血虚证实验动物造模及其证候的检验与评估

血虚证实验动物造模及其证候的检验与评估

高维琴

2006711047

摘要：查阅近10年来有关中医血虚实验研究方面的医学资料，对现行各种血虚实验方法和观察指标进行了文献回顾与总结，并对其目前存在问题及未来发展作一讨论。从而为今后实验动物证的研究提出新的思路。

关键词：血虚证；动物模型；检测指标

血虚证[1]是中医的基础病证，主要表现为营血亏损。要阐明血虚证的本质和病理生理，以及中药治疗血虚证的机理，动物实验研究是不可缺少的途径。而要进行实验研究，首先必须有一个标准化的血虚证动物模型，这是中医药现代化研究的重要环节。许多科研工作者在这方面做了探索和努力，然而至今尚无统一的造模规范程序和公认指标。近年来，随着对血虚证研究的不断深入，对血虚证动物模型的研究也有新的进展。尽管动物模型在当前还不能准确反映人体血虚证的全部实质，但作为替代实验对象，已在血虚证发病机制探讨及中药治疗研究等方面发挥了重要作用。现对目前所已有多种血虚证动物模型制作方法，其特点及检测指标作一总述。

1中医对血虚证的认识

中医理论认为，血虚多因失血过多，血液生化之源不足，或因瘀血阻滞，新血不生等原因引起。临床表现为面色苍白或萎黄、皮肤毛发枯黄、唇舌及指甲无华、头晕、心悸失眠、手脚发麻、脉细弱无力等。

祖国医学所指血虚内涵丰富，从病因、临床特点与现代医学的贫血有密切的关系[2]。现代医学中贫血包括低增生性（再生障碍性贫血、骨髓病性贫血）、红细胞大量破坏或丢失（溶血性贫血和失血性贫血）、成熟异常（缺铁性贫血、巨幼细胞性贫血、中海贫血和铁幼粒贫血等）。且经研究发现[3,49]，血虚证的症状在贫血患者中有较高的出现率。因此可以借鉴现代医学对贫血的研究方法来帮助建立中医血虚证的动物模型、检测指标。

2血虚证动物模型

血虚证动物模型一般用大鼠、小鼠、家兔等制备。

2.1失血性血虚证动物模型

2.1.1一般制备方法

小鼠，体重20～22g，尾部放血0.5ml／只，失血后24h左右即可；大鼠，体重180～200g，尾部放血1.5～2ml／只，隔日1次，连续5次；家兔放血占全血量30%，狗按40ml/kg放血，可反复几次，即可造成失血性贫血血虚动物模型[4]。

本类模型多为急性失血性血虚证，其制作思路不甚符合中医的生理病机，不能够充分反应中医的血虚证特点，不是中医血虚证的较好造模选择。目前，多采用放血的同时结合其他方法制备慢性失血性血虚证动物模型。

2.1.2放血加适当限食方法

欧敏等[5]每次由兔耳中央动脉、静脉及耳缘静脉放血，放血量为全身血容量的10％，隔日1次，共7次。自造模之日起，家兔改为半量喂养。

桂蜀华[6]等采用每日小鼠尾部放血25滴，同时配合喂养低营养精面粉。通过对血红蛋白的动态监测，证实第3周小鼠血红蛋白显著降低，停止放血后，继续

喂精面粉7d，血红蛋白维持在原有水平不再回升。

2.1.3综合放血法

梁毅等[7]采用慢性放血配合饥饿、疲劳法，制作出复合血虚证小鼠模型。具

体方法：放血。由眼眶后静脉丛放血6～8滴（约0.5m1），隔日1次。直至模型成功。控制饮食。自造模之日起改变其正常饮食量，控制在每日50g／kg体

重，自由饮水。劳倦。小鼠每天在温水池中强迫游泳2次，每次游泳时间不定，以即将下沉为限，持续15～20d。一般在造模第15天起显现血虚证症状体征。

失血法方法简单，指标明确，不需特殊设备，可有效降低外周血中全血细胞数量，但放血量难以精确控制，模型间差别较大。着眼于直接造成外周血中的细胞数量减少，对机体造血系统功能的影响不大。

2.2化学损伤性血虚证动物模型

2.2.1溶血性血虚证

乙酰苯肼（APH）是一种强氧化剂，对红细胞（RBC）有缓慢的进行性氧化损伤作用，突出表现在干扰RBC内葡萄糖-6磷酸脱氢酶（G-6-PD），使RBC 易于崩解而出现溶血性贫血。

