第三章_蛋白质样品的制备

高电压技术(第三版) 简答题整理

第一章电解质的极化和电导 ①气体介质的介电常数：1)一切气体的相对介电常数都接近于1。2)任何气体的相对介电常数均随温度的升高而减小，随压力的增大而增大，但影响都很小。 ②液体介质的介电常数：1)这类介质通常介电常数都较大。但这类介质的缺点是在交变电场中的介质损较大，在高压绝缘中很少应用。2)低温时，分子间的黏附力强，转向较难，转向极化对介电常数的贡献就较大，介电常数随之增大；温度升高时，分子间的热运动加强，对极性分子定向排列的干扰也随之增强，阻碍转向极化的完成，所以当温度进一步升高时，介电常数反而会趋向减小。 ③固体介质的相对介电常数：1)中性或弱极性固体电介质：只具有电子式极化和离子式极化，其介电常数较小。介电常数与温度之间的关系也与介质密度与温度的关系很接近。2)极性固体电介质：介电常数都较大，一般为3—6，甚至更大。与温度和频率的关系类似畸形液体所呈现的规律。 3、介电常数与温度、频率关系:1)低温时，分子间黏附力强，转向较难，转向极化对介电常数的贡献较小，随温度升高，分子间黏附力下降，转向极化对介电常数贡献较大，介电常数随之增大，当温度进一步升高时，分子的热运动加强，对极性分子的定向排列的干扰也随之增强，阻碍转向的完成，介电常数反而趋向较小。2)当频率相当低时，偶极分子来得及跟随交变电场转向，介电常数较大，接近于直流电压下测得的介电常数，当频率上升，超过临界值时，极性分子的转向已跟不上电场的变化，介电常数开始减小，随着频率的继续上升由电子位移极化所引起的介电常数极性。 4.电解质电导与金属电导区别：金属导电的原因是自由电子移动；电介质通常不导电，是在特定情况下电离、化学分解或热离解出来的带电质点移动导致。 5温度对电导影响：温度升高时液体介质的黏度降低，离子受电场力作用而移动所受阻力减小，离子的迁移率增大，使电导增大；另外，温度升高时，液体介质分子热离解度增加，也使电导增大。 6.电容量较大的设备经直流高压试验后，接地放电时间长的原因：由于介质夹层极化，通常电气设备含多层介质，直流充电时由于空间电荷极化作用，电荷在介质夹层界面上堆积，初始状态时电容电荷与最终状态时不一致；接地放电时由于设备电容较大且设备的绝缘电阻也较大则放电时间常数较大（电容较大导致不同介质所带电荷量差别大，绝缘电阻大导致流过的电流小，界面上电荷的释放靠电流完成），放电速度较慢故放电时间要长达5～10min。第二章气体放电的物理过程 1.电离形式：①光电离②撞击电离③热电离 ④表面电离：热电子发射、强场发射（冷发射）、正离子撞击阴极表面、光电子发射 2. 负离子的形成：负离子的形成不会改变带电质点的数量，但却使自由电子数减少，因此对气体放电的发展起抑制作用。（或有助于提高气体的耐电强度）。 3. 去游离的三种形式：1)带电粒子在电场的驱动下作定向运动，在到达电极时，消失于电极上而形成外电路中的电流；2)带电粒子因扩散现象而逸出气体放电空间。3)带电粒子的复合。气体中带异

细胞总蛋白的制备, SDS-PAGE,Western Blot

医学生物学研究技术与实验实验报告实验名称：细胞总蛋白的制备,SDS-PAGE，Western Blot 一、实验目的 1.掌握SDS直接裂解细胞法提取蛋白质 2. 掌握Lowry法测定蛋白质浓度的原理 3. 掌握SDS-PAGE分离蛋白质的原理和技术 4. 掌握半干转移的操作和Western Blot 的原理和技术二、实验原理 1.蛋白质提取常见裂解方法极其原理。蛋白质的抽提是指破碎过程中，将生物材料在水，缓冲液或稀盐溶液等适当溶剂中浸泡，使胞内的蛋白质等内容物释放到溶剂中。血浆，消化液和分泌液等体液中可溶性蛋白质，可不经抽提，直接进行分离。细胞内一般蛋白质的抽提，应先将细胞膜或细胞壁破碎，然后用适当溶剂将蛋白质溶出，再用离心法除去不溶物，得到出抽提液。膜蛋白的抽提比较复杂。膜蛋白按其所在位置分为外周蛋白和固有蛋白。外周蛋白通过次级键和膜外侧脂质的性头部鳌和在一起，应选则适当离子强度及PH的缓冲液，其中要好友EDTA，将其抽出。固有蛋白嵌和在膜脂质双层中，通过疏水键于膜内侧脂质层的疏

