免疫荧光原理
免疫荧光（Immunofluorescence, IF）原理
免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。
紫外光激发荧光物质放射荧光示意图
免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。
由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。
基本实验步骤：
（1）细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；
对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm，5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
（2）固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3×5 min。
（3）通透。使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min。通透后用PBS洗涤3×5 min。
（4）封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min。
（5）一抗结合。室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min。
（6）二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h。PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。
（7）封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。
（一）细胞准备
用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。贴壁良好的细胞一般在培养时直接放入coverslips让细胞生长在其上即可，尽量避免使用贴壁性能不好的细胞进行免疫荧光实验，以免后续的漂洗操作引起细胞脱落。少数实验需要使用这类细胞或者悬浮细胞进行免疫荧光观察，建议使用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
（二）固定和通透
除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。固定的目的有三：
①防止细胞从玻片上脱落；
②除去防碍抗原-抗体结合的类脂；
③使标本易于保存。
标本的固定原则是：
①不能损伤细胞内的抗原；
②不能凝集蛋白质；
③应保持细胞和亚细胞结构；
④固定后应保持通透性，以保证抗体自由进入所有细胞与亚细胞组分与抗原结合。
常用的固定剂有多种，应根据所研究抗原的性质和所使用的抗体特性选择适当的固定剂。通常固定方法可以分为两类：有机溶剂和交联剂。有机溶剂如甲醇和丙酮等可去除类脂并使细胞脱水，同时将细胞结构蛋白沉淀。交联剂如多聚甲醛通常通过自由氨基酸基团形成分子间桥连，从而产生一种抗原相互连接的网络结构。交联剂比有机溶剂更易于保持细胞的结构，但因为交联阻碍抗体结合，可能会降低一些细胞组分的抗原性，因此需要增加一个通透步骤以使抗体能够进入标本。两种固定方法都可能使蛋白抗原变性，因此使用变性蛋白作为抗原生产的抗体在免疫荧光中可能更为有效。
最常用的固定剂有多聚甲醛和甲醇，少数情况也使用乙醇，丙酮及戊二醛等进行固定。通常，细胞结构抗原、病毒及一些酶类抗原使用丙酮、乙醇及高浓度的甲醛固定可获得较好的结果，而细胞膜相关组分抗原一般以多聚甲醛固定。细胞器和细胞颗粒内的抗原一般也用多聚甲醛固定，并需要进行通透以使抗体能达到抗原表位。
通透步骤只在检测细胞内抗原表位的时候才需要，因为抗体需要进入细胞内部去检测蛋白。但是，如果待检测的是跨膜蛋白，且其抗原表位处于胞质内区域，则同样需要对细胞进行通透。相反，如果所检测的抗原表位位于膜蛋白的胞外段，则不需要进行通透。丙酮本身具有通透作用，因此用丙酮作为固定剂时是不需要通透的。甲醇同样具有通透作用，但有些场合并不适合用甲醇，因为一些表位对甲醇非常敏感。常用的通透剂是去垢剂，如Triton ，NP-40，以及Tween 20, Saponin, Digitonin 和 Leucoperm等。Triton和NP-40属于烈性去垢剂，可部分溶解细胞核膜，因此非常适合核抗原检测。但应该注意的是，如果在高浓度下使用或者作用时间过长，它们将破坏蛋白，从而影响实验结果。Triton X-100是最常用的通透剂，但是它将破坏细胞膜，因此不适用于细胞膜相关抗原。后面一组去垢剂要温和得多，它们可以在细胞质膜上形成足够大的孔隙以允许抗体通过，但是不会溶解细胞质膜。适于胞质抗原或者质膜上靠近胞质一面的抗原，也适于可溶性的核抗原。
一般的操作程序是先固定后通透，但针对有些水不溶性的目的抗原的检测宜先通透再固定，这样做的原因主要是可以通过通透去除许多水溶性的蛋白，从而大大减少了免疫荧光的背景和非特异性信号。固定后以冷PBS液漂洗，最后以蒸馏水冲洗，防止自发性荧光。
（三）封闭
封闭的目的是为了减少抗体的非特异性结合，最常用的封闭剂为1% BSA, PBS pH 7.5，其他可选择的封闭剂还有1% gelatin, 1%bovine 或与二抗种属相同的血清（3-10%）等。
（四）抗体孵育
直接免疫荧光法中的一抗和间接免疫荧光法中的二抗都是荧光抗体，因此在这些抗体孵育的时候必须注意避光。此外，为保证结合质量和防止干燥，抗体孵育应尽量在湿盒中进行。
（五）封片及荧光观察
标记好荧光的细胞片原则上可以直接进行观察，特别是有时候封片不当反而使得前功尽弃。但在绝大多数情况下，为了保存结果，以便进一步观察、照像、统计分析等，需作封片处理。常规的方法是采用甘油或中性树脂封片，为了增强封片的效果，往往需要在封片时添加特殊的抗荧光淬灭剂。
（六）标本保存
由于荧光色素和蛋白质分子的稳定性都是相对的，因此随着保存时间的延长，在各种条件影响下，标记蛋白可能变性解离，失去其应有的亮度和特异性。因此给标本的保存带来一定的困难，所以在标本进行荧光染色之后应立即观察。由于性能良好的抗荧光淬灭剂的出现，荧光标记的标本可以在低温（4℃或-20℃）下保存相当长的时间。在某些情形下，考虑到实验的成本及实验条件，也可以采取权宜的办法，比如固定标本片后低温保存，在需要时再进行荧光标记，即随用随染
免疫细胞(组织)化学实验中如何选择固定剂？
固定剂主要有两类：一类是有机溶剂，如甲醇、乙醇、丙酮等。它们通过强烈脱水变性蛋白，同时它们也能够溶解脂类物质，因此产生通透效应。另一类为交联剂，如甲醛、多聚甲醛、戊二醛等，它们导致细胞内分子相互连接成网状结构，从而维持在原位上。这两类固定剂各有优缺点，交联剂比有机溶剂更易于保持细胞的结构，但交联可能会破坏一些细胞组分的抗原性。同时交联剂固定的细胞需要通透处理，才能让抗体穿越膜结构与胞内抗原结合。醇类固定的优势在于蛋白变性完全，对抗原的保存性好，能充分暴露出抗原。醇类固定的细胞不需要再通透。
在免疫细胞(组织)化学实验中选择哪种固定方法，先要考虑所检测抗原在细胞中的定位，通常膜组分的蛋白需要用多聚甲醛固定。其他蛋白往往凭经验选择固定剂，可以试用两种方法，然后选择较好的一种。
免疫荧光，免疫细胞化学和免疫组织化学实验如何设置对照？
设立对照的目的在于证明和肯定阳性结果的特异性，排除非特异性疑问，同时对照的设立也有助于判断实验中出现的问题。
（1）阴性对照
阴性对照可以了解背景荧光和非特异性染色，当待检标本呈阳性结果时，阴性对照就更加重要，用以排除假阳性。较理想的阴性对照检测遗传背景相同但仅仅不表达所研究抗原的细胞，例如把某个蛋白已敲除的细胞或动物组织样品。但这样的标本不一定存在或很难找到，常见的阴性对照也可以是针对一抗的PBS对照或来自同一种属动物的血清对照。
（2）阳性对照