制备方法：选用Wistar大鼠，皮下注射2％APH生理盐水溶液，剂量为10ml ／kg体重。实验分一次性给药和实验第1、4、7天3次给药两种，后者第2、3次给药剂量减半。补血中药可防治和逆转由APH所致血虚证[8]。

小鼠皮下注射2%乙酰苯肼0.3ml/只，共2次；或在1、4、7天皮下注射乙酰苯肼0.2g/kg、0.1g/kg、0.1g/kg，第9天造成模型；或于第3天皮下注射乙酰苯肼0.2g/kg，第7天造成模型。大鼠于第1、4天皮下注射乙酰苯肼0.16g/kg、0.08g/kg，8天造成模型，或两次剂量均为0.2g/kg，10天造成模型[4]。

溶血性血虚操作较失血性血虚更为方便，但由于红细胞变形及碎片的干扰，镜检计数较困难，以红细胞压积法代替镜检计数较为准确。着眼于直接造成外周血中的细胞数量减少，对机体造血系统功能的影响不大。

2.2.2骨髓抑制性血虚证

环磷酰胺（CTX）是常用的抗肿瘤药物和免疫抑制剂，是细胞毒制剂，其作用机制是抑制骨髓功能，使造血细胞生成减少。

小鼠以CTX100mg／kg体重腹腔注射1次，4天后外周血白细胞数明显下降。大鼠以CTX灌胃，首次60mg／kg体重，1周后改用20mg/kg体重，3～4天1次，共2次；用30mg／kg体重，3～4天1次，共2次；大鼠以CTX静脉注射，第一周10mg ／kg体重，给药2次，第二周15mg／kg体重，给药1次，均可形成白细胞减少模型[9]。

此种造模方法简单易行，用量及时间可灵活掌握。但其对红细胞作用不如对白细胞明显，且持续时间较短，如果受试药物显效较慢，模型动物血象即自然恢复，甚至出现反跳现象[10]。

丝裂霉素应用法:丝裂霉素是抗生素类广谱抗肿瘤，可抑制DNA复制，不良反应为骨髓抑制，以白细胞和血小板下降明显。马里兰应用法:又名百消安，属磺酸酯类，在体内解离后起烷化作用，小剂量即可明显抑制粒细胞生成，剂量提高可抑制全血象。顺铂致大鼠贫血模型:顺铂是常用的金属铂的络合物，为广谱抗肿瘤药，它能与DNA结合形成交叉键，防止其复制，高剂量时亦能阻止RNA 和蛋白质的合成，可骨髓抑制[4]。

2.2.3复合血虚证模型

目前，化学损伤模型还采用APH与CTX联合使用的复合血虚证模型。采用

分次给药法:环磷酰胺总剂量为160mg/kg与乙酰苯肼总剂量为60mg/kg。分别于第一天，第四天皮下注射乙酰苯肼20mg/kg、40mg/kg，第四天起，每日腹腔注射环磷酰胺40mg/kg，连续4日。模型小鼠在注射后第4天即出体温显著降低，游泳时间缩短、血象异常的表现。用当归补血汤能减轻骨髓细胞超微结构的损伤，显著增加血虚模型小鼠的红细胞、白细胞数，降低网织红细胞在外周血红细胞中过高的比例[10]。

袁久荣[11]等于造模第1天和第4天分别给予小鼠CTX60mg／kg体重，第4天和第7天分别给予APH0．1mg／kg体重制备血虚证模型，造模后第5天，小鼠出现懒动、竖毛、少食、体重下降、尾色苍白晦暗等现象。造模后第11天模型小鼠外周血红细胞计数、血红蛋白量、白细胞数等均显著降低。给予补血中药方剂的小鼠各项指标均显著高于模型小鼠。

此种造模方法与目前常用的血虚模型相比，从双重环节造成动物血虚，使模型动物的病理、生理变化不再局限于某一方面。采用此方法造模，模型动物存活率较高，血虚状态的持续时间相对较长[12]。