水性尾部结合。在抽提固有蛋白时，要减弱器与膜脂的疏水性结合，又要使其保持部分疏水基暴露在外的天然状态，这一过程叫增溶作用。较为理想的增溶剂是去垢剂。目前用的去垢剂分为阴离子型，阳离子型，两性离子型，非离子型。增溶后的膜蛋白抽提剂有较好的均一性，便于进一步纯化。纯化后的膜蛋白，可通过透析法去除去垢剂，进行膜蛋白重组。抽提蛋白质的理想条件是尽可能促进蛋白质在溶剂中溶解，而减弱蛋白水解酶活力，以减少细胞的自溶过程。主要是通过选择适当PH，温度，或溶剂，以及加适当蛋白水解酶抑制剂。常见裂解方法有：1 低渗裂解，2 冻融法，3 Triton100或者NP-40等非离子去污剂（比较温柔），4 脱氧胆酸钠、SDS、Triton100 （强烈），5 上样缓冲液（含SDS）＋细胞沸水浴5 min，6 匀浆器。 2.Lowry法测定蛋白质浓度 1. 蛋白质与碱性铜试剂产生双缩脲反应，形成紫红色蛋白质-铜复合物； 2. 紫红色复合物中的酪氨酸和色氨酸残基还原磷钼酸和磷钨酸，产生深蓝色，呈色强度与蛋白质浓度呈正相关，分光光度计测A750吸光度，做标准曲线 3.SDS-PAGE分离蛋白质 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是蛋白分析中最经常使用的一种方法.它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS）及巯基乙醇一起加热，使蛋白变性，多肽链内部及肽键之间的二硫键被还原，肽键被打开，打开的肽键靠疏水作用与SDS结合而带负电荷，电泳时在电场作用下，肽链在凝胶中向正极迁移。不同大小的肽链由于在迁移时受到的阻力不同，在迁移过程中逐渐分开，其相对迁移率与分子量的对数间成线形关系。 4. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)是在不加入SDS 疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于同工酶的鉴定和提纯。未

第十五章：蛋白质的生物合成.doc

第十五章蛋白质的生物合成一：填空题 1.蛋白质的生物合成是以________________作为模板，________________作为运输氨基酸的工具， ________________作为合成的场所。 2.细胞内多肽链合成的方向是从________________端到________________端，而阅读mRNA的方向是从________________端到________________端。 3.核糖体上能够结合tRNA的部位有________________部位、________________部位和 ________________部位。 4.ORF是指________________，已发现最小的ORF只编码________________个氨基酸。 5.蛋白质的生物合成通常以________________作为起始密码子，有时也以________________作为起始密码子，以________________、________________和________________作为终止密码子。 6.SD序列是指原核细胞mRNA的5′-端富含________________碱基的序列，它可以和16SrRNA的3′-端的________________序列互补配对，而帮助起始密码子的识别。 7.含硒半胱氨酸的密码子是________________。 8.原核生物蛋白质合成的起始因子(IF)有________________种，延伸因子(EF)有________________种，终止释放因子(RF)有________________种；而真核生物细胞质蛋白质合成的延伸因子通常有 ________________种，真菌有________________种，终止释放因子有________________种。 9.密码子的第2个核苷酸如果是嘧啶核苷酸，那么该密码子所决定氨基酸通常是________________。 10.原核生物蛋白质合成中第一个被参入的氨基酸是________________。 11.真核生物细胞质蛋白质合成对起始密码子的识别主要通过________________机制进行。 12.无细胞翻译系统翻译出来的多肽链通常比在完整的细胞中翻译的产物要长，这是因为 ________________。 13.蛋白质的半寿期通常与________________端的氨基酸性质有关。 14.tmRNA是指________________。 15.同工受体tRNA是指________________。 16.疯牛病的致病因子是一种________________。 17.已发现体内大多数蛋白质正确的构象的形成需要________________的帮助，某些蛋白质的折叠还需要________________和________________酶的催化。 18.SRP是指________________，它是一种由________________和________________组成的超分子体系，它的功能是________________。 19.蛋白质定位于溶酶体的信号是________________。 20.分子伴侣通常具有________________酶的活性。答案：1. 2 3 4

高电压技术(第三版)课后习题集答案解析2

第一章作业 1-1解释下列术语（1）气体中的自持放电；（2）电负性气体；（3）放电时延；（4）50%冲击放电电压；（5）爬电比距。答：（1）气体中的自持放电：当外加电场足够强时，即使除去外界电离因子，气体中的放电仍然能够维持的现象；（2）电负性气体：电子与某些气体分子碰撞时易于产生负离子，这样的气体分子组成的气体称为电负性气体；（3）放电时延：能引起电子崩并最终导致间隙击穿的电子称为有效电子，从电压上升到静态击穿电压开始到出现第一个有效电子所需的时间称为统计时延，出现有效电子到间隙击穿所需的时间称为放电形成时延，二者之和称为放电时延；（4）50%冲击放电电压：使间隙击穿概率为50%的冲击电压，也称为50%冲击击穿电压；（5）爬电比距：爬电距离指两电极间的沿面最短距离，其与所加电压的比值称为爬电比距，表示外绝缘的绝缘水平，单位cm/kV。

1-2汤逊理论与流注理论对气体放电过程和自持放电条件的观点有何不同？这两种理论各适用于何种场合？答：汤逊理论认为电子碰撞电离是气体放电的主要原因，二次电子来源于正离子撞击阴极使阴极表面逸出电子，逸出电子是维持气体放电的必要条件。所逸出的电子能否接替起始电子的作用是自持放电的判据。流注理论认为形成流注的必要条件是电子崩发展到足够的程度后，电子崩中的空间电荷足以使原电场明显畸，流注理论认为二次电子的主要来源是空间的光电离。汤逊理论的适用围是短间隙、低气压气隙的放电；流注理论适用于高气压、长间隙电场气隙放电。 1-3在一极间距离为1cm的均匀电场电场气隙中，电子碰撞电离系数α=11cm-1。今有一初始电子从阴极表面出发，求到达阳极的电子崩中的电子数目。解：到达阳极的电子崩中的电子数目为 n a= eαd= e11?1=59874 答：到达阳极的电子崩中的电子数目为59874个。

