗菜、洗鱼、洗肉、洗餐具的水池混用，无餐具及容器用具的消毒设施，餐具不经消毒直接使用。盛放生菜、肉的容器用自来水清洗后直接盛放熟菜。该饭店有卫生许可证，但部分临时性工作人员未经过任何食品卫生知识、法规知识培训，未进行健康体检，无健康证明和培训合格证明。 1.3 现场调查方法 首先进行核实诊断结果，明确病例，由卫生人员为就餐发病者逐例填写《食物中毒个案调查表》，收集病例基本情况、就餐情况、发病情况、临床表现以及治疗等；对就餐未发病者逐例进行登记，了解未进食食谱情况，饭店的厨房卫生、饮用水卫生、环境卫生和食品原料采集、采购、储存、加工以及熟食品上桌等情况进行了调查登记，初步判断引起中毒可疑因素。
大肠杆菌检查法
目的：建立大肠杆菌检查法的标准操作程序，规范二大肠杆菌检查法的操作 范围：适用于大肠杆菌检查法 职责：检验科主管、检验员 规程： 1 简述 大肠杆菌即大肠埃希菌（Escherichia coli），为肠杆菌科埃希菌属的模式种，埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发现有非脱羧埃希菌等四个种。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。在药品中检出大肠杆菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体，大肠埃希菌除普通大肠杆菌外尚有致病性大肠杆菌，可引起婴幼儿，成人爆发性腹泻，为保证人体健康，口服药品必须检查大肠杆菌。 用4-甲基伞形酮葡萄苷酸（4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide，即MUG）和靛基质（Indole）试验检查大肠杆菌是一项新技术，其检验步聚为：增菌培养后，转种MUG蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如MUG，Indole试验为阳性或阴性即可报告结果，如MUG与Indole试验不一致时，则需分离培养，革兰染色，镜检及生化试验鉴别。 原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反应作为指示系统来鉴定目标菌。 实验证明96%的大肠杆菌含β－葡萄糖苷酸酶（β-glucuronidase，GUD），约10%的沙门菌属一些菌种也含有此酶。MUG被GUD水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG鉴定大肠杆菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。单一的MUG鉴别大肠杆菌其漏检率达6%，鉴于98%的大肠杆菌靛基质试验为阳性，故将MUG-靛基质试验结合，用EMB琼脂平板分离，辅以IMViC试验，在理论上可使大肠杆菌的检出率达99%。 2 仪器、设备及用具 2.1 无菌室［参照细菌，霉菌(酵母菌)计数2.1.1］。
SOP-QC4-010大肠埃希菌检查SOP
. 分发部门 质量管理部设备部物资部总经理办公室 质量保证室销售部生产部车间 质量控制室
●大肠埃希菌检查SOP 1.目的 建立一个规程，规范大肠埃希菌计数操作方法。 2.范围 本规程适用于xxxxxxxxxx公司质量控制室对水质、碳酸钙成品及其他的微生 物限度检查。 3.职责 QC检测人员负责按照本规程进行样品检测和记录；QC负责人及监管人员有权 对检测过程及结果进行监督检查，有权制止不符合规程的操作并向QA提出重试请求，得到QA批准后方可进行重试。必须开启偏差记录来解决不符合规程的操作。4. 物料和设备 4.1试剂和材料 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液： 取磷酸二氢钾3.56g、无水磷酸氢二钠5.77g、氯化钠4.30g、蛋白胨1.00g，加水1000ml，微温溶解、滤清、分装、灭菌。 胰酪大豆胨液体培养基： 胰酪胨17.0g 氯化钠5.0g 大豆木瓜蛋白酶水解物3.0g 磷酸氢二钾2.5g 以上成分混合加水1000ml，微温溶解，滤过，调节PH使灭菌后在25℃的pH 为7.3±0.2，加入无水葡萄糖2.3g或葡萄糖2.5g，分装，灭菌。20~25℃培养3～5天后无菌生长即可使用。 胰酪大豆胨琼脂培养基： 胨 10.0g 氯化钠5.0g 牛肉浸出粉3.0g 水1000ml 葡萄糖5.Og 除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH为弱碱性，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇勻，滤清，调节pH使灭菌后在25°C的pH值为7.2士0.2，分装，灭菌。 麦康凯液体培养基 明胶胰酶水解物20.0g 溴甲酚紫10mg 乳糖10.0g 水1000ml牛胆盐 5.0g 除乳糖、溴甲酚紫外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH 使灭菌后在25℃的pH值为7.3±0.2，加入乳糖、溴甲酚紫，分装，灭菌。 麦康凯琼脂培养基 明胶胰酶水解物17.0g 中性红30.0mg 胨3.0g 结晶紫1mg 乳糖10.0g 琼脂13.5g 脱氧胆酸钠1.5g 水1000ml氯化钠 5.0g 除乳糖、中性红、结晶紫、琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH 使灭菌后在25℃的pH值为7.1±0.2，加入乳糖、中性红、结晶紫、琼脂，加热煮沸1分钟，并不断振摇，分装，灭菌。 市售成品培养基按说明书配制。 革兰氏染色试剂：有商品供应，含结晶紫染剂、碘液固染剂、酒精脱色剂、复红复染剂。 4.2器材和设备 无菌器皿：吸管、量筒、锥形瓶或盐水瓶等。 其它器材和设备：接种针、酒精灯、玻片、细菌培养箱等。