用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染色，这种阳性对照可验证Protocol，排除实验过程中出现的差错。另一种阳性对照可以是在细胞内过表达所研究的抗原。同时也可以在这个抗原上接上商业化的表达标签，如Flag, Myc, His tag等。
什么是免疫荧光双标记，怎么进行荧光双标实验？
免疫荧光双标记（Double Immunofluorescence）是用两种不同荧光染料标记的抗体同时检测两种抗原。标记这两种抗体的荧光素具有不同的颜色（激发和发射波长不同），通过荧光显微镜可以在同一细胞上分别观察到两种抗原，并可通过图像处理软件将它们同时呈现在一张图片上。
由于在同一个样本使用两种染料，为此就要求每一种检测试剂仅能识别一种抗原。主要有两种方法能够达到这一目的。最确定的方法就是直接标记一抗，如其中一种标记FITC，另一种标记Texas红，一般会有满意的结果。第二种方法是应用两套种属特异性的检测试剂。在进行这类进行荧光双标前，最好先验证单标对特定组织或细胞是有效的。在操作上与单标方法并无不同，但两种一抗必须来源于不同种属的动物，且两种二抗不能存在交叉反应。
应该选择什么样的抗体进行免疫荧光及免疫细胞（组织）化学实验？
如果使用商业化的抗体，在使用之前要仔细阅读公司关于抗体的说明，该抗体是否能用来做免疫荧光或免疫细胞（组织）化学实验。对于自己生产的抗体，在生产抗体时选用的免疫原对获得高质量的试验结果非常重要。
其次，就是单抗和多抗的选择问题。这方面基本上遵循着通用的原则，多抗的优点是来源动物种属多，亲和力高，反应性广，可以识别抗原的多种亚型，缺点是特异性相对较差，有时容易带来假阳性结果，且抗体质量存在批次差异；单抗的最大优点是特异性好，质量稳定，但缺点是动物来源受限（绝大多数是小鼠），灵敏度较低，而且价格较高。单抗对固定的容忍度不如多抗，因为它们识别的位点比较单一，更容易受到破坏。
免疫荧光实验中用于标记抗体的荧光素有哪些，在选择上有什么考虑？
以下列举几种常用的荧光素，更多的荧光素可以从相关网站上找到：
1. FITC（Fluorescein） Excitation 495nm，Emission 525nm，黄绿色荧光；
2. Rhodamine (TRITC) Excitation 552nm，Emission 570nm，橙红色荧光；
3. R-Phycoerythrin (PE) Excitation 488nm，Emission 578nm，橙红色荧光；
4. Texas Red Excitation 596nm，Emission 620nm，红色荧光。
选择荧光素主要考虑以下几点：
①高消光系数（extinction coefficient）和光子产量（Quantum yield），这意味着光捕获能力强和效率高；
②光稳定性较好；
③与常见光源和滤光器匹配性较好；
④不干扰抗体反映；
⑤水溶性以及pH稳定性。此外，还需要考虑到是否有毒性以及荧光素的颜色是否与背景颜色反差大对比鲜明等。
免疫酶标细胞(组织)化学中有哪些显色液，它们的各自特性是什么？
免疫酶标细胞化学中，由于抗原-抗体反应所形成的复合物本身无色，无法直接观察，因而需借助于某些化学基团的呈色作用，使其得以显示，以利于在显微镜下观察。常用的显色液有：
1．DAB（Diaminobenzidine；3，3-二氨基苯联胺）显色液
DAB显色液主要用于免疫过氧化物酶法（如酶标法、PAP法等），是广泛应用的电子供体之一，较敏感，切片可脱水透明，半永久保存，且其终产物具嗜饿性，既可直接在光镜下观察，也可经OsO4处理后，增加反应产物的电子密度，适于电镜下确定抗原存在的部位。但有几点需注意：DAB溶解要完全，否则未溶解的颗粒沉积于标本上影响观察；DAB浓度不易过高，否则显色液呈棕色，增加背景染色，另外DAB有致癌作用，应尽量减少吸入和接触次数，最好将DAB制成10倍贮存液，分装于-20℃保存，应用时稀释、过滤。操作时应戴手套，尽量避免与皮肤接触，用后及时彻底冲洗，接触DAB的实验用品最好经洗液浸泡24h后使用。
2．CN（4-Cl-1-Naphthol，4-氯-1-萘酚）显色液
4-Cl-1-萘酚的终产物显示蓝色。由于酒精可溶解4-Cl-1-萘酚显色的组织标本，勿用酒精脱水。与DAB比较，CN敏感性略差，但因其终产物较局限，很少弥散，光镜观察较为适合。
3．AEC（3-amino-9-ethyl-carbozole, 3-氨基-9-乙基卡唑）显色液
该显色液作用后，阳性部分呈深红色，加以苏木精或亮绿等作为背景染色，则效果更佳。由于终产物溶于酒精和水，故需用甘油封固。AEC 染色后的颜色比DAB好看，但是灵敏度比DAB低，而且保存时间短，易褪色。
4．TMB显色液
TMB即四甲基联苯胺（Tetrabenzidine）是一种脂溶性较强的基团，因此容易进入细胞与细胞器中的HRP反应，且由于这种高度的脂溶性，使其易形成多聚体，在HRP活性部位产生粗大的、深蓝色沉淀物，这使得TMB成为组化实验中的一种很好的发色团。同时反应产物的沉淀，使得HRP的活性部位更加暴露，利于酶氧化反应进行。TMB的反应产物为深蓝色，利于光镜观察，且反应产物越聚越大，常超出单个细胞器的范围（而DAB则被限制在其内），故TMB反应的检测阈较低。由于上述优点，目前TMB常用于光镜及超微结构水平的HRP及HRP-WGA神经投射的研究。需要注意的是：TMB显色液中的A液和B液应在2h内新鲜配制。另外，TMB是一种较强的皮肤刺激剂，并有致癌的潜在可能，故使用时应带手套及在通风条件下操作。
5．BCIP/NBT显色液
是碱性磷酸酶的显色底物。BCIP即5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate）。NBT即四唑氮蓝（Nitro-Blue-Tetrazolium）,MW=818,为深蓝色无定形微溶物质。当二者存在时，在碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase, AP）作用下，NBT被还原形成显微镜下可见的蓝色或紫色沉淀。
有没有办法增强IF/ICC/IHC中的特异性染色，减少非特异性染色？
为了获得高质量的结果，在免疫染色中应特别注意增强特异性染色，减少或消除非特异性染色。在各种免疫染色中都必须注意以下几个问题：
1．增强特异性染色的方法
（1）蛋白酶消化法：其作用是暴露抗原，增加细胞和组织的通透性，以便抗体与抗原最大限度的结合，增强特异性染色和避免非特异性染色。
这种方法已广泛用于各种免疫细胞化学染色，常用的蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶以及链霉蛋白酶（pronase）等，也可用3mol/L尿素处理
切片，达到酶消化的目的。酶消化的时间和温度因各种抗原对消化的敏感性不同，应根据酶的活性通过预试验确定，消化的时间还与组织固定
的时间有关，一般是陈旧固定组织所需时间长，以37℃为宜，消化时间短的组织可在室温中进行。消化处理时间过长能损伤组织，易使切片
脱落，应使用切片粘附剂，消化时间尽量缩短。
（2）合适的抗体稀释度：抗体的浓度是免疫染色的关键，如果抗体浓度过高，抗体分子远远多于抗原决定簇，可导致抗体结合减少，产生阴
性结果。此阴性结果并不一定缺少抗原，而是由于抗体过量。这种现象类似于凝集反应中的前带效应（Prozone effect）。因此，必须使用一
系列稀释或作“棋盘式效价滴定”检测抗体的合适稀释度，以得到最大强度的特异性染色和最弱的背景染色。抗体稀释度应根据：
①抗体效价，溶液中特异性抗体浓度越高，工作稀释度越高；
②一般讲，应用的抗体稀释度越大，温育时间越长；
③抗体中非特异性蛋白含量，只有高稀释度时才能防止非特异性背景染色；
④稀释用缓冲液的种类、标本的固定和处理过程等也可影响稀释度。所以合适的稀释度应根据自己的情况测定。抗体的稀释主要是指第
一抗体，因为第一抗体中特异性抗体合适的尝试是关键，应用高稀释度第一抗体仅显示主亲和力的特异性染色反应，可减少或消除
其中交叉抗体反应。