高电压技术(第三版)课后习题答案

第一章作业 ?1-1解释下列术语（1）气体中的自持放电；（2）电负性气体；（3）放电时延；（4）50%冲击放电电压；（5）爬电比距。答：（1）气体中的自持放电：当外加电场足够强时，即使除去外界电离因子，气体中的放电仍然能够维持的现象；（2）电负性气体：电子与某些气体分子碰撞时易于产生负离子，这样的气体分子组成的气体称为电负性气体；（3）放电时延：能引起电子崩并最终导致间隙击穿的电子称为有效电子，从电压上升到静态击穿电压开始到出现第一个有效电子所需的时间称为统计时延，出现有效电子到间隙击穿所需的时间称为放电形成时延，二者之和称为放电时延；（4）50%冲击放电电压：使间隙击穿概率为50%的冲击电压，也称为50%冲击击穿电压；（5）爬电比距：爬电距离指两电极间的沿面最短距离，其与所加电压的比值称为爬电比距，表示外绝缘的绝缘水平，单位cm/kV。

1-2汤逊理论与流注理论对气体放电过程和自持放电条件的观点有何不同？这两种理论各适用于何种场合？答：汤逊理论认为电子碰撞电离是气体放电的主要原因，二次电子来源于正离子撞击阴极使阴极表面逸出电子，逸出电子是维持气体放电的必要条件。所逸出的电子能否接替起始电子的作用是自持放电的判据。流注理论认为形成流注的必要条件是电子崩发展到足够的程度后，电子崩中的空间电荷足以使原电场明显畸，流注理论认为二次电子的主要来源是空间的光电离。汤逊理论的适用范围是短间隙、低气压气隙的放电；流注理论适用于高气压、长间隙电场气隙放电。 1-3在一极间距离为1cm的均匀电场电场气隙中，电子碰撞电离系数α=11cm-1。今有一初始电子从阴极表面出发，求到达阳极的电子崩中的电子数目。解：到达阳极的电子崩中的电子数目为 n a= eαd= e11?1=59874 答：到达阳极的电子崩中的电子数目为59874个。

实验样品采集运输保存方法

1.R N A实验样品采集、保存方法使用范围及样品量类别：Microarray Service；Sequencing Service; PCR Array& PCR Service 样本量：样本样本量哺乳动物培养细胞样品（悬浮细胞）1*107个哺乳动物培养细胞样品（贴壁细胞）15cm2 植物组织样品100mg-1g，根据植物不同部位的组织决定组织需要量，尽可能多些，但不必超过1g 动物组织样品新鲜组织样品 A. 使用RNAlater试剂取新鲜组织（注：动物死亡后尽快在10min内取材），组织块以PBS或生理盐水清洗干净，所用组织必须切至厚度在一下，然后放入装有5倍体积RNAlater的离心管（或冻存管）中。 4度孵育过夜，此时样品管需要横置以便组织块充分接触到RNAlater，然后转入-20中保存，样品在-20不会冻结，但溶液中可能会有一些晶体出现，这并不影响后续的RNA抽提。 B. 使用Trizol试剂取新鲜组织（1min以内），组织块以PBS或生理盐水清洗干净，每50-100mg组织加入1ml Trizol溶液匀浆裂解组织样品，最好冰上进行操作。

匀浆的裂解液4度短期保存（1month），-20或者-70度长期保存。冻存组织生物体死亡后尽快（10min以内）切取新鲜组织，并以PBS或生理盐水清洗干净切成小块；培养液倒入离心管中，离心沉淀细胞，弃去上清液。细胞沉淀（1*107个）中加入1ml Trizol裂解液反复吸打几次后，目视可见细胞层溶液完全 -70保存贴壁细胞从培养容器中吸出并弃去培养液培养瓶直接加入Trizol试剂，Trizol用量与细胞贴壁面积有关，15cm2细胞贴壁面积加入1mlTrizol。反复吸打几次后，目视可见细胞层溶解完全。 -70度保存。植物组织样品准确取得所需新鲜组织后，如有必要可用PBS清洗干净，将所用组织切碎，装入冻存管中或者用锡箔包裹好。立即投入液氮中保存。 2.血液类样品采集、保存方法适用范围及样品量全血/血细胞：Microarray Service；Sequencing Service; PCR Array& PCR Service 血清/血浆：Microarray Service；PCR Array& PCR Service