2.3放射性损伤血虚证动物模型

60Co射线等照射动物全身可使动物造血干细胞和祖细胞减少，骨髓造血机能受到抑制，从而使全血细胞下降，这种血虚类似临床上的再生障碍性贫血。

在以往的文献报导中[13]，常用的骨髓抑制性贫血小鼠模型的造模方法常用的主要剂量从7.5Gy～2Gy不等

单纯的60co照射，高、中、低剂量组均能使全血细胞数和骨髓有核细胞数下降，高剂量组死亡率高，低剂量组自愈倾向明显，中剂量组虽避免了上两种缺陷，但粒系下降明显，红系和血小板下降不很理想[14]。

造模效果明显，但需特殊设备，且照射量的控制有一定难度，过小达不到损伤要求，偏大又会导致动物死亡，有时药物的作用难以观察。

2.3.1复合造模

陈志伟[15]通过正常组、单纯照射组、单纯环磷酰胺注射组、照射加环磷酰胺注射组和照射加环磷酰胺加氯霉素注射组等复合造模比较骨髓造血情况，以期建立适用疗效观察的骨髓抑制性贫血小鼠模型。结果根据死亡率和全血细胞数分析发现，复合造模照射加环磷酰胺组的效果最为突出。方法：照射后给予环磷酰胺注射3d。尤以2Gy+50mg环磷酰胺组效果最佳。

复合造模全血各系细胞数全面下降，模型稳定，复合造模的优势在于更符合骨髓抑制的临床表现：全血下降，骨髓有核细胞明显减少。辐射和化疗造成骨髓抑制的机理不同：放射线直接损害干细胞和骨髓微环境，一定剂量后能造成骨髓抑制，对三系尤其对粒系造血影响明显。细胞周期非特异性烷化剂环磷酰胺能通过烃化作用直接破坏DNA并阻止其复制，主要作用是抑制骨髓，引起细胞下降，对粒细胞和红系的影响非常明显，对血小板作用较轻。复合造模的药效叠加造成第3天起全血下降，并且可持续一周以上，该法操作简便，复制周期短，成功率高的优点，是观察药物对骨髓抑制作用比较理想的动物模型[14,15]。

2.4免疫介导型血虚证动物模型

2.4.1淋巴细胞输注介导动物模型建立

机理：先使模型动物免疫功能严重受损，再输人一些特定的免疫活性细胞。这些细胞在宿主体内生存，使宿主出现造血抑制，引起全血细胞减少。可能是T 细胞通过细胞毒性及其释放的抑制性细胞因子，直接抑制造血或经凋亡导致骨髓衰竭。

一般方法为[16]：取DBA／2小鼠，断颈处死，95％乙醇浸泡消毒后，无菌条件下取出胸腺及颈、腋下、腹股沟淋巴结，加RPMI1640培养液，除去表面血污及黏附的结缔组织后，制成单细胞悬液，细胞计数，调节细胞浓度为1×106／ml，其胸腺细胞与淋巴结细胞比为1:2，并鉴定细胞活性应在95％以上。Balb／c小鼠经X射线6.0Gy／3min亚致死剂量照射后1--4h内，立即经尾静脉输入上述细胞悬液，每只0．2ml。但由于模型小鼠在短时间就全部死亡，推测由于射线剂量过大，故现常用5.5Gy的剂量处理小鼠。实验表明[7,17]，采用免疫介导法复制的小鼠再障模型均在11～14天表现为皮毛枯搞、唇色眼睑苍白、拱背消瘦等中医血虚证临床特点，以及全血细胞减少、骨髓有核细胞下降等“髓不生血”的病理特点。

将正常亲代小鼠的淋巴细胞输注到杂交第一代小鼠体内也可以诱导AA，经过和未经过非致死剂量照射的子代小鼠会在2～3个星期内发生致命性的全血细胞减少。但经过照射所建立的模型更加符合人类AA的发病特点[18,19]。

此类模型具有复制成功率高、稳定性好的特点。并且还能和人类AA表现出相似的病理生理过程，使得研究者可以动态观察病情发展，更好地了解发病机制制作复杂，条件要求高。

2.4.2病毒感染介导动物模型建立

持续的病毒感染可以使得机体免疫系统在清除病毒过程中发生异常而导致骨髓的衰竭。

Mayer A.等[20]建立了巨细胞病毒相关AA（CMV-AA）的动物模型，用巨细胞病毒持续感染小鼠，出现重要骨髓网状间质细胞的缺失及功能的损害。同时检测到编码必需的造血因子粒细胞集落刺激因子（CSF）和白介素L-6的基因表达下降。