（3）温育时间：大部分抗体温育时间为30-60min，必要时可4℃过夜（约18h）。温育的温度常用37℃，也可在室温中进行，对抗原抗体
反应强的以室温为佳。37℃可增强抗原抗体反应，适用于多数抗体染色，但应注意在湿盒中进行，防止切片干燥而导致失败。
（4）多层染色法：对弱的抗原可用间接法（双层）、PAP和ABC法（三层）、四或五层PAP法或ABC法，或PAP和ABC联合染色法等，可以很大程度的提高敏感性，获得良好结果。
（5）显色增敏剂的应用，如在过氧化物酶底物中加入氯化镍，可提高显色敏感度4倍。
2．减少或消除非特异性染色的方法
组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为非特异性背景染色，最常见的原因是蛋白吸附于高电荷的胶原和结缔组织成分上。最有效方法是在用第一抗体前加制备第二抗体动物之非免疫血清（1：5-1：20）封闭组织上带电荷基团而除去与第一抗体非特异性结合。必要时可加入2%-5%牛血清白蛋白，可进一步减少非特异性染色。作用时间为10-20min。也可用除制备第一抗体以外的其它动物血清（非免疫的）。有明显溶血的血清不能用，以免产生非特异性染色。免疫荧光染色时，可用0.01%伊文氏兰（PBS溶液）稀释荧光抗体，对消除背景的非特异性荧光染色有很好的效果。当然使用特异性高、效价高的第一抗体是最重要的条件。洗涤用的缓冲液中加入0.85%~1%NaCl成为高盐溶液，充分洗涤切片，能有效的减少非特异性结合而减少背景染色。
如何判断免疫细胞（组织）化学实验的结果？
对免疫细胞化学结果的判断应持科学的慎重态度，要准确判断阳性和阴性，排除假阳性和假阴性结果，必须严格对照实验。染色结果呈阴性并非都是抗原不表达，要考虑是否与组织中的抗原受到破坏有关；对新发现的阳性结果，除有对照试验结果之外，应进行多次重复实验，要求用几种方法进行验证，如用PAP法阳性，可再用ABC法验证。
必须学会判断特异性染色和非特异性染色，对初学者更为重要，否则会得出不科学的结论。特异性染色与非特异性染色的鉴别点主要在于特异性反应产物常分布于特定的部位，如胞浆内，也有分布在细胞核和细胞表面的，即具有结构性。特异性染色表现为在同一切片上呈现不同程度的阳性染色结果。非特异性染色表现为无一定的分布规律，常为某一部位成片的均匀着色，细胞和周围的结缔组织均无区别的着色，或结缔组织呈现很强的染色。非特异性染色常出现在干燥切片的边缘，有刀痕或组织折叠的部位。在过大的组织块，中心固定不良也会导致非特异性染色。
有时可见非特异性染色和特异性染色同时存在，由于过强的非特异性染色背景不但影响对特异性染色结果的观察和记录，而且令人对其特异性结果产生怀疑。
阳性细胞具有如下的染色特征：（1）阳性结果应定位在细胞中相应的部位，比如在细胞膜表达的抗原阳性结果应定位在细胞膜上，在其他部位的阳性反应均为非特异性染色。不当的抗原修复会导致抗原在组织细胞中定位的改变。根据所检测抗原的不同，抗原分别定位在：①细胞
膜，如LCA 和UCHL1等；②细胞质，如Keratin 和Lysozyme 等；③细胞核，如PCNA 和ER 等。大部分抗原定位于细胞质（胞浆），可见于整个胞浆或部分胞浆。（2）阳性细胞分布可分为烟性和弥漫性。（3）由于细胞内含抗原量的不同，所以染色强度不一。如果细胞之间染色强度相同，常提示其反应为非特异性。（4）阳性细胞染色定位于细胞，且与阴性细胞相互交杂分布；而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞。（5）切片边缘、刀痕或皱折区域，坏死或挤压的细胞区，胶原结缔组织等，常表现为相同的阳性染色强度，但绝大多数是非特异性染色，不能用于判断阳性。
Troubleshooting the IF, ICC/ IHC 免疫荧光
问题 可能的原因
解决方法 目标蛋白在细胞中没有表达 制备细胞裂解液，用Western Blotting 验证目标蛋白在细胞中有表达
表达目标蛋白的细胞过少
标本中使用更多的细胞，试用其他瞬时转染方法，或者使用稳定转染
细胞系
细胞通透性差 增加通透剂作用的时间或者浓度，或改用其他的通透剂
染色前的固定步骤破坏了抗原表位 改用其他固定方法 通透使抗原丢失 减少通透剂作用的时间或强度
抗体不识别 换用其他抗体
一抗稀释度过大
同一样品按最佳的二抗用量作一抗稀释曲线，以确定最佳的一抗稀释
比例
信号弱或无信号，染色细胞
过少 二抗选择错误
使用正确的二抗 一抗质量不高 使用特异性高，效价高的一抗
一抗浓度太高
同一样品按最佳的二抗用量作一抗稀释曲线，以确定最佳的一抗稀释
比例
二抗浓度太高
同一样品按最佳的一抗用量作二抗稀释曲线，以确定最佳的二抗稀释
比例
封闭不完全 使用二抗来源动物的非免疫血清进行封闭；改善封闭条件
封闭液BSA 中含IgG 使用高纯度（IgG free ）的BSA
背景过高 洗涤不充分
充分洗涤 细胞片被风干
在任何时候都不要让细胞片干燥；使用湿盒 细胞呈扁平状或像撞击坑
使用了甲醇固定 甲醇可破坏细胞膜，因此不能很好保持细胞形态。改用甲醛或戊二醛
等其他固定剂
使用了戊二醛固定
细胞有自发荧光
材料本身（如石蜡）有自发荧光
在固定后荧光染色前进行荧光淬灭，如使用NaIO 4，NaBH 4，甘氨酸等，染色前检查自发荧光 因洗涤不充分导致背景太亮
充分洗涤 细胞模糊，封片剂明亮
二抗结合太弱
确保抗体牢固结合，确保固定良好 二抗浓度过高
降低二抗浓度 整个细胞片都出现荧光亮点
二抗发生沉淀 过滤或离心荧光标记二抗
免疫细胞（组织）化学
问题
可能原因 解决方法
组织不表达待测抗原或者表达水平太低 参照阳性对照片确定为真阴性结果 切片时选错蜡块和选错切片 用HE 染色验证 漏加试剂或者试剂使用顺序错误 重复实验，确保每一步均正确
试剂孵育时间不充分 确保试剂孵育了足够的时间
抗体不正确，或检测系统和一抗不匹配 选择正确的一抗和匹配的二抗
底物和酶不匹配 选用匹配的底物
抗体浓度太低 通过抗体稀释曲线决定最佳浓度
色原/底物溶液失效
将一滴标记有酶的抗体加入到制备好的底物溶液中，如果底物发生预期的颜色变
化，则可排除底物的因素。否则需更换新的酶标抗体或底物
抗体储存不当，导致失效 根据抗体说明书进行适当的保存
一抗失效（过了有效期） 换用新的一抗
二抗失效 换用新的抗体（能否成功与其它一抗配合？）
冲洗液和反应试剂不匹配 检查溶液的pH 值很重要，与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠。 脱石腊不充分 延长脱腊时间或者换用新的二甲苯
组织固定不充分或者不当（如温度过高） 增加固定时间或者改用不同的固定方法
染色弱或者没有染
色 组织固定过度 减少固定时间或4℃固定。若已固定过度，则需使用正确的或者推荐的抗原修复
方法
抗原修复方式不当采用合适的抗原修复方式
细胞内抗原未使用穿孔剂
洗液中加入0.05%Triton-100，有助于抗体渗透入细胞内，也可降解内源性Fc
受体
复染剂、脱水、透明和封片剂和所使用的色原不匹配选择正确的试剂（荧光素染色封片要选用水溶性封片剂，藻胆素蛋白染剂不能用含甘油的封片剂。AEC, AP Red/Fast Red, INF 和其它水溶性染料不能用二甲苯有机溶剂透明）
清洗不充分选择适当的清洗液，严格按操作步骤进行
组织含有内源性的酶，如HRP/AP
在加入一抗之前使用新鲜配制的3%的H2O2-甲醇封闭内源性HRP活性，使用左
旋咪唑（levamisole）溶液阻断内源性AP活性。或者换用葡萄糖氧化酶系统组织含有内源性生物素（尤其肾脏、肝和脾）
在加入一抗之前，血清封闭之后使用avidin/biotin阻断试剂。或者避免使用
biotin-avidin系统或改用IF方法
一抗的非特异性结合或者抗体浓度过高增加一抗的稀释度，或选用特异性更好，纯度和效价更高的抗体
二抗和组织非特异性结合
使用与二抗动物的正常血清（一般是3-10%）封闭，必要时可以将血清浓度加大；
或者用其它无关蛋白，如牛血清白蛋白或5%脱脂奶粉替代血清进行抗原封闭组织抗原弥散染色结构不清，主要见于冰冻切片固定不及时造成。切片后应立即固定
