2020年分子生物学实验参照模板(0001)

实验操作

1. 避免长时间的培养，大肠杆菌一般培养12个小时就可以挑取克隆子进行验证了。

主要是因为培养时间过长，尤其是含有Amp抗性的质粒。重组菌能够分泌酶降解Amp，造成平板中局部Amp浓度太低。其他未重组菌在Amp存在的情况下只是生长受抑制而非死亡，当Amp浓度降低时就可以生长了。卫星菌落，由于阳性菌落大量分解抗生素，造成周围区域抗生素浓度降低，则无抗性的菌也生长出来了。一句话，你的板子培养时间过长了。这是amp抗性质粒特有的卫星菌落，就是又抗性的E col分泌beta内酰胺酶分解周围的amp，从而使没有抗性的e coli生长。

2.3.乙醇能够消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。Na＋之类的平衡离子能够与这些带电基团结合，在沉淀形成部位降低多核苷酸链之间的排斥作用。因此只有在阳离子的量足以中和暴露的磷酸残基的电荷时才会发生乙醇沉淀。1.为什么用无水乙醇沉淀DNA？

用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。

DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15－30分钟即可。

2.在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25mol/L？

在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。

DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15－30分钟即可。1。DNA不溶于乙醇

2。乙醇可以吸附水分子（极性相同），使得溶液中相对的水分子减少，增大了DNA在水中的相对浓度。

3。附：乙醇沉淀DNA需要盐离子，用金属离子屏蔽DNA上磷酸的负电荷，降低DNA分子间的斥力，才能沉淀完全。

4.溶菌酶是一种碱性球蛋白，分子中碱性氨基酸、酰胺残基和芳香族氨，酸的比例较高，酶的活动中心是天冬氨酸和谷氨酸。

溶菌酶是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，称包胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，它专一地作用于肽多糖分子中N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4键，从而破坏细菌的细胞壁，使之松驰而失去对细胞的保护作用，最终使细菌溶解死亡。也可以直接破坏革兰氏阳性菌的细胞壁，而达到杀菌的作用，这主要是因为革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由胞壁质和磷酸质组成，其中胞壁质是由杂多糖和多肽组成的糖蛋白，这种多糖正是由N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4键联结的。对某些革兰氏阴性菌，如埃希氏大肠杆菌，伤寒沙门氏菌，也会受到溶菌酶的破坏。溶菌酶是母乳中能保护婴儿免遭病毒感染的一种有效成分，它能通过消化道而保持其活性状态，溶菌酶还可以使婴儿肠道中大肠杆菌减少，促进双歧杆菌的增加，还可以促进蛋白质的消化吸收

5.酚、氯仿是变性蛋白质的（由于苯酚能溶进少量水损失DNA，因此与氯仿一起使用，减少DNA损失）

异戊醇是消泡剂（蛋白质变性中常常产生气泡，会损失DNA，因此需消泡）抽提DNA去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好？酞与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）使用。

10．为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊酵？在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为24：1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。1.酚/氯仿/异戊醇的作用：从核酸样品中除去蛋白质时常常使用酚和氯仿都能使蛋白质变性，并使其溶于有机相或中间相内，而异戊醇则有助于消除抽提过程中出现的气泡。

6.β-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除

7.

8.说得对。75%乙醇清洗DNA的目的是脱盐的。

其机理如下：75%乙醇中含有25%的水，这部分水可以溶解和DNA沉淀中混有的、DNA沉淀前加入的钾盐（或钠盐），但同时也会溶解（损失）少部分DNA（盐离子比DNA更易溶于水中）。为了减少DNA损失，所以用含量较高的乙醇溶液（DNA不溶于乙醇）。蛋白质、糖、脂类等都可以溶于75%酒精，而DNA不溶

9.