2.5运动性贫血性血虚动物模型

赵杰修等长期递增负荷跑台运动作为实验手段。跑台运动方案以30m/min、0%坡度和1min/次为起始，运动时间以2min/次的速度递增、运动频率前2周为1次/天，后3周为2次/天。跑台组大鼠进行递增负荷跑台训练（BCPT-96型）5周，跑台坡度为0，速度为30米/分，每周训练6天，前2周每天训练1次，后3周每天早晚各1次。训练计划为:第1次训练时间为1分钟，之后以2分钟/次的速度递增，最后1次训练时间为95分钟。跑台组大鼠如果训练过程中出现力竭症状:连续施加机械刺激大鼠不能继续跑动、下跑台后腹部触地严重呈“甲鱼状”，则允许其休息2～5分钟。实验结果显示运动组大鼠Hb、RBC、Hct指标水平显著低于正常对照组大鼠，并且，多次的血细胞分析结果表明贫血指标结果并非偶然，而是具有可重复性[21,22,50,51]。

3血虚动物实验中采用的观察指标

3.1血虚与四诊检测指标

卢文丽[23]等观察不同品系小鼠虚证四诊表现的异同，检验课题组已经建立的小鼠四诊工作站的适用范围。复制气、血两种虚证模型。以体重、饮水、摄食、腋温、爪和尾显微数码拍照获取反映红色程度指标r值、晚间35s自主活动计数，并结合外观检测等四诊指标，对各虚证各模型进行评价与比较。证明课题组已经建立的小鼠四诊工作站是可靠的。

3.2血虚与外周血象

动物各种血细胞及凝血指标：外周血红细胞数、血红蛋白含量、红细胞压积、平均红细胞体积、APTT、PT、PLT

谭洪玲等[24]采用60Co|?射线照射、环磷酰胺腹腔注射和综合放血法制作血虚证动物模型，检测外周血各血液成份、骨髓造血干/祖细胞、CD34+细胞等指标变化。3种血虚证小鼠外周血中的主要血液成分下降，骨髓造血干/祖细胞的集落生成能力降低，骨髓中CD34+细胞减少。从外周血象来看，60Co|?射线照射建立的血虚证模型白细胞降低明显，环磷酰胺注射建立的血虚证模型白细胞和红细胞降低明显，综合放血法建立的血虚证模型红细胞和血红蛋白降低明显。

梁毅等[7]采用免疫介导法制作的血虚证小鼠模型在处理后的第8天即出现明显的血虚证症状体征，在血液细胞学检查方面，主要表现为红细胞计数明显下降，白细胞系、血小板系则无明显改变。

王若永等[25]应用苯肼致小鼠发生溶血性贫血，建立急性溶血性贫血模型，可使C57BL／6小鼠短期内产生明显的急性溶血性贫血。症皮肤黏膜颜色苍白体重下降，饮食量减少，活动能力降低，贫血症状典型；外周血红细胞数量、血红蛋白含量、红细胞压积降低。

APTT为活化部分凝血活酶时间，是内源性凝血功能的综合性检查指标，PT为凝血酶原时间，是外源性凝血活性的综合性检查指标。若骨髓抑制严重时，三系均降低，APTT、PT延长。苏晓妹等[26]采用ip吉西他滨导致全血细胞下降动物模型观察阿胶对化疗后动物模型骨髓抑制的作用，结果发现中、高剂量阿胶组白细胞计数WBC，红细胞计数RBC，血小板PLT均较模型组增高，而PT、APTT，明显缩短，且疗效与剂量成正比关系。提示阿胶时化疗药物所致的骨健抑制具有一定的治疗作用。

3.3血虚证与免疫功能

包括细胞免疫、体液免疫及红细胞免疫等方面。

淋巴细胞转化率、IL-2及TNF活性均为反映细胞免疫功能的指标。袁栎等[27]应用环磷酰胺造成小鼠血虚模型，观察血虚小鼠此3项指标变化，结果与正常组相比，血虚小鼠淋巴细胞转化率显著降低（P<0.01），血虚小鼠分泌的IL-2活性明显低于正常组，血虚小鼠TNF活性显著高于正常组。