使用小鼠来源的二抗检测小鼠组织在加一抗之前使用MouseOnMouse封闭试剂
染色背景高
切片干透保持在高湿环境中，避免干透
一抗或者二抗浓度过高降低抗体浓度，通过抗体稀释曲线确定最佳浓度
孵育时间过长减少孵育时间
孵育温度太高降低孵育温度，在4℃过夜或者37℃0.5-1小时或者室温
底物孵育时间过长减少孵育时间
染色过度
干片染色过程中避免出现干片现象
量子点免疫层析检测技术
量子点免疫层析检测技术方兴未艾 免疫层析技术是一种快速、简便、灵敏、直观、价格低廉、可真正实现现场检测的检测方法。具有很多气相色谱、高效液相色谱、气质联用色谱、液质联用色谱、毛细管电泳等仪器检测方法以及其他传统方法无法企及的优点。在检测领域中处于特殊重要的地位，同时也是传统检测和仪器检测的良好补充。尤其在经济高速发展，生活水平提高的今天，人类重大疾病，环境污染，食品安全等问题日益受到极大的关注，让免疫层析检测技术更具有巨大的潜力和蓬勃的生命力。 目前，免疫层析产品主要为胶体金免疫层析试纸条，其最早应用于医学检验，在早孕检测中的应用取得了极大的成功，随后在各个领域迅速渗透漫延，其在毒品检测、环境检测、以及食品安全检测领域得到了迅速的发展，但是又出现新的问题，在很多方面，尤其是食品安全检测领域，有些农兽药残留限度极度苛刻，甚至要求0.1 ng/ml的检测限度，同时食品类物质如肉类、禽类、果蔬、谷物等成分复杂，前处理难度也很大，造成胶体金免疫层析检测灵敏度无法胜任。除了进一步提高前处理方法以外，寻求高灵敏度的免疫层析方法也显得尤为重要。 量子点是近20 年来发展起来的半导体纳米晶材料，因为它的优良特性，受到了很大的关注，并且已经显示出一定的潜力，近几年来从细胞标记等应用已逐渐开始向多个领域的检测与诊断方向渗透。 一、量子点特性 量子点(简称QDs,又称半导体纳米粒子)是由Ⅱ～Ⅵ族或Ⅲ～V族元素组成的，半径小于或接近于激光玻尔半径，能够接受激发光产生荧光的一类半导体纳米颗粒，其中研究较多的主要是CdX(x=S、Se、Te)，直径约为2nm-6nm。量子点由于存在显著的量子尺寸效应和表面效应，从而使它具有常规材料所不具备的光吸收特性，使其应用领域越来越广泛，特别是其在免疫生物学和临床检验学等研究中的潜在的应用价值，已引起了广大科学工作者的极大关注，发光量子点作为荧光试剂探针标记生物大分子，正是近年来迅速发展的纳米材料在生物分析领域的重要应用之一。与普通的荧光染料相比较，量子点具有以下特点： (1) 有机染料荧光分子激光谱带较窄，每一种荧光分子必须用合适能量的光来激发，而且产生的荧光峰较宽，不对称，有些拖尾。这给区分不同的探针分子带来困难，很难利用有机染料分子同时检测多种组分。量子点由于量子限域效应使其激发波长的范围很宽，可以被波长短于发射光的光(一般短10nm以上)激发，并产生窄(半波宽约13nm)而对称的发射光谱，从而避免了相邻探测通道的串扰。 (2) 量子点具有“调色”功能，不同粒径大小的量子点具有不同的颜色，激发量子点的激发波长范围很宽，且连续分布，所以可以用同一波长的光激发不同大小的量子点而获得多种颜色标记，是一类理想的荧光探针。 (3)量子点的荧光强度强，稳定性好，抗漂白能力强，Chan和Nie通过实验证明ZnS包覆的CdSe比罗丹明6G分子要亮20倍和稳定100-200倍，可以经受多次激发，且标记后对生物大分子的生理活性影响很小，因此为研究生物大分子之间的长期作用提供了可能。
免疫荧光操作步骤及注意事项
免疫荧光操作步骤及注意事项 免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术(比如流式细胞仪)测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透(或称为透化)、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备(通俗的说法是细胞爬片)是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片(Slides or Coverslips)的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法(如ELISA或Western Blot)中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4?或-20?避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。
由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤: (1) 细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次;对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤(1000rpm,5min)2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 (2) 固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4?保存3个月。PBS洗涤3×5 min. (3) 通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min. (4) 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min. (5) 一抗结合。室温孵育1h或者4?过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min. (6) 二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。 (7) 封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。 (一)细胞准备 用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。贴壁良好
直接免疫荧光法测抗原
直接免疫荧光法测抗原 基本原理 将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。 试剂与仪器 l 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4 l 荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释 l 缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制 l 搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml） l 有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫） l 荧光显微镜 l 玻片架 l 滤纸 l 37℃温箱等。 实验步骤 1. 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。 2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30min）。 3. 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。 4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。 5. 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示： （-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++