蛋白质提取与制备的原理和方法

蛋白质提取与制备蛋白质种类很多，性质上的差异很大，既或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质和酶。蛋白质与酶在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用。将细胞内蛋白质提取出来。并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化硫等）中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。这些蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。水适用于白蛋白类蛋白质的抽提。如果抽提物的pH用适当缓冲液控制时，共稳定性及溶解度均能增加。如球蛋白类能溶于稀盐溶液中，脂蛋白可用稀的去垢剂溶液如十二烷基硫酸钠、洋地黄皂苷（Digitonin）溶液或有机溶剂来抽提。其它不溶于水的蛋白质通常用稀碱溶液抽提。蛋白质类别和溶解性质白蛋白和球蛋白: 溶于水及稀盐、稀酸、稀碱溶液，可被50%饱和度硫酸铵析出。真球蛋白 : 一般在等电点时不溶于水，但加入少量的盐、酸、碱则可溶解。拟球蛋白: 溶于水，可为50%饱和度硫酸铵析出醇溶蛋白: 溶于70～80%乙醇中，不溶于水及无水乙醇壳蛋白: 在等电点不溶于水，也不溶于稀盐酸，易溶于稀酸、稀碱溶液精蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀组蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀硬蛋白质: 不溶于水、盐、稀酸及稀碱缀合蛋白(包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血红蛋白、金属蛋白、黄素蛋白和氮苯蛋白等) : 此类蛋白质溶解性质随蛋白质与非蛋白质结合部分的不同而异，除脂蛋白外，一般可溶于稀酸、稀碱及盐溶液中，脂蛋白如脂肪部分露于外，则脂溶性占优势，如脂肪部分被包围于分子之中，则水溶性占优势。蛋白质的制备是一项十分细致的工作。涉及物理学、化学和生物学的知识很广。近年来虽然有了不改进，但其主要原理仍不外乎两个方面：一是利用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配于可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离的目的，如电泳、超离心、超滤等。由于蛋白质不能溶化，也不能蒸发，所能分配的物相只限于固相和液相，并在这两相间互相交替进行分离纯化。制备方法可按照分子大小、形状、带电性质及溶解度等主要因素进行分类。按分子大小和形态

第十一章蛋白质生物合成

商洛职业技术学院教案教案首页

教案续页

基酸的工具，以核蛋白体为合成场所，在多种酶和辅助因子等200多种成分共同参与下完成。准备过程：氨基酸的活化与转运氨基酰-tRNA合成酶具有绝对专一性，对氨基酸、tRNA两种底物都有高度特异的识别功能，并将氨基酸连接在对应的tRNA上，从而保证了遗传信息的准确翻译。一、一、肽链合成的起始由核糖体、大小亚基，模板mRNA及起始tRNA组装形成起始复合物的过程，需GTP、三种IF及Mg2+的参与。 1. 核糖体大、小亚基分离 2. mRNA 在小亚基上定位结合 3. 起始氨基酰-tRNA的结合 4. 核糖体大亚基结合二、肽链合成的延长 1．注册：又称进位，按照A位处对应的mRNA第2个密码子，相应的氨基酰tRNA与EF-TuGTP构成复合物，并通过反密码识别mRNA模板上的密码子。 2．成肽：在大亚基上转肽酶的催化下，P位上起始tRNA所携带的氨基酰与A位上新进入的氨基酸的氨基缩合形成肽键。 3．移位：又称转位，EF-TuGTP复合物与核糖体结合，并水解GTP 提供能量，促使核糖体沿mRNA向3＇-端移动移动一个密码子的距离。新生肽链上每增加一个氨基酸残基都要经过进位、成肽、移位三步反应，此过程需要2种EF参与，消耗2分子GTP。三、肽链合成的终止当核蛋白体的A位出现mRNA的终止密码后，多肽链合成停止，肽链从肽酰-tRNA中释出，mRNA大小亚基等分离，这些过程称为肽链合成终止。蛋白质的生物合成

以上所述是单个核蛋白体合成肽链（单个核蛋白体循环）的情况。每条mRNA模板在蛋白质合成过程中同时与多个核蛋白体结合所形成的念珠状结构称为多聚核蛋白体，是多肽链合成的功能单位。由此可见，多个核蛋白体利用同一条mRNA模板，按不同进度各自合成多条相同的肽链，从而提高了翻译的效率。蛋白体合成的速度很快，据估算，每一个核蛋白体每秒钟可翻译约40个密码，即每秒合成相当于40个左右氨基酸残基组成的多肽链。第三节翻译后加工包括一级结构的修饰和空间结构的修饰：（一）新生肽链的折叠：新合成的肽链需经过折叠形成特定空间结构才具有生物活性。这一过程主要在细胞内质网中进行，一般需要在折叠酶和分子伴侣参与下才能完成。（二） N端甲酰蛋氨酸或蛋氨酸的切除：在肽链合成后或肽链延长过程中，由脱甲酰基酶或氨基肽酶催化，将甲酰蛋氨酸或蛋氨酸残基水解切除掉。（三）氨基酸残基侧链的修饰：例如，丝氨酸和苏氨酸残基的磷酸化；脯氨酸和赖氨酸残基的羟基化；组氨酸残基的甲基化；谷氨酸残基的羧基化等。 10分钟

(完整版)高电压技术习题与答案.(DOC)

