食品专业毕业论文修订稿

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重组乙醛脱氢酶的分离纯化及其酶学性质研究姓名:

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重组乙醛脱氢酶的分离纯化及其酶学性质研究

摘要：【目的】研究工程菌 BL21(DE3)/pET32a-istALDH产乙醛脱氢酶的纯化和酶学性质。【方法】工程菌经过 IPTG 诱导后产生乙醛脱氢酶，通过Ni-NTA 亲和层析纯化，得到纯度较高的酶蛋白，并对纯酶进行了酶学性质及动力学研究。【结果】酶最终被纯化了9倍，并达到电泳纯。经过SDS-PAGE 测得该酶的分子量约为57 kDa。以乙醛为底物，酶促反应的最适温度为40℃，最适pH值为，热稳定性和酸碱稳定性相对较差；金属离子K+、Li+、AL3+对酶均具有激活作用，而Ag+、Zn2+、Gu2+对酶促反应具有强烈的抑制作用，酶活性基本丧失，在化合物EDTA、DTT中活性明显提高，SDS 使酶完全丧失活性；反应的最适底物是乙醛和NAD+,乙醛和NAD+动力学常数Km值分别为L和L，最大反应速度Vmax分别为mg和mg。【结论】研究为重组乙醛脱氢酶纯酶的纯化、得到稳定性好、活性高的酶反应体系及利用该酶进行催化反应和工业化应用提供了重要参数。

关键词：乙醛脱氢酶；纯化；酶学性质

Study on Purification and Characterization of Recombinant ALDH Student majoring in National Life Science and Technique Talent Training Base? Jie Xu

Tutor Zhaoxin Lu

Abstract：[Objective] To purify and characterize recombinant aldehyde dehydrogenase expressed in engineered strain E. Coli BL21(DE3)/pET32a-istALDH. [Methods] The aldehyde dehydrogenase gene was expressed in engineered strain after IPTG induction and the crude enzyme was obtained by sonication. We purified the recombinant aldehyde dehydrogenase by using metal chelate affinity chromatography on a Ni-NTA column. Then we characterized catalytic kinetic parameter of purified enzyme. [Results] The molecular weight of aldehyde dehydrogenase measured by SDS-PAGE was kDa. The enzyme had an optimum temperature at 40℃, and an optimum pH of . It was unstable with thermostability and pH stability. Metal ions K+、Li+ and AL3+ could active the enzyme activity, while Ag+、Zn2+ and Gu2+could strongly inhibit the enzyme activity. The compounds EDTA and DTT could active the enzyme apparently while SDS could greatly inhibit the enzyme. The optimal substrates were acetaldehyde and NAD+ with the kinetic constant Km of mmol/L and mmol/L, respectively and Vm of mg and mg, respectively.[Conclusion] These results may provide an important basis for industrial applications of the recombinant aldehyde dehydrogenase.

Key words: aldehyde dehydrogenase; purification; characterization

引言

目前与酒精中毒关系密切的许多候选基因中研究最多的就是参与乙醇代谢的乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase，ADH)和乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)[1-2]。前者使乙醇转化为乙醛，后者使乙醛进一步转化为乙酸，最终分解为二氧化碳和水【3】。乙醛脱氢酶属于氧化还原酶类，广泛存在于微生物、植物和动物体中【4】。在人体中，一般都存在前一种酶，而且数量基本相等，但缺少后一种酶的人就比较少，此酶突变后活性缺失，导致乙醛在肝脏内大量累积，导致肝脏损伤及某些癌症疾病【5-6】，因此在细胞解毒研究中乙醛脱氢酶受到高度关注。

国内外对于乙醇脱氢酶的酶学性质、分离纯化等研究比较成熟，而对于ALDH的研究较少【7】，国内已有相关研究如乙醛脱氢酶基因在甜菜、菠菜和水稻中【8-10】的表达等等，目前，ALDH的提取一般是以动物为原料，主要是从动物的肝脏中提取，这制约了该酶的产量[11-12]，通过微生物发酵、分离纯化ALDH具有很大的市场前景，本课题通过从重组大肠杆菌中分离纯化得到ALDH，并对其进行酶学性质的测定,为乙醛脱氢酶的工业化应用奠定基础。乙醛脱氢酶分离纯化及其性质的研究对将来控制和减少酒精性肝病的预防和健康教育工作有重要意义