--++++）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。 注意事项 1. 对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。 2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。染色温度多采用室温（25℃左右），高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2℃的低温，延长染色时间。低温染色过夜较37℃30 min效果好的多。 3. 为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。 （1）标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。 （2）特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。 （3）阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。 如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。 4. 一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。
深圳市活水床旁干式荧光免疫分析仪 产品技术要求
医疗器械产品技术要求编号： 干式荧光免疫分析仪 2. 性能指标 2.1外观与结构 2.1.1 外形应平整，表面不应有明显的凹凸痕、划痕、裂纹、变形、霉斑、锋棱、毛刺。表面镀层不应起泡、龟裂和脱落。 2.1.2 外表的各处文字、符号应完整，标记应清晰、准确、牢固。 2.1.3 紧固件连接应可靠、不得有松动。 2.1.4 运动部件应平稳，不应有卡滞、突跳。 2.2功能指标 2.2.1 分析仪具备自检功能； 2.2.2 对反应区温度进行即时监控，不在设置范围时分析仪会有警告； 2.2.3 分析仪应具有ID卡信息读取功能； 2.2.4 应可输入并保存病人信息； 2.2.5 数据显示，分析仪测试结束后，显示屏结果项中可查询项目名称、检测结果、单位； 2.2.6 自动打印和保存数据功能； 2.2.7故障提示：分析仪对操作错误、机械及电路故障应有相应提示和自动做出应急反应的功能； 2.2.8 可以通过GPRS或WIFI信号上传仪器相关信息。 2.3 性能指标 2.3.1 反应区温度准确度和波动度 仪器反应区具备控温功能，仪器设定的温度范围（25℃~37℃），当设置值在该范围内，连续设置温度跨度不小于 3.0℃时，准确性在±0.5℃内，测试值波动度不超过1.0℃。 2.3.2 通道内精密度 分析仪测定结果的变异系数CV≤2%。
2.3.3 通道间精密度 分析仪各通道测定结果的变异系数CV值应≤4%。 2.3.4 线性范围 在[0.25，20]线性范围内： a)线性相关系数r不小于0.990； b)线性相对偏差应不超过±10%。 2.3.5 稳定性 分析仪开机处于稳定工作状态后第4个小时、第8个小时的测试结果与稳定工作状态初始时的测试结果的相对偏倚α≤±5%。 2.3.6 准确度 分析仪测定结果的相对偏差B≤±3%。 2.4 数据接口 2.4.1串口； 2.4.2网络接口； 2.4.3 GPRS网络模块； 2.4.4传输协议：LIS数据是通过ASTM协议传输； 2.4.5存储格式：db。 2.5 用户访问控制 2.5.1用户类型及权限：1-3级用户类型：1级为普通用户，2级为管理员用户，3级为设备维护人员用户； 2.5.2用户身份鉴别方法：用户名和密码； 2.5.3用户访问：通过用户名和密码控制用户使用本仪器，用户类型包括普通用户和管理员，以上用户类型输入正确的用户名和密码可以使用本仪器，除以上用户类型外，不可使用本仪器。 2.6 环境试验 仪器环境试验应符合GB/T 14710－2009中气候环境试验I组，机械环境试验Ⅱ组的要求及表1中的规定。运输试验、电源电压适应能力试验应分别符合GB/T 14710-2009中第4章、第5章的规定。 表1环境试验
免疫组化与免疫荧光的区别
免疫组化与免疫荧光 一、两者都是蛋白定位的检测（也就是确定蛋白是表达在细胞核/浆/膜）。 二、区别是： 1、概念和基本原理 免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜的现像和放大作用，在细胞，亚细胞水平检测各种抗原物质，并可在原位显示相应的基因和基因表达产物。免疫组织化学技术现已有：免疫荧光组织（细胞）化学技术、免疫酶组织（细胞）化学技术、亲和组织化学技术、免疫金银及铁标记免疫组织化学技术等。 免疫荧光组织（细胞）化学技术是采用荧光素标记的已知抗体（或抗原）作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原（或抗体），形成的抗原抗体复合物上带有荧光素，在荧光显微镜下，由于受高压汞灯光源的紫外光照射，荧光素发出明亮的荧光，这样就可以分辨出抗原（或抗体）的所在位置及其性质，并可利用荧光定量技术计算抗原的含量。以达到对抗原物质定位、定性、定量测定的目的。 2、标本制作： 免疫荧光一般用冰冻切片，减少杂质干扰；而酶免疫组化一般用石蜡切片或冰冻切片均可以。 3、实验步骤：免疫荧光染色步骤简单，而酶免疫组化方法较为复杂，多了DAB显色过程。 4、染色后的标本保存：免疫荧光染色后的标本一般短时间拍照，时间长了荧光衰退；而酶免疫组化染色标本可以长期保存。 5、免疫组化结果除了知道蛋白是在细胞浆还是细胞膜表达高些，还可以用软件做相对定量分析。 6、免疫荧光得到的图片是彩色的，漂亮些，可以发高档次文章。 免疫学三大工具：免疫组化、Western、ELISA，分别用于定位，定性和定量。
免疫荧光技术的实验方法及其分类
免疫荧光技术的实验方法及其分类 一、免疫标记法及其分类 1.荧光免疫法 原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min 内得出结果。结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。 以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。 传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。
2.放射免疫法 放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。 RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng/ml 水平。但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。 3.酶联免疫法(ELISA) ELISA法有竞争法和夹心法两种。竞争法是基于标准或血清Mb 和微孑L板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg/L，线性范围达1 000ug/L。夹心ELISA 法与EIA具有良好的相关性(r=0.92)。ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。但不适合急诊的快速检测。
荧光仪使用说明书A1版本 2015-7
干式荧光免疫分析仪 使用说明书 【生产企业】 【注册地址】 【生产地址】 【联系方式】 【售后服务单位】 【医疗器械生产企业许可证编号】 【产品注册证】 【产品标准编号】 【说明书批准及修改日期】 1
前言 本手册完全按照国家技术监督局发布的GB/T 9969-2008《工业产品使用说明书总则》，国家药品监督管理局发布的《医疗器械说明书管理规定》进行编写，符合企业标准。本手册所述内容完全与本系列干式荧光免疫分析仪情况相符合。若有修改，本公司将不再另行通知。 本手册根据产品的特点和需要描述出主要结构、性能、型式、规格和安装、使用、操作、维护、保养和贮存等方法，以及保护操作者和产品安全措施，详细内容请见各章节。 本手册由xx公司编写，版权所有，未经许可不得翻印、删改。 本手册内容本公司有最终解释权。