第一章气体放电的基本物理过程一、选择题 1) 流注理论未考虑 B 的现象。 A ．碰撞游离 B ．表面游离 C ．光游离 D ．电荷畸变电场 2) 先导通道的形成是以 C 的出现为特征。 A ．碰撞游离 B ．表面游离 C ．热游离 D ．光游离 3) 电晕放电是一种 A 。 A ．自持放电 B ．非自持放电 C ．电弧放电 D ．均匀场中放电 4) 气体内的各种粒子因高温而动能增加，发生相互碰撞而产生游离的形式称为 C 。 A.碰撞游离 B.光游离 C.热游离 D.表面游离 5) ___ B ___型绝缘子具有损坏后“自爆”的特性。 A.电工陶瓷 B.钢化玻璃 C.硅橡胶 D.乙丙橡胶 6) 以下哪个不是发生污闪最危险的气象条件？D A.大雾 B.毛毛雨 C.凝露 D.大雨 7) 污秽等级II 的污湿特征：大气中等污染地区，轻盐碱和炉烟污秽地区，离海岸盐场3km~10km 地区，在污闪季节中潮湿多雾但雨量较少，其线路盐密为 C 2/cm mg 。 A .≤0.03 B.>0.03~0.06 C.>0.06~0.10 D.>0.10~0.25 8) 以下哪种材料具有憎水性？A A . 硅橡胶 B.电瓷 C. 玻璃 D 金属二、填空题 9)气体放电的主要形式：辉光放电、电晕放电、刷状放电、火花放电、电弧放电。 10)根据巴申定律，在某一PS 值下，击穿电压存在极小（最低）值。 11)在极不均匀电场中，空气湿度增加，空气间隙击穿电压提高。 12)流注理论认为，碰撞游离和光电离是形成自持放电的主要因素。 13)工程实际中，常用棒－板或棒－棒电极结构研究极不均匀电场下的击穿特性。 14)气体中带电质子的消失有扩散、复合、附着效应等几种形式 15)对支持绝缘子，加均压环能提高闪络电压的原因是改善(电极附近)电场分布。 16)沿面放电就是沿着固体介质表面气体中发生的放电。 17)标准参考大气条件为：温度C t 200 ，压力 0b 101.3 kPa ，绝对湿度30/11m g h 18)越易吸湿的固体，沿面闪络电压就越__低____ 19)等值盐密法是把绝缘子表面的污秽密度按照其导电性转化为单位面积上____NaCl ______含量的一种方法 20)常规的防污闪措施有：增加爬距，加强清扫，采用硅油、地蜡等涂料三、计算问答题 21) 简要论述汤逊放电理论。答∶当外施电压足够高时，一个电子从阴极出发向阳极运动，由于碰撞游离形成电子崩，则到达阳极并进入阳极的电子数为e as 个(α为一个电子在电场作用下移动单位行程所发生的碰撞游离数；s 为间隙距离)。因碰撞游离而产生的新的电子数或正离子数为(e as -1)个。这些正离子在电场作用下向阴极运动，并撞击阴极．若1个正离子撞击阴极能从阴极表面释放r 个(r 为正离子的表面游离系数)有效电子，则(e as-1)个正离子撞击阴极表面时，至少能从阴极表面释放出一个有效电子，

蛋白样品制备

双向电泳之样品的制备 2008-04-02 21:58:37| 分类：默认分类|举报|字号订阅一般性原则：样品制备是双向电泳中最为关键的一步，这一步处理的好坏将直接影响2-DE 结果。目前并没有一个通用的制备方法，尽管处理方法是多种多样，但都遵循几个基本的原则： 1）尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；2）减少对蛋白质的人为修饰； 3）破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。根据这一原则，样品制备需要四种主要的试剂：离液剂(chaotropes),主要包括尿素（Urea）和硫脲（thiourea）；表面活性剂（sufactants），也称去垢剂，早期常使用NP-40、TritonX -100 等非离子去垢剂，近几年较多的改用如CHAPS 与Zwittergent 系列等双性离子去垢剂；还原剂（reducing agents ），最常用的是二硫苏糖醇（DTT），也有用二硫赤藓糖醇（DTE）以及磷酸三丁酯（TBP）等。当然，也可以选择性的加入Tris-base,蛋白酶抑制剂（如EDTA 、PMSF or Protease inhibitor c℃ktails ）以及核酸酶。样品的来源不同，其裂解的缓冲液也各不相同。通过不同试剂的合理组合，以达到对样品蛋白的最大抽提。在对样品蛋白质提取的过程中，必须考虑到去除影响蛋白质可溶性和2DE 重复性的物质，比如核酸、脂、多糖等大分子以及盐类小分子。大分子的存在会阻塞凝胶孔径，盐浓度过高会降低等电聚焦的电压，甚至会损坏IPG 胶条；这样都会造成2-DE 的失败。样品制备的失败很难通过后续工作的完善或改进获得补偿。核酸的去除可采用超声或核酸酶处理，超声处理应控制好条件，并防止产生泡沫；而加入的外源核酸酶则会出现在最终的2D 胶上。脂类和多糖都可以通过超速离心除去。透析可以降低盐浓度，但时间太长；也可以采取凝胶过滤或沉淀/重悬法脱盐，但会造成蛋白质的部分损失。因此，处理方法必须根据不同的样品、所处的状态以及实验目的和要求来进行选择。样品制备程序：