杨若丽等[28]应用同样方法造模后，观察到血清IgG含量与正常组相比下降。

IL-2主要由CD4细胞分泌，参与机体的免疫应答与调控。IL-6参与免疫应答等多方面的作用。苗明三等的研究表明[29]，血虚证小鼠血清IL-2、IL-6均显著减少。补血中药能使其显著回升。

当小鼠骨髓造血机能损伤后，脾脏可代偿性髓外造血，因此脾脏的重量改变可间接了解小鼠的造血能力。方晓艳[30]采用失血法和环磷酰胺并用法复制气血双虚小鼠动物模型。解剖发现，其重要的免疫器官胸腺、脾脏均明显小于空白对照组；脏器组织切片镜检结果表明模型组各小鼠胸腺、脾脏均发生严重萎缩、皮质明显变薄、细胞稀疏、脾小结明显缩小、淋巴细胞数明显减少，说明模型组小鼠的免疫功能显著下降。

采用免疫介导法制作的血虚证小鼠模型，在处理后的第8天即出现明显的血虚证症状体征：胸腺、脾脏器官的反应尤其敏感，表现为明显萎缩，其重量及相应指数较之正常小鼠有极显著性的差（P<0.01）。而且于第15天起，即出现濒死状态，小鼠陆续死亡，这些反映出其骨髓造血功能衰竭、免疫器官严重受损的病理特点。应用综合放血法制作血虚证小鼠模型在胸腺、脾脏的重量及比值方面，突出表现为胸腺萎缩（但不及免疫介导组明显），指数较正常明显下降（P<0．01）；但脾脏在重量和指数两项指标上并无异常改变[17]。

杨耀芳等[31]应用环磷酰胺（0.01g/kg）ip小鼠，随着血虚模型的形成，小

鼠的红细胞C3b受体花环率（RBC-C3bRR）下降，血清抗心磷脂抗体（AGA）:AGA IgC、AGA IgA含量明显升高，体重下降AGA IgG及脾脏、胸腺重量减轻。

梁毅等[32]利用放血和控制饮食法复制家兔血虚模型，观察各项免疫指标。结果血虚模型家兔较正常组家兔其RBC-C3bR花环率显著降低，而RBC-IC花环率显著升高，血虚状态时家兔的T、B淋巴细胞转化率均较正常时低（P<0.01）。

3.4血虚证与骨髓造血细胞及造血微环境

小鼠骨髓中CD34+细胞的比例可反映骨髓中造血干／祖细胞的数量；细胞周期分布状态可反映细胞的增殖状态[33]。谭洪玲[24,35]采用60Co|?射线照射、环磷酰胺腹腔注射和综合放血法制作三种血虚证动物模型，结果3种血虚证小鼠骨髓造血干/祖细胞的集落生成能力降低，骨髓中CD34+细胞减少，骨髓细胞周期紊乱，3种模型都先后出现了G2/M期阻滞，以|?2射线照射组出现最早，与照射组不同的是CTX组与综合放血组在造模后都先后在第3、7天出现了S期细胞峰值。

骨髓有核细胞数直接反应了骨髓造血功能状态。杨岚等[35]采用慢性失血法、溶血法和骨髓抑制法制造三种血虚证模型，三种血虚证模型骨髓有核细胞数均显著降低。失血性血虚模型组和溶血性血虚模型、Ｇ2／S期细胞比例升高；骨髓抑制性血虚组抑制骨髓造血干细胞由G1期向G2／S期转化。

于震等[36]观察到小鼠腹腔注射环磷酰胺后，模型组小鼠骨髓DNA含量明显降低。

刘永学等[37]采用不同剂量的.射线造成小鼠不同程度的血虚状态，然后对血虚证小鼠骨髓和脾脏有否凋亡及凋亡的程度进行了认定。实验结果显示，照后24h 之内各剂量组小鼠骨髓及脾脏细胞均检测到了明显的凋亡，且与血虚症在程度上只有一致性，随着时间的推移，凋亡细胞逐渐消失，与此同时，血虚证的表现却日渐明显。如此看来，造血细胞早期发生的凋亡，可能影响了造血干/祖细胞的数量和质量，后者的改变又通过外周血细胞数量的下降被慢慢体现出来。

造血微环境是造血细胞定居于其中并发育和分化的部位，它不单单是为造血细胞提供场所和营养，而且积极参与对造血干细胞定居和分化的调控，并对造血祖细胞的增殖以及成熟和释放产生影响，从而在血细胞生成的全过程中起调控、诱导和支持作用。