用户安全提示 ※请您在仪器使用之前，仔细阅读本《使用说明书》后再进行仪器的使用。※仅限经培训合格的专门技术人员才能使用本仪器。
禁止翻滚 温度范围 湿度范围 ◆不要用湿手插拔电源,可能会触电。 ◆不要损坏电线和连接电缆等，不要踩踏、扭曲、拉扯电线和电缆， 如果电线和电缆折断会发生触电或引发火灾。 ◆不要用已经损坏的电线和连接电缆等，可能会发生触电、或引发火
灾。 ◆不要用设计要求以外的其他电线和电缆，如果电容量小，会引发火 灾。 ◆有异常动作时，应立即停止操作。 ◆当感觉到有烧焦味或异味等，异常错误时，立刻关掉电源，拔下电 源线。 ◆必须使用有良好接地的电源插座，否则当仪器出现漏电时，会引起 触电。 ◆使用和操作时应遵照“用户使用手册”的规定或指导。 ◆不要用松脂油、苯等化学试剂清洁外部的污渍，因为它可能引起颜 色和形状的变化，用软布或湿布擦洗，对于严重的污渍，用清洗剂或75%的酒精清洁。 ◆如遇到螺钉或金属物掉进仪器内，以立即停止操做作，请有资质的 维修人员将金属物取出后再开始操作，否则可能会引起仪器故障。 ◆不要把试剂和水等放到仪器台面上，避免液体漏进仪器内部，对仪 器造成损坏。
免疫层析技术
层析法概念 层析法(chromatography)的原理是利用混合物中各组分的物理性质之差(如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等)而建立来的一种分离技术。 层析系统是由固定相(stationary phase) 和流动(Mobile Phase)相组成。固定相是固体物质或固定于固体物质上的成分。流动相是可以流动的物质，如水或各种溶剂。 层析过程：当待分离混合物随流动相通过固定相时，由于混合物各组分的理化性质的差异，与固定相相互作用弱的组分随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移的速度快；与固定相相互作用强的组分向前移动的速度慢。从而实现混合物中各组分的分离。 免疫层析法概念 免疫层析法(immunochromatography)是近几年来国外兴起的一种快速诊断技术，其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品（尿液或血清）后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。 免疫层析技术是建立在层析技术和抗原一抗体特异性免疫反应基础上的一项新兴免疫检测技术。 免疫层析技术以固定有检测线和控制线的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，通过毛细管作用使待测物在层析条上移动。 待测物在T线处发生特异性免疫反应。游离物在C线处发生免疫反应。 分类 检测方法标记物质 TRFIA技术镧系稀土元素螯合物 上转换发光技术上转磷光材料（UCP） 荧光乳胶层析技术荧光胶乳颗粒 荧光微球免疫层析技术荧光微球 荧光QDS层析技术量子点 IMB层析技术免疫磁珠 新型胶体金技术纳米磁性微粒、核酸适配体
干式荧光免疫分析仪产品技术要求haomai
干式荧光免疫分析仪 适用范围：配套本公司的荧光免疫层析试剂盒，用于医疗机构体外定量检测人体样本中抗原/抗体的含量。 2.1 使用条件 a）环境温度：10℃～30℃； b）相对湿度：10%～80%； c）大气压力：860hpa～1060hpa； d）电源要求：AC220V±22V，50Hz±1Hz。 2.2 外观 a) 分析仪外形应平整，表面不应有明显的凹凸痕、划痕、裂纹、变形、 霉斑、锋棱、毛刺。表面镀层不应起泡、龟裂和脱落； b) 分析仪外表的各处文字、符号应完整，标记应清晰、准确、牢固； c) 分析仪的金属零件不应有锈蚀及其他机械损伤； d) 分析仪的开关、按键及开启装置的操作应灵活可靠，零部件应紧固 无松动。 2.3 性能
2.3.1 最低响应值 0.5ng/L的荧光素Alexa flow对应的校准荧光卡（其制备方法及赋值过程见附录B）C1的值≥本底噪声的2倍。 1.3.2 重复性 检测5ng/L的荧光素Alexa flow对应的校准荧光卡C2的重复性：变异系数（CV）≤10%。 2.3.3 线性范围 以校准荧光卡（C1～C5）为检测对象，在0.5ng/L～200ng/L内，线性相关系数r≥0.975，线性偏差不超过±15%。 2.3.4 稳定性 分析仪开机处于工作状态第4小时、第8小时的测试结果与第1小时的测试结果的相对偏差在±15%范围内。 2.3.5 准确度 分析仪与C反应蛋白（CRP）测定试剂盒（荧光免疫层析法）配合使用，使用商业质控品进行测试，相对偏差应不大于15%。 2.4 功能 2.4.1 仪器可以把试剂ID芯片中的参数按项目分类依次存入仪器中。 2.4.2 具备显示、储存、查询、打印功能，可外接网络。 2.5 安全要求 应符合GB4793.1-2007《测量、控制和实验室用电气设备的安全要求第1部分：通用要求》和YY 0648-2008《测量、控制和实验室用电气设备的安全要求第2-101部分：体外诊断（IVD）医疗设备的专用要求》的规定，见附录A、附录B。
LUMINEX技术原理及应用
Luminex的基本原理及应用 传统的蛋白质分析主要采用双抗体夹心ELISA法。此法长期以来被视为蛋白质定量分析的“标准方法”。ELISA可以用来准确测定大批量生物样品，但每次实验只能分析一个目标分子，而不具备同时分析多种目标分子的能力。在ELISA基础上发展出的 luminex技术，不仅同样通过双抗体选择而具有高特异性，同时也具有ELISA的高通量、操作简便、测量准确等优点，而且可以在一次实验中完成对多种目标分子的分析，从而改变了过去的分析模式，建立了更加高效快速的分析平台。Luminex技术原理，在近年发表的文章中已有过详细的介绍和说明。Luminex 技术应用微球和流式细胞仪的原理。微球内部含有三种荧光免疫荧光，通过荧光不同的比例可以区分500种不同的微球。每种微球可以用来检测一种不同的蛋白或基因。因此，利用微球技术，可以同时检测高达500个蛋白或基因。该技术利用荧光编码的微球共价交联单克隆抗体，与被测定的目标分子结合后，加入荧光素标记的检测抗体，再通过激光扫描荧光编码来识别单个微球和测量“检测荧光”强度来确定被测分子的浓度。在使用相同抗体对的条件下，luminex技术的测量结果在准确度、精确度、灵敏度方面与ELISA均可达到相似的水平。Luminex应用的荧光编码微球带有针对不同目标分子的特异性抗体，不同的微球在一定程度上可以自由组合，这样在一次实验中可以同时完成多个目标分子的分析。多目标分子的同时测定可以大大减少生物样品的消耗量，节省成本和测定时间，并且使多种目标分子之间相关性的分析更加准确。很多公司已经开始提供Luminex试剂盒，用于基础和临床医学研究以及临床检测。目前，Luminex 试剂盒已经可以检测500多种蛋白质分子，包括细胞因子、激素、自身抗体、肿瘤标志物等。 Luminex常见问题及解答 LUMINEX应用于哪些领域? 生物医学研究，生物标记物开发，临床检测等领域。Luminex技术主要用于蛋白和核酸检测分析。 LUMINEX敏感性如何？ 灵敏度取决于开头的质量。对于同样的抗体对，Luminex检测的灵敏度高于ELISA技术。一般检测灵敏度在pg级。 对不同类型的样品制备和样品量的要求是怎样的？ 血清、血浆是常用的样本，每次检测需要10ul，每次可以检测多个蛋白。 从各种细胞或组织中提取的蛋白也可以用Luminex技术检测，制备方法与ELISA、Western Blot完全一样。 一般可以检测到多少基因或蛋白的表达信息？ 检测蛋白和基因的数目主要取决于试剂盒。蛋白质检测目前最高可以达到50个左右，基因检测最高达500个。 如何保证检测结果的特异性？ 检测的特异性取决于抗体高特异性。试剂几乎全部来源于美国大公司，产品经过了严格的质量控制。同时，我们检测公司也有近15年的经验、严格的操作程序和质量控制体系。 客户自己提供抗体，是否可以进行LUMINEX检测？ Luminex和ELISA检测试剂都需要两个配套的特异性抗体。我们公司具有开发Luminex试剂盒的经验。但是，需要一系列的开发工作才能保证结果的特异性、重复性和可靠性。 除了蛋白，LUMINEX技术是否还可以用于其它指标的检测？ 可以用于基因表达，基因多态性和HLA配型分析。