10.RNase A的作用是使RNA降解，减少提取得到的DNA中的RNA，以便减少对后续实验的影响。RNaseH 是一种逆转录酶。消化mRNA用的。RNase H，即Ribonuclease H，中文名为核糖核酸酶H，是一种核糖核酸内切酶，可以特异性地水解DNA-RNA杂合链中的RNA。RNase H不能水解单链或双链DNA或RNA中的磷酸二酯键，即不能消化单链或双链DNA或RNA。特点：特异性消化DNA-RNA杂合链中的RNA，常用于cDNA第二链的合成

编辑本段用途

·在cDNA第二链合成前去除mRNA · DNA-RNA杂交体的鉴定·在Oligo(dT) 存在下去除mRNA 的poly(A)尾

11.当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。0.2 N NaOH：是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。由于质粒和细菌染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然缠绕在一起不分开；但后者完全变性分甚至出现断裂。因此，在裂解细菌时要注意：

第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下DNA片断会慢慢断裂；

第二，混合必须轻柔，不然DNA也会断裂。

1% SDS（十二烷基磺酸钠）：是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。

–12.这一步的K置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na，得到PDS（十二烷基磺酸钾）沉淀；SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产

生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时基因组DNA也被PDS共沉淀。当

加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值，使溶液pH值恢复较低的近中性水平时，质

粒的两条小分子单链可迅速复性恢复双链结构，但是主染色体DNA则难以复性。

–SDS遇到钾离子后变成十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS 是不溶于水的，而高浓度的盐使得沉淀更完全。SDS极易和蛋白质结合，平均两个氨基

酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀

了。

–同时，尽管SDS并不与DNA分子结合，由于大肠杆菌的基因组DNA很长，很容易和变性的蛋白质缠绕在一起。在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，变性蛋白质等缠绕一起

被沉淀，而复性的质粒DNA以可溶性状态留在上清夜中。

13.所谓星活性又称Star活性。是指由于反应条件不同而产生的切断与原来认识序列不同的位点的现象，也就是说产生Star活性后，不但可以切断特异性的识别位点，还可以切断非特异性的位点。产生Star活性的结果是酶切条带增多。所以说Star活性与粘端变平端没关系。另外，Star活性除了与酶本身的性质有关外，与甘油浓度，pH值及离子浓度有关。一般正规厂家生产的限制酶出厂前都做相关的检测，buffer体系也都做了相应的考虑。因此正常情况下酶切，可以先不必考虑Star活性的问题。一旦出现底物DNA不好切断，需要增加酶量或延长反应时间时，如果使用的是易产生StaR活性的限制酶切，一般优先考虑增加酶量，而不是延长反应时间，换句话说，延长时间比增加酶量更易产生Star活性。另外，实际上几乎所有的限制性内切酶都可能产生Star活性。但目前Star活性对实际实验室操作过程中的影响并不太大，可以先不考虑。一般来说，限制性内切存在严格的识别在序列特异性，但某些条件改变，会使其对识别序列特异性的放宽，而导致在DNA内产生附加切割，限制性内切酶表现的这种活性称为星活性，或第二活性，在名称右上角加一星号表示。

产生星活性的条件

①甘油浓度

②离子强度高盐缓冲液酶降低盐

③pH值 7.5～8．5产生

④有机溶剂 DMSO(二甲亚砜)1～2%(V/V)

⑤二价阳离子Mn2+代替Mg2+

⑥酶与DNA的比例

酶与DNA比为(50U／μg)产生星活性。为了防止星活性的出现，所有限制性内切酶反应在标准条件下(特别是pH、离子强度、二价离子浓度的条件下)进行。

某些限制性内叨酶诱导产生星活性的反应条件

酶诱导星活性条件

AvaI A,B,D

EcoRI A,B,D,E,F

HaeⅢ B,D

HhaI B,D,G

BamHI A,B,C,D,E,H

A．乙二醇(45％)；B.甘油(11～20％)；C.乙醇(12％)；

D．高酶：DNA比值()25U／μg)；E．Mn2+代替Mg2+；

F．pH8．5；G．DMSO(8％)；H．无NaCl

14.同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。要保证双酶切实验的高效、准确，就要选择合适的通用buffer。这样就能避免质粒和基因没有切动或者被切散。常用的几家内切酶公司有MBI、NEB、Promega、Roche、Takara，要查找双酶切体系的通用buffer，最好到出品该内切酶的公司网站上查询。