1材料与方法

材料

菌株

基因工程菌E. Coli BL21(DE3)/pET32a-istALDH由食品院酶工程实验室构建、保藏。

培养基

LB培养基（w/v）：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10， pH 。121℃高压灭菌

20min。

主要试剂

IPTG(上海生工生物有限公司)；牛血清白蛋白（国药集团化学试剂有限公司）；凝血酶为标准品（中国药品生物制品检定所）；琼脂糖（电泳级）（中国医药（集团）上海化学试剂公司）；考马斯亮蓝G-250（美国Sigma公司）；酵母提取物、胰蛋白胨等（英国Oxoide公司）；乙醛、甲醛、丁醛、戊醛等醛类物质；EDTA、DTT、2-ME、SDS、PMSF等化合物；其它试剂均为市售分析纯。

主要仪器

手体式压力蒸汽灭菌锅（上海医用核子仪器厂）

BC/BP-225SB海尔冰柜（海尔集团）

OPIONpH计MODEL818

PYX-DHS-50X65 隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）

UV-1601紫外分光光度计(日本SHIMADZU公司)

HYG-A全温摇瓶柜(太仓实验设备厂)

Sartorious电子精密天平(北京赛多利斯天平有限公司)

SW-CJ-IBU洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)

Centrifuge 5804R冷冻离心机(德国eppendorf公司)

BS-100A自动部分收集器(上海沪西分析仪器厂)

BIO-RAD PAC1000微型电泳仪(BIO-RAD 生命医学产品有限公司)

凝胶成像系统Gel Doc2000 （BIO-RAD公司）

1．2 方法

乙醛脱氢酶的表达和制备

从保存于-70℃超低温冰箱的基因工程菌甘油菌中挑取少许菌液划线于LB平板（含氨苄青霉素100μg/mL和%葡萄糖）,37℃培养12-14h，挑单菌落接入LB培养基（含氨苄青霉素100μg/mL和%葡萄糖）于30℃、100rpm培养过夜（11h），然后以4%的接种量转接到100mL的LB培养基（含氨苄青霉素100μg/mL和%葡萄糖），37℃、180rpm培养约至OD600为时，加入IPTG至终浓度为ml，15℃、180rpm培养

15h诱导乙醛脱氢酶的表达。将100mL发酵液于4℃、9000rpm离心10分钟收集菌体，重悬于50mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液（pH ）中，冰水浴中超声5s，间歇

10s，400W 破碎15min后，10,000rpm离心15min收集上清即得粗酶液。

乙醛脱氢酶的纯化

用缓冲液(含50mmol/L PBS、L NaCl, pH 平衡床体积为2mL的Ni-NTA小柱，在粗酶液加入5mmol/L咪唑后上样，样品过三次，然后分别用10倍介质体积的浓度为50 、100、150、200、500mmol/L 咪唑洗脱，每2ml收集一管，测定酶活，收集洗脱液后经SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色鉴定纯化蛋白。

乙醛脱氢酶活力测定

酶活测定体系（3mL）： mol/L Tris-HCl， 2mmol/L乙醛， mmol/L NAD+，10 mmol/L 2-巯基乙醇， mol/L KCl，待测酶液。用分光光度法，在25℃、340nm下测定NADH吸光度的变化。定义每分钟催化还原1μmol NAD+所需要的酶量为一个酶活单位。

蛋白含量测定

采用Bradford法【13】，以牛血清白蛋白为标准蛋白，测595nm处吸光值，计算蛋白质含量。

纯度鉴定和分子量测定

采用垂直板SDS-PAGE电泳测定乙醛脱氢酶的纯度和分子量，分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%。

乙醛脱氢酶酶学性质

酶的最适反应pH及pH稳定性

在不同pH的缓冲液（L Tris-HCL缓冲液,；L磷酸钾缓冲液,pH –；L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH –）中测定酶活力，研究酶促反应的最适反应pH。将酶液分别置于不同pH的缓冲液中，30℃保温1 h，按常规酶活测定方法测定剩余酶活力，以未处理的酶活为100%，研究酶的酸碱稳定性。