免疫荧光原理
免疫荧光（Immunofluorescence, IF）原理 免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。 由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤： （1）细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次； 对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm，5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 （2）固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3×5 min。 （3）通透。使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min。通透后用PBS洗涤3×5 min。
免疫荧光技术
免疫荧光技术（Immunofluorescence technique）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位。 一、基本原理： 免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。 二、应用范围： 其应用范围极其广泛，可以测定内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质。根据诊断类别，又可分为传染性疾病、内分泌、肿瘤、药物检测、免疫学、血型鉴定等。 三、基本实验步骤：
1、细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 2、固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3×5min. 3、通透。使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5min. 4、封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min. 5、一抗结合。室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min. 6、二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。 7、封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。 四、注意事项： 1、染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。 2、荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。
干式荧光免疫分析仪产品技术要求万孚
2.性能指标 2.1分析仪应符合本技术要求，并按规定程序批准的图样和技术文件制造。 2.2使用条件 环境温度：10℃～30 ℃。 相对湿度：30%～70%。 操作海拔:0 ～ 2000m。 大气压力：700hPa～1060hPa。 额定电压：AC220V。 额定频率：50Hz。 2.3外观 2.3.1分析仪外表面应光滑、无划痕。 2.3.2各控制器件（或主机）应操作灵活、可靠。 2.3.3各种文字、符号应清晰、正确、牢固。 2.4性能指标（以检测心肌肌钙蛋白Ⅰ（cTnI）项目为例） 2.4.1精密性 变异系数（CV 值）≤10%。 2.4.2准确度 检测 cTnI 浓度小于 1 ng/mL 时相对偏差(Bias%)应不大于±15%； 检测 cTnI 浓度大于或等于 1 ng/mL 时相对偏差(Bias%)应不大于±10%。 2.4.3测量时间 从加待检样品到显示检测结果全程应不超过 25min。 2.4.4功能 2.4.4.1参数设置 仪器可以把试剂批号卡中的参数按项目分类依次存入仪器中。 2.4.4.2数据显示 测试结束后 LCD 显示屏显示测试结果。 2.4.4.3结果打印输出 测试结果可根据需要进行自动打印或调取历史记录打印。 2.4.4.4弃卡处理
检测完成后试剂卡自动从弃卡槽丢出。 2.4.4.5监温功能 可监测仪器内部温度，并显示当前仪器温度。 2.4.4.6LIS 系统连接功能（适用于 FS-205）
可以与 LIS 服务器对接，测试结果可以上传 LIS 服务器。 2.4.4.7POCT 管理系统连接功能（适用于 FS-205） 可以与 POCT 管理系统服务器对接，测试结果可以上传 POCT 管理系统服务器。 2.5安全要求 分析仪应符合 GB 4793.1-2007 、GB 4793.9-2013 和 YY 0648-2008 的要求。 2.6环境要求 分析仪环境试验应符合GB/T 14710-2009气候环境试验I组、机械环境试验I 组的要求。运输试验、电源电压适应性试验应符合GB/T 14710-2009中第4章、第5章的要求。 2.7电磁兼容 分析仪应符合GB/T 18268.1-2010和GB/T 18268.26-2010的要求。 2.8产品性能 2.8.1稳定性 分析仪开机处于稳定工作状态后第4h、第8h的测试结果处于稳定工作状态时的测试结果的相对偏倚量，σ≤±8%。 2.8.2线性相关性 在不小于2个数量级的浓度范围内，线性相关系数（r）≥0.97。 2.8.3反应区温度准确性和波动度（适用于FS-203） 反应区温度，在15-28℃范围任意设置，不在设置范围时分析仪会有警告，当设置温度区间不小于3.0℃时，准确性在±0.5℃内，测试值波动度不超过1.0℃。 2.8.4反应区温度准确性和波动度（适用于FS-205） 反应区温度，在10-30℃范围任意设置一个目标温度和一个波动温度，不在目标 温度允许的波动温度范围内分析仪会有警告，分析仪的准确性在±0.5℃内，测试值波动度不超过1.0℃。
免疫荧光(单标和双标)注意事项及具体方法
免疫荧光（单标和双标）注意事项及具体方法 一、技术简介 免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。 将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。 二、实验流程 免疫荧光单标记方法 免疫荧光单标记是指只标记一种蛋白质分子，方法比较简单，只要按照染色步骤去做，通常不存在太多的问题。但要注意固定液的选择，固定液选择的合适与否，可能会直接影响染色结果。具体染色方法如下。 1. 所需材料与试剂： a. 培养在盖玻片或玻璃培养皿中融合程度达到60%-70%的细胞。 b. 一抗、FITC或TRITC标记的二抗。 c. 4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液 (-20℃预冷20 min)。 d. 封闭液。 e. 0.01mol／LPBS缓冲液。 2. 染色方法： a. 取出培养有细胞的盖玻片或glass-bottom培养皿，用0.01MPBS洗2-3遍。 b. 加入0.3%的Tritonx-100，37℃，30 rain。 c. 加入4%多聚甲醛试问固定30 min或冷丙酮4℃固定10 min。 d. 正常阻断血清1:20封闭试问20-30 min，抑制IgG的非特异性结合。阻断 血清必须选择与二抗同一种属的正常血清。
免疫层析技术的发展及在POCT中的应用