蛋白质提取与制备的原理和方法

蛋白质提取与制备的原理和方法蛋白质提取与制备蛋白质种类很多，性质上的差异很大，既或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质和酶。蛋白质与酶在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用。将细胞内蛋白质提取出来。并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化硫等）中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。这些蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。水适用于白蛋白类蛋白质的抽提。如果抽提物的pH用适当缓冲液控制时，共稳定性及溶解度均能增加。如球蛋白类能溶于稀盐溶液中，脂蛋白可用稀的去垢剂溶液如十二烷基硫酸钠、洋地黄皂苷（Digitonin）溶液或有机溶剂来抽提。其它不溶于水的蛋白质通常用稀碱溶液抽提。蛋白质类别和溶解性质白蛋白和球蛋白: 溶于水及稀盐、稀酸、稀碱溶液，可被50%饱和度硫酸铵析出。真球蛋白: 一般在等电点时不溶于水，但加入少量的盐、酸、碱则可溶解。拟球蛋白: 溶于水，可为50%饱和度硫酸铵析出醇溶蛋白: 溶于70～80%乙醇中，不溶于水及无水乙醇壳蛋白: 在等电点不溶于水，也不溶于稀盐酸，易溶于稀酸、稀碱溶液精蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀组蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀硬蛋白质: 不溶于水、盐、稀酸及稀碱缀合蛋白(包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血红蛋白、金属蛋白、黄素蛋白和氮苯蛋白等) : 此类蛋白质溶解性质随蛋白质与非蛋白质结合部分的不同而异，除脂蛋白外，一般可溶于稀酸、稀碱及盐溶液中，脂蛋白如

高电压技术第四版习题内容

第一章 1‐1 极化种类电子式极化离子式极化偶极子极化夹层极化产生场合所需时间能量损耗无几乎没有有有产生原因束缚电子运行轨道偏移离子的相对偏移偶极子的定向排列自由电荷的移动任何电介质-15 s 离子式结构电介质-13 s 极性电介质-10～10-2 s 多层介质的交界面-1 s～数小时 1‐4 金属导体气体，液体，固体电导形式（自由电子）电子电导电导率γ很大（自由电子、正离子、负离子、杂质电导、自身离解、杂质、离子）γ很小离子电导ρ很大金属导电的原因是自由电子移动；电介质通常不导电，是在特定情况下电离、化学分解或热离解出来的带电质点移动导致。1‐6

由于介质夹层极化，通常电气设备含多层介质，直流充电时由于空间电荷极化作用，电荷在介质夹层界面上堆积，初始状态时电容电荷与最终状态时不一致；接地放电时由于设备电容较大且设备的绝缘电阻也较大则放电时间常数较大（电容较大导致不同介质所带电荷量差别大，绝缘电阻大导致流过的电流小，界面上电荷的释放靠电流完成），放电速度较慢故放电时间要长达5～10min。补充：图中C1 代表介质的无损极化（电子式和离子式极化），C2 —R2 代表各种有损极化，而R3则代表电导损耗。图1－4－2中，Rlk为泄漏电阻；Ilk为泄漏电流；Cg为介质真空和无损极化所形成的电容；Ig为流过Cg的电流；Cp为无损极化所引起的电容；Rp为无损极化所形成的等效电阻；Ip为流过Rp－Cp支路的电流，可以分为有功分量Ipr和无功分量Ipc。 Jg为真空和无损极化所引起的电流密度，为纯容性的；Jlk为漏导引起的电流密度，为纯阻性的；Jp为有损极化所引起的电流密度，它由无功部分Jpc和有功部分Jpr组成。容性电流Jc与总电容电流密度向量J 之间的夹角为δ，称为介质损耗角。介质损耗角简称介损角δ，为电介质电流的相角领先电压相角的余角，功率因素角?的余角，其正切t gδ称为介质损耗因素，常用％表示，为总的有功电流密度与总无功电流密度之比。

生物样品储存方法概述-冷冻保存

https://www.360docs.net/doc/b52756461.html, 生物样品储存方法概述-冷冻保存将需要冷冻的样品冷冻（freezing,放于-20?C或-80?C）得当能有效的保证样品质量！下面给大家安利几种常见样品的冷冻储存方式： DNA及缓冲液：对于基因组材料来说，收到轻微的机械剪切力不是什么大事情；对于不稳定的缓冲液，如含有DTT的缓冲液，可直接冷冻储存，无需调整。蛋白：需要添加防冻剂用于蛋白的冷冻储存。蔗糖或甘油是防冻剂很好的选择，但对于不同的蛋白，蔗糖或甘油所占的百分比须有所不同。可选择20％的蔗糖或10％的甘油。限制性内切酶可以储存在50％甘油中以保持稳定性。由于较低的冷冻温度，这种甘油的浓度可防止溶液完全冻结！微生物（细菌，酵母和真菌）：10-20％甘油效果很好。更高的百分比（即更接近20％）使平板划线更加容易。高等真核细胞：常见的的冷冻过程为（仅供参考）： 1. 配制含10% DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液； 2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中；