15. 缓冲液在电泳过程中的一个作用是维持合适的pH。电泳时正极与负极都会发生电解反应，正极发生的是氧化反应（4OH--4e->2H2O+O2)，负极发生的是还原反应（4H++4e->2H2)，长时间的电泳将使正极变酸，负极变碱。一个好的缓冲系统应有较强的缓冲能力，是溶液两极的pH保持基本不变。

电泳缓冲液的另一个作用是使溶液具有一定的导电性，以利于DNA分子的迁移，例如，一般电泳缓冲液中应含有0.01-0.04mol/L的Na+离子，Na+离子的浓度太低时电泳速度变慢；太高时就会造成过大的电流使胶发热甚至熔化。

电泳缓冲液还有一个组分是EDTA，加入浓度为1-2mmol/L，目的是螯合Mg2+ 等离子，防止电泳时激活DNA酶，此外还可防止Mg2+离子与核酸生成沉淀。

16.

17.对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2％之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。孔径大的琼脂糖。

19.⑴、细胞的生长状态和密度

最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已经过多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。对TG1菌株，OD600为0．5时，细胞密度在5×107个/ml左右。（应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。密度过高或不足均会使转化率下降。此外，受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。

⑵、质粒DNA的质量和浓度

用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。一般地，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和。对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，实验证明，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。此外，重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍，因此重组DNA大都构成环状双螺旋分子。

⑶、试剂的质量

所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于4℃。

⑷、防止杂菌和杂DNA的污染

整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。

⑸、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。

20.TAE是Tris-乙酸，缓冲容量小，但是溶解度大，易于储存

TBE是Tris-硼酸，缓冲容量大，但是溶解度小，不易长期储存，易产生沉淀

TAE与TBE的区别

首先要知道 TAE 與 TBE 緩衝溶液的成份如下：

50x TAE Buffer (Tris-Acetate-EDTA)

242 gm Tris base

57.1 ml Acetic acid 100ml

0.5M EDTA

Add ddH2O to 1 liter and adjust pH to 8.5.

10x TBE Buffer (Tris-Borate-EDTA)

108 gm Tris base

55 gm Boric acid

9.3 gm Na4EDTA

Add ddH2O to 1 liter.

The pH is 8.3 and requires no adjustment.

它們的分別有下列幾點：

1. TBE 不能太濃 (它只可有 10 times)，因為 borate 會很容易沉澱，但一般有少許沉澱是不會有太大問題。

2. TBE 的 buffering capacity 比 TAE 高，用 TBE 來跑出來的 gel，分辨率 (resolution) 會比較高。

3. 因為 TBE 有 borate 離子 (ion)，它會影嚮酵素 (enzyme) 的工作。因此，若要為分離出的 DNA 進行下一步酵素處理，如 cloning 或 restriction cut 的話，就要切記不要讓 DNA 碰上 borate ion。

4. TAE的 buffer capacity 比較差，gel 一般比較模糊，但它不會對影嚮酵素

三种缓冲液的配制方法

Tris-乙酸（TAE）：50×浓贮存液（每升）：

242g Tris 碱

57.1ml 冰乙酸

100ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0)

使用时再稀释50倍。

Tris-磷酸（TPE）：10×浓贮存液（每升）：

108g Tris 碱

15.5ml 85％磷酸（1.679g /ml）

40ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0)

使用时再稀释10倍。

Tris-硼酸（TBE）：5×浓贮存液（每升）：

54g Tris 碱

27.5g 硼酸

20ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0)

21.标准的PCR反应体系：

10×扩增缓冲液 10ul

4种dNTP混合物各200umol/L 800ul