综一一述 免疫层析技术的发展及在P O C T中的应用 黄德智综述,蒲晓允?审校 (陆军军医大学新桥医院检验科,重庆４０００３７) 一一摘一要:免疫层析技术因其简单二方便二易操作二快速,价格相对低廉,已广泛应用于即时检测(P O C T).随着P O C T检测项目的增多和对已有项目检测定量二灵敏度二特异度等要求的提高,本文就免疫层析技术的最新发展及其应用,作以下综述. 关键词:免疫层析技术;一即时检测;一量子点 D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１６７３Ｇ４１３０．２０１９．０５．０２２中图法分类号:R４４６ 文章编号:１６７３Ｇ４１３０(２０１９)０５Ｇ０５９４Ｇ０４文献标识码:A D e v e l o p m e n t o f i m m u n o c h r o m a t o g r a p h y a n d i t s a p p l i c a t i o n i nP O C T HU A N GD e z h i,P UX i a o y u n? (D e p a r t m e n t o f C l i n i c a lL a b o r a t o r y,X i n q i a oH o s p i t a l,A r m y M e d i c a l U n i v e r s i t y,C h o n g q i n g４０００３７,C h i n a) A b s t r a c t:I m m u n o c h r o m a t o g r a p h y h a sb e e nw i d e l y u s e d i nP O C Tb e c a u s eo f i t s s i m p l i c i t y,c o n v e n i e n c e, e a s y o p e r a t i o n,r a p i d i t y a n d r e l a t i v e l y l o w p r i c e．W i t h t h e i n c r e a s eo fP O C Tt e s t i n g i t e m s a n d t h e i n c r e a s eo f t h e r e q u i r e m e n t s f o r q u a n t i f i c a t i o n,s e n s i t i v i t y,a n d s p e c i f i c i t y o f e x i s t i n g p r o j e c t s,t h i s p a p e r r e v i e w s t h e l a t e s t d e v e l o p m e n t s a n d a p p l i c a t i o n s o f i m m u n o c h r o m a t o g r a p h y． K e y w o r d s:i m m u n o c h r o m a t o g r a p h y;一P O C T;一q u a n t u md o t s １一免疫层析技术简介 一一免疫层析技术是在２０世纪６０年代在发达国家兴起并被用于检测血清蛋白的一种结合了免疫技术和色谱层析技术的快速检测分析方法,利用胶体金二胶体碳二磁性纳米材料二稀土纳米材料二量子点等着色标记物,在层析时,标记物与待测物的络合物被相应的配体捕获而浓集显色于硝酸纤维素膜上的检测线,以纤维膜上显色条带的有无二颜色深浅和反射光线来定性或定量,在即时检测(P O C T)中应用极为广泛.免疫层析试纸条由样品垫二结合垫二硝酸纤维素(N C)膜二检测线(T线)二质控线(C线)二吸水垫二聚氯乙烯(P V C)底板等部分组成,根据待检测物的大小和抗原抗体结合的方式,分为双抗体夹心法和竞争法[１Ｇ２].２一免疫层析技术发展及应用 一一免疫层析技术关键在于依靠标记抗体的免疫标记材料,而纳米材料由于优越的信号放大作用,能达到良好的灵敏度和特异度而备受青睐.下面主要从胶体碳二量子点二稀土纳米材料二上转换发光技术和超顺磁性纳米材料以及适配体等方面进行介绍.２．１一胶体碳一与胶体金相比,胶体碳的优点包括更高的颜色强度,即更高的灵敏度和标记效率,动力学检测范围更广,成本低廉,制作工艺简单,可大规模生产且更环保,但由于其标记和封闭时间长,并未体现出对胶体金的绝对优势,故其商业化程度较低[３Ｇ４].何卓等[３]利用碳纳米颗粒制作的胶体碳试纸条用于检测疟原虫,并可通过扫描检测带灰度值以定量.最近,Y U等[４]利用一种新的胶体碳材料氧化石墨烯作为标记物,成功制作出用于检测黄曲霉素B１的试纸条,肉眼最低检测限可达０．３n g/m L.材料学的进步能促进检测的进步,诸如碳量子点和石墨烯量子点等材料也是免疫层析研究中可以利用的标记材料.２．２一量子点一量子点被认为是免疫层析中最有前途的荧光半导体纳米材料,与一般荧光染料相比,量子点具有尺寸可调的荧光,发射光谱窄而对称,高量子产率,宽吸收光谱,荧光强度高,耐光漂白和稳定性好等优点[５Ｇ６].水溶性量子点表面富含羧基或氨基以用于连接蛋白质.表面是羧基的量子点被１Ｇ(３Ｇ二甲氨基丙基)Ｇ３Ｇ乙基碳二亚胺盐酸盐(E D C)和NＧ羟基琥珀酰亚胺(N H S)激活,并且这些激活的羧基和抗体的氨基相连接.这些特性使得量子点是一个可以达到高灵敏度和同时对多种检测物定量的免疫层析标记物[７].为了检测样本中不同的物质,有两种不同模式的检测方法.第一种模式是不同的T线去检测与之对应的分析物;第二种模式是一条T线去检测不同的分析物.例如,第一种模式,T A R A N O V A等[８]设计了一种 交通信号灯 式的竞争性免疫层析方法,他们 ４９５ 国际检验医学杂志２０１９年３月第４０卷第５期一I n t J L a bM e d,M a r c h２０１９,V o l．４０,N o．５ ?一通信作者,EＧm a i l:１５８０９３２０＠q q．c o m. 一一本文引用格式:黄德智,蒲晓允．免疫层析技术的发展及在P O C T中的应用[J]．国际检验医学杂志,２０１９,４０(５):５９４Ｇ５９７．
干式荧光免疫分析仪产品技术要求kangsirunye
干式荧光免疫分析仪 适用范围：与本公司的免疫荧光法测定试剂盒配套，用于检测人体样本中待测物质的含量。 1.1 型号： KS-001 1.2 型号划分说明 1.3 组成 本仪器主要由光学单元、机械单元、控制单元、输出/显示单元、读取单元组成。 其中光学单元主要包括光源、激发单色器、发射单色器、检测器；机械单元主要包括定位装置和传动装置；控制单元主要包括触摸屏；输出/显示单元主要包括液晶屏和打印机。 2.1 正常工作条件 a)电源电压AC 220V，50Hz 输入功率 38VA； b)环境温度15℃～30℃； c)相对湿度≤80%； d)大气压力86kPa～106kPa； e)远离强电磁场干扰源；
f)避免强光直接照射； g)具有良好的接地环境。 2.2准确度 以肌红蛋白纯品对肌红蛋白测定试剂盒（免疫荧光法）做回收试验，其回收率应在85%～115%范围内。 2.3 重复性 以高浓度200 ng/ml~300 ng/ml、低浓度20 ng/ml~120 ng/ml两水平肌红蛋白质控品为样本，用肌红蛋白测定试剂盒（免疫荧光法）各重复测定10次，其测定值的变异系数（CV）应不大于10%。 2.4 线性 在[2.4,400]ng/mL范围内，测定肌红蛋白测定试剂盒（免疫荧光法），线性相关系数应满足R2≥0.95。 2.5 开机稳定性 仪器开机自检完毕后与仪器开机4h、8h后，分别用肌红蛋白测定试剂盒（免疫荧光法）测试高浓度200 ng/ml~300 ng/ml肌红蛋白质控品各3次，其结果相对偏差应不超过±10%。 2.6外观 2.6.1 分析仪外观应整洁、色泽均匀、无裂纹或划痕。 2.6.2 分析仪的文字和标识应清晰、正确。 2.6.3 分析仪的紧固件连接应可靠、不得有松动。 2.6.4 分析仪的运动部件应平稳，不应有卡滞、突跳及显著回空。 2.7 基本功能