3. 离心1000rpm，5min； 4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml； 5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml； 6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者； 7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。 8．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液； 9．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤； 10．冻存和复苏最好用新配制的培养液。另外，反复冻融对样品损害很大，因此将样品分装成小规格保存是不错的选择。为了最大限度减少样品浪费，分装之前需要知道样品的浓度、后续实验每次的用量，以便分装成适当的体积。小贴士：对于分装成微小的体积，PCR条管是不错的选择。此外，一些大分子在储存之前快速冷冻（flash-freezing）,能更好的保持功能。如何进行快速冷冻：穿上实验室外套，戴上护目镜、手套，将样品放入含有少量液氮的杜瓦瓶（dewar）中，有泡沫和烟雾产生（此操作需要在通风环境中进行）。一旦停止产生泡沫，迅速将样品取出，存储在-20?C或-80?C。 https://www.360docs.net/doc/b52756461.html,

蛋白质组学样品制备注意事项

蛋白组学样品制备常规流程及注意事项一、细胞, 组织裂解 ●Lysis buffer (SDT, RIPA…)： ThermoFisher提供了针对于各种样品的解缓冲液 ●Detergent: SDS, CHAPS, NP40… (破坏细胞膜，蛋白质变性） ●Reducing agent: DTT… (打开二硫键，使得蛋白质结构更为开放，更易酶解) ●Urea: 增加蛋白质的可溶性，适用于提取全蛋白二、蛋白质抽提三、样品蛋白质含量测定、还原烷基化还原烷基化原理: 蛋白质不能从PAGE胶里被抽提出，而肽段则可以被抽提出，打断蛋白质的二硫键，破坏蛋白质二级结构，是蛋白质结构松散，增加蛋白质酶切效率。四、蛋白水平的预分级或蛋白质免疫沉淀五、蛋白质酶解 i.胶内酶解 (In-gel digestion) ●将考染后的SDS-PAGE切成小块 ●用100mM NH4HCO3/30%ACN 脱色 ●在胶内进行 DTT, IAA ●在NH4HCO3溶液体系中加入酶，在胶内进行酶解 ●用60% ACN/0.1% TFA 从胶中抽提生成的肽段 ii.FASP: Filter aided sample preparation

●采用滤膜装置进行溶液置换（10K, 20K, 30K） ●使用尿素可以更有效的除去溶液体系中的去垢剂（如SDS） ●最后置换至NH4HCO3 or TEAB 溶液体系进行蛋白质酶切（pH 在8.0左右） ●酶解完成后收集滤膜的流穿组分得到肽段原理: 蛋白质不能通过滤膜，而酶解生成的肽段则可以通过。丙酮沉淀是另一种去除去垢剂的方法，从而可进行溶液内酶解。 iii.蛋白酶的选择：最为常用的蛋白酶: Trypsin（保持胰酶处于低温，并且保存在酸性环境中，以防止胰酶自身酶解） ●特异的切断C端为Arg, Lys的肽键（若Arg, Lys后紧跟Proline, 酶切效率降低） ●生成的肽段平均长度为9个氨基酸 ●胰酶酶解生成的肽段至少为2+价，易于离子化其他一些蛋白酶，酶切位点的特异性可在搜库软件中查找。六、肽段水平的预分级或翻译后修饰的富集七、肽段除盐 (非常重要) 蛋白质谱分析对样品的要求： ?无盐：少量挥发性盐不影响（如100mM以下碳酸氢铵）（充分脱盐） ?无聚合物：如PEG（避免使用国产耗材、避免手套等接触样品） ?无表面活性剂：如SDS（前处理过程中避免使用） ?无沉淀或颗粒：（充分离心、过滤）

(整理)样品保存方法

精品文档分析项目固定剂名称采样器皿保存方法保存时间钙微孔滤膜空气采样器滤膜接尘面对折2次置于清洁容器室温下可长期保存铬微孔滤膜空气采样器滤膜接尘面对折2次置于清洁容器室温下可长期保存铅烟微孔滤膜空气采样器滤膜接尘面对折2次置于清洁容器室温下可长期保存铅尘微孔滤膜空气采样器滤膜接尘面对折2次置于清洁容器室温下可长期保存锰微孔滤膜空气采样器滤膜接尘面对折2次置于清洁容器室温下可长期保存钼微孔滤膜空气采样器滤膜接尘面对折2次置于清洁容器室温下可长期保存镍微孔滤膜空气采样器滤膜接尘面对折2次置于清洁容器室温下可长期保存钾微孔滤膜空气采样器滤膜接尘面对折2次置于清洁容器室温下可长期保存钠微孔滤膜空气采样器滤膜接尘面对折2次置于清洁容器室温下可长期保存锌微孔滤膜空气采样器滤膜接尘面对折2次置于清洁容器室温下可长期保存一氧化氮吸收液空气采样器，多孔玻板吸收管封闭吸收管进出气口，置于清洁容器中当天测定二氧化氮吸收液空气采样器，多孔玻板吸收管封闭吸收管进出气口，置于清洁容器中当天测定氨吸收液空气采样器，大型气泡吸收管封闭吸收管进出气口，置于清洁容器中当天测定氰化氢吸收液空气采样器，小型气泡吸收管封闭吸收管进出气口，置于清洁容器中当天测定氰化物微孔滤膜空气采样器滤膜置于具塞刻度试管室温下至少7天磷酸微孔滤膜空气采样器滤膜接尘面对折2次置于清洁容器室温下可保存3天二氧化硫吸收液空气采样器，多孔玻板吸收管封闭吸收管进出气口，置于清洁容器中室温下可保存15天三氧化硫微孔滤膜空气采样器滤膜接尘面对折2次置于具塞比色管室温下可保存3天硫酸微孔滤膜空气采样器滤膜接尘面对折2次置于具塞比色管室温下可保存3天硫化氢吸收液空气采样器，多孔玻板吸收管封闭吸收管进出气口，置于清洁容器中至少可保存5天氟化氢微孔滤膜空气采样器，多封闭吸收管进出气室温下可保存7天