酶的最适反应温度及热稳定性

在不同温度下测定酶活力，考察酶的最适反应温度。将酶液在不同温度水浴锅中保温2 h，每15min取样测量其对应的剩余酶活力，以未处理的酶活为100%，考察酶的热稳定性。

3 金属离子和其他化合物对酶活力的影响

在不同反应体系中分别加入 mmol/L和 mmol/L的各种金属离子和化合物，测定酶活力，以未加入的酶液做对照，观察金属离子和化合物对酶活力的影响。

不同底物对酶活性的影响

用不同底物取代原测定方法中的底物，测定酶的活力，考察酶的最适作用底物。以原测定方法中的底物测得的酶活力作为对照。

动力学常数Km和最大反应速度Vmax的测定

将酶液分别与不同浓度的乙醛和NAD+底物作用，测定酶反应的初速度，用Lineweaver-Burk 双倒数作图法求出以乙醛和NAD+为底物的Km值和Vmax值。

2 结果与分析

乙醛脱氢酶的分离纯化

经过IPTG诱导表达后的粗酶液活力达到 U/mL，比活力达到 U/mg。粗酶液经过Ni-NTA亲和层析后，经SDS-PAGE检测，只显示单一条带，分子量约为57kD（图1），说明已达到了电泳纯，纯化倍数是粗酶液的9倍，回收率为%（表1）。

表1 重组大肠杆菌乙醛脱氢酶的纯化

Table 1 Purification of acetaldehyde dehydrogenase from E. Coli BL21(DE3)/pET32a-istALDH

Purification step Activity (U) Protein （mg）Specific activity

(U/mg)

Purification fold Yield(%)

Crude extract 1 100 Ni-NTA agarose column

1 BL21(DE3）/pET-32a 细胞破碎液上清;

2 BL21(DE3）/pET-32a-ALDH细胞破碎液上清;

3 Ni-NTA柱纯化ALDH

SDS-PAGE of ALDH purified by Ni-NTA column and thrombase cleavage

1 Supernatant of BL21(DE3）/pET-32a lysate;

2 Supernatant of BL21(DE3）/pET-32a-ALDH lysate;

3 ALDH purified

by Ni-NTA column

乙醛脱氢酶酶学性质研究

酶的最适反应pH及酸碱稳定性

该酶在三种不同的缓冲液体系中反应，由图2可知，乙醛脱氢酶在Tris-HCl缓冲液中比在其他两种中的活性要高，且其反应的最适条件为，在磷酸钾缓冲液和甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中酶活性很低。在其酸碱稳定性实验结果表明该酶在pH 范围内比较稳定（图3），催化活力仍在70%以上，而酶在以下或者以上，酶活下降较快，当pH 值小于5时，酶活力几乎全部丧失，其稳定性差。

图2 pH对酶活力的影响

Effect of pH on activity

图3 酶的pH稳定性

pH stability of aldehyde dehydrogenase

酶的最适反应温度及热稳定性

酶的最适反应温度为40℃，35-50℃范围内，酶活仍在80%以上，结果如图4所示。热稳定性实验表明（图5），该纯化酶在37℃以下处理2小时，酶活基本无变化，当温度超过37℃时，酶活力明显下降。酶在40℃处理1h后剩余活力为原来的70%，温度达到50℃保温1 h后酶全部失活，表明该酶的热稳定性较差。

图4 温度对酶活力的影响

Effect of temperature on activity

图5 酶的热稳定性

Temperature stability of aldehyde dehydrogenase

将乙醛脱氢酶液分别与不同金属离子混合混合反应，按常规方法测定酶活，结果如表2示，在1mmol/L浓度下，金属离子K+、Li+、AL3+对酶均具有激活作用，而Zn2+、Gu2+对酶促反应具有强烈的抑制作用，酶活性丧失，随着金属离子浓度的增大，其变化趋势不明显。EDTA是金属螯合剂对该酶活性具有激活作用，DTT是还原剂，可延缓蛋白质的氧化，尤其保护酶的巯基，从而防止、延缓酶的失活，增加酶的稳定性，具有明显的激活作用，SDS使酶完全丧失活性。