大肠埃希菌的检测(一类特选)
幻灯片1 大肠埃希菌的检测 错误!未找到引用源。 幻灯片7 甲基伞形酮葡糖苷酸(MUG)培养基 ●胨10.0g 硫酸锰0.5mg ●硫酸锌0.5mg 硫酸镁0.1g ●氯化钠5.0g 氯化钙50.0mg ●磷酸二氢钾0.9g 磷酸氢二钠6.2g ●亚硫酸钠40.0mg 去氧胆酸钠1.0g ●MUG 75mg 水1000mL ●除MUG外，取上述成分，混合。微温溶解，调节PH7.2-7.4，加入MUG，溶解，每 管分装5mL，灭菌。 幻灯片8 实验步骤： ●取供试供试液1mL，直接或处理后接种在制好的100mL胆盐乳糖培养基中,在37℃ 恒温箱中培养18～24 h，进行增菌培养。 ●取上述培养物0.2mL,接种至含5mL MUG培养基的试管内培养，于5小时，24小时在 366nm紫外灯光下观察，同时用未接种的MUG培养基做本底对照。 ●若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性，不呈现荧光，则为MUG阴性。 幻灯片9 ●观察后，沿着培养管的管壁加入数滴靛基质试液，叶面呈玫瑰红色，为靛基质阳性， 呈试剂本色，为靛基质阴性。 ●本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。 ●靛基质实验原理 ●某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲 哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。 ● 幻灯片10 伊红美蓝培养基（EMB培养基） ● 蛋白胨水琼脂培养基100ml，20%乳糖溶液2ml，2%伊红水溶液2ml，0.5%美蓝水溶液1ml，将已灭菌的蛋白胨水琼脂培养基（pH7.6）加热溶化，冷却至60℃左右时，再把已灭菌的乳糖溶液，伊红水溶液及美蓝溶液按上述量以无菌操作加入。摇匀后，立即倒平板。乳糖在高温灭菌易被破坏必须严格控制灭菌温度，115℃灭菌20min。 幻灯片11
SOP-QC4-010大肠埃希菌检查SOP
页眉内容 分发部门 质量管理部设备部 质量保证室车间 质量控制室
●大肠埃希菌检查SOP 1.目的 建立一个规程，规范大肠埃希菌计数操作方法。 2.范围 本规程适用于xxxxxxxxxx公司质量控制室对水质、碳酸钙成品及其他的微生物限度检查。 3.职责 QC检测人员负责按照本规程进行样品检测和记录；QC负责人及监管人员有权对检测过程及结果进行监督检查，有权制止不符合规程的操作并向QA提出重试请求，得到QA批准后方可进行重试。必须开启偏差记录来解决不符合规程的操作。 4. 物料和设备 4.1试剂和材料 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液： 取磷酸二氢钾3.56g、无水磷酸氢二钠5.77g、氯化钠4.30g、蛋白胨1.00g，加水1000ml，微温溶解、滤清、分装、灭菌。 胰酪大豆胨液体培养基： 胰酪胨17.0g 氯化钠5.0g 大豆木瓜蛋白酶水解物3.0g 磷酸氢二钾2.5g 以上成分混合加水1000ml，微温溶解，滤过，调节PH使灭菌后在25℃的pH为7.3±0.2，加入无水葡萄糖2.3g或葡萄糖2.5g，分装，灭菌。20~25℃培养3～5天后无菌生长即可使用。 胰酪大豆胨琼脂培养基： 胨 10.0g 氯化钠5.0g 牛肉浸出粉3.0g 水1000ml 葡萄糖5.Og 除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH为弱碱性，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇勻，滤清，调节pH使灭菌后在25°C的pH值为7.2士0.2，分装，灭菌。 麦康凯液体培养基 明胶胰酶水解物20.0g 溴甲酚紫10mg 乳糖10.0g 水1000ml牛胆盐 5.0g 除乳糖、溴甲酚紫外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH 使灭菌后在25℃的pH值为7.3±0.2，加入乳糖、溴甲酚紫，分装，灭菌。 麦康凯琼脂培养基 明胶胰酶水解物17.0g 中性红30.0mg 胨3.0g 结晶紫1mg 乳糖10.0g 琼脂13.5g 脱氧胆酸钠1.5g 水1000ml氯化钠 5.0g