金若敏等[10]采用乙酰苯肼和环磷酰胺联合造成小鼠血虚状态，电镜观察到骨髓超微结构发生变化，细胞出现变性、坏死、凋亡，表现为细胞肿胀、细胞膜消失、线粒体肿胀、嵴断裂或消失、内质网、核糖体减少或消失，核染色质周缩裂解造血微环境遭到破坏，骨髓造血重建活性下降，骨髓有核细胞数量及其增殖速度下降。

粱毅等[17]研究血虚证小鼠模型骨髓造血祖细胞催外增殖水平及变化规律以H-Balb／c小鼠为实验对象．分别采用免疫介导法和综台放血法制作血虚证模型，采集其骨髓有核细胞进行培养。结果两种血虚证小鼠模型的CFU-E、BFU-E、CFU-GM集落形成较空白对照组显著下降．尤以前者为甚；中药复方地甘口服液、红霖四物口服液均可促进模型小鼠骨髓细胞的增殖。

佟丽等[38]应用细胞因子寡核苷酸表达谱芯片检测放射线致血虚小鼠不同脏器组织内造血相关细胞因子差异表达情况。结果显示，放射线照射后不同时间点各脏器组织血虚组均有表达下调的基因，这些差异表达的细胞因子基因的功能大致分为3类：促细胞生长或增殖、免疫调节和诱导血细胞的形成或促造血祖细胞的集落形成。实验中检测到辐照后2h参与免疫应答的细胞因子基因IL-2首先下

调，6h后间接促进造血的IL-4、IL-8R表达下调，提示造血系统功能开始下降，到12h时，促红细胞生成的PDGF-R、促GM-CSF生成的IL-l8及主要造血因子GCSF 本身均下调。脾脏组织在照射后12h发现1个上调的基因IL-12b，该因子具有直接促进骨髓干细胞的增殖和形成集落作用。肾脏组织在照射后6h出现大量下调基因，其中包括C-fos、C-jun原癌基因，它们均是在核中参与转录调控的基因。

3.5血虚证与体液因子

EPO是一种由肾内皮细胞、上皮细胞产生的具有生物活性的糖蛋白，能调控红系造血干细胞的分裂、分化和增殖。小鼠脾条件培养液（SCM）中亦各有红系造血祖细胞的集落刺激因子。陈玉春等[39]通过灌胃环磷酰胺造成大鼠血虚模型，而后观察八珍汤对血虚大鼠SCM中EPO样生长因子生成的影响，结果发现血虚大鼠SCM中EPO样生长因子水平明显低于正常大鼠，提示CY对T淋巴细胞分泌EPO样生长因子有抑制作用。

高月等[40]通过.射线全身照射小鼠制成血虚证模型，应用四物汤和芍药苷可增强血虚证小鼠骨髓造血干祖细胞的集落形成能力。芍药苷可促进骨髓基质细胞分泌造血因子（G-CSF、GM-CSF、PDGF-a）等，抑制造血抑制因子（M-C IP）的分泌。

3.6血虚证与血液流变学

夏洪生等[41]应用环磷酰胺造成大鼠血虚模型，结果与对照组相比，红细胞电泳时间延长，电泳率明显下降，说明环磷酰胺腹腔注射对大鼠的红细胞聚集性有明显的影响。

3.7血虚证与微循环

欧敏等[17]采用间日放血法合限制饮食法复制家兔血虚模型，观察到血虚家兔红细胞变形性降低。

3.8血虚证与红细胞膜酶。

欧敏等[5]通过动物实验发现，血虚家兔模型表现出超氧化物歧化酶（SOD）活力的降低，而过氧化脂质（LPO）水平增高，认为在血虚状态下，红细胞膜ATP的来源障碍，新陈代谢降低，机体清除自由基能力降低，自由基过剩累积，细胞膜的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，从而导致SOD下降，LPO水平上升。

3.9生育功能的改变

龙子江等[42]用放血法制备小鼠血虚证模型，发现血虚小鼠阴栓出现及胚胎数较正常组降低，其子宫、卵巢重量减轻，卵巢表面排卵斑和生长卵泡减少，表明血虚证降低小鼠生育能力。

