食品微生物综合实验报告

食品微生物综合实验报告项目一:食品中细菌总数的测定 (1)

项目二：革兰氏染色技术 (5)

项目三：饮用水中大肠菌群测定 (7)

指导老师：郭永

班级:食品1002班

学号：2010040734

姓名：任冠华

项目一：食品中细菌总数的测定

1.目的

本方法规定了食品中菌落总数的测定方法。

本方法适合于各类食品中菌落总数的测定。

2.设备和材料

温箱：36±1℃。恒温水浴：46±1℃。电炉吸管。广口瓶或三角瓶：容量为500ml玻璃珠：直径约5mm。平皿：直径为90mm。

试管。酒精灯。试管架。灭菌刀或剪子。灭菌镊子。

3.测定步骤

检样稀释及培养

（1）以无菌操作，将检样25g(或mL)剪碎放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1∶10的均匀稀释液。

（2）用1mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内(注意吸管尖端不要触及管内稀释液)，振摇试管，混合均匀，做成1∶100的稀释液。

（3）另取1mL灭菌吸管，按上条操作顺序，做10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1支1mL火菌吸管。

（4）根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。

（5）稀释液移入平皿后，应及时将凉至46℃营养琼脂培养基(可放置于46±1℃水浴保温)注入平皿约15mL，并转动平皿使混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1mL稀释液的灭菌平皿内作空白对照

（6）待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h。

菌落计数方法

做平板菌落计数时，可用肉眼观查，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。

菌落计数的报告

（1）平板菌落数的选择

选取菌落数在30～300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。平皿内如有链状菌落生长时(菌落之间无明显界线)，若仅有一条链，可视为一个菌落；如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。（2）稀释度的选择

应选择平均菌落数在30～300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之。

若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30～300之间，则视两者之比如何来决定。若其比值小于或等于2，应报告其平均数；若大于2则报告其中较小的数字。

若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之。

若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

菌落数的报告

菌落数在100以内时，按其实有数报告，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数，也可用10的指数来表示。

4.出现的问题

①接种过程操作速度太慢，导致培养基与接种液无法充分混合。②平板划线不规律。③仪器使用不熟练，配合不够默契。

5.参照国标得出结论部分食品国标

瓶（桶）装饮用水菌落总数限量是≤20CFUmL，/总大肠菌群（MPN/100mL或CFU/100mL）不得检出，耐热大肠菌群（MPN/100mL 或CFU/100mL）不得检出，大肠埃希氏菌（MPN/100mL或CFU/100mL）不得检出常温液态奶≤10cfu/ml。

6.结论：

自来水（或啤酒）的培养基均未培养出菌落，表示自来水（或啤酒）中菌落总数合格。土壤（或污水）的培养基中发现有大量菌落，则自来水和啤酒中无超标现象，符合卫生标准。

项目二:细菌涂片制作及革兰氏染色技术

一．目的

学习金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等细菌涂片制作、干燥和固定技术。掌握细菌的简单染色和革兰氏染色技术

二．设备和材料

菌种

大肠杆菌16h 牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，金黄色葡萄球菌16h 牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物。

溶液和试剂

草酸铵结晶紫染液，革兰氏碘液，95%乙醇，番红复染液等。

仪器和其他用品

酒精灯，载玻片，显微镜，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，接种环，试管架，镊子，载玻片夹子，滤纸，滴管和无菌生理盐水等。

三．测定步骤

1、细菌涂片制作

（1）涂片。用接种环从试管培养液中取一环菌，于载玻片中央涂成薄层即可，或先滴一滴无菌水于载玻片中央，用接种环从斜面挑出少许

（2）干燥。涂片后自然干燥，也可在酒精灯上略加热，使之迅速干燥。

（3）固定。固定的方法主要取决于勇什么染色方法，常用的有火焰固定法和化学固定法，火焰固定法的主要操作要领是：手持载玻片一端，标本面向上，在灯的火焰外侧迅速来回移动3~4次，约3~4s.

2、革兰氏染色法

涂片→干燥→草酸铵结晶紫（60s）→水洗→革兰氏碘液媒染（60s）→95%酒精脱色（30s）→水洗→番红（2min）→水洗→干燥→镜检。

脱色是革兰氏染色关键的一步，可直接用95%酒精冲洗脱色，直到流下的酒精无明显的紫色为止。然后，应立即用水冲洗，以避免脱色时间过长而影响最终染色结果。另外，挑菌量、固定温度、染色时间也是影响结果的重要因素，只有通过反复实践，才能获得满意的结果。

四．注意事项:

1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。

2.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。

项目三：饮用水中大肠菌群测定

一、目的：

1.学习食品中大肠菌群检测程序、方法。

2.掌握食品中大肠菌群检测结果的报告方式

二、实验器材

1.培养基：乳糖胆盐发酵管，伊红美蓝琼脂、乳糖发酵管、蛋白胨

2.试剂：革兰氏染液

3.器皿：水浴、均质器或乳钵、载片等

三．内容、方法与步棸

1.检样稀释

以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。

另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。

根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管、

2. 乳糖发酵试验

将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管,置36±1℃温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进

行。

3.分离培养

将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃温箱内,培养18-24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。

4.证实试验

在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置 36±1℃温箱内培养24±2h,观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。

5. 报告

根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。

四．总结

1.实验步骤多且繁琐，因此需要小组成员的共同协作，从实验器材的刷洗到检样的稀释，以及培养基的配制等等都是需要每个成员认真密切配合的，如果哪位成员粗心大意或者偷懒少做步骤都会导致实验

结果的变化，而这是我们食品工作者的禁忌。所以说，与队友的配合

和一丝不苟、任劳任怨的精神是至关重要的。

2.作为一个学生，很多东西都不懂，因此做实验的时候，必须要阅读实验步骤和实验要求，最重要的是认真听取老师的观点和方法以及注意事项。

3.实验过程中，我们每个人都难免会有出错或者是不懂得地方，这时候一定要虚心求教，不能不懂装懂。尤其是当队友提出我们不正确的时候，不能不服气，更不能莽撞恶语伤人。

5.做实验时我觉得我的技术还不娴熟，一些细节还掌握不够比如涂片始终涂不均匀，导致镜检时观察到的现象总是一团一团或一对一对的。还有一个问题就是，虽然按照严格的步骤进行了操作，但就是做不出结果，现实与期望的相差太远，我想这里面的原因就是因为技术和细节没有达到标准要求。

6.通过这次试验我认识到团队的力量是无穷的，个人太过渺小了。一粒沙虽微不足道，但聚沙能成塔；一滴水渺小无比，但汇集能成海。这个实验要想成功团队各个成员要有明确的分工，我们小组做的实验之所以不太成功，一方面的原因就是分工不太明确，每个人对自己的任务都不太清楚，尤其是我自己更不清楚，做实验时有点无所事事。

7.这次做实验虽然出现了诸多问题，但是我还是受益匪浅学到了很多知识。