表2 不同金属离子和化合物对酶活性的影响

Table 2 Effect of some metal ions and compounds on activity

Metal ions and compounds Relative activity (%)

1mmol/L

Relative activity (%)

5 mmol/L

K+±±Na+±±Li+±±NH4+±±

Ag+±0

Mg2+±±

Ca2+±±

Zn2+0 0

Ba2+±±

Sn2+±±

Co2+±±

Mn2+±±

Gu2+0 0

Ni2+±±

Fe3+±±

AL3+±±

EDTA ±±

2-ME ±±

DTT ±±

Urea ±±

PMSF ±0

SDS 0 0

不同底物对酶活性的影响

分别以不同底物取代原测定方法中的底物，测定不同底物下重组乙醛脱氢酶的活力，确定酶的最适作用底物。由表3知，NAD+为最适底物，其他底物对乙醛脱氢酶活性均有不同程度的抑制作用，且在甲醛、丙酮醛、苯乙醛、戊二醛中，酶活全部丧失。除甲醛外,随着醛类物质支链数的增加，对该酶的抑制作用增强。

表3 不同底物对酶活性的影响

Table 3 Effect of different substrates on the enzymatic activity

Substrate Relative activity (%)

NAD+100±

NADP+±

Formaldehyde 0

Propionaldehyde ±

Butylaldehyde ±

Valeraldehyde ±

Isobutyraldehyde ±

Benzaldehyde ±

Gutaraldehyde 0

Pyruvaldehyde 0

Phenylacetaldehyde 0

酶的动力学常数

以Lineweaver-Burk双倒数作图法测定米氏常数Km及最大反应速度Vmax，如图6、图7所示，乙醛和NAD+动力学常数Km值分别为 mmol/L和 mmol/L，最大反应速度Vmax分别为mg和mg。

图6 双倒数法作图求底物乙醛的Km和Vmax

Lineweaver-Burk plot for Km and Vmax values of the acetaldehyde

图7 双倒数法作图求底物NAD+的Km和Vmax

Lineweaver-Burk plot for Km and Vmax values of the NAD+

3讨论

一直以来，人们都在研究一些解酒药品和保健食品 , 但这些解酒制剂在人体中起作用时都不符合乙醇在人体中的代谢机理和代谢途径 , 不能从根本上消除饮酒给人体造成的危害【14】。而向人体补充外源性的乙醛脱氢酶是一种有效的弥补内源性乙醛脱氢酶不足的好方法 , 且乙醛脱氢酶在人体内起作用时符合乙醇在人体中的代谢机理和代谢途径 , 是从根本上治疗和缓解各种酒精性疾病的最理想途径【15】。

本实验室克隆表达的乙醛脱氢酶酶活性较高，直接超声破碎菌体即可得到粗酶液，纯化也只需经Ni柱亲和层析即可，操作步骤简单易行，回收率达到%。

但是，经酶学性质研究表明，该酶的热稳定性和酸碱稳定性都相对较差，其最适反应温度在40℃，比较符合人体体温，但人体胃部的pH值大约在左右，而该酶在反应体系时活性几乎全部丧失，所以后续研究该酶的耐酸碱性体质是必要的。

利用微生物生产乙醛脱氢酶不但成本低而且产酶量大【16】。该工程菌的产酶性能相对稳定,解决了自然界中乙醛脱氢酶不足这一问题 , 为后续研究奠定了基础。

致谢

本论文是在指导教师陆兆新教授的悉心指导下完成的，感谢陆老师在我学习试验过程中的关怀和谆谆教诲，悉心指导助我完成以上的研究工作，其兢兢业业的治学风范、严谨的工作态度、敏捷的科学思维使我受益匪浅，其对工作的热忱给予我启迪和鼓舞。在此，谨向陆老师致以最诚挚的谢意。

在实验过程中，本实验室的别小妹、吕凤霞等老师给予诸多的帮助和支持。在此，表示衷心的感谢。感谢本实验室姚正颖、张充博士在实验过程中给予的指导和帮助。

感谢诸位老师四年来的谆谆教诲。

我愿在未来的学习和研究过程中，以更扎实的工作、更丰厚的成果，来答谢曾经关心、帮助和支持过我的所有领导、老师、同学和朋友。

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