蛋白质制备及含量测定(凯氏定氮法)

实验六蛋白质制备及含量测定—— 微量凯氏（Mirco-Kjeldahl）定氮法一、实验目的要求 1、了解蛋白质提取的一般方法和原理 2、了解蛋白质含量测定的常用方法 3、学习微量凯氏定氮法的原理 4、掌握微量凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化、蒸馏、滴定、含氮量的计算及蛋白质含量的换算等。二、实验原理 1、蛋白质的提取与制备蛋白质的提取与制备方法与生物材料的类型及蛋白质的存在部位有关。如果是胞内蛋白，首先必须要进行细胞破碎。细胞破碎的方法与细胞的类型有关，包括物理破碎（研磨、超声波等）、化学破碎（化学溶剂处理）、酶法破碎等。如果是胞外蛋白，可以根据相应蛋白质的性质进行提取分离纯化。如果待提取的蛋白质是具有生物活性的蛋白质如酶，则在样品处理、提取及分离纯化过程中需注意防止蛋白质的变形失活，如在低温下操作、选择适当的缓冲体系等。 2、蛋白质含量测定蛋白质含量测定的方法很多，如：紫外吸收法、双缩脲法、考马斯亮蓝染色法（Bradford法）、Folin酚法、微量凯氏定氮法等。 3、凯氏定氮生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法。其原理如下：（1）消化：有机物与浓硫酸共热，使有机氮全部转化为无机氮——硫酸铵。为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。这一步约需2～3h，视样品的性质而定。天然的含氮有机物（如蛋白质，核酸及氨基酸等）与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水；蛋白质分解，而有机氮则变成氨（无机氮），并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此时程称之为“消化”。但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。甘氨酸的消化过程可表示如下： NH2-CH2 -COOH + 3H2SO4→NH3 + 2CO2↑+ 3SO2↑+ 4H2O 2 NH 3 + H2SO4→(NH4)2 SO4 或2 NH2-CH2 -COOH + 7H2SO4→(NH4)2 SO4 + 4CO2↑+ 6 SO2↑+ 8H2O （2）加碱蒸馏：浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一

临床样本保存及处理方式

临床常见的标本有血清（浆）、全血、分泌物、棉拭子、脓液、体液、新鲜组织、石蜡切片等，这些临床标本的处理和保存方法各有不同。临床标本的处理血清（浆）标本一些病原体，如乙肝病毒（HBV）、丙肝病毒（HCV）、人类免疫缺陷病毒（HIV）等的PCR检测常采用血清或血浆标本。 HBV：标本通常由医护人员采集，应注意避免溶血，如为血浆标本注意抗凝剂的选择，一般用EDTA-Na2或枸橼酸纳，不可使用肝素。标本为全血时，及时分离出血浆，提取病毒DNA进行检测。 HCV：检测RNA病毒。由于RNA极易降解，标本的制备和保存方式往往可以影响测定结果。若用血浆标本，应使用EDTA抗凝。严禁使用肝素，因其对PCR扩增有抑制作用,且无法在核酸提取过程中去除。抗凝后6小时内分离血浆。如用血清标本，则应尽快（2小时内）分离血清进行检测，或-20oC保存。全血标本通常用来提取外周血单个核细胞核酸：如基因组DN A、线粒体DN A、总RNA等。抗凝剂：一般使用EDTA-Na 2、枸橼酸xx，不使用肝素。

1）加适量的红细胞裂解液（破膜液），裂解全血中的红细胞。 2）再加适量的细胞核裂液（破核液），裂解白细胞中的细胞核，使核内DNA释放出来。 3）然后再加SDS（十二烷基硫酸钠）等去污剂，溶解脂蛋白，解聚核蛋白。 SDS可与蛋白质结成复合物，使蛋白质变性沉淀，但SDS在以后的核酸提取过程中必须除去。痰标本痰属于分泌物，临床上常用作结核杆菌DNA测定样本，由于痰标本中含大量粘蛋白和杂质，故在核酸提取时，一定要对标本进行前处理，即用4%NaOH 液化，去除粘蛋白，然后用煮沸或蛋白酶、酚/氯仿等经典法提取DNA。具体方法：用无菌平皿取患者肺深部咳出的痰液1-3ml，↓加入4倍体积4%NaOH，摇匀，室温下放置30分钟左右液化↓取 1.5ml EP管，加 0.5ml液化痰液，再加 0.5ml 4%NaOH室温放10分钟↓ 12000 rpm，离心15分钟↓弃上清，加无菌生理盐水1 ml，混匀，12000rpm离心5分钟↓弃上清，沉淀物用于DNA提取棉拭子用PCR方法检测性病病原体时（衣原体、支原体、淋球菌、梅毒螺旋体、人乳头状瘤病毒等），临床标本一般为棉拭子。标本取材是关键，衣原体等病原体感染上皮细胞，因此取材一定要取到细胞。