3.10视网膜变化

亢泽峰等[43]等研究了血虚证大鼠视网膜的病理变化，发现随着血虚证的进展，视网膜病变逐渐加重，早期大鼠视网膜各层结构轻度水肿，内外核层细胞排列稍紊乱，后期视网膜出现稳定的萎缩病变，内、外核层细胞数减少，细胞密度、视网膜厚度降低。

3.11代谢组学研究

高月等[44]通过检测辐射损伤所致血虚证及用四物汤干预治疗后小鼠内源性代谢物的变化，发现小鼠在血清代谢组学、胸腺提取物的代谢组学、脾脏提取物的代谢组学、骨髓提取物的代谢组学变化方面都呈现出正常组、辐射损伤所致血虚证模型组以及四物汤反证组之间能够明显的区分的现象。具体表现有：磷酸化胆碱、肌酸、低密度脂肪酸的含量上升，药物处理后其含量下降；葡萄糖、胆碱、乳酸的含量下降，给予四物汤处理后其含量上升。乳酸水平的异常提示机体能量

代谢失调，机体无氧氧化功能受损；胆碱是乙酰胆碱的重要前体，是体内的重要的甲基供体，是能量代谢和脂类代谢的重要参与者；四物汤反证后，能够明显逆转上述效应，因此可以推测四物汤能够改善机体的能量代谢，辐射损伤所致血虚证的机制可能与机体无氧氧化功能受损、能量代谢和脂类代谢失调、细胞内外渗透压平衡破坏、机体免疫功能失调有关。

4关于现存问题的思考和未来发展的展望

4.1关于血虚模型制作的思考

综上所述，小鼠血虚证模型的造模方法主要有模拟中医传统病因建立动物模型（如控制饮食加放血法塑造失血血虚模型）、采用西医病因病理复制动物模型（如免疫介入法塑造血虚证动物模型）。尽管已研究出多种血虚证模型，每种模型都有其特点，但每种模型也同时都存在其局限性和片面性。现有的任何模型都尚不能全面反映中医理论指导下的血虚证本质。在以上血虚证模型中存在的及需进一步完善的问题有：

各血虚证模型主要着眼点停留在血象上，涉及脏腑的虚证模型较少，肝血虚、心血虚的模型更少；脏腑兼证的模型更少，这与临床复杂的证型存在一定的距离，故有必要开拓脏腑虚证模型的范围。

同一方法造模得出不同证的讨论，环磷酰胺塑造的模型有人认为是脾虚证，有人当作血虚证，其界限的量化指标究竟如何呢?这些问题需要解决。证的标准必须统一，造模的构思要符合临床实际，这就必须基于广泛和大量的临床流行病学调查，由此而模拟出符合临床的客观模型。

古今对“毒”的认识不一致，古人所说的毒范围很广，如用环磷酰胺塑造小鼠证的模型，究竟是某种虚证，还是古人所云的中毒?不见得部分符合中医证的标准就是合理的模型。

今后造模须遵循以下原则：应严格、准确地按照中医病因学说（如六淫、七情）的理论和临床发病的实际塑造动物模型；造模后动物表现出的症候必须与临床一致或接近；模型动物经过合理的辨证论治治疗后必须有效或部分有效；因动物也存在个体差异，故有必要筛选出自然状态下的虚证动物，在此基础上发展虚证模型，必将更符合中医的虚证理论；应该建立起实验动物模型非创伤性的主要辨证方法和手段，从而使证的研究能够建立在客观化和标准化的基础之上。

中医临床病证是多方面的，为了能更好的反映临床，就目前所有的技术手段来看，动物模型的复制应采用复合方法造模，从多环节使动物模型更接近临床病证。更符合中医的血虚证[45-47]。

4.2关于血虚实验中采用客观指标的思考

现有的血虚实验研究，无论是判定成模标准，还是确定用药疗效，基本上都是以现代医学的客观指标为基准，对于各种血虚模型的症状诊断，目前尚无统一标准。中医的血虚证与西医的贫血必定不是完全对等的事物，不能完全借助现代医学的客观指标来作为血虚的诊断标准。此外，现有的各种血虚模型中采用指标众多，且多为阳性的，但没有集中趋势，看不出哪种病理变化是根本性的。显然，在血虚证的各种动物模型实验中，应该选择相关性强的客观指标作为诊断的辅助依据，以提高模型的可靠性。因而有必要开展大规模实验指标的比较筛选研究，从而得出中医证型与微观指标的相关性